（动物学专业论文）斑背大尾莺遗传多样性分析及分类研究.pdf

摘要 斑背大尾莺是东亚特有鸟类，种群数量十分稀少，已被i u c n 列为濒危物种，目前 其有关研究相当少见，濒危机制也不甚清楚。鸟类线粒体控制区进化速度快，遗传变异 大，很适合于做种内、种群或个体间的遗传分化研究。本研究应用d n a 序列分析的方 法，对斑背大尾莺线粒体控制区部分序列的变异进行分析，并对其遗传多样性水平做出 初步的评价。对3 0 个样本7 9 7 b p 序列长度的检测结果表明：3 0 个样本共检测到1 5 个变 异位点，其中仅有一处为颠换，其余均为转换，核苷酸多样度( n u c l e o t i d ed i v e r s i t y ) p = 0 0 0 1 3 9 ，平均核苷酸差异( a v e r a g en u m b e ro fp a i r w i s en u c l e o t i d ed i f f e r e n c e s ) 肛 1 1 0 6 。3 0 个样本共检测到1 4 个单倍型，其中一个单倍型的频率占到5 3 3 ，单倍型歧 异度( h a p l o t y p ed i v e r s i t y ) h d = 0 7 7 2 ，斑背大尾莺扎龙种群的遗传多样性水平与同亚科 下的广布近缘种东方大苇莺相比偏低，这可能是其濒危的表现和诱因。两个采集地点样 本间的遗传分化系数f s t = 0 0 3 5 3 7 ，检验结果显示两组间的差异不显著。 斑背大尾莺在传统的分类系统中被划分在大尾莺属下，而有学者认为其与蝗莺属的 亲缘关系更近，目前已有形态学和分子系统学的证据支持这一观点。本研究利用细胞色 素b 来研究斑背大尾莺的分类地位。对斑背大尾莺细胞色素b 全序列进行扩增，共得到 1 1 3 4 b p 片段长度的序列。大尾莺属和蝗莺属共8 种鸟类的8 3 5 b d 细胞色素b 片段长度用 来探讨斑背大尾莺的分类地位以及蝗莺属的系统发育关系。细胞色素b 的遗传距离和建 树结果显示斑背大尾莺与蝗莺属亲缘关系很近，支持将斑背大尾莺划分在蝗莺属。细胞 色素b 的建树结果还显示出蝗莺属的非单系性。此外遗传距离和建树结果还显示史氏蝗 莺和小蝗莺间的亲缘关系很近，河蝗莺和鸲蝗莺间的亲缘关系很近。 关键词：斑背大尾莺；蝗莺属；线粒体控制区；细胞色素b ；遗传多样性；分子系统分 类 a b s t r a c t j a p a n e s em a r s hw a r b l e r ( m e g a l u r u sp a l u s t r i s ) i so n eo ft h es p e c i e s w h i c ho n l y d i s t r i b u t e di ne a s ta s i a , t h ep o p u l a t i o nn m n h e ri sv e r ys m a l l ，i th a sb e e nl i s t e db yi u c na s e n d a n g e r e ds p e c i e s a tp r e s e n tt h e r ea r el i t t l er e s e a r c h e so n i ta n dt h em e c h a n i s mo f e n d a n g e ri s n o tv e r yc l e a r a st h ee v o l u t i o nr a t eo f c o n t r o lr a g i o no f b i r di sf a s t e ra n dt h eg e n e t i cv a r i a t i o n o f t h i sr e g i o ni st h em o s tc o m p a r e dw i t ho t h e rp a r t so f m i t o c h o n d r i a ld n a t h i sr a g i o ni su s e d i nt h er e s e a r c ho f g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o no fi n n e rs p e c i e s ，i n t e r s p e c i e s ，a n di n t e r i n d i v i d u a l i n t h i ss t u d y , d n as e q u e n c ea n a l y s i sw a su s e dt od e t e c tt h eg e n e t i cd i v e r s i t yl e v e lo fj a p a n e s e m a r s hw a r b l e r ap a r ts e q u e n c eo ft h em i t o c h o n d r i a lc o n t r o lr e g i o n ( 7 9 7b p ) w a so b t a i n e di n 3 0g r e a ts a m p l e si i lt h eb r e e d i n gs i t e so fz h a l o n g ，a m o n gt h e m , 1 5w e r eo b t a i n e di n2 0 0 4 ，a n d t h eo t h e r1 5w e r eg o ti n2 0 0 5 t h er e s u l t ss h o w e d ：1 5v a r i a b l es i t e sw e r ef o u n di n3 0d - l o o p s e q u e n c e s ，o n l yo n ev a r i a n t ew a st r a n s v e r s i o n , t h eo t h e r sw e r et r a n s i t i o n s ，a n dt w os i t s ( 2 2 4 ， 5 7 9 ) l o s tn u c l e o t i d ea i nt o t a l ，1 4h a p l o t y p e sw e r ed e t e c t e di n3 0s a m p l e s , t h ef r e q u e n c yo f h a p o t o t y p ea w a sa sh i g ha s5 3 3 ，h a p l o t y p ed i v e r s i t yh d = o 7 7 2 ，n u c l e o t i d ed i v e r s i t y p i = o 0 0 1 3 9 ，a v e r a g en u m b e ro f p a i r w i s en u c l e o t i d ed i f f e r e n c e s 拓1 1 0 6 ，t h ed i f f e r e n c eo f t h e h a p l o t y p e sw a sn o ts i g n i f i c a n t t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fj a p a n e s em a r s hw a r b l e ri nz h a l o n gi s l o w e rt h a ng r e a tr e e dw a r b l e r , w h i c hi sw i d e s p r e a ds p e c i e sa n di nt h es r u l es u b f a m i l yw i t h j a p a n e s em a r s hw a r b l e r t h ev a l u eo f f s tb e t w e e nt h e mi so 0 3 5 3 7 a n dt h eg e n e t i cd i v e r g e n c y b e t w e e ng r o u pi ( 2 0 0 4 ) a n d g r o u p2 ( 2 0 0 5 ) i sn o ts i g n i f i c a n t i nt r a d i t i o n a lc l a s s i f i c a t i o n s y s t e m , j a p a n e s em a r s hw a r b l e rw a sc l a s s i f i e dt o m e g a l u r u sg e n u s ，b u tt h e r ea r ea n o t h e rv i e w p o i n tt h a ti ts h o u l db ec o n s i d e r e dt ob ec l a s s i f i e d t ol o c u s t e l l ag e n u s ，t h i sv i e ww a s s u p p o r t e db ym o r p h o l o g i c a lr e s e a r c ha n dm o l e c u l e s y s t e m a t i c sr e s e a r c h i nt h i sr e s e a e h , c o m p l e t ec y t bo f j a p a n e s em a r s hw a r b l e r ( 1 1 3 4 b p ) w a s s e q u e n c e d ，a n d8 3 5 b po f8k i n d so fb i r d sw e r eu s e dt od i s c u s st h el o c a t i o no fj a p a n e s em a r s h w a r b l e r , a n dt h ep h y l o g e n c t i cr e l a t i o n s h i po fl o c u s t e l l ag e n u s 1 1 1 er e s u l ts u g g e s t dt h a t ： j a p a n e s em a r s hw a r b l e rs h o u l dh ec l a s s i f i e dt ol o c u s t e ag e n u s n 把d i s t a n c ed a t aa n dt r e e - b u i l d i n gr e s u l tb o t hs u p p o r tt h a tp l e s k e sg r a s s h o p p e r - w a r b ( l o c u s t e l l ap l e s k e oa n dr u s t y r u m p e dw a r b l e r ( l o c u s t e l l ac e r t h i o l a ) ，r i v e rw a r b l e r ( l o c u s t e l l a f l u v i a t i l i s ) a n ds a v i sw a r b l e r ( l o c u s t e l l al u s c i n i o i d e s ) h a sc l o s e rr e l a t i o n s h i pt h a nc o m p a r e dw i t ho t h e r s k e y w o r d st j a p a n e s em a r s hw a r b l e r ( m e g a l u r u sp a l u s t r i ss i n e n s i s ) ，w a r b l e r ( l o c u u e h a ) m i t o e h o n d r i a ld n a d - l o o pr e g i o n , c y t o e h r o m eb ，g e n e t i cd i v e r s i t y , m o l e c u l a r p h y l o g e n e t i c h 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特 l , l j j l l 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅韭盎些盘茎或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塞i 堡盎些盘茔有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权苤些盎些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 遁讯地址： 电话： 邮编： l 绪论 1 绪论 斑背大尾莺( m e g a l u r u sp a l u s t r i $ ) 为东亚特有鸟类，其中武汉亚种( m e g a l u r u s p a l u s t r i ss i n e n s i s ) 是我国特有鸟类。仅分布于我国，另一亚种为指名亚种，分布于日 本，两个亚种的种群数量均不丰富，分布区域也很狭窄。斑背大尾莺属濒危物种， i u c n l 9 9 8 世界濒危鸟类红皮书将其列为濒危物种，濒危等级为易危( v u l n e r a b l e ) 。在 我国除少数图鉴类文献中对该种鸟有简要的生态描述外，相关资料非常有限，对该种鸟 的生态学研究国内外也罕见报道。2 0 0 6 年有对武汉亚种的繁殖生态学方面的研究报道 i ”，在分子生物学研究方面，2 0 0 0 年有对该鸟微卫星位点分离的报道 2 1 。 1 1 课题背景 1 。1 1 斑背大尾莺的分布情况 据i u c n 记载：斑背大尾莺主要存在六个繁殖地，其中包括日本的本州岛：青森、 秋田、茨城的辖区内，中国的黑龙江和辽宁，以及俄罗斯的兴凯湖；越冬地主要有日本 的本州岛和四国岛以及中国的长江盆地一带。除此之外，在蒙古东部及韩国也有少量发 现记录，朝鲜发现记录较多，多为迷鸟。该种在我国据记载见于湖北汉口( 冬候鸟) 、 河北秦皇岛( 旅鸟) ，辽宁朝阳地区( 繁殖鸟) 、丹东( 旅鸟) 以及黑龙江省扎龙地区 ( 繁殖鸟) 【3 4 1 ，数量甚稀少 5 - t o l 。郑光美在中国鸟类分类与分布名录( 2 0 0 5 ) 一书 中对该鸟的分布记述为“黑龙江，辽宁，河北，天津，山东。湖北，湖南，江西，上 海”t i l l 。 1 9 9 6 年5 月，在黑龙江省扎龙自然保护区芦苇沼泽生境中采集到斑背大尾莺标本， 确定扎龙自然保护区为该种鸟的新分布地【1 2 】。并发现该种在保护区内种群数量较大，在 当地为繁殖鸟。随后在保护区内对该种鸟进行了初步的生态学研究工作。 2 0 0 4 年4 月下旬6 月上旬有人在辽宁双台河口保护区；吉林向海保护区、莫莫格 保护区；黑龙江扎龙保护区、兴凯湖保护区进行了斑背大尾莺分布调查。结果向海、莫 莫格、兴凯湖保护区没有发现该鸟。在双台河口5 月末6 月初发现该鸟，但没有找到 巢。2 0 0 4 年6 月1 日在扎龙保护区核心区内馒头岗发现斑背大尾莺，并发现鸟巢这 是我国首次发现斑背大尾莺巢【”l 。2 0 0 5 年有报道称上海崇明滩发现有该种鸟分布0 4 1 。 1 1 。2 斑背大尾莺的数量情况 日本早在1 9 7 3 年就开始斑背大尾莺的研究，历时十余年，主要内容为数量和分布调 查i l “，斑背大尾莺在本州岛北部为繁殖鸟，本州岛中南部的太平洋沿岸温暖地区为其越 冬地，栖息生境为河、海沿岸芦苇沼泽1 1 3 1 。数量也十分稀少，年调查数量最少为2 8 只雄 鸟( 1 9 7 3 ) ，最多也不过1 2 2 只雄鸟( 1 9 7 7 ) t t 5 1 ，据估计日本种群的数量大约为1 0 0 0 只 鸟。在我国关于斑背大尾莺的数量调查工作尚没有开展，因此该种鸟在我国的具体数量 东北林业大学硕士学位论文 并不清楚，只知道十分稀少。在扎龙地区，2 0 0 4 年共统计到雄性斑背大尾莺4 7 只， 2 0 0 5 年共统计到雄性斑背大尾莺4 9 只【”，斑背大尾莺大多情况下为一夫一妻制，仅有 少数为一夫多妻，因此推算两个年份在扎龙地区斑背大尾莺的数量也仅有百余只左右， 数量十分稀少。 1 。1 3 斑背大尾莺的繁殖生物学研究 在日本对斑背大尾莺的繁殖情况研究开展得比较早，有研究发现斑背大尾莺在枯芦 苇丛呈镶嵌状布、周围水源充足、植物繁茂的芦苇沼泽中繁殖。该亚种通常繁殖在6 月 下旬至8 月上旬，营巢于海岸沼泽湿地芦苇丛或枯草丛中，多用弯折芦苇或草茎做巢 基，再用枯草茎和草叶编织而成，内垫有细草茎和羽毛。每窝产卵5 6 枚，卵白色、 光滑无斑，大小为l g 5 m i n x l 4 m m 。 在我国，2 0 0 5 年有对斑背大尾莺武汉亚种的繁殖生态学研究，斑背大尾莺的巢在枯 芦苇丛中呈斑块状分布，周围水源充足，植物茂盛，主要巢材为枯芦苇叶，卵乳白色， 钝端有细微浅黄褐色斑点。窝卵数为6 士0 6 3 2 ，孵化期为l i d ，育雏期约为l o d 。每巢雏 鸟数5 士o 7 8 4 。孵化成功率为7 2 2 1 ；每巢出飞雏鸟数2 5 士o 5 7 2 ，出飞率为5 7 4 5 ；繁 殖成功率为4 0 9 1 t 1 1 。 1 1 4 斑背大尾莺的栖息生境及种群现状 斑背大尾鹭的主要栖息于湖泊、河流、海岸、和邻近地区的芦苇和草地，常单独活 动在芦苇丛或草丛中。近年来湿地大量被开垦( 农田、盐田和水产养殖基地等) ，工业 发展所造成的水体污染、水资源减少等导致湿地遭受严重的破坏，使该鸟栖息环境更加 恶化，生境已呈现出明显的片段化，这些因素使斑背大尾莺这一濒危物种的生存受到严 重威胁。 迄今为止，在中国只发现三出斑背大尾莺繁殖地，分别为黑龙江扎龙保护区、辽宁 双胎河口保护区和上海崇明岛保护区，这三个繁殖地在地理上跨度大，形成明显的种群 间隔离。 斑背大尾莺种群目前受到的主要威胁是其繁殖地和越冬场所湿地沼泽的丧失和退 化。日本八郎沟的研究表明，开垦湿地使其失水干燥化，再加上控水工程建设加速了湿 地干燥，是当地斑背大尾莺数量不断下降的主要因素1 1 5 】，另外，其他物种的入侵也是导 致斑背大尾莺数量减少的原因【1 6 】。 1 2 斑背大尾莺遗传多样性研究简介 1 2 1 遗传多样性的概念及意义 广义的遗传多样性是指地球上所有生物携带的遗传信息的总和，是生物多样性的重 要组成部分。各物种的遗传多样性是这一遗传多样性的基本组成单元。因此，遗传多样 性也就是生物的遗传基因的多样性。狭义的遗传多样性是指存在于生物个体内、单个物 种内以及物种之间的基因多样性。此外，遗传多样性可以表现在多个层次上，包括分 l 绪论 子、细胞和个体三个水平上的遗传变异度一个物种的遗传组成决定着它的特点，这包 括它对特定环境的适应性，以及它被人类的可利用性等特点。 遗传多样性是生命进化和适应的基础。种内遗传多样性或变异性越丰富，物种对环 境变化的适应能力也越大。遗传多样性还和物种的活力、繁育有着密切的关系。因此， 一个物种遗传多样性越丰富，其进化的潜力也就越大，或者说遗传多样性为物种的进化 提供了潜在的原料储备。种内遗传多样性的保持也有助于保持物种和整个生态系统的多 样性，或可以减慢由于适应和进化所导致的灭绝过程。遗传的均一性威胁群体或物种的 生存已是显而易见的事实。 对稀有濒危物种种群层次上的保护是保护生物多样性的重要焦点，也是保护生物多 样性最有效的手段之一。而种群的遗传多样性水平与种群的数量大小以及生存能力都有 密切的关系。遗传多样性的保持对于人类还有着直接的经济意义，因为我们还远未知道 哪些物种将来是有用的，许多濒于灭绝的生物，其对人类的潜在价值仍然是个谜。 遗传多样性的丧失，不仅仅是我们可能丧失对生物进化历史进程深入探讨的机会。 而且更重要的是，生物对未来环境适应性将降低并因此导致灭绝，从而人类迸一步发展 所依托的生物资源不复存在。然而，在我国人们又往往忽视了物种遗传多样性的保持对 于保存物种的重要性，单纯从数量上对一个濒危物种进行恢复是不可取的，对其遗传多 样性的保护和恢复才是从根本上缓解濒危压力的有效措施，是保护珍稀物种的重要途 径。 1 2 2 检测遗传多样性的方法 遗传多样性的检测是以遗传标记为基础的，遗传标记( g e n e t i cm a r k e r ) 指可追踪染 色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基 本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗 传标记。遗传标记经历了形态学标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 、细胞学标记 ( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 、生化标记同功酶标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 和分子遗传学标 记( m o l e c u l a rg e n e t i cm a r k e r s ) 等几个阶段，目前应用最为广泛的是分子遗传学标记。 1 2 2 1 形态学标记 形态标记是与目标性状紧密连锁，表型上可识别的等位基因突变体。主要包括肉眼 可见的外部特征，自然界的生物存在着许多非常明显的形态标记，如植物的花色、动物 的毛色等等，这些一直是人类选育新品种的重要标记，也是孟德尔遗传学的重要基础。 利用形态标记，从表型上观察就可选择到与之连锁的目标个体。但由于形态标记数量 少、多态性差、易受环境条件的影响，此外形态标记的获得周期较长，因此形态标记在 检测遗传多样性方面的应用是十分有限的。 1 2 2 2 细胞学标记 细胞学标记即细胞染色体的变异。包括染色体核型( 染色体数目、结构、随体有 无、着丝粒位置等) 和带型( c 带、n 带、g 带等) 的变化。细胞遗传学的研究发现， 东北林业大学硕士学位论文 染色体数目的变化如缺体、单体、三体及结构的变化如缺失、易位、倒位、重复等，常 常引起某些表型性状的变化。因此染色体的变化可作为一种遗传标记，用于测定基因所 在的染色体及位置，或通过染色体代换等遗传操作进行基因定位。由于细胞学标记材料 需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏 感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于检测遗传多 样性的细胞学标记还很少。 1 2 2 3 生化标记 生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的 不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分 析方法是通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。同工 酶标记已被广泛用于建立遗传图谱、种群分析等研究中。 1 2 2 4 分子标记 分子标记指能反映生物个体或种群问基因组中某种差异特征的d n a 片段，它直接反 映基因组d n a 间的差异。与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显的优越性，表 现为：( 1 ) 直接以d n a 的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到， 不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；( 2 ) 数量极多，遍布整个基因组，可检 测座位几乎无限；( 3 ) 多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；( 4 ) 表现 为中性，不影响目标性状的表达；( 5 ) 许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和 杂合体。目前分子标记已广泛用于分子遗传图谱的构建；遗传多样性分析与种质鉴定； 基因定位与图位克隆；分子标记辅助育种选择等许多方面。 分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。第一类是以分子杂交为 核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性标记( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，简称r n j 标记) 、d n a 指纹技术( d n af i n g e rp r i n t i n g ) 、原位杂交( i n s i t uh y b r i d i z a t i o n ) 等；第二类是以聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，简称 p c r 反应) 为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性d n a 标记( r a n d o m a m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s md n a ，简称r a p d 标记) 、简单序列重复标记( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，简称s s r 标记) 或简单序列长度多态性( s i m p l es e q u e n c el e n g t h p o l y m o r p h i s m ，简称s s l p 标记) 、扩展片段长度多态性标记( a m p l i f i e df i a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，简称a f l p 标记) 、序标位( s e q u e n c et a g g e ds i t e s ，简称s t s 标记) 、序 列特征化扩增区域( s e q u e n c ec h f l r a c t c 他da m p l i f i e dr e g i o n ，简称s c a r 标记) 等；第三 类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，简称 s n p 标记) 、表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c e st a g s ，简称e s t 标记) 等。 1 2 3 评价遗传多样性的指标以及统计方法 不同分予标记技术所获得的数据不同，统计方法也相应不同。在群体遗传学运用数 理统计的长期历史中建立了多种模型和参数计算方法。分子标记技术在遗传多样性检测 1 绪论 中的应用，可以获得大量的数据，概括分为序列数据( s e q u e n c ed a t a ) 和离散数据 ( d i s c r e t ec h a r a c t e rd a t a ) 。序列数据是由某些核内编码基因、线粒体编码基因( 如 1 2 s r r n a ，c t y b 基因等) 以及d 1 0 0 p 测序所获得，序列数据统计方法包括核苷酸多样 性( n u c l e o t i d ed i v e r s i t y ，p 或p i ) 、相似指数( i n d e xo fs i m i l a r i t y ，i ) 以及遗传距离 ( g e n e t i cd i s t a n c e ，d ) ；离散数据是由r a p d 、r f l p 、a f l p 或其他分子分析技术的得 到的一系列d n a 图谱。 1 2 4 研究遗传多样性的理论意义及实际应用 从达尔文开始遗传多样性的研究一直是进化理论的基础，群体生物学和进化生物学 的核心。遗传多样性也是孟德尔首创并延续到今天进行遗传分析的基础，包括染色体连 锁图到基因图谱直至全序列分析。用r f l p 和r a p d 快速地绘制出重要作物森林树种的 饱和基因图谱并进行了抗性和产量性状位点的基因定位分于标记大大加快了育种过程， 对病原鉴定、疾病诊断，尤其是遗传病的诊断，作物品种和食品鉴定等一直是遗传多样 性研究的应用领域，遗传多样性的研究也可为濒危物种保护制定繁殖方案。 遗传多样性研究主要包括两方面的任务：一是检测和确定物种或种群内的基因结构 组成、变异及其种间的遗传和进化关系；二是在此基础上建立并发展保护和利用基因资 源的手段和措施。 遗传多样性是保护生物学研究的核心内容之一。不了解种内遗传变异的大小、时空 分布及其与环境条件的关系，我们就无法采取科学有效的措施来保护这些遗传资源，也 就无法对濒危物种进行有效的保护和数量恢复。对濒危动物的保护策略制定依赖于我们 对其遗传多样性的认识。对物种遗传多样性的保护就是对其进化潜力和对环境适应能力 的保护。另外，对遗传多样性的研究有助于人们对生物多样性起源的认识，尤其能加深 人们对微观进化的认识，为动植物的分类、进化研究提供有益的资料。最后，遗传多样 性研究有助于对生物资源的合理开发和利用，研究并利用栽培植物和驯养动物野生近缘 种所含有的遗传变异，尤其是那些与产量、质量、抗性等形状相关的遗传变异是这些动 植物遗传改良成功的关键。所以遗传多样性研究对现代医学和农业生物技术的研究具有 十分重要的实践意义。 虽然近年来出现了有关“遗传因子是否对濒危物种的保护有意义的”的争论旧， 但是事实上物种濒危的因素是多个的，其中环境因子是很重要的一个方面，是导致物种 种群数量减少的直接因素，而遗传变异的降低进一步加剧了物种的濒危状况，遗传变异 与环境因子之间是相互作用的，因此濒危动物的保护对策的制定也必须要将所有的因素 综合考虑。 1 2 5 斑背大尾莺遗传多样性研究概况 遗传多样性研究方面，2 0 0 0 年y a s u y u k i 等人对斑背大尾莺指名亚种的微卫星位点 的研究结果表明斑背大尾莺5 个微卫星位点的h 0 值在o 1 6 o 7 2 之间，遗传多样性水 平较低1 2 j 。这也可能是导致该物种数量下降的一个原因，或者是将促使该物种数量进一 东北林业大学硕士学位论文 步下降的诱因。对于斑背大尾莺线粒体控制区遗传多样性水平的分析目前尚未见报道， 本研究将利用线粒体控制区作为研究对象，对该物种的遗传多样性水平做出评价。 对濒危物种遗传多样性的保护在我国还只集中在少数几个具有特殊价值的物种，例 如大熊猫、金丝猴等，而其他物种的遗传多样性保护在实践中少有考虑，对于雀形目鸟 类的研究与保护工作开展则少之又少，本文试图通过对斑背大尾莺这样的濒危物种的遗 传多样性水平进行分析和评价，以此制定出科学、合理的保护管理措施，为我国其他濒 危动物的保护和研究提供参考，也这是本研究的意义所在。 1 3 斑背大尾莺分子系统学研究简介 分子系统学是以研究生命的普遍性为对象的分子生物学与研究生物多样性的系统学 相结合而出现的一个新的生物学分支，基于在分子水平上建立分子系统树，来探讨动物 的系统进化关系f 1 8 1 。z u c k e r k a n d l 在生物进化历史的档案一文中指出“存在于 每一个生物个体中的d n a 分子都是其进化历史的积累” 1 9 1 。分子系统学是指通过 对生物大分子( 蛋白质、核酸等) 的结构、功能等的进化研究，来阐明生物各类群( 包括 已绝灭的生物类群) 间的谱系发生关系【2 0 】。相对于经典的形态系统分类研究，由于生物大 分子本身就是遗传信息的载体，含有庞大的信息量，且趋同效应弱，因而其结论更具可 比性和客观性。尤为重要的是，一些缺乏形态性状的生物类群( 如微生物和某些低等 动、植物) 中，它几乎成为探讨其系统演化关系的唯一手段。 1 3 1 分子系统学的优点 分子途径来研究进化关系较之经典的形态学和生理学途径有如下优点：( 1 ) d n a 仅由4 种碱基组成，即：腺嘌呤( a ) 、胸腺嘧啶( t ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 。所 有生物，无论是细菌还是动植物种的d n a 都是由这4 种碱基组成。因而，可用他们比 较所有有机体的进化关系。( 2 ) d n a 的进化演变或多或少是有规律的，因而能用数学 模型来描述其变化并可比较亲缘关系较远的生物间的d n a 。形态的进化演变，即使在 一段较短的进化时间也是极其复杂的，形态的系统发育研究所做的种种假设往往令人难 以信服。( 3 ) 所有生物的基因组都是由长长的核苷序列组成，比形态形状包含的系统发 育信息要多得多。因此，分子系统学的研究越来越广泛。 1 3 2 分子系统学存在的问题 系统学有许多研究方法，但检测样本大小是所有方法中都存在的问题，分子系统学 研究取样数较少，一般在l 3 0 之间，样本数过小的结果是无法检测出所有的变异，尤 其是稀有变异。在应用不同地区的同种个体对某一物种进行系统进化的研究时，所取样 本的遗传潜质，或者说它的遗传代表性有多大，能否代表所在地区所有或者大多数个体 经历系统发育进程。对于序列分析来说，存在选取序列长度的问题，如果分析序列的长 度太短，结果易受随机因素的影响。 除取样问题之外，分子系统学还存在许多其它问题。首先，现阶段分子系统学研究 l 绪论 中所应用的蛋白质和d n a 分子进化模型并不能真实地反应分子进化的过程，它们只是 一种理论上的假设，随之而来的取样方法的设计、数据的校正和加权、系统发育分析方 法便都有一定的局限性，使得研究和结果缺乏坚实的基础；其次，由于系统进化过程中 高频发生的碱基插入、缺失、不等交换、转位和复制错位等现象，序列对准和分析中的 位点厨源性确定困难较大；再次。分子系统学研究中只有序列数据和二维结构数据才具 有绝对价值，因为这类数据表现了分子中的所有变异。而其它类型的数据只有相对价值， 因此，分子标记数据要在不同研究之间进行比较，就必须进行样本数量、实验条件、数 据收集和变换的标准化，目前的大多数方法缺少标准化，在一定程度上降低了这类研究 的比较价值和通用意义；最后。d n a 顺序的进化速率是不同的，因此，现有的用恒定 的进化速率估计出的分歧时间与实际情况往往有较大误差。 1 3 3 分子系统学常用的研究方法 分子系统学的研究首先是通过现代分子生物学技术，获得物种特定遗传标记的大量 数据，然后把这些数据进行相关的数学分析而对研究结果进行解释和说明。目前常用的 核酸分析方法有d n a 杂交、串联重复序列数目变异、单链构象多态性、变性梯度凝胶 电泳、限制性片段长度多态性、随机扩增多态性d n a 、测序和克隆。蛋白质分析技术 中常用的方法有：免疫学技术，同工酶电泳、蛋白质电泳、氨基酸分析等。染色体分析 中常用的方法有：核型分析、带型分析、荧光原位杂交、染色体原位隐藏杂交、引物原 位标记、多( 探针) 引物原位标记等，在上述方法中主要以核酸分析为主。特别是近几年 钡4 序技术的推广和普及，自动测序技术的发展，序列分析技术越来越多的地被采用1 2 0 捌。 1 3 3 1 系统( 发育) 树及其构建方法 系统树( p h y l o g e n e f i ct r e e ) 是表达类群( 或序列) 问系统发育关系的一种树状图。 包括有根树( r o o t e dt r e e ) 和无根树( u n r o o t e dt r e e ) 、标度树枝( s c a l e db r a n c h ) 和非标度树 枝( u n s c 面e db r a n c h ) 、基因树( g e n et r e e ) 和物种树( s p e c i e st r e e ) 洲。常用的建树方法 主要包括以下三种： 距离法：距离法包括非加权算术平均组对法( u p g m a ) 、最小二乘法( l s ) 、最小 进化法( m e ) 和邻接法( n j ) 。该方法基于这样一种假设，即只要获得一组同源序列间 的进化距离( 遗传距离) ，那么就可以重建这些序列的进化历史。距离法中以邻接法( n j ) 最为常用。n j 法是由s m t o u 和n e i ( 1 9 8 7 ) 提出，其原理是逐步寻找新的近邻种类( 序 列) ，使最终生成的分子树的遗传距离总长度为最小【2 。该法虽并不检验所有可能的拓 扑结构，但在每阶段诸物种( 序列) 聚合时都要应用最小迸化原理，故丽被认为是m e 的 一种简化方法。由于分析程序大大简化，费时较少。适于分析较大的数据集，目前已成 为距离法分析中最通用的一种方法n j 法不包含速率致的假设，通过采用“校正” 距离矩阵来减少各分支速率的影响，因而系统树的正确与否依赖于校正距离系数的准确 性。当序列较短时，计算仍可能有较大的统计误差。n j 法由于仅限于数据矩阵的统计 东北林业大学硕士学位论文 值，相对于后述的具体位点的分析方法，其最大优势是运算十分简便而快捷。但是该法 的不足之处是由于不考虑各个位点的具体情况而丢失了一些有用的遗传信息，另外，通 过这一方法得出的枝长估算值不具有确定的进化意义 2 6 1 。 简约法：这种方法旨在确定最短的系统树，对该树核苷酸或氨基酸的替代总数应取 最小值。该方法中影响较大的有最大简约法，加权简约法和进化简约法。最大简约法源 于形态学的分支系统学研究，而最早被f i t c h ( 1 9 7 1 ) 用于核苷酸数据研究。它是一种最优 化标准，遵循“奥卡姆剃刀( o c k h a m s r a w r ) 原理，即假设由一祖先位点替换为另一位 点时，发生的替换数目最少的事件为最可能发生的事件【2 刀。最大简约法在原理上与进化 路径的最简约理论一致。应用最大简约法所获得的最简约树中，所有类群的性状状态变 化总数最小，在实际应用中，由于m p 法只考虑所谓的“信息位点”，所得的进化树是 最短的、也是变化最少的进化树例。因而，简约法的“最小核苷酸替换数目”原则也意 味着“异源同型事件( h o m o p l a s t i ee v e n t ) ( 即平行替换、趋同替换、同时替换和回复突变 等) 最少。就序列上的位点来说，它没有明确的假设，无须估计核苷酸替换时所用的各 种数学模型，且当序列间的分化程度较小、序列长度较大且核苷酸替换率较稳定的情况 下，该法能获得更为真实的拓扑结构【勰l 。反之，当序列较短且序列间的进化速率差异较 大或替换形式不同时，异源同型事件出现的概率就大，产生所谓的“长枝吸引”或“短 枝吸引”效应，而得出错误的拓扑结构。另外，由于m p 法需要比较大量的拓扑结构， 当序列数目和长度较大时，运算过程非常耗时。 似然法：以各种假设的进化数学模型对观测结果进行检验，选出具有最大似然函数 的模型构树。该法最早由f e l s e n s t e i n ( 1 9 8 1 ) 提出，其原理是以一个特定的替代模型分析 一组既定的序列数据，使获得的每一个拓扑结构的似然率均为最大，再挑出似然率值最 大的拓扑结构作为最终树。这里所分析的参数是每个拓扑结构的枝长，并对似然率的最 大值来估算枝长。迄今的研究表明，在分类群数目较大、序列长度较长的复杂分析中， m l 法的分析结果优于其它任何方法。但由于该法涉及到全部序列的所有核苷酸位点的 替换数，加之假设的替换模型包含一组可变参数( 如转换，颠换比等) 。所以该法和m p 法 一样，当序列数目和长度较大时，构建m l 树是极其耗时的。同时当序列数目足够大而序 列长度很小时，和m p 法一样，它也容易给出错误的拓扑结构。 1 3 3 2 各种方法比较 构建分子系统树的方法很多，但目前还没有一种方法适合于各种数据或各种条件， 不同的建树方法遵循的原则不同设定的假设条件也不同，例如，在距离法中，u p g m a 法假设所有的分枝中速率相同，而在许多实际情况中这种假设不能成立，特别是序列长 度较短时，该方法构建的系统树更容易造成错误。邻接法没有速率一致的假设，而是采 用校正矩阵，它的准确性依赖于距离系数的准确性，当序列较短时，对距离的估测可能 会有较大的统计误差。最大简约法并没有明确的假设，当序列间分歧度很小时，同型情 形就较少，简约法效果较好。反之，分歧度大时，同型情形很普遍，简约法效果较差。 最大似然法对于进化速率和核苷酸置换形式的假设十分明确，同时对违背假定的情形也 不太敏感，但该方法在计算上较其他方法复杂计算机模拟实验证实：在进化速率恒定 的假设下，最大简约法比邻接法略差，最小进化法和邻接法相近，最大似然法结果的可 靠性依赖于进化模型的选择。在进化速率可变的假设下，最大简约法略差于转换距离法 和邻接法的结果，最大似然法的结果最好。然而，如果转换的频率大大高于颠换时，邻 接法优于似然法。由于分子数据由抽样获得，所以在用某种方法获得系统挝后，还要用重 抽样法来检验校正，常见的方法有折刀法和自助法。总之，在数据处理时最好用多种方 法进行比较，以期获得一致的结果，提高结果的可靠性瞄j 。 1 3 3 3 基因树的检验方法 在获得分子系统树后，需要知道其统计性质以了解该系统树所反映系统发育关系的 可靠性。如果同时对多个基因分析并获得不同的系统树，往往还需要将这些系统树组合 成一致的系统树。 一致性指数与一致树：一致性指数( c o n s i s t e n c yi n d e x ，c i ) 是用于检验数据矩阵与 系统树拓扑结构之间的配合程度的定量指标。一致树在实际研究中有两类：严格一致树 ( s t r i c tc 0 璐e n 吼塔t r e e ) 和多数一致树( m a j o r i t y r u l ec o n s c n s l l st r e e ) 。严格一致树包含所 有系统树中公共的单系类群，而多数一致树的思路类似于股票表决中的“多数原则” 洲。 统计检验：重复取样( r e s a m p l i n gm e t h o d ) 是目前应用最为广泛的一种统计检验工 具，主要包括自展法( b o o t s t r a pm e t h o d ) 和刀切法( j a c k k n i f em e t h o d ) 等。其中自展法 的应用最为普遍，该方法利用对原始数据随机抽样产生的自展数据集获得多个系统树， 然后检验这些系统树对其一致树各分支的支持率。该方法尤其适用于数据分布位置的情 况。 1 3 4 分子系统学研