（食品科学专业论文）韦兰胶生产工艺初探及流变特性研究.pdf

摘要 摘要 韦兰胶( w e l a ng u m ，简称w g ) 是由产碱杆菌a l c a l i g e n e s s p 以碳水化合物 为主要原料，经发酵产生的高分子胞外多糖，具有出色的流变特性，广泛应用 于多种行业。目前只有美国的c p k e l c o 公司拥有韦兰胶产业化技术，国内还未见 韦兰胶产业化报道。为了早日实现我国韦兰胶产品的产业化，本文开展了下述 研究工作。 1 研究韦兰胶的生产条件，主要包括生产菌株，发酵培养基及发酵工艺条 件三方面。通过绘制菌体生长曲线，了解此菌种的生长情况，初步确定二级种 子的培养时间。在此基础上，采用单因素实验探讨了碳源、氮源、m g s 0 4 7 i - 1 2 0 和k 2 h p 0 4 7 h 2 0 对韦兰胶产率和发酵液粘度的影响。初步确定在单因素条件下 最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为酵母膏，m g s 0 4 7 h 2 0 的最佳浓度为3 班左右、 k 2 h p 0 4 7 h 2 0 的最佳浓度为5e , l 左右。然后。应用正交实验进一步研究了碳源、 氮源、无机盐对菌体合成韦兰胶能力的影响。综合单因素实验及正交实验结果， 并参考文献，得出韦兰胶的最佳发酵培养基配方为：蔗糖4 0g ，l 。酵母膏3g ，l ， k 2 h p 0 4 7 h 2 05e , l ，m g s 0 4 7 1 2 02g l ，f e s 0 4 7 h 2 0lp p m ，c a c l 20 5g ，l 韦 兰胶产率由原来的7 。3 1g 兀上升到1 7 2 3 9 几。最佳发酵工艺参数为：接种龄1 8 h 、 接种量0 5 、装液量4 0m l ( 2 5 0m l 摇瓶) 、初始p h7 0 、摇床转速2 2 0r p m 、 培养温度3 0 、培养时间7 2h 在此条件下，韦兰胶产率达2 0 6 4g ，l 2 应用单因素实验和b o x - b e h n k e n 中心组合实验设计方法。对韦兰胶的提 取工艺进行优化，得出最佳提取工艺参数为：乙醇与发酵液的科液比 1 4 0 ，因此韦兰胶的耐温优势以及它的一些独特性能，使它可望成为一种性能 更为优良的驱油制剂。 1 2 2 - 3 水泥和混凝土制品中的应用 韦兰胶可广泛的应用于水泥和混凝土产品中，该生物胶能增强泥浆的保水 性，当它作为保水剂时，不需要像其它添加剂一样使用分散剂，由于它吸水后会 导致粘度增加，粘度的增加补充了水泥固化前的粘度不足，增加水泥的附着性。 水泥凝结过程中流动性较差，水泥颗粒表面会形成一层胶体薄膜，而溶液过饱 和导致析出的结晶和凝胶都会夺去一部分水泥固化所必须的水分。使水泥固化 不充分，生物胶的加入和其中涵蓄的水分正好补充水泥凝结和硬化所需要的水， 使水泥硬化更充分、更快，从而在一定程度上提高水泥强度和混凝土的抗压性。 韦兰胶能够增强混凝土的悬浮能力，低用量的韦兰胶就能达到很好的效果，且 与其它的添加剂有很好的兼容性 6 4 , 6 1 q 。有研究表明【6 6 l 水泥成分中加入水泥干重 量的0 0 1 - 4 ) 9 0 的韦兰胶可以增加水泥的可塑性、悬浮量、空气含量、抗下陷 能力以及流动特性和抗失水性而这些改进的特性在提高温度时仍能保持不变。 i o 第l 章引言 1 2 2 3 日用化学工业中的应用 韦兰胶可广泛的应用于牙膏、洗发水、化妆品等产品中。( 1 ) 韦兰胶是所 有类型牙膏的优良结合剂，其易于水化、优秀的稳定性可生产出稳定均匀的产 品。且其优良的剪切稀化流变行为使牙膏易于从管中挤出和泵送分装。( 2 ) 洗 发水由于易于使用和在头发上易于扩散而被人们广泛接受。但是，当洗发水里 含有小尺寸颗粒活性成分时，这些颗粒的悬浮和沉积就会带来各种问题。这时 如果加入少许韦兰胶就可以改良洗发水的流动性质，悬浮不溶性色素和药用成 分，产生稳定、丰富、细腻的奶油泡沫，而且在广范围p h 值内与表面活性剂及 其他添加剂有协同作用。( 3 ) 对护肤霜和乳液，韦兰胶提供优良的稳定性。韦 兰胶静置时的高黏度有利于个人护理产品中均匀分散油相的稳定，擦用时的剪 切稀化性质则提供了良好的润滑和爽肤作用抗氧化剂抗坏血酸，因为能促进 胶原蛋白合成、预防老化、减少细纹、淡化黑色素常用于护肤类化妆品中，但 是为了把有效成分运送到特定位置必须选用合适的运送体系，这时在o w 的微 乳化体系中加入少量韦兰胶作为增稠剂可以起到很好的效果。韦兰胶还可以作 为遮光剂用于防晒类护肤品中，使皮肤免受紫外线的伤害。另外韦兰胶也可以 作为增稠剂在低p h 值和高电解质存在的条件下用于美白化妆品中。 1 2 2 4 农业中的应用 在农业上韦兰胶用作农药乳浊液的稳定剂和悬浮剂，喷雾时能控制微液滴 的大小和防止漂移，使药物很好地粘附于植物叶面，延长了药物成分与庄稼的 接触时间，并耐雨水冲刷。 1 2 2 5 其他领域中的应用 韦兰胶在医药工业可作为药物生产中乳液和悬浮液的乳化稳定剂，使药剂 均匀一致。韦兰胶应用于印染工业，可作为染料和颜料的悬浮剂、印染控制剂， 控制印染泥浆的流变性质，防止染料的迁移，使图纹清晰，与浆中的多数成分 可以互溶，其自身的洗出特性也卓有成效。因此，韦兰胶广泛地应用于地毯及 丝绸等印染行业中。韦兰胶在低浓度时的流变性能能使瓷釉中的不可溶成分较 长期地悬浮，与瓷釉成分互溶，可防止粉碎性瓷釉成分的成团，并缩短研磨时 间。同时也可控制干燥时间、降低炉温、并相应减少斑点等缺陷，大大改进陶 瓷加工工艺，提高产品质量。 第l 章引言 1 2 3 韦兰胶的生产工艺 韦兰胶的生产包括发酵和提取两部分。生产工艺流程如下： 保藏菌种一斜面活化一摇瓶种子( 或茄瓶培养) 一一级种子扩大培养一二级 种子扩大培养一发酵罐发酵一发酵液一提取一干燥一粉碎一包装一成品。 韦兰胶的发酵主要是以碳氢化合物为原料，碳氢化合物的主要来源有：葡萄 糖、糖( 甘蔗、甜菜、谷物) 、糖蜜、淀粉、谷类的面粉( 稻谷、小麦、燕麦等) 、 豆( 大豆和豌豆) 和米糠等，通常谷物需经水解糖化才能作为原料，并按一定 比例加入磷( k 2 h p 0 4 ) 、镁c m g s 0 4 ) 、氮( n 1 4 埘0 3 ) 等。碳氢化合物的用量一 般是2 4 ，而氮源用量一般是0 0 5 0 4 。适合的氮源主要有酵母水解物、 大豆粉、棉籽粉，干酪素、玉米浆。发酵温度可以是2 5 3 5 ，但最优的温度 一般控制在2 8 3 2 。发酵培养基的p h 控制在6 5 7 5 ，发酵周期一般是2 4 天 6 2 j 。发酵液于7 5 巴氏灭菌l o 1 5 分钟，用5 8 6 0 的异丙醇沉淀提取， 将所得产品于5 0 5 5 烘箱中烘干( 大约l 小时) 6 2 1 ，然后进行粉碎和包装。 1 3 本课题的研究意义及主要研究内容 1 3 1 研究意义 韦兰胶是美国c p k e l c o 公司2 0 世纪8 0 年代继黄原胶、结冷胶开发之后， 又一个积极推广的生物胶品种，有广泛的市场前景。迄今为止，美国的c p k e l c o 公司是韦兰胶全球唯一的生产、供应商。由于产量有限加之市场前景广阔，韦 兰胶的市场价格居高不下，其国际市场价格高达3 0 万t ，但其生产成本却只需 4 万t 。巨大的商业利润使得韦兰胶的生产技术被垄断，有关生产的论文与专利 几乎没有报道，但有关其应用的专利却很多。 国内目前只有南京化工学院在从事这方面的研究，还未见韦兰胶生产的公 开报道。本课题的主要目的就是研究韦兰胶的生产工艺，并对所生产的韦兰胶 成品的流变特性进行研究，为实现韦兰胶的工业化生产及拓宽其应用范围奠定 基础。 1 2 第l 章引言 1 3 2 主要研究内容 针对当前国内外研究现状，本课题主要研究以下内容： ( 1 ) 单因素营养实验，在此基础上，采用正交实验设计对韦兰胶发酵的营 养条件进行选择和优化，确定韦兰胶发酵的最佳营养条件；采用单因素实验法 确定韦兰胶发酵的最佳工艺条件 ( 2 ) 在提取工艺单因素实验基础上，采用响应曲面法确定韦兰胶提取的最 佳工艺参数。 ( 3 ) 通过对韦兰胶水溶液流变学性能的研究，掌握高分子多糖的流体类型， 掌握多糖水溶液对温度、p h 、盐离子浓度的耐受性。 ( 4 ) 通过对韦兰胶与黄原胶共混胶溶液流变性的研究，进一步了解了韦兰 胶与黄原胶共混后的协效性，为拓展微生物代谢胶产品的工业应用范围提供一 定的参考。 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 2 1 前言 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 韦兰胶的产量与生产条件密切相关，因此研究韦兰胶的最佳生产条件是很 有必要的。在查阅了大量文献的基础上，本文主要对韦兰胶生产菌株、发酵培 养基配方及发酵工艺条件三方面进行了研究。首先通过测定菌体生长过程中的 各项指标，得到菌体的生长曲线；其次在采用单因素实验初步确定发酵培养基 成分后，应用正交实验筛选出高效培养基；最后，对发酵工艺条件( 种龄、接 种量、装液量、初始p h ) 与韦兰胶产率的关系也做了一定的研究 2 2 实验部分 2 2 1 实验材料和仪署 表2 i 实验材料 t a b l e2 。1m a t e r i a l so f e x p e r i m e n t 1 4 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 表2 2 实验仪嚣 t a b l e2 2a p p a m l mo f a 中a i 嗍t 2 2 2 曹株 产碱杆菌a l c a l i g e n e s 蜀b ( a t c c 3 1 5 5 5 ) ，由美国菌种保藏中心购得。 2 2 3 培养基 斜面培养基c 8 l ) ：酵母粉3 ，蛋白胨4 ，k c i5 ； 种子培养基( 班) ，葡萄糖1 5 ，蛋白胨7 k c i5 ； 发酵培养基c g l ) ：葡萄糖3 0 ，蛋白胨3 ，c a c l 20 5 ，k 2 1 4 p 0 4 7 h 2 00 3 ， m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ，f e s 0 4 。7 1 - 1 2 0lp p m 。 2 2 4 实验方法 2 2 4 1 菌体生长曲线的绘制 2 5 0m l 带挡板的摇瓶装液量5 0m l ，接种量1 ，培养温度3 0 ，2 2 0r p m 1 5 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 振荡培养。在0 ，5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 ，2 5h 上分别取发酵液样品，测定菌体浓度、 还原糖、总糖含量，绘制生长曲线。 2 2 4 2 发酵培养基的筛选 2 2 4 2 1 单因素实验 本文先采用单因素实验初步确定碳源、氮源和m g s 0 4 、k 2 f i p o 、c a c 0 3 的 用量。 a 最佳碳源的选择 分别采用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木薯淀粉水解液作碳源，以韦兰胶 的胶产率为主要指标、发酵液粘度为参考，考察碳源种类对发酵的影响。 b 最佳氮源的选择 分别采用蛋白胨、玉米浆、酵母膏、n h 4 n 0 3 、( n i - 1 4 ) 2 s o , 、尿素作氮源，以 韦兰胶的胶产率为主要指标、发酵液粘度为参考，考察氮源种类对发酵的影响 c m g s 0 4 7 i - 1 2 0 用量的选择 在浓度o 1 0c a , 的范围内，以韦兰胶的胶产率为主要指标、发酵液粘度为 参考，选出最佳浓度。 d k 2 h p 0 4 7 h 2 0 用量的选择 在浓度o l og l 的范围内，以韦兰胶的胶产率为主要指标、发酵液粘度为 参考，选出最佳浓度。 2 2 4 2 2 正交实验设计 根据单因素实验的结果，确定了营养条件正交实验的几种考察因素及其水 平，采用正交实验设计进一步优化发酵培养基配方以碳源含量( a ) 、氮源含 量( b ) 、k 2 h p 0 4 7 i - 1 2 0 ( c ) 、m g s 0 4 7 h 2 0 ( d ) 含量为发酵因素，每因素选择 3 水平，用b 正交表设计9 组摇瓶发酵实验。表头设计如表2 3 所示： 表2 3 正交实验表头设计 t a b l e2 3o r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n t 1 6 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 2 2 4 3 发酵工艺条件的优化 2 2 4 3 1 种龄及接种量对发酵的影响 以韦兰胶的胶产率为主要指标、发酵液粘度为参考， 发酵的影响。 2 2 4 3 2 培养基装液量对发酵的影响 以韦兰胶的胶产率为主要指标，发酵液粘度为参考， 发酵的影响。 考察种龄及接种量对 考察培养基装液量对 2 2 4 3 3 初始p h 对发酵的影响 以韦兰胶的胶产率为主要指标、发酵液粘度为参考，考察初始p h 对发酵的 影响。 2 2 4 4 培养方法 一级种子培养：2 5 0m l 摇瓶内装5 0m l 种子培养基，接种活化后的斜面两 环，摇床转速2 2 0r p m ，培养温度3 0 ，培养时间2 4 h 。 j 二级种子培养：2 5 0m l 摇瓶内装5 0m l 种子培养基，接种量l ，摇床转速 2 2 0r p m 。培养温度3 0 。培养时间1 5h 。 发酵培养：将培养好的种子液按l 的接种量接入装有5 0m l 发酵培养基的 2 5 0m l 摇瓶中培养，摇床转速2 2 0r p m ，培养温度3 0 ，培养时问7 2h 2 2 4 5 测定方法 。 2 2 4 5 1 发酵液酸度的测定 用p h s 一3 b 精密p h 计进行测定。 2 2 4 5 2 还原糖的测定 ， 原理：在氢氧化钠和苯酚存在下，3 , 5 - 二硝基水杨酸( d n s ) 与还原糖共热 后被还原生成氨基化合物，在过量的n a o h 碱性溶液中此化合物呈桔红色，在 5 4 0 r i m 处有最大的吸收峰，在一定的浓度范围内，还原糖的量与吸光度呈线性 关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 标准曲线的绘制：精确吸取0 ，o 5 ，1 0 。1 5 ，2 0 ，2 5m l 浓度为o 2g l 的葡萄糖标准溶液，定容至2 5m l ，加入2 5m ld n s ，摇匀，煮沸5r a i n 。冷 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 却后，用7 5 2 型分光光度计在5 4 0 衄波长下测吸光度，以糖浓度对吸光度值作 图，得标准曲线。 样品测定：根据样品中还原糖含量，用蒸馏水进行适当的稀释。以蒸馏水为 参比。同样操作测吸光度，根据标准曲线方程和稀释倍数计算还原糖含量。 o0 51i 5 吸光度 圈2 1 总还原糖标准曲线 f i g2 1t h es t a n d a r dc u n o f r e d u c i n gs u g a r 图2 1 所示为还原糖标准曲线，线性方程：y = o 1 3 2 8 x 卜o 0 2 7 ( ) ( 表示吸光度， y 表示还原糖含量) ，拟合度为0 9 9 9 4 。 2 2 4 5 3 总糖的测定 原理：糖在浓硫酸的作用下，脱水生成的糠醛或羟基糠醛能与苯酚缩合成一 种橙色化合物，在1 0 1 0 0p g 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在4 9 0 n m 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。 标准曲线绘制：精确吸取0 0 1 。0 2 ，0 3 ，0 4 ，0 5 ，0 6 ，0 7 ，0 8 ，0 9 ， 1 0m l 浓度为o 1g ，l 的葡萄糖标准溶液，定容至1 0m l ，加入9 苯酚1 0m l 及浓硫酸5 0m l ，摇匀，煮沸5m i l l ，于4 9 0n m 测吸光度，以糖浓度对吸光度 值作图，得标准曲线。 样品糖含量测定：根据样品中总糖含量，进行适当的稀释，以空白为参比。 同样操作测吸光度，根据标准曲线方程和稀释倍数计算糖含量。 图2 2 所示为总糖标准曲线，线性方程：y = o 1 1 8 5 x o 0 0 5 ( x 表示吸光度， y 表示总糖含量) ，拟合度为0 9 9 9 1 。 略 眈 ! 耋 叭 懈 o ，矗v毯餐姆睡睃 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 00 20 40 6 0 8l 吸光度 图2 2 总糖标准曲线 f i s2 2t h es t a n d a r dg r i e v eo f t o t a ls u g f l t 2 2 4 5 4 菌体生长量的测定 菌体浓度标准曲线绘制：取对数生长期菌液( 培养约2 4h ) 适当稀释，4 5 r p m 下离心3 0r a i n ，收集沉淀，经多次洗涤、离心，1 1 0 烘干，依次配制0 0 2 1 o 6 6 7 5g l 浓度的菌液，用蒸馏水作空白，在6 6 0n e l l 下比色，以菌体浓度对光 密度作图，得标准曲线。 样品测定：发酵液适当稀释，以离心除去菌体的稀释液作为空白，测光密度 值，然后查标准曲线，确定菌体浓度。 00 20 40 6 0 8 i1 2 吸光度 图2 3 菌体浓度标准曲线 f i g 2 3t h es t a n d a dc t l l v eo f c e l lc o n c e l l t r f l d o l l 耋| 吣 嘶 懈 耋| o 1，宕)越矮舞砑 们”吆叭。 一1，矗)瑙嫒肇蕾 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 图2 3 所示为菌体浓度的标准曲线，线性方程：y = 0 6 4 4 3 x - - 0 0 3 9 3 ( x 表示 吸光度，y 表示菌体浓度) ，拟合度为0 9 9 7 5 2 2 4 5 5 发酵液粘度测定 以b r o o k f i e l dd v - i i 型粘度计，4 号转子，转速6 0r p m 下进行测量。 2 2 4 5 6 韦兰胶产胶率测定 采用乙醇沉淀法，称取适量发酵液，加入2 倍9 5 7 醇沉淀析出韦兰胶， 过滤，烘干，称重。提取的韦兰胶质量与发酵液体积之比即产胶率。 2 3 结果与讨论 2 3 1 曹体生长曲线 菌体生长曲线如图2 4 所示，菌种在经过1 0h 的延滞期后到达对数生长期。 1 5h 后菌体生长较为稳定，2 0h 后菌体生长进入衰退期。最佳种龄一般处于对 数生长期的末期，由此我们可以预测最佳的种龄( 即二级种子培养时间) 应该 在1 5h 左右 葛 v 剖 爱 器 o51 5笛加 时间( h ) 圈2 4 菌体生长曲线 f i g2 4c n o w t hp a n mo f a t c a n g e n e si ns e e d 皿e d 柚啊 2 0 3 2 5 2 吉 1 5 8 l 们 0 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 总糖与还原糖的变化趋势与菌体的生长趋势保持一致。在菌体生长的延滞 期，总糖与还原糖浓度基本无变化，进入对数生长期后，总糖与还原糖浓度都 有明显的下降但总体而言，在整个菌体生长的过程中耗糖量不大，糖含量不 是菌体生长的主要限制性因素。 2 3 2 发酵培养基的筛选 2 3 2 1 单因素实验 a 最佳碳源的选择 分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木薯淀粉水解液作碳源进行摇瓶发 酵实验，考察不同的碳源对韦兰胶合成的影响。如图2 5 所示，a t c c 3 1 5 5 5 在 以蔗糖为碳源时发酵液的粘度与胶产率均最高，以葡萄糖或木薯淀粉水解液为 碳源也可获得较高的胶产率，但发酵液粘度明显偏低。而在以可溶性淀粉为碳 源时，a t c c 3 1 5 5 5 几乎不产胶，发酵液粘度和产胶率均为零。淀粉是一种高分 子的多糖，由3 0 0 到1 0 0 0 个单位的葡糖基所组成，因此很难被菌种利用。可能 需要酶将高分子淀粉分解成葡萄糖，才能被菌体所利用。实验结果表明蔗糖为 最佳碳源。 冒蕾蔗糖可碧性淀粉术薯淀粉水解液 图2 5 不同碳源摇瓶发酵实验结果 f i g2 5w e l a ng u mp r o d u , c t i o na | l dv i 靶o s i l yw i t hd i f f e r e n tu u b o ns 呲嚣 2 i 鲫 姗 椭 姗 抛 啪 。 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 b 最佳氮源的选择 氮源的种类及浓度不仅对菌体生长有很大的影响，对发酵产物的合成也意 义重大嘲。分别采用蛋白胨、玉米浆、酵母膏、n h n 伤、( n i - h ) 2 s 0 4 、尿素作 氮源，考察其对胶产率和发酵液粘度的影响。如图2 6 所示，a t c c 3 1 5 5 5 在以 酵母膏为氮源时，发酵液的粘度和胶产率均为最高。以蛋白胨或玉米浆为氮源 也可获得较高的胶产率，但发酵液粘度明显偏低。以无机氮为氮源比以有机氮 为氮源效果要差的多，这可能是由于有机氮富含发酵所需要的各种氨基酸和维 生素。实验结果表明酵母膏为最佳的氮源。 2 0 0 0 ， 蛋白胨玉米装尊母青n i - 1 4 n 0 3 ( n 哪) 2 $ 0 4 l 盹 图2 6 不i 司氮源摇瓶发酵实验结果 f i g2 6w e l a ng u mp r o d u c t i 彻a n dv l , s i t yw i t hd i f f e r e n tn i t r o g e n9 叭淄 c m g s 0 4 7 h 2 0 用量的选择 镁是许多重要酶( 如己糖磷酸化酶、柠橡酸脱氢酶、羧化酶等) 的激活荆。 镁离子不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成。因此考察m g s 0 4 7 h 2 0 对 韦兰胶合成的影响，在o l og l 的范围内，以韦兰胶产率为主要指标，发酵液 粘度为参考，选出最佳浓度。实验结果表明m g s 0 4 7 h 2 0 浓度为3g l 左右时最 佳。 啪枷枷枷啪 啪啪枷抛。 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 硫酸镁浓度( g ，l ) 图2 7 硫酸镁浓度对摇瓶发酵实验的影响 f j g2 7e f f e c to f l v 蟾s o + 7 - 1 2 00 1 1w c | a ng 岫p r o d u c t i o na n dv i 时 d k 2 肿o 7 h 2 0 用量的选择 磷是核酸和蛋白质等重要细胞物质的组成成分，也是重要的能量传递者一 三磷酸腺苷( a r p ) 的成分在代谢途径的调节方面，磷也起着非常重要的作用 磷有利于糖代谢的进行，因此它能促进微生物的生长繁殖。但磷过量时，许多 产物的合成常受到抑制。因此k 2 i - i p o + 7 i - 1 2 0 用量的选择显得非常必要，在o 1 0g ，l 的范围内，以韦兰胶产率为主要指标，发酵液粘度为参考，选出最佳浓度。 实验结果表明k 2 h p o + 锂r 1 2 0 浓度为5g 兀左右时最佳。 1 9 1 6 1 4 i 加0 1 0 0 0 8 0 0 墓 6 4 0 0 2 i 吣 0 02468 1 0 1 2 醇酸氢二钾浓度( 帅 圈2 8 磷酸氢二钾浓度对摇瓶发酵实验的影响 f i s 2 8 e f f e c t o f i q h p o + 7 1 - 1 2 1 0 0 n w e l a n 娶m p r o d u c t i o n a n d “k 嘶 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 2 3 2 2 韦兰胶发酵营养条件的正交优化实验 根据以上单因素实验的研究结果，确定了营养条件正交实验的几种考察因 素及水平，采用t 4 3 4 ) i t 交表进行实验，结果见表2 4 。 表2 4 正交实验设计表及结果 t a b l e 2 4 t h e 【“3 ) o r l h o g o n a la r r a ya p p l i e d f o r w e l a n p r l u c t i o n b y d l c a l l g e n e a a t c c 3 1 5 5 5 ( a ) 蔗糖0 3 ) 酵母膏 ( c ) k 2 h p o , 7 1 - 1 a ) ( d ) m g s 0 4 7 1 4 2 0 胶产率 实验号( g l )( 叽)( 班) ( g ，l )( 叽) l2 01427 9 3 22 0 3 531 3 9 2 32 0564 1 0 4 8 44 0 、l5，41 2 3 6 5 4 0 3621 6 5 4 64 054 3 1 2 1 8 76 0l638 6 9 83 441 3 5 4 96 05521 2 2 7 k 1l o 7 7 79 6 6 01 1 2 1 71 2 2 4 7 k 21 3 6 9 31 4 6 6 71 2 8 5 0li 5 9 7 k 31 1 5 0 01 1 6 4 31 1 9 0 31 2 1 2 7 r2 9 1 65 0 0 7i 6 3 30 6 5 0 a = = o 0 5 由极差和方差分析可知，影响韦兰胶产胶率各因素的主次关系为：酵母膏 蔗糖 k 2 i - i p 0 4 7 h 2 0 m g s 0 4 7 h 2 0 。由方差分析可知，蔗糖和酵母膏都具有 显著性。最佳培养基配方为a 2 8 2 c 2 d i ，即蔗糖4 0 9 l ，酵母膏3e , l ，k 2 i - i p 0 4 7 1 - 1 2 0 5g ，l ，m g s 0 4 a - 1 2 02g ，l ，f e s 0 4 7 h 2 0l p p m ，c a c l 20 5e , l 按上述条件进行 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 验证实验，结果得韦兰胶产率为1 7 2 3g l ，超过正交实验最大值。方法可行 2 3 3 发酵工艺条件的优化 2 - 3 3 1 种龄及接种量的选择 种龄是指种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养 时间。在种子罐中，随着培养时间的延长，菌体量增加，基质消耗和代谢产物 不断积累，菌体量不再增加，逐渐老化。因此。选择适当的种龄是一个至关重 要的因素。接种龄一般以菌体处于生长旺盛期，即对数生长期最合适。如果种 子过于年幼，接入发酵罐后，会出现前期生长缓慢，整个发酵周期拉长，产物 开始形成的时间推迟，而过老的种子也会出现使生产能力下降而使菌体自溶的 现象。 接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例。接 种量大小取决于生产菌的生长繁殖速度。大接种量可以缩短发酵罐中菌体数达 到高峰的时间，可以提早形成产物。这是因为种子液中含有胞外水解酶类，种 子量大，酶量也多，有利于对基质的作用和利用，同时菌体量多，占有绝对生 长优势，可以相对减少杂菌的污染生长机会。但接种量太大，也会造成菌体生 长过速，溶氧跟不上，从而影响产物的合成因此，选择适当的接种量对发酵 也是非常重要的。 本实验将种龄控制在1 2 2 4h ，接种量控制在0 5 4 的范围内，综合考 虑对胶产率和发酵液粘度的影响，结果如表所示，最佳种龄为1 8h ，最佳接种 量为0 5 。综合表2 6 与图2 4 的结果可知，种龄处于菌体对数生长期末期最有 利于发酵生产；当种龄超过稳定期，进入衰退期后，韦兰胶的生物合成量明显 下降。 表2 6 种龄对发酵的影响 t a b l e2 6e f f e c to f a g eo f i n o c u l m n0 1 1f e r m e n t a t i o n 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 表2 7 接种量对发酵的影响 t 曲l e2 7e 胁o f s i z eo f i n o c u l u mo i lf e r m e n t a t i o n 2 3 3 2 培养基装液量的选择 氧是需氧微生物生长所必需的，在有氧发酵过程中，氧参与菌体的生长， 产物的形成和维持细胞代谢。在发酵过程中有许多的限制因素，而溶氧往往最 易成为控制因素，这是因为氧在水中的溶解度很低，在2 8 时发酵液中的饱和 氧浓度只有7m g ，l 左右。在对数生长期即使发酵液中的氧浓度达到饱和，若此 时终止供氧，发酵液中的溶氧可在几分钟之内全部耗尽，使溶氧成为控制因素。 发酵过程中常通过固定装液量来控制溶氧本实验将装液量控制在2 0 1 0 0m l ( 2 5 0m l 摇瓶) 之间，综合考虑对胶产率和发酵液粘度的影响，结果如图2 9 所示，最佳装液量为4 0m l 喜 茬 蝥 o舶l 装液量 图2 9 培养基装液量对发酵的影响 f i g 2 9e f f e c to f w o r k i n gv o l u m eo nf e r m e n t a t i o n 瑙 撂 淼黧淼萋 淼嚣器裟鬈。 o 8 6 4 2 o 8 6 4 2 o 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 2 3 3 3 初始p h 的选择 ， 发酵环境的p x 对微生物生长和产物合成具有明显的影响：( 1 ) 影响酶的活 性，当环境p h 抑制菌体某些酶的活性时，就会阻碍菌体的新陈代谢；( 2 ) 影响 微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质 的吸收和代谢产物的分泌；( 3 ) 影响培养基中某些组分的解离，进而影响微生 物对这些组分的吸收；( 4 ) p h 不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产 物的质量和比例发生改变培养基中营养物质的代谢，是引起p h 变化的主要原 因。p h 不当，可能严重影响菌体的生长和产物的合成。本实验将初始p h 控制 在5 9 之间，综合考虑对胶产率和发酵液粘度的影响，结果如图2 1 0 所示，最 佳p h 为7 ，这与之前报道的其它的一些微生物多糖的初始p h 一致1 1 4 ，6 例。 2 5 2 0 商1 5 甜 叁m 5 0 2 4 本章小结 45 67891 0 p h 图2 1 0 初始p h 对发酵的影响 f i g2 1 0e f f e c to f p x0 1 1f e r m e n t a t i o n 吾 毯 舞 一 ( 1 ) 菌体生长曲线表明菌种在经过1 0h 的延滞期后到达对数生长期。1 5h 后菌 体生长较为稳定，2 0h 后菌体生长进入衰退期。最佳种龄( 即二级种子培养时 间) 应为1 5h 左右。总糖与还原糖的变化趋势与菌体的生长趋势基本保持一致， 且糖含量不是菌体生长的主要限制因素。 ( 2 ) 韦兰胶发酵生产单因素营养条件的研究表明：碳源种类与氮源种类对韦兰 篇嚣舢蛋毫裟。 第2 章韦兰胶发酵工艺的优化 胶的生产有明显的影响，蔗糖为最佳碳源，酵母膏为最佳氮源；m g s 0 4 7 i 1 2 0 浓 度在3g l 左右，k 2 h p 0 4 7 1 4 2 0 浓度5g ，i 。左右时最有利于产物的积累。在单因 。素实验研究的基础上对营养条件进行4 因素3 水平的正交设计实验，通过分析 揭示培养基4 种成分对发酵水平的影响程度：酵母膏 蔗糖 k 2 h p o , , 7 1 - 1 2 0 m g s 0 4 - 7 h 2 0 。预测最优的营养条件的组合为：a 2 8 2 c 2 d i ，即蔗糖4 0g l ，酵母 膏3 班，k 2 h p 0 4 。7 h 2 05g l ，m g s 0 4 7 h 2 02g l ，f e s 0 4 7 h 2 0l p p m ，c a c l 20 5 g ，l 。按上述条件进行验证实验，结果得韦兰胶产率为1 7 2 3g l ( 3 ) 通过对发酵工艺条件的研究，得到最佳发酵工艺条件组合：接种龄1 8h 、 接种量0 5 、装液量4 0m l ( 2 5 0m l 摇瓶) 、初始口h7 0 、摇床转速2 2 0r p m 、 培养温度3 0 、培养时间7 2h 。在此条件下，韦兰胶产率高达2 0 6 4g ，l 。 第4 章韦兰胶流变特性的研究 3 1 前言 第3 章韦兰胶提取工艺的研究 韦兰胶发酵液中除含有韦兰胶外，还有菌体细胞、未消耗完的碳水化合物、 无机盐及大量的液体。如果大量杂质混杂在韦兰胶成品中会造成产品的色泽差、 味臭、品质低劣，从而限制了韦兰胶的使用范围。由于韦兰胶发酵液粘度大， 给韦兰胶的分离提取带来较大困难，导致提取费用占生产成本的主要部分。因 此对提取方法加以研究以降低韦兰胶的生产成本是很有意义的。 醇沉淀法是目前生产微生物代谢胶最常用的提取方法，其优点是醇容易蒸 发除去。不会残留在成品中。而且醇密度低、与沉淀物密度差别大，便于离心 分离，产品回收率较高常用的醇有甲醇、乙醇和异丙醇。醇与发酵液充分混 合，当含酵6 0 7 0 后形成絮状沉淀，过滤后烘干粉碎得产品。这种方法制得 的产品部分地洗脱了发酵液中的色素、盐类和细胞，所以质量很好，国内乙醇 原料来源广、价格相对较低故多采用乙醇沉淀法。 为了提高韦兰胶的提取收率，深入研究乙醇与发酵液的料液比( v v ) 、乙 醇浓度、提取温度、提取时问的影响。本文在单因素实验以及全因子中心组合 设计基础上，借助实验设计软件d e s i g ne x p e r t ( v e r s i o n6 使5 ) ，采用b o x - b c h n k e n 响应曲面法对上述4 个关键因子进行了较深入的研究。传统的单变量优化实验不 考虑各因子之间交互作用的不足，虽然全因子实验( f u l lf a c t o r i a ld e s i g n ) 可以解决 这一问题，但费时费力f f o l 。而响应曲面实验设计不仅可以建立连续变量曲面模 型 7 1 , 7 2 1 ，对影响提取过程的因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围1 7 3 ， 而且所需的实验组数相对较少，可节省人力物力州，为工业分离提纯韦兰胶提 供参考。 第4 章韦兰胶漉变特性的研究 电热恒温干燥箱 分析天平 超级恒温水槽 多功能搅拌器 d g f - 3 0 a r i l 4 0 型 d k b 5 0 1 a 型 5 型 粘度计dvii+pro 南京实验仪器厂 美特勒一托利多基团奥豪 斯品牌 上海信森实验仪器有限公司 江苏省金坛市荣华仪器制造 有限公司 b r 0 0 k f i e l d 3 2 2 实验方法 3 2 2 1 单因素实验 在乙醇提取韦兰胶的工艺研究中，基于文献报道，乙醇与发酵液的料液比 ( v v ) 、乙醇浓度、提取时间、提取温度四个因素对韦兰胶提取收率的影响较大， 通过单因素实验确定它们作用的合适范围，为之后的b o x - b e h n k e n 响应曲面法 实验优化提供数据。本文中涉及的“提取收率”定义为每升发酵液中提取出的 胶质量 3 2 2 2b e x - l k h n k u 响应曲面法实验 本文采用b o x - b e h n k e n 模型对影响韦兰胶提取收率的参数进行最佳水平研 第4 章韦兰胶流变特性的研究 究和探索。所用软件为d e s i g n e x p e r t ( v e r s i o n 6 0 5 ) ，评价指标( 响应值) 为 韦兰胶的提取收率。考察因子( 自变量) 为乙醇与韦兰胶发酵液的料液比( v v ) 、 乙醇浓度、提取温度、提取时间，分别以x l 、。x 2 、x 3 和x 4 代表之，每一自变量 的低，中、高实验水平分别以1 、0 、l 进行编码。 表3 3 实验因素水平及编码 t a b l e3 3l e v e l sa n df a c t o r s 3 3 结果与讨论 3 3 1 单因素实验 3 3 1 1 科液比( 乙醇发酵液) 的影响 固定乙醇浓度为9 5 ，提取温度3 0 ，提取时间2 h ，料液比设定在0 5 ： i 4 ：l ，研究料液比对韦兰胶产率的影响，结果如表3 a 所示料液比为2 ：l 时，韦兰胶产率基本达到最高水平，再增大料液比对韦兰胶产率影响不大从 实验结果和经济性考虑，料液比为2 ：l 左右时最佳 表3 4 料液比对韦兰胶提取收率的影响 t a b l e 3 。 料液比 韦兰胶提取收率( g l ) 0 5 ：l l ：1 2 ：l 3 ：l 4 ：l 无法形成絮状沉淀 无法形成絮状沉淀 1 9 7 l 1 9 7 4 1 9 6 8 3 l 第4 章韦兰胶流变特性的研究 3 3 1 2 乙醇浓度的影响 在料液比为2 ：1 ，提取温度3 0 ，提取时间2 h 的条件下，考察乙醇浓度 对韦兰胶提取收率的影响，结果如图3 1 所示。结果表明，随着乙醇浓度的增加， 韦兰胶的提取收率也逐渐增加。在乙醇浓度低于9 0 时，韦兰胶提取收率提高 的比较明显，以后增加趋于平缓。实验表明。乙醇浓度在9 0 左右最佳。 吉 v 鼍 善 备 取 鳘 ；it l 棒 乙醇浓度 图3 1 乙醇浓度对韦兰胶提取收率的影响 f 蟾3 1e f f e c t so f t h e c o n c e n t r a t i o no f e t h a n o lo nw g 能呲d r a t e 3 3 1 3 提取温度的影响 在料液比为2 ：l ，乙醇浓度9 5 * , ，提取时间2h 的条件下考察提取温度 对韦兰胶提取收率的影响。结果如图3 2 所示。结果表明，随着提取温度的提高， 韦兰胶提取收率增加，但温度过高提取收率下降。实验表明，提取温度在7 0 左右最佳。这可能是由于随着温度的升高，乙醇能更好的渗入发酵液中使多糖 沉淀出来，而随着温度的升高，短链多糖分子在醇溶液中的溶解度增加，多糖 的提取收率下降，这样就存在一个平衡点使韦兰胶多糖的提取收率达到最高。 第4 章韦兰腔流变特性的研究 2 5 喜加 篓1 5 霾加 犁5 o 舶舯1 0 0 温度( ) 图3 2 提取温度对韦兰胶提取收率的影响 f i g3 2e f f e c t so f t h et e m p e n t m o l lw g 由翟响mr a t e 3 3 1 4 提取时间的影响 在料液比为2 ：l ，乙醇浓度9 5 ，提取温度7 0 的条件下，考察提取时间 对韦兰胶提取收率的影响，结果如图3 3 所示。结果表明随着提取时间的延长， 韦兰胶的提取收率也逐渐增加。在时间低于2h 时，韦兰胶提取收率提高比较明 显，之后基本保持不变。这可能是由于时间过短乙醇与发酵液分子问作用还不 充分，但时问过长。又会引起产物结构的变化进而使提取收率降低。从实验结 果和经济性考虑，提取时间2h 为宜。 oi 2 3 4 5 提取时问( h ) 图3 3 提取时间对韦兰胶提取收率的影响 f 培3 3e f f e c t s o f t h e t i m e o n w g e 删o n t a r e 3 3 第4 章韦兰胶流变特性的研究 3 3 2b o x - b e h n k e n 响应曲面法实验 3 3 2 1 模型的建立 一 表3 5b o x - b e h n k e n 设计以及韦兰胶提取收率的实测值及预测值 t a b l e3 5e x p e d m e n t a la n dp r e d i c t i v ev a l u e so f w e l a ng u me 瞻a c t i o nr a t eb a s e do i l b o x - b e h n k e nd e s i g n 第4 章韦兰胶流变特性的研究 实验设计及结果见表3 5 ，利用d e s i g ne x p e r t 软件对表3 5 数据进行二次多 元回归拟合，分别获得了韦兰胶提取收率预测值y 对编码自变量料液比、乙醇 浓度、提取温度和提取时间的二次多项回归方程： y = 2 3 0 6 + 2 2 6 a + 0 1 3 b + 0 1 2 c + 0 2 0 d - 2 1 3 a 2 - 0 1 2 8 2 1 3 6 c 2 0 2 6 1 ) 2 + 0 1l a b - 0 0 9 3 a c + 0 0 5 2 a d 加们5 b c + 5 0 0 0 x 1 0 3 b d + 0 0 2 8 c d 从该模型的方差分析( 表3 6 ) 可见，本实验所选的二次多项模型具有高度 的显著性( p 鲥 f n m m1 3 1 t o f s q u a r e s i 砷印p t 2 3 0 60 0 9 2一一一一 a 料液比 2 2 6 0 0 5 96 1 5 66 1 5 61 4 6 0 6 9 0 0 0 0 1 b 乙醇浓度0 1 3 0 0 5 90 2 00 2 04 8 1 0 0 4 5 6 c 提取温度0 1 2 0 0 5 90 1 60 1 6 3 8 80 0 6 9 1 d 提取时同0 2 00 0 5 90 4 60 4 61 0 8 3 0 0 0 5 4 a 2 - 2 1 3o 0 8 12 9 4 22 9 4 26 9 7 9 7 0 0 0 0 1 b 2 0 1 2o 0 8 10 0 9 70 0 9 72 2 9o 1 5 2 1 c 2 1 3 60 0 8 11 2 0 31 2 0 32 8 5 5 3 2 的增效作用，这就是多糖 之间相互作用的结果。利用这种相互作用可以拓宽多糖产品的应用范围，也有 利于认识许多生命现象本文主要研究韦兰胶与黄原胶共混后的协效性以及制 备温度及静止放置时间对它表观粘度的影响。并且考察了温度、p h 、n a c l 、柠 檬酸对混胶溶液的影响为拓展微生物代谢胶产品的工业应用范围提供一定的 参考。 5 2 实验部分 5 2 1 实验材料和仪叠 第5 章韦兰胶与黄原胶的复配研究 精密p h 计 分析天平 超级恒温水槽 多功能搅拌器 粘度计 变频滚子加热炉 p l s - 3 b a