（细胞生物学专业论文）鲤鱼（cyprinus+carpio+l）肠粘液细胞对血清igm转运机制的初步研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 独创声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：苏稿淼 黜字：杪，叼忉搬 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂 圭奠可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：萌稿投 导师签字： 伊伺涨 签字f j 期：2 0 0 亨年芎月2 7 日签字同期：2 0 0 5 年等月却同 山东师范大学硕士学位论文 摘要 本研究以我国常见的鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i ol ) 为材料，首先纯化鲤鱼血清i g m ， 然后利用纯化的鲤鱼血清i g m 制备亲和层析柱，获得鲤鱼肠上皮细胞膜i g m 受体分 子( 简称f p i g r ) ，再以f p l g r 为抗原制备豚鼠抗血清( 简称a n t i f p i g r ) ，利用免 疫荧光标记技术对该i g m 受体分子的分布进行观察和分析。 采用s e p h a d e x g - 2 0 0 凝胶层析和m b p 亲和层析方法分离纯化鲤鱼血清i g m ，分 子量约8 8 5 k d a 。利用s d s p a g e 和h p l c 对其进行初步分析，结果表明，血清i g m 可以解离形成重链和轻链，分子量分别是8 2 k d a 和2 9 k d a 。 利用凝胶层析纯化的鲤鱼血清i 谢制备亲和层析柱，获得了鲤鱼肠上皮细胞膜 i g m 受体f p i g r ，s d s p a g e 和h p l c 检测结果表明，该受体分子的分子量为4 3 k d a ， h p l c 检测呈现一个主峰。将纯化的f p i g r 与血清i 酬过夜孵育后再进行h p l c 检测， 结果表明。纯化的肠上皮细胞膜i 酬受体f p i g r 仍具有与血清i g m 结合的能力。 利用不同的荧光标记物对鲤鱼肠组织和脾脏淋巴细胞进行免疫荧光标记。 对肠组织的标记分为三个部分。首先，利用f i t c 标记鲤鱼血清l g m ( 简称f i t c i g m ) ，观察发现，鲤鱼肠组织中含有较多粘液细胞的上皮细胞层具有对其血清 i g m 的结合性，此外，粘膜固有层也具有部分结合性；其次，利用亲和纯化的晕i g r 免疫豚鼠制备抗血清a n t i - f p i g r ，二抗采用f i t c 标记的羊抗豚鼠全分子抗体进行间 接免疫荧光标记。结果表明，鲤鱼肠组织中具有该受体分子f p l g r ，且其分布与鲤 鱼肠粘液细胞的分布一致：再次，利用a n t i f p l g r 封闭鲤鱼肠组织后，再进行f i t c i g m 标记，结果表明，封闭后的肠组织对i g m 的结合能力大大降低。综合上述 结果可知，在肠组织中参与i g m 结合的主要为f p i g r ，此外，在肠组织粘膜固有层 也有部分染色，可能是其中含有的弥散的淋巴组织造成的，它们能结合i g m ，并且 其结合方式可能与淋巴细胞相似。 对鲤鱼脾脏淋巴细胞的标记分为两个部分。第一，只t c i g m 标记显示，鲤鱼 脾脏淋巴细胞能结合培m ，而红细胞则不行；第二，a n t i f p i g r 及其荧光标记二抗 对鲤鱼脾脏淋巴细胞进行标记，结果表明，脾脏中的淋巴细胞和红细胞均不能被染 色，说明由亲和纯化得到的鲤鱼肠上皮细胞膜上f p i g r 并不存在于脾脏淋巴细胞表 面。脾脏细胞的上述标记结果表明，鲤鱼脾脏淋巴细胞表面参与i 叠m 结合的不是 f p 培r 。 综上所述，纯化得到的i g m 受体分子f p i g r 只存在于鲤鱼肠上皮细胞，不同于 脾脏淋巴细胞表面的i g m 受体分子。 本研究通过亲和层析方法获得的鲤鱼肠上皮细胞膜i g m 受体分子在鲤鱼的粘 液性免疫球蛋白转运中可能起着关键作用，对其展开深入研究对了解鱼类粘液性免 山东师范大学硕士学位论文 疫球蛋白的来源和粘液免疫机制具有重要的意义。 关键词：鲤囱_ _ ( c y p r i n u sc a r p i o l ) ，粘液细胞，多聚免疫球蛋白受体 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t s e r u mi g mw a sp u r i f i e df r o mc o m m o nc a r p ( c y p r i n u sc a r p i ol ) a n dt h e nt h e i g mw a su s e dt om a k e aa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yt op u r i f yt h el g mr e c e p t o ro ni n t e s t i n e e p i t h e l i a lc e l lm e m b r a n eo fc o m m o nc a r p ( f p i g r ) ，i m m u n i z et h eg u i n e ap i gw i t hf p i g r a n dt h e no b s e r v et h ed i s t r i b u t i o no fi t s e r u mi m m u n o 出o b u l i n ( i g ) f r o mc o r n m o nc a r p ( c y p r i n u sc a r p i ol ) w a s p u r i f i e db yu s i n ga m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o nf o l l o w e db ys e p h a d e x g 一2 0 0s i z e e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p ha n dm b pa f f i n i t yp u r i f i c a t i o n 。t h em o l e c u l en ! a s so ft h e w h o l ei g mw a s8 8 5 k d a s e r u mi g mw a sa s s e s s e d b ys o d i u md o d e c y ls u l p h a t e p o l y c a r y l a m i d eg e ld e e t x o p h o r e s i s ( s d s - p a g e ) a n dh p l c t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h es e m ii g m 啪b es e p a r a t e di n t ot w os u b u n i t s ：t h eh e a v yc h a i na n dt h el i g h tc h a i n ， w i t ht h em o l e c i l l a rm a s s e sw e r e8 2 k d aa n d2 9 k d a ，r e s p e c t i v e l y t h ei gp u r i f i e db ys e p h a d e x g 一2 0 0w a su s e dt om a k eac h r o m a t o g r a p h yf o r a f f i n i t yp u r i f i c a t i o no ft h er e c e p t o ro ni n t e s t i n ee p i t h e l i a lc e l lm e m b r a n e ( f p l g r ) s d s p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rm a s so ft h er e c e p t o rw a s4 3 k d a a n d t h e nt h ef p l g ra n dt h em i x t u r eo ff 0 1 9 ra n di g mw e r ea n a l y s e db yh p l c t h er e s u l t s s h o w e dt h a tf p l g rb i n d e di g m t h ei n t e s t i n et i s s u ea n dl y m p h o c ”ei n s p l e e n w e r ef l u o r e s c e n c el a b e l e d d i f f e r e n t l y f i r s t l y , t h ei n t e s t i n et i s s u ew a sf h l o r e s c e n c el a b e l e db yf i t c i g m ，t h ee p i t h e l i a l m u c o s a lc e l lb i n d e ds e r u mi g ma n da tt h es a m et r i n e ，t h el a m i n ap r o p r i am u c o s a ew a s a l s ol a b e l e d s e c o n d l y , f p l g rp u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yw a su s e dt op r e p a r e g u i n e ap i ga n t i s e r a ( a n t i - f p i g r ) a n dt h e nu s e dt ol a b e lt h ei n t e s t i n et i s s u ei n d i r e c t l y , t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i s t r i b u t i o no ff p l g rw a sa c c o r d a n c ew i t hm u c o s a lc e l t l a s t l y , t h ei n t e s t i n et i s s u ew a sb l o c k e db ya n t i - f p l g ra n dt h e nw a sl a b e l e db yf i t c - i g m ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h eb i n d i n go fi g ma n di n t e s t i n et i s s u ew a sd e c r e a s e do b v i o u s l y s u mu p a l la b o v e ，t h ef p i g rm i g h tb et h ek e ym o l e c u l ep a r t i c i p a t i n gi nt h eb i n d i n go fi n t e s t i n e t i s s u ea n di g m ，m o r e o v e rt h el a m i n ap r o p r i am u c o s a eo fi n t e s t i n et i s s u ew a sl a b e l e d a t t r i b u t i n g 幻t h ed i s p e r s e dl y m p ht i s s u e t h el y m p h o c y t e si ns p l e e nw e r en u o r e g c e n c el a b e l e d f i r s t l y ，f i t c i g ml a b e l i n g s h o w e dt h a tl y m p h o c y t e si ns p l e e nb i n d e di g m ，w h i l et h ee r y t h r o c y t e sd i d n o t s e c o n d l y , a n t i f p i g ra n df i t c g o a ta n t ig u i n e ap i gw h o l em o l e c u l ei g gw e r eu s e dt ol a b e l l y m p h o c y t e si ns p l e e n ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t ht h el y m p h o c y t e sa n de r y t h r o c ”e s 3 4 山东师范大学硕士学位论文 c o u l dn o tb el a b e l e d s ot h ef p l g rd i dn o te x i s to nc e l l so fs p l e e n i no u rr e s e a r c h ，f p l g rw a sp u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n di tm i g h tb e t h ek e ym o l e c u l et os t u d yt h et r a n s p o r t a t i o no fm u c o s a li go ff i s h i tw o u l d h e l pt o c l a r i f yt h eo r i g i no fm u c o s a li ga n dt h em e c h a n i s m so fm u c o s a li m m u n i t yi nf i s h k e yw o r d s ：c o m m o nc a r p ( c y p r i n u sc a r p i ol ) ，m u c o s a lc e l l ，p l g r 山东师范大学硕士学位论文 综述：免疫球蛋白转运机制的研究 一鱼类免疫球蛋白的研究 l 鱼类免疫球蛋白的研究 自2 0 世纪中期开始，对各种代表性鱼类的免疫球蛋白( i g ) 的研究十分活跃， 其主要依据是来自生物化学和免疫学性质的实验结论。 在无颌亚门“3 ( a g n a t h a ) 中，研究集中的代表性鱼类是粘盲鳗科和七鳃鳗科， 它们都是原始的无颁鱼类。j u d i t h 等发现嘲，作为最原始的有头无颌类无脊椎动物 的盲鳗( e p t a t r e t u ss t o u t i i ) ，其血清中存在免疫球蛋白，该蛋白的重链与抗鲨鱼免疫 球蛋白的抗血清具有微弱反应性，并且部分性质与免疫球蛋白极为相似，如：具有 等摩尔的重链( h 链) 和轻链( l 链) ，具有重链的氨基末端糖基化，具有链内和 链问的二硫键，半胱氨酸周围的氨基酸序列具有一定的保守性等。但是，与其他鱼 类免疫球蛋白也有不同之处：其两条重链具有不同的分子量，分别是6 9 k d a 和 7 4 k d a ，它们都与2 9 k d a 的轻链结合，组成异二聚体形式的免疫球蛋白样分子。 h a n l e y 等”3 通过单克隆抗体亲和层析的方法从盲鳗( e p t a t r e t u ss t o u t i ) 血清中分离 免疫球蛋白，总分子量2 1 0 k d a ，s d s - - p a g e 分析得到两条重链分子量分别是7 7 k d a ( h 1 ) 和7 0 k d a ( h 2 ) ，轻链的分子量是3 0 k d a ，h 1 和h 2 在肽图谱上有所不同， 氨基末端氨基酸测序以及与单克隆抗体m a bh 4 5 的反应性说明其重链是一种独特 的类型；双向非变性和变性电泳表明，重链和轻链共价连接形成h l 构型及h - h l 构型，此外，还具有非共价连接轻链。h - h l 复合物中既含有h 1 异二聚体也含 有h l - h 1 同源二聚体。 七鳃鳗科的免疫应答比粘盲鳗科稍稍进化。p a p e r r a a s t e r “1 用血兰素免疫接种七 鳃鳗，查明有微弱的血凝抗体反应，可以从循环中清除抗原，但是，七鳃鳗只能对 有限种类的抗原产生抗体应答。关于七鳃鳗抗体分子的结构有两种观点： m a r c h a l o n e s 和e d e l m a n 8 1 认为由两条重链( 分子量7 0 k 3 a ) 积两条轻链( 分子量 2 5 k d a ) 构成了6 5 s 的分子，并且认为该分子是1 4 s 分子的亚单位。p o l l a r a 和 l i t m a n 等”1 认为由4 个相同的亚单位构成了简单的9 s 抗体分子型。两者一致的观 点是都认为七鳃鳗抗体分子链是疏松结合的结构。2 0 0 4 年，p a n c e r 等”1 在海七鳃 鳗中发现了具有体细胞多样性的淋巴细胞受体( v l r s ) 。这类新型淋巴细胞受体由 大量富含亮氨酸重复序列( l r r ) 的三明治结构组成，其杆状区域含有糖基化磷脂 酰肌醇靶位，并将受体稳定锚定于细胞表面。一个v l r 基因含有大量不同的l r r 三明治结构，并且都能插入不完整的胚系v l r 基因，从而产生免疫系统所需要的 多样性，但是，一个淋巴细胞以单一等位基因形式表达单一二重排v l r 基因。通过 对无颌鱼类l r r 重排和有颌类脊椎动物免疫球蛋白基因片段重排的比较研究发 山东师范大学硕士学位论文 现：产生高度多样性的淋巴细胞受体可以通过不同的进化策略实现。 软骨鱼纲( c h o n d r ic h t h y e s ) 是一个在形态上趋异的纲，鲨鱼和鳐鱼免疫球蛋白 的研究使人们相信它们具有和人类相似的免疫应答，并且具有活性免疫记忆的自动 体液抗体应答。鲨鱼( g i n g l y m o s t o m ac i r r a t u m ) 可以产生分子量不同的两种抗体， 最大的分子和见于人类的i g m 相同( 分子量9 0 0 k d a ，1 9 s ) ，并且，在i g m 巨球蛋 白开始产生之后接着产生类似于i g g 的分子( 分子量1 8 0 k d a ，7 s ) ，但是，这两种 i g 皆由同一类重链和轻链组成。3 。斑鳐血清中也分离出两种i g 高分子量免疫球蛋 白( i i w m i g ) 和低分予量免疫球蛋白( l w m i g ) h w m i g 为五聚体，分子量为 8 4 0 k d a ，沉降系数为1 8 s ，这被认为是斑鳐的培m 。l w m 培，分子量是3 2 0 k d a ， 沉降系数8 9 s ，h w m i g 和l w m i g 皆有自己的特异性抗原决定簇，说明斑鳐的血 清中h w m i g 和l w m i g 不是同一种物质。h a i n e s 等利用单克隆抗体发现：作为 古老的具有获得性免疫的脊椎动物，铰口鲨( g i n g l y m o s t o m ac i r r a t u m ) 的免疫球蛋 白分子分别为i g m 和i g n a r 。n u u a l l 等研究发现“：铰口鲨和斑点澳洲鲨 ( o r e c t o l o b u sm a c u l a t u s ) 的新抗原受体( i g n a r ) 具有免疫球蛋白样的一个可变区和 五个恒定区，并以形成二聚体的形式存在于血清中，能够发挥结合抗原的作用。新 抗原受体i g n a r 由一个基因座编码，经重排和体细胞多样化形成，它被认为是免 疫球蛋白和t c r 的进化祖先。银鲛属软骨鱼纲全头亚纲，s a n c h e z 等发现“”，在 银鲛( c a l l o r h y n c h u sc a l l o r h y n c h u s ) 中也存在免疫球蛋白，分子量9 6 0 k d a ，解离后， 重链和轻链分子量分别是7 4 9 k d a 和2 4 4 k d a 。在软骨鱼中还有一种由i g r 和i g n a r 组成的新嵌合抗体，对i g m 是原始i g 同种型的传统概念提出了质疑。 鲟鱼是硬骨鱼纲辐鳍鱼亚纲硬鳞总目的代表鱼类，m a r k 等【埘研究发现，白鲟 ( a c i p e n s e rt r a n s m o n t a n u s ) 血清免疫球蛋白可以经离子交换层析和凝胶层析纯化， 凝胶电泳检测及氨基端测序证明该蛋白是免疫球蛋白，包括两部分，分子量分别是 8 7 0 k d a 和1 7 0 k d a ，重链和轻链的分子量分别是7 3 k d a 和2 7 3 0 k d a 。利用离子交 换纯化的免疫球蛋白去免疫小鼠获得单克隆抗体，得到六种组分，两种识别重链， 四种识别轻链。识别重链的单克隆抗体对白鲟免疫球蛋白具有高度特异性，识别轻 链的单克隆抗体与绿鲟似m e d i r o s t r i s ) 、大西洋鲟鱼翻o x y r h y n c h u so x y r h y n c h u s ) 、 铲鲟( s c a p h i r h y n c h u s p l a t o r y n c h u s ) 和匙吻鲟( p o l y o d o ns p a t h u l a ) i g 都具有交叉反应， 与沟鲶( 1 c t a l u r u sp u n c m t u s ) ，虹鳟鱼( o n c o r h y n c h u sm y k 括s ) 及条纹鲈( m o r o n e s a x a t i l i s ) i g 不具有交叉反应。 真骨鱼类被进化学家认为是鱼类中最高等和多样他的鱼类，这类鱼的免疫系 统非常相似，b r o m a g e 等“”利用s p a 吸附和s e p h a c r y ls - 3 0 0 凝胶层析的方法从六 种硬骨鱼中分离纯化其免疫球蛋白，这六种硬骨鱼分别是条纹鲈( m o r o n e s a x a t i l i s ) 、澳洲肺鱼( l a r e sc a l c a r i f e r ) 、莫桑比克罗非鱼( o r e o c h r o m i sm o s s a m b i c u s ) 、 山东师范大学硕士学位论文 尼罗河罗非鱼( o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) 、大西洋鲑鱼( s a l m os a l a r ) 和虹鳟鱼 ( o n c o r h y n c h u s m y l d s s ) ，除澳洲肺鱼属硬骨鱼肺鱼亚纲外，其余均属辐鳍鱼亚纲。 纯化得到的免疫球蛋白均为四聚体，分子量约8 0 0 k d a ，重链和轻链的分子量分别 是7 5 k d a 和2 5 k d a ，只是在尼罗河罗非鱼中观察到了三种不同的重链，其分子量分 别是7 5k d a 、8 5k d a 、9 5 k d a 。实验还发现s p a 对六种鱼类i g 的吸附能力不同， 并且对单体的吸附能力比对多聚体的吸附能力强，只有莫桑比克罗非鱼例外。 2 脊椎动物免疫球蛋白的进化 脊椎动物第一次出现体液免疫应答，产生各类免疫球蛋白，由原始鱼类七鳃鳗 出现i g m 到人类出现i g m 、i g a 、i g g 、i g d 、i g e 五大类免疫球蛋白，继而还发展了 一个所谓放大系统，如补体“。 用噬菌体或红细胞反复刺激七鳃鳗会出现特异性反应，产生1 9 s i g 和7 s i g ， 能使噬菌体失活或者使红细胞凝集。七鳃鳗i g 具有原始特征，其重链和轻链之间 没有二硫键连接。尽管出现了抗体，但是这种原始鱼类仍然以细胞介导免疫作为其 主要免疫应答形式，具有分散的淋巴组织和胸腺，并具有功能有限的t 细胞和b 细 胞。比圆口类稍进化的软骨鱼，如角鲨，具有两种免疫球蛋白，即7 s g 和1 7 s ( 或 者是1 9 s ) i g ，但是，由于两者具有相同的抗原性，因而推测1 7 s ( 或者1 9 s ) i g 可能是7 s i g 的多聚体，并且，鲨鱼同样也是以细胞免疫为主，具有明显的细胞免 疫应答能力o ”“。进化地位较高的硬骨鱼类，对异物排斥速度不亚于哺乳动物，并 且可以产生针对多种抗原的特异性抗体。 有人认为，免疫球蛋白基础结构的多样化从肺鱼开始“”，因为它除了产生1 9 s 或1 7 s i g 以外，还产生种5 s i g ，但是，i g 真正具有分类意义的多样性结构是从 无尾两栖类开始“”“”“，因为它非常明确的具有1 9 s 和7 s 的i g m 和i g g ，其重 链分子量分别是7 2 k d a 和5 3 k d a ，而且，作为对陆生生活适应性的表现，蟾蜍已经 明确具有了浆细胞。鳐鱼和鲨鱼等软骨鱼所具有的低分子量的非u 抗体与其他重链 型的进化关系并不明确，在鲶鱼b 细胞表面就有一种与i g d 相关的i g 同种型的高 水平表达。令人意外的是，鱼类缺乏i g e ，但是硬骨鱼类可以发生i 型超敏反应， 说明有组织结合的亲同种细胞抗体存在。鱼类抗体的多样性有限，但是，硬骨鱼类 i g m 具有不同的氧化还原型，它们呈现出不同的功能，从而在一定程度上弥补了其 i g 型别多样性缺乏的不足。两栖类、爬行类和鸟类重链的同种型称为i g y ，由四个 恒定区组成，被认为是哺乳类i g g 和i g e 的祖先，因为它们之间具有共同的结构和 功能特征。美西螈的i g y 可能是一种分泌型免疫球蛋白，因为其在肠管中能与分泌 片样的分子结合在一起。i g a 最早出现于鸟类中。 由于脊椎动物处在较高的进化地位上，因而其免疫系统更复杂、更丰富也更有 效率，淋巴组织从分散趋向集中，出现各种免疫器官，如胸腺、脾脏、淋巴结、法 9 山东师范大学硕士学位论文 式囊和骨髓等。 分子生物学的发展为人类认识免疫球蛋白及免疫系统进化提供了新的思路。利 用分子生物学方法，人们从基因水平对免疫球蛋白进化有了新的认识。 低等脊椎动物免疫球蛋白基因的组成可以分为四种模式。第一种模式见于两栖 类、硬骨鱼和h o l o s t e a n 鱼，重链的基因结构与哺乳动物相类似，属于易位子型， 而轻链的基因为多簇结构。第二种模式是鸟类中存在的，并且只能特定的发生于鸟 类的法氏囊中，如鸡i g 轻链的基因座就是由单一的v 基因先行重排，并且是与单 一j c 单位连接。第三种模式见于软骨鱼，免疫球蛋白的重链和轻链都是由许多 分散的基因簇编码，每个基因簇中含有v 、d 、j 、c 基因，这些序列都是位于胚系 结构中。第四种模式是存在于胶棘鱼中的一种新的模式，其v 、d 基因群沿染色体 分布，是一种新型的i g h 基因。 免疫球蛋白进化可以概括为三个阶段，第一阶段，可变区( v ) 和恒定区( c ) 的形成以及重链( h ) 和轻链( l ) 的形成；第二个阶段，重链类别的分化和轻链型 别的分化；第三个阶段，亚类和亚型的分化。点突变和基因重复是免疫球蛋白进化 过程中各阶段分化的遗传基础。通过比较l 链的v 区和c 区的长度( 约l l o 个氨基 酸) 、二硫键位置以及链内形成环的大小发现v 区和c 区具有一定相似性，说明v 区和c 区基因可能起源于一个共同的原始基因，并且在进化早期就发生了分离；此 外，根据氨基酸序列分析的结果可以看出，l 链和h 链c 区彼此约有3 0 一4 0 氨 基酸是同源的，说明它们可能也起源于一个共同的原始基因。一个原始的h 链基因 组可能只含有一个u 链基因，在进化过程中依靠基因的重复和突变，逐渐分化，形 成y 、q 、e 等h 链基因。i g d 被认为是进化过程中最晚产生的免疫球蛋白，以前 只在灵长类和啮齿类动物中发现，现在在硬骨鱼类中也分离出一种复杂的嵌合免疫 球蛋白重链基因，它与哺乳动物i g d 的重链6 部分同源啪1 ，为免疫球蛋白进化的分 析又提示了新的观点。 根据氨基酸序列分析的结果，一般认为免疫球蛋白祖基因在进化过程中除了分 化产生免疫球蛋白各类及亚类以外，还衍生出t 细胞受体、表面分化抗原、主要组 织相容性复合物、b 一微球蛋白等，形成一个超基因家族。 3 鱼类免疫概述 3 1 鱼类免疫球蛋白产生的基本过程 鱼类免疫球蛋白产生的基本过程和哺乳动物一样，当颗粒性抗原或者可溶性抗 原进入鱼体内以后，出现一个潜伏期，此时血清免疫球蛋白很少或没有，经巨噬细 胞吞噬后的抗原被送至肾脏或脾脏内进行初步加工和积累，然后以抗原呈递的形式 传送给淋巴效应细胞，在与特异性体液免疫相关的辅助细胞如t h 细胞、t s 细胞作 用下，b 细胞开始分化增殖，转化为浆细胞，产生大薰抗体。刺激后约2 3 个月， 1 0 山东师范大学硕士学位论文 免疫鱼的血清中开始出现特异性抗体，抗体产生细胞开始充分发挥特异性免疫功 能，血清抗体的数量在保持一段稳定时期后逐渐减弱，直到刺激源再次侵入，才能 再次产生特异性抗体。相同免疫原不同的侵入途径，可能对鱼类产生不同的免疫效 应。 与哺乳动物相比，鱼类的免疫应答规律稍有区别，并且受外界环境的影响较大。 低温能阻止、延缓鱼类免疫应答的产生，各种鱼类都有不同的免疫临界温度，一般 来说，温水性鱼类的高，冷水性鱼类的低，在低于临界温度时鱼类的免疫应答机制 可能会丧失；其次，低温会限制浆细胞释放抗体，鱼类的免疫记忆比哺乳动物弱， 并且同样也受温度影响。“。鱼类的免疫球蛋白可以表达在b 细胞表面作为抗原受 体，或者是由活化的b 细胞分泌到血循环中。 3 2 鱼类免疫球蛋白的分布 鱼类是比较低等的脊椎动物，在鱼类中存在以抗体i g m 为中心的特异性体液免 疫，但是其作用机制并不完善。鱼类i g w 不仅存在于血清中，也存在于皮肤粘液、 肠粘液、胆汁等分泌物中o “，此外，在鱼类的肾脏、脾脏、胸腺、卵以及消化道中 也有分布。 目前，在虹鳟鱼( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 潍3 、沟鲶( i c t a l u r u s p u n c t a t u s ) 。”、罗非 鱼( o r e o c h r o m i sm o s s a m b i c u s ) 乜8 1 、海鲈( d i c e n t r a r c h u sl a b r a x ) 1 、鲨鱼 ( g i n g l y m o s t o m ac i r r a t u m ) 等多种鱼类的卵中发现了i g ，并已经对其进行了较深 入的性质分析。多项实验表明，除了在淋巴细胞表面存在膜i g 以外，在免疫相关 组织中也有i g 阳性细胞的存在。f o u r n i e r 等1 用兔抗鳟鱼血清i g m 多克隆抗体进 行免疫组化实验发现，胸腺中具有少量的i g 阳性细胞；脾脏中，i g 阳性细胞集中 分布在白髓m m c s 周围；肾脏中则分散于造血细胞和粒细胞周围，并且，肾脏中i g 阳性细胞的数量要多于脾脏；肠相关淋巴组织( g a l t ) 也含有i g 阳性细胞，并且 粘膜层较多，而上皮细胞层却几乎没有。e l l i s 等。”通过荧光标记的抗鳐鱼i g 抗体 发现鳐鱼( r a j an a e v u s ) 的淋巴细胞表面具有膜结合型i g ，并且在外周血、脾脏和胸 腺中都发现了大量i g 阳性细胞。用抗i g 抗体封闭后，仍然能够出现新合成的i g ， 说明淋巴细胞膜表面的膜结合型i g 是单个淋巴细胞的产物，不是血清k 主动转运 的结果。i g 阳性细胞在成体胸腺中出现说明胸腺可能是主要的淋巴器官，能够产生 类似于t 细胞和b 细胞的细胞。c o r t h e s y 等。”发现，并不是所有淋巴细胞膜表面都 具有i g ，在硬骨鱼类中存在独立的淋巴细胞群，根据是否表达i g 分为i g 阳性或i g 阴性淋巴细胞。 二免疫球蛋白转运的研究 2 0 世纪6 0 年代，对鱼类免疫球蛋白的研究已经广泛开展，近几年来，对鱼类 1 1 山东师范大学硕士学位论文 粘液性免疫球蛋白转运的研究逐渐引起重视。尽管，对鱼类免疫球蛋白转运机制的 了解还很少，但是，关于哺乳动物免疫球蛋白转运的机制却已经进行了相当深入的 研究探讨，因此，我们首先来了解一下哺乳动物免疫球蛋白受体的相关内容，以期 对鱼类的研究思路有所启示。 1 哺乳动物免疫球蛋白受体的研究 在哺乳动物中，i g a 、i g g 和i g m 都是以受体介导的方式转运穿过上皮细胞的， 这个过程我们通常称之为穿胞吞排，除了能够中和消化道、呼吸道和泌尿生殖道中 的病源菌以外，这些抗体对免疫激活和免疫耐受都具有重要作用。 在哺乳动物的呼吸道、消化道和泌尿生殖道粘膜表面覆盖着上皮细胞，这些上 皮细胞之间以紧密连接的方式排列在一起，能够有效地将细胞表面分成两个相对独 立的区域顶生膜和基底膜，这样的结构特征对器官发育和功能维持都具有重要 的意义。上皮细胞能够调节离予流和可溶性物质的吸收流动，并对肠腔内的刺激做 出应答。进入肠胶的毒素、寄生虫、细菌和病毒通过不断破坏上皮组织导致感染和 疾病的发生，为了保护这一敏感的粘膜表面，生物体产生了一整套复杂的非特异性 和特异性机制以中和病源菌“。 非特异性机制包括一些粘膜分泌物的作用，如粘液、酸性物质、乳铁传递蛋自 和溶菌酶，这些物质都能抑制病源菌活性。此外，覆盖在项生膜表面丰富的多糖复 合物和相邻细胞之间的紧密连接共同构成了抵御病源菌侵入的有效屏障。特异性防 御反应则包括细胞介导的应答和免疫球蛋白介导的应答。由系统性淋巴组织和分散 于上皮下的弥散淋巴组织分泌产生i g g 、l 酚和i 鲥，它们通过穿胞吞排被转运通 过上皮并继而分泌进入腔面中，发挥阻止病源菌侵入的作用。如人类母体i g g 通过 穿胞吞排穿过胎盘而给胎儿提供免疫防护，又如小鼠，乳汁中的i g g 通过穿胞吞排 穿过新生鼠上皮进入胎鼠循环系统，发挥免疫防护作用“1 。 受体介导的穿胞吞排最早发现于免疫球蛋白转运，但是现在认为这种机制对于 维持上皮细胞极性的顶生膜蛋白都是普遍适用的，所有上皮细胞都表现出穿细胞转 运的活性，而且在一些细胞中，这种机制还是物质到达顶生膜的重要途径。免疫球 蛋白与粘膜免疫密切相关，它们的功能在很大程度上依赖于穿胞吞排的转运作用， 参与多聚免疫球蛋白转运的主要有两类受体：一类是多聚免疫球蛋白受体( p i g r ) ， 通过寡糖链与二聚体i g a 分子( d i g a ) 结合，另一类是f c 受体( f c r n ) ，与i g 分 子f c 段结合m 3 。 1 1 哺乳动物p i g r 的研究 1 1 1p i g r 的分布与结构 p i g r 是i 型跨膜蛋白，细胞外配体结合区为五个免疫球蛋白样结构域，每个 结构域由11 0 个氨基酸组成，这五个结构域与免疫球蛋白的可变区具有很大相似 山东师范大学硕士学位论文 性，因此该分子属于免疫球蛋白超家族。跨膜区由2 3 个氨基酸组成，细胞质内区 域由1 0 3 个氨基酸组成”“。p l g r 由内质网合成，经高尔基体修饰加工后输出，由 高尔基体反面管网结构t g n 直接转运到基底面，t g n 是高尔基体中p h 值最高的一 个区域，被转运至此的p l g r 在基底面与d l g a 结合。p l g r d i g a 复合物形成后被内 吞，通过一系列内吞小体转运通过上皮细胞，最终到达顶生膜。在顶生膜，p l g r 受蛋白酶裂解作用，其细胞外结合区和d i g a 一起被释放到粘膜分泌物中。经蛋白 酶裂解切割下来的受体细胞外结构就是我们通常所说的分泌性组分( s c 组分) ，通 常将d l g a 和s c 组分一起称为分泌性i g a ( s i g a ) 。 参与粘膜免疫的免疫球蛋白是由粘膜弥散淋巴组织中的b 细胞激活后产生的， 唾液、初乳和眼泪中都有d i g a ，此外，还有三聚体或四聚体i g a 。在粘膜分泌物中， 还有五聚体i g m ，它与多聚体i g a 一样，也具有连接单体的j 链。分泌产生的d l g a 和五聚体i g m 都能结合粘膜上皮基底面的p l g r 。 1 1 2p i g r 的功能及d i g a 转运的生物学意义 d l g a s l g a 至少在三个位点发挥功能，分别是肠腔、呼吸道和泌尿生殖道上皮 层和粘膜固有层。分泌性i g a 可以阻止肠腔中病源菌的吸附，可以在上皮细胞内发 挥中和病毒的作用，也可以通过结合粘膜固有层病原菌而直接发挥清除抗原的功 能。 1 1 2 1 阻止肠腔内病源菌的吸附 经穿胞吞排分泌到粘膜腔中的s l g a 能结合细菌、病毒、寄生虫和毒素抗原。 s l g a 一方面可以阻止这些病源菌运动，比如抑制鞭毛的功能或者诱导微生物凝集， 另一方面可以与病源菌竞争上皮细胞顶生膜的粘附位点，从而阻止病源菌吸附和侵 入粘膜表面，后一种功能就是s c 糖链组分的作用。此外，s i g a 结合到病源菌表面 会形成空间位阻，阻碍病源菌和其相应细胞膜受体的结合。这种情况的一个典型例 子就是s l g a 和h i v 表面衣壳蛋白的结合阻碍了h i v 病毒和细胞之间的吸附，也就 中止了发生细胞内病毒复制的可能。 1 1 2 2 中和细胞内的病毒 除了阻止病源菌吸附和侵入以外，体内实验和体外实验都证实，对细胞内病毒 的中和，d l g a 也发挥着重要的作用。m d c k 细胞系是一种常用的上皮细胞系模型， 在培养的m d c k 细胞中，由基底膜内化的d l g a 是一种病毒衣壳蛋白的特异性抗体， 遇到顶生膜内化形成含有病毒的内吞体样结构，可以抑制其组装去组装以及抑制 其在细胞内的扩散释放，d l g a 介导的上皮细胞内病毒中和可能提供了阻止感染的 深层机制“。 1 1 2 3 阻止抗原分泌 d l g a 介导的免疫防御第三道防线发生在粘膜固有层，有些病源性抗原能够通 山东师范大学硕士学位论文 过如m 细胞一类的途径渗透穿过上皮层，然后接近粘膜层甚至进入系统性循环。因 此，由b 淋巴细胞产生的d l g a 分泌出来以后在粘膜固有层能直接遭遇并结合这些 抗原，结合以后，d l g a - 抗原复合物再通过p l g r 介导的穿胞吞排转运到粘膜腔中， 被机体清除”“。 p l g r 基因敲除小鼠具有显著的i g a 分泌缺乏症状，但是，在胆汁、粪便排泄 物和肠道内容物中仍然可以发现d l g a 的存在，这说明，d l g a 的分泌可能还存在其 他途径。令人惊奇的是，有些细菌如肺炎球菌也能够特异性的结合顶生膜表面的 p i g r ，这就使得细菌同样可以利用这个途径有效的进入生物体中。 1 1 3 极化上皮细胞中p l g r d l g a 相关信号通路 m d c k 是一种转染了p l g rc d n a 的上皮细胞系，该细胞系是研究p l g r d l g a 复 合物在极化上皮细胞中穿胞吞排途径的模型。在p l g r 介导的转运中最重要的步骤 是p l g r - d l g a 在细胞基底膜被包涵素包被的膜泡小体内化，在这个过程中，p l g r 细胞质区域内两个酪氨酸残基，即6 6 8 和7 3 4 号酪氨酸发生磷酸化m 1 ，此外，t 2 6 位丝氨酸残基磷酸化导致细胞快速内吞的发生，上述三个位点是p i g r 发生磷酸化 韵主要位点”1 。 大多数p l g r d l g a 复合物以及基底膜循环蛋白如转铁蛋白一受体复合物都是以 微管蛋白依赖的方式被转运到细胞核周围区格化小泡中，这些小泡能延伸至c k 细胞顶生膜细胞质，称为循环内体( c r e ) “”“”。c r e 呈管状，结合膜相关配体 后由细胞膜内化形成，能循环返回细胞膜基底面。r a b1 7 ，是一种上皮特异性r a b g t p a s e ，在m d c k 细胞中，r a b1 7 定位于顶生膜下方的管一囊泡组分中，该组分含 有穿胞吞排过程中的p l g r d i g a ，r a b17 的过表达能抑制p l g r d l g a 的穿胞吞排“”。 p l g r - d l g a 穿胞吞排的最后一步目前争议很多。其中一种假说认为：，从c r e 出 来的p l g r d l g a 被转运到一个独立的囊泡中，该囊泡在m d c k 细胞中我们称之为顶 生膜循环内体( a r e ) ，在肝细胞中称之为亚顶生膜小泡( s a c ) 1 。a r e s a c 被 认为是最后一个发挥功能的组分，向a r e 的转运是微管依赖性过程，能调节细胞内 组分向顶生膜的转运。从这一观点看，小g t p a s er a b l l 和r a b 2 5 与此组分相关， 调节穿胞吞排信号通路及顶生膜循环。从a r e 出来以后，p l g r 又被转运到顶生膜 表面，在顶生膜，p l g r 受硫醇依赖性蛋白酶裂解作用，释放s c 组分，形成分泌物。 但是，在m d c k 细胞中，相当一部分p l g r d l g a 能够逃逸，因而并未受到蛋白酶裂 解作用，而是在细胞顶生膜被内化，形成顶生膜早期内吞体，继而被转运至c r e 或 r a b l1 阳性组分，再次循环，最终，项生膜内化的p l g r - d l g a 中只有不足1 0 能从 基底面释放”1 ，但是，有效的顶生膜循环保证了大多数p l g r d l g a 复合物最终被裂 解、释放形成分泌物。 1 1 4p l g r d l g a 穿胞吞排的调节 1 4 山东师范大学硕士学位论文 p i g r d i g a 的穿胞吞排近