微生物检验第十讲G需氧杆菌PPT课件.ppt

1,第二十二章革兰阳性需氧杆菌,1,2,第一节炭疽芽胞杆菌,炭疽是人畜共患的急性传染病主要是牛、羊等食草类动物的传染病，人可通过接触或摄食病畜及畜产品而感染皮肤炭疽、肠炭疽、肺炭疽等，可并发败血症，甚至炭疽性脑膜炎,2,3,致病物质,荚膜：抗吞噬，有利于细菌在组织内繁殖扩散炭疽毒素：保护性抗原、致死因子、水肿因子,3,4,所致疾病,炭疽病：传染源：患病食草动物及其制品或被污染物传播途径：接触皮肤炭疽食用肠炭疽吸入肺炭疽可并发败血症，死亡率极高乙类传染病(发生肺炭疽按甲类处理)病后可获得持久免疫力,4,5,形态染色:致病菌中最大的G+杆菌，两端平切、竹节状有毒株可有明显荚膜芽胞椭圆形，小于菌体，位于菌体中央多在有氧条件下形成，2530，在培养基中、土壤内、动物尸体解剖后暴露在空气中，都易形成芽胞在活体或完整未解剖尸体内不形成芽胞，尸体严禁解剖,二、微生物特性,革兰染色1000,5,6,培养特性：需氧或兼性厌氧，生长条件不严格，最适温度3035普通培养基扁平、粗糙、不透明、灰白色、无光泽，边缘不整齐的菌落，低倍镜下菌落边缘呈卷发状,BAP：1215h不溶血，1824h轻微溶血其他需氧芽胞杆菌大多溶血明显而快速,6,7,肉汤絮状沉淀生长明胶371824h表面液化成漏斗状，由于细菌沿穿刺线向四周扩散形成倒松树状。NaHCO3BAP：-有毒株5%CO2、372448h、产生荚膜呈黏液型菌落，挑取时呈粘丝状(鉴别要点)-无毒株粗糙型菌落,7,8,生化反应：,分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、蕈糖，有些菌能迟缓发酵甘油和水杨素产酸不产气水解淀粉、还原硝酸盐不产生吲哚和硫化氢、不利用柠檬酸盐、不分解尿素在牛乳中生长24天牛乳凝固缓慢胨化触酶（+）、卵磷脂酶弱（+）,8,9,菌体多糖抗原：与毒力无关，耐热、耐腐败，特异性不高。荚膜多肽抗原：与毒力有关，有抗吞噬作用，有利于细菌生长和扩散。荚膜肿胀试验，对本菌鉴定有意义芽胞抗原：血清学诊断价值炭疽毒素：保护性抗原（PA)、致死因子（LF）、水肿因子（EF）三个组分。单独皆无致病性，与PA结合才显示出致病性具有抗吞噬和免疫原性。,抗原构造：,9,10,抵抗力：,-芽胞抵抗力很强，煮沸10min或干热1403h才能杀灭-在干燥土壤中或皮毛中常温下存活数十年致病力不减，牧场一旦污染，传染性可持续数十年-生物武器,10,11,-芽胞对化学消毒剂抵抗力不一，对碘和氧化剂较敏感，常用以下方法杀菌：1：2500碘10min、3%H2O21h、4%高锰酸钾15min、0.5%过氧乙酸10min-对磺胺、青霉素、链霉素、四环素、红霉素、氯酶素均敏感,11,12,要求快速检出、分离鉴定病原菌，以利早期确诊、查清疫源、及时治疗和采取预防对策,三、微生物学检验,12,13,标本的采集与处理,皮肤炭疽：病灶深部标本肺炭疽：痰和血液肠炭疽：粪、呕吐物脑膜炭疽：CSF、血液死于败血症的动物，严禁宰杀和解剖，可消毒皮肤后割取耳朵、舌尖采集少量血液，局限性病灶可取病变组织或附近淋巴结。,13,14,无杂菌污染标本：直接接种肉汤增菌或固体培养基污染杂菌固体标本：加10倍量生理盐水充分浸泡，振荡1015min、静置10min，取悬液65水浴30min或855min杀死杂菌，保留芽胞活性，再增菌和培养污染杂菌液体标本：离心，弃上清液后，加0.5%洗涤剂振荡1015min，离心取沉淀物增菌和分离培养,14,15,生化反应,噬菌体裂解,青霉素抑制,毒力试验,荚膜肿胀试验,15,16,16,17,涂片染色：-G染色、荚膜染色、芽胞染色初步报告-荚膜荧光抗体染色核酸检测：核酸杂交分离培养：-BAP、戊烷脒多粘菌素B平板-2%兔血清肉汤增菌分离培养,17,18,鉴定试验：形态和菌落特征生化试验:串珠试验:-接种于含青霉素(0.050.5U/ml)的肉汤中，376h，大而均匀成串的圆球状菌体-与青霉素抑制细菌细胞壁合成有关-类炭疽无此现象,18,19,青霉素抑制试验：接种于含青霉素5、10、100U/ml琼脂平板，3724h生长受抑制不生长串珠和青霉素抑制联合试验：,兔血琼脂平板,抑菌环,青霉素纸片,青霉素1U片纸片贴于平板，3712h，低倍镜下观察，可见纸片周围有一无菌生长的抑菌环，其外周青霉素浓度低,菌体细胞壁受抑而成为串珠。,19,20,噬菌体裂解试验：AP631炭疽噬菌体NaHCO3毒力试验：接种于含0.5%NaHCO3和10%马血清的平板，10%CO2、37、2448h有毒株形成荚膜黏液型菌落无毒株不形成荚膜粗糙型菌落动物试验：小鼠、家兔或豚鼠皮下接种,20,21,植物凝集素试验：Ascoli热沉淀试验：可作追溯性诊断,21,22,第二节蜡样芽胞杆菌,食物中毒含菌量达105/g以上呕吐型耐热肠毒素腹泻型不耐热肠毒素全眼球炎（外伤后）心内膜炎、败血症和脑膜炎,22,23,夏、秋季多见食物有米饭、乳品、禽畜肉类、果汁饮料等，大多为加热烹调过的熟食在米饭中极易繁殖，由米饭受污染引起的食物中毒在国内、外均为常见中毒食物大多无腐败、变质现象，感官性状正常，应引起注意,23,24,形态与染色：-G+大杆菌-生长6h后即形成圆形芽胞、位于菌体中心或次末端、不突出菌体-菌体两端平截，多数呈链状排列-引起食物中毒的菌株多有周鞭毛、无荚膜,二、微生物特性,24,25,培养特性：需氧或兼性厌氧营养要求不高最适温度3035普通琼脂平板：菌落较大，灰白色，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，有蜡样光泽,25,26,BAP有溶血卵黄平板生长迅速，培养3h后，虽看不到菌落，但该菌可分解卵磷脂而形成白色的混浊环，称乳光反应或卵黄反应,26,27,生化反应：能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素、糊精，产酸不产气能胨化牛乳，液化明胶，VP（+）、卵磷脂酶（+）多次传代后生化特性常可改变,27,28,抵抗力：耐热，肉汤中细菌需10020min才能杀死，食物中毒菌株的游离芽胞耐受10030min、干热12060min才能杀死对氯霉素、红霉素、庆大霉素敏感，对青霉素、磺胺、呋喃类耐药,28,29,三、微生物学检验,标本采集：可疑食物、粪便、呕吐物，因食品暴露于空气中，在一定程度都会受到本菌污染，所以不能分离出该菌就认为是引起食物中毒的病原菌。,29,30,确诊由该菌引起的食物中毒必须：,从食物中分离出菌数105CFU/g，提示本菌活跃生长，构成潜在危险从可疑食物分离到的菌株与从病人粪便和(或)呕吐物中分离到的菌株属同一血清型,30,31,31,32,检验方法：直接镜检分离培养与活菌计数普通琼脂平板、BAP、卵黄平板鉴定与分型：根据菌落特点、形态染色、生化反应等初步鉴定生化分型、血清分型、噬菌体分型，肠毒素检测,32,33,产单核细胞李斯特菌（Listeriamonocytogenes),致病物质：李斯特菌溶血素O(LLO)主要毒力因子内在素表面蛋白（侵袭性蛋白）磷脂酶C,33,34,所致疾病:,健康带菌者是主要的传染源污染食物，粪-口途径传播，通过肠道扩散全身胎盘和产道感染新生儿接触病畜及产品眼和皮肤的局部感染,34,35,（二）微生物特性,形态与染色：G+短小杆菌，形态与培养时间有关-3736h，菌体主要呈杆状，随后以球杆状为主，35天常形成长丝状无芽胞，一般不形成荚膜，在含血清的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜,35,36,2025形成周鞭毛，有动力；37时鞭毛很少或无细菌接种半固体培养基，置室温，由于动力强，细菌自穿刺线向四周弥漫生长，在离琼脂表面数毫米处出现一个倒伞形的生长，是本菌特征之一,36,37,培养特性：,兼性厌氧菌、生长温度范围广0.545均生长（4冷增菌），最适3037营养要求不高，在含血液、血清、腹水的培养基生长更好BAP极小的露滴状、侧光微显蓝绿色灰白色菌落。狭窄的溶血环萘啶酸选择性平板细密湿润、边缘整齐的兰色圆形小菌落肉汤均匀混浊，表面有菌膜,37,38,生化反应：,3724h，发酵葡萄糖、果糖、蕈糖、麦芽糖和水杨素产酸不产气触酶（+）甲基红（+）VP（+）水解七叶苷、水解精氨酸产氨CAMP（+）,38,39,分型：,根据O抗原和H抗原，分4个血清型，1、3、4型可分若干亚型抗原结构与毒力无关，与地理分布有联系与葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌等有共同抗原,39,40,抵抗力：,耐盐、耐碱、不耐酸对热、常用消毒剂敏感多种抗生素敏感，首选氨苄青霉素，青霉素、链霉素、红霉素等也敏感对杆菌肽、多粘菌素耐药,40,41,（三）微生物学检验,标本采集：血液、CSF、宫颈、阴道、鼻烟分泌物等直接涂片：-在CSF标本中成对排列，形如球菌，易误认为肺炎链球菌-G染色过度脱色形似流感杆菌-有时与类白喉杆菌也极易混淆可用该菌1型和4型及多价荧光抗体染色，同时作动力检查,41,42,分离培养：BAP、巧克力平板杂菌污染标本可用20%NaCl心脑浸液肉汤2支1支10%CO2，372448h分离培养（BAP、萘啶酸选择性平板）1支4“冷增菌”分离培养（每24h一次，共4次，以后每周一次，至少4周）,42,43,鉴定：形态特征、菌落特点、动力及生化反应作出鉴定可疑菌落用已知李斯特菌1型、4型或多价抗血清做玻片凝集试验进行鉴定与其他G+菌鉴别,43,44,触酶动力马尿酸盐水解产单核李斯+-B群链球菌-+,本菌有耐碱耐盐的特点，可用?试验与肠球菌鉴别,44,45,二、红斑丹毒丝菌,毒力与其产生的神经氨酸酶有关，能使细菌粘附至靶细胞从事屠宰、经营鱼类和皮革行业的人员及兽医等感染机会较多通过破损皮肤侵入，引起局限性皮肤病灶，通常称“鱼毒”或“类丹毒”,45,46,（二）微生物特性,形态与染色：G+杆菌，菌体细长、直或稍弯，单个或短链状，慢性期分离的菌落为粗糙型，常呈长丝状，而且有分支及断裂，与放线菌近似.无荚膜、无芽胞、无鞭毛,红斑丹毒丝菌革兰染色1000,46,47,培养特性:厌氧或微需氧、初次分离需在厌氧环境，传代后有氧环境也能生长，最适温度30-35。在含葡萄糖或血清培养基生长旺盛BAP：3524h可形成两种菌落光滑型：菌落细小、透明突起、发亮、边缘整齐、质软易于悬于液体中，毒力较强粗糙型：菌落较大，颗粒状、扁平、边缘不齐可呈卷发状，无毒力,47,48,BAP上新分离的菌株有轻微的溶血，培养时间延长溶血现象明显，传代后溶血特性常消失含碲盐的培养基黑色菌落,48,49,葡萄糖肉汤：培养24h后，呈轻微混浊，不形成菌膜，室温静置23天后，管底有少量灰色沉淀；粗糙型沉淀较多。S-R变异同时毒力、抗原性也发生变异，但遗传学上不稳定，常出现互变。,49,50,（三）微生物学检验,标本：病灶边缘组织碎片或皮肤病变抽出液直接涂片G染色镜检：G+细长杆菌，有时长丝形，单独或呈短链状。分离培养：1%葡萄糖肉汤，355%CO2环境增菌，每日移种BAP，可出现二种菌落（S型和R型）,50,51,鉴定依据：G+、H2S+、无动力、触酶-、吲哚-、VP-与产单核细胞李斯特菌鉴别（表11-2）新霉素敏感试验：红斑丹毒丝菌R产单核李斯特菌S动物毒力试验：对小鼠、大鼠、兔、鸽均有致病性，0.2ml的24天培养物注入小鼠腹腔，4-5天后，败血症而死，心血培养（+）,51,52,第四节阴道加特纳菌,属于加特纳菌属,此菌属只有本菌一个种与非特异性阴道炎（细菌性阴道病）有关,52,53,二、微生物特性,形态与染色：-G染色视菌株和菌龄不同而异，实验室保存菌株趋向G-，新鲜临床标本中分离的菌株趋向G+，生长在高浓度的血清中呈G+-具有多形性，两端钝圆，无芽胞、无荚膜、无鞭毛,53,54,培养特性：,兼性厌氧，营养要求较高，在含5%人血琼脂平板上3%5%CO2、3537环境中培养48h后，可形成0.30.5mm大小、圆形、光滑不透明的菌落，在兔血平板上可出现溶血，在羊血平板上不溶血。,54,55,生化反应：氧化酶-、触酶-、尿素酶-发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等产酸不产气水解马尿酸钠和淀粉，吲哚-、明胶液化-、甘露醇分解-抵抗力：对氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、苯唑青霉素、青霉素、万古霉素、甲硝哒唑敏感，对萘啶酸、新霉素、多粘菌素和磺胺嘧啶耐药。,55,56,三、微生物学检验,标本采集：阴道和宫颈分泌物等直接湿片镜检：大量阴道上皮细胞，少量脓细胞及无数成簇的细小杆菌群集并吸附于上皮细胞表面，使细胞特别是边缘不清，呈锯齿形，即为线索细胞,56,57,涂片染色镜检：观察线索细胞，了解阴道菌群状况，常见大量小的G-和染色不定的杆菌和球杆菌，而无大的G+杆菌（乳酸杆菌）pH测定：pH4.5，提示细菌性阴道病胺试验：滴加10%KOH即发出鱼腥嗅为“+”,57,58,分离培养：5%人血琼脂平板、35、5%CO2环境48h鉴定：菌落、涂片染色、氧化酶-、触酶-、糖发酵及其他生化反应,58,59,59,第五节棒状杆菌属,60,棒状杆菌属是一群革兰染色阳性杆菌，菌体形态特征是在其一端或两端常呈棒状膨大，故名，归属放线菌科。,棒状杆菌属概述,61,棒状杆菌属种类繁多，主要有：白喉棒状杆菌（C.diphtheriae）假白喉棒状杆菌（C.pseudodiphtheriticum）干燥棒状杆菌（C.xerosis）化脓棒状杆菌（C.pyogenes）溃疡棒状杆菌（C.ulcerans）假结核棒状杆菌（C.pseudotuberculosis）溶血棒状杆菌（C.haemolyticum）J-K群棒状杆菌（C.jeikeium-CDCgroupJK）,62,G+杆菌、一端或两端膨大成棒状染色不均匀，两端浓染或有异染颗粒无鞭毛、无芽胞排列不规则，呈栅栏状白喉棒状杆菌致病菌类白喉棒状杆菌条件致病菌,63,白喉棒状杆菌C.diphtheriae,64,致病物质(一)白喉外毒素毒力强，130ng/kg可使人死亡抗原性强编码外毒素的tox基因-棒状杆菌噬菌体,一、临床意义,65,作用机制：A亚单位可使细胞延伸因子-2（EF-2）灭活，影响蛋白质的合成作用特点：毒性作用大，1分子能杀一个细胞作用于多种细胞，心肌、神经细胞均有毒素受体肿瘤细胞对此毒素敏感,66,（二）索状因子细菌表面的一种糖脂，能破坏细胞的线粒体，影响细胞的呼吸与磷酸化（三）K抗原-细胞壁外面的一种不耐热糖蛋白-抗吞噬-有利于细菌在黏膜表面的定植,67,所致疾病：白喉-急性呼吸道传染病,传染源：患者及带菌者传播途径：飞沫或污染临床表现细菌-上呼吸道粘膜，生长繁殖，产生毒素细菌与毒素共同作用引起局部炎症：炎性渗出，坏死，纤维蛋白假膜窒息毒素血液全身中毒症状外周N-N炎：膈肌麻痹-呼吸困难声带麻痹-声音嘶哑软颌麻痹-吞咽困难心肌-心肌炎,68,白喉假膜,69,抗毒素免疫感染后机体可获得牢固的免疫力机体还可通过其它方式获得免疫力：六月以下婴儿-母亲成人-隐性感染、人工主动免疫易感者：15岁儿童成人-也有可能,免疫性：,70,二、生物学特性,形态与染色:G+细长微弯的杆菌一端或两端膨大呈棒状常排列呈V、L、X等文字形异染颗粒形态上的鉴别特征无荚膜、无芽胞、无鞭毛,白喉棒状杆菌异染颗粒1000,71,培养特性：,需氧或兼性厌氧，最适温度3537营养要求高，在含血液、血清、鸡蛋的培养基上生长良好吕氏（Loeffler)血清斜面或鸡蛋斜面：生长最快，6h即生长，1012h长出灰白色、湿润、有光泽的光滑型菌苔/菌落，菌体形态典型、异染颗粒明显，连续传代可保持形态和产毒性能不变,72,BAP中菌落,BAP：菌落灰白色、光滑型、直径12mm、有狭窄溶血环（轻型）多次传代后菌体变为球型,73,亚碲酸钾BAP：选择鉴别培养基黑色菌落鉴别依据不同菌型还原能力不同，呈现黑色或灰黑色菌落根据菌落特征及生化反应特点可将本菌分为：重型、中间型、轻型,白喉棒状杆菌在亚碲酸钾BAP中菌落,74,液体培养基：生长较好，但菌型不同其生长特点也不相同,75,生化反应：,分解葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖产酸不产气，不分解乳糖、甘露糖，一般不分解蔗糖，吲哚（-）、硝酸盐还原（+）、触酶（+）、氧化酶（-）、明胶液化（-）尿素（-）重型能分解淀粉、糖原、糊精，迟缓分解蔗糖,76,抵抗力：,对干燥、寒冷和日光抵抗力较其他无芽胞细菌强，在干燥的假膜中可生存3个月对青霉素、红霉素等敏感，对磺胺不敏感,77,三、微生物学检验,分离出白喉杆菌，并证明其毒力1、标本采集：分泌物取双份如不能及时检验，标本浸于无菌生理盐水或15%甘油生理盐水保存,78,三、微生物学检验,2、标本直接检查，初步报告3、分离培养4、鉴定5、毒力试验,79,直接涂片染色镜检：-23张涂片G染色、异染颗粒染色镜检初报“直接涂片检出形似白喉杆菌”早期诊断-用无菌棉拭子浸以动物血清，采集标本，3710h，涂片染色镜检提高阳性率,80,分离培养：,吕氏血清斜面：37、812h涂片染色镜检-检出率要比直接涂片高，有助于快速诊断亚碲酸钾BAP：37、2448h，黑色菌落BAP：轻型有溶血环，应注意与溶血性链球菌鉴别,81,鉴定：,形态染色、菌落特点、生化反应糖发酵试验、尿素酶、硝酸盐还原鉴别棒状杆菌属不同的种白喉：葡萄糖（+）、麦芽糖（+）蔗糖（-）,82,毒力试验（鉴定致病菌株的重要依据）,体外法：琼脂平板毒力试验（Elek平板毒力测定）SPA协同凝集试验对流电泳,琼脂平板毒力试验-Elek平板,对流免疫电泳,83,鉴定流程,84,防治原则：-人工主动免疫白喉类毒素DPT混合疫苗：白喉类毒素、百日咳菌苗、破伤风类毒素-人工被动免疫白喉抗毒素+白喉类毒素-治疗：抗毒素+抗生素早期足量注射白喉抗毒素，使毒素在与细胞结合以前被抗毒素中和,85,类白喉棒状杆菌,86,除白喉棒状杆