第2章 基因工程 上(西南大学 普通生物学).ppt

基因工程的优点,第二章基因工程,原核生物与真核生物、动物与植物的遗传信息进行相互重组和转移,打破物种界限,可实现,基因工程研究的理论依据,2）基因是可切割,1）不同基因具有相同的遗传物质,3）基因是可以转移,4）多肽与基因之间存在对应关系,5）遗传密码是通用的,6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,第一节DNA重组,一、DNA,1、核酸的组成与结构,DNA是一类由四种脱氧核苷酸（A、T、G、C）聚合而成的大分子,核苷酸分子由戊糖、磷酸和碱基组成。,（1）核酸的组成,碱基,核糖,核苷,核苷酸,（2）DNA的结构,单链DNA,双链DNA,（1）DNA分子能在细胞内复制,2、DNA的功能,（2）携带遗传信息,DNA分子上只有编码基因的片段才能转录合成相应的RNA（mRNA、rRNA、tRNA）。,1）DNA分子转录合成RNA,mRNA,T,U,tRNA,核糖体RNA(rRNA),原核生物,原核生物,2）mRNA翻译合成蛋白质,缬,酪,色,二、限制性内切核酸酶和DNA片段化,基因工程的关键技术是DNA的连接、重组，但是DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需要的片段。,在合适条件下，使每条DNA的一个磷酸二酯键断开，,1、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）,一类以环状或线形双链DNA为底物，,能识别DNA中的特定核苷酸序列，,产生3-OH和3-P基团DNA片段,的脱氧核酸内切酶(endodeoxyribonuclease)。,III型酶：识别和切割相差限定数核苷酸。,分为I、II、III型酶。基因工程中使用的为酶。,限制性内切酶,I型酶：先识别，移动后在切割。,II型酶：识别处切割DNA。,限制性内切酶在DNA分子上能识别的特定核苷酸序列,3CTTAAG5,2、限制性核酸内切酶的识别序列,识别序列(识别位点),如：,EcoRI的识别序列为,5GAATTC3,不同限制性内切酶产生DNA片段大小,型限制性内切酶的切割位点处在识别序列内,3、限制性核酸内切酶的酶切位点,同裂酶（isoschizomer）,有一些限制性内切酶虽来源不同，但有相同的识别序列。,BamHI和BsI具有相同识别序列,如：,5GGATCC3,3CCTAGG5,两条链断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产生的DNA末端是平齐的。,两条链断裂呈交错对称，产生的DNA末端的一条链多出几个核苷酸，成为凸出末端。,粘性末端（stickyend）,平齐末端（bluntend）,限制性内切虽然识别序列不同，但切割DNA片段具有相同的粘性末端。,BamHI的识别序列GGATCC,同尾酶（isocaudamer）,BclI的识别序列TGATCA,如：,4、限制性内切核酸酶反应系统,底物（环状或线状双链DNA）,缓冲液,温度（37）,3）部分酶切,5、限制性内切核酸酶酶切DNA的方法,1）单酶切,2）双酶切,三、特异性DNA片段的PCR扩增,DNA聚合催化（70-75）使引物延伸。,1、PCR原理,PCR包括3个反应,双链DNA变性成单链,复性（36-60）,引物同单链DNA互补序列结合,变性（90-95）,延伸（70-75）,如此经过25-40次循环。,以单链或双链DNA为模板,2、DNA聚合酶(polymerase),一种催化由脱氧核糖核苷酸合成DNA的酶,称为依赖DNA的DNA聚合酶,DNA聚合酶催化合成DNA互补链的条件,四种脱氧核苷5-三磷酸,带有3-OH游离基团的引物链,DNA摸板，双链DNA只有在糖-磷主链上有缺口时，才是有效的摸板。,最大特点：耐高温。,TaqDNA聚合酶,一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶,具53聚合酶活性,具53外切酶活性,通过切口平移标记DNA分子，测序。,DNA聚合酶,大肠杆菌PolA基因编码的一种单链DNA聚合酶,Pol有三种不同的酶活性,53的聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,DNA聚合酶的主要用途,修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端，标记DNA末端，cDNA克隆中第二链的合成，DNA序列测定。,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段,又叫Klenow聚合酶或Klenow大片段酶,是由大肠杆菌DNA聚合酶全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段分子。,Klenow聚合酶的功能,53的聚合酶活性,35的核酸外切酶活性,Klenow聚合酶的主要用途,T4DNA聚合酶,T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶,具53的聚合酶活性,35的核酸外切酶活性,用途,标记探针DNA片段，DNA测序。,合成的长度比其他聚合酶要长,T7噬菌体DNA聚合酶,来源T7噬菌体感染的大肠杆菌,持续合成最强的DNA聚合酶,逆转录酶（Reversetranscriptase）,主要作用,一类依赖于RNA的DNA聚合酶,以RNA为模板,催化脱氧-5-三磷酸合成DNA,具有RnaseH活性,将mRNA反转录成cDNA,3、PCR引物,5,3,5,3,能够引导模板DNA互补链合成的寡聚核苷酸,3-OH,15-30个核苷酸,GC含量40-60%,浓度一般为0.1-0.5mol/L,4、DNA片段扩增系统,P4,P3,P1,P2,巢式/套式PCR（Nestedpolymerasechainreaction）,再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物,第一次扩增所用引物,第二次扩增作用的引物,先用一对引物对模板进行扩增,因为同两套引物都互补的靶序列很少降低了扩增多个靶位点的可能性,外引物,内引物,主要用于极少量的模板的扩增,优点,用途,反向PCR（reversePCR）,扩增引物与PCR序列方向相反,主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增,不对称PCR（asymmetricPCR）,两种引物比例相差较大的PCR,用于制备核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针,在一通用引物反转录的cDNA3端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR。,锚定PCR,可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建,降解源自脱嘌呤作用，即DNA分子中碱基和戊糖间的氮糖苷键发生水解。,长程PCR,长程PCR系统可扩增20kb以上的片段,在一般条件下，难以扩增大于5kb的DNA片段,主要原因,扩增大片段时标准缓冲液在高温下不能保持正常的pH值，从而导致模板DNA降解，,由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增,反转录PCR（reversetranscriptionPCR）,在同一反应中用多组引物同时扩增几种基本片段,多重PCR（multiplePCR),直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增,原位涂片PCR,定量PCR（real-timePCR）,PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量,荧光定量PCR技术,荧光探针:荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。,为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等,修饰引物PCR,四、DNA片段的化学合成,1、合成引物,2、合成DNA寡聚合核苷酸连杆（linker）,也称为衔接物或接头,3、合成基因片段,最适温度37,五、DNA片段的连接重组,1、DNA连接酶（ligase）,能够催化两个DNA片段末端之间的-P基团和-OH基团形成磷酸二酯键的酶,DNA连接酶反应温度,一般采用16-20。,由大肠菌DNA编码的DNA连接酶,大肠菌DNA连接酶,也能连接用不同内切酶切割产生的平齐末端,只能连接具互补粘性末端的DNA片段,T4噬菌体DNA连接酶,由T4噬菌体DNA编码的DNA连接酶,既能连接具互补粘性末端的DNA片段,2、DNA片段之间的连接,（1）粘性末端DNA片段的连接,直接连接,转化成平齐末端再连接,使DNA平齐末端的3-OH加上同聚核苷酸，产生具有poly(A)、poly(T)、poly(G)、poly(C)的粘性末端。,（2）DNA末端修饰后的连接,1）DNA片段末端修饰酶,末端脱氧苷酸转移酶,简称为末端转移酶,可以切去DNA片段的凸出末端，成为平齐末端。,核酸外切酶,（terminaldeoxynucleotidyltransferase）,催化核酸分子脱掉5P基团,转换成为5OH的酶。,碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）,使DNA或RNA的去磷酸化，防止DNA的自身环化。,主要作用,若同聚物不等长，需用DNA聚合酶或Klenow大片段酶填补。再用DNA连接酶连接。,同聚物加尾法（homopolymertailing）,2）DNA末端修饰后的连接,衔接物连接法,用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链DNA寡聚核苷酸片段。,衔接物（linker）,接头连接法,接头（adaptor）,能够携带外源基因进入受体细胞的DNA分子。,承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛选克隆子。,第二节基因克隆载体,载体（vector）,（1）多克隆位点（MCS，multiplecloningsite）,基因克隆载体必备条件,（2）复制原点(ORI,origin),（4）安全,能使外源DNA片段插入,能进行自我复制,（3）选择标记基因,一、质粒载体,质粒（plasmid）,染色体外能自我复制的双链闭合环DNA分子，,广泛存在于细菌细胞中,松弛型复制质粒,在寄主细胞内，能复制几百上千个拷贝。,严紧型复制质粒,在寄主细胞内，只能复制少数几个拷贝。,外源基因插入的多克隆位点（MCS）,构建质粒载体,一般选用分子小的松弛型复制质粒,应具有复制起始点（ori），能够在受体细胞内复制。,此外，质粒还有1-2个选择标记基因（Ampr、Kanr、Cmr、Tetr、LacZ）,BR分别为Boliver&Rodrigue首字母缩写,1、大肠杆菌质粒载体,（1）pBR322质粒,p表示质粒,氨苄青霉素（Ampr，Tn3）,pMB1（类似ColE1质粒，具大肠杆菌素E1合成酶基因）,四环素抗性（Tetr，pSC101）基因,复制原点,选择标记基因,多克隆位点（multiplecloningsite）,TcR内有11个限制性内切酶位点，其启动子内2个,64个限制性内切酶位点,ApR内有6个限制性内切酶位点,大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码-半乳糖苷酶-肽链的DNA序列(lacZ基因),（2）pUC质粒载体,Messing&Vieria（UniversityofCalifornia）1987年构建,pBR322质粒的复制起点（ori）,氨苄青霉素抗性基因（ampr）,lacZ内有13个酶切位点的多克隆位点。,pUC18,pUC19,X-Galisanoninducingchromogenicsubstrateforbeta-galactosidase,whichhydrolyzesX-Galforminganintenseblueprecipitate.X-GaIismostfrequentlyusedinconjunctionwithIPTGinblue/whitecolonyscreeningtodetectrecombinants(white)fromnon-recombinants(blue),X-Gal,5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside,5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷,IPTGinducesactivityofbeta-galactosidase,anenzymethatpromoteslactoseutilization,bybindingandinhibitingthelacrepressor.IPTGisusedtoinducelacZgeneexpressionincloningexperiments,IPTG,(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside),异丙基-D-硫代半乳糖苷,有多克隆位点,酵母穿梭质粒载体,2、穿梭质粒载体（shuttlevector）,能在两种不同的生物（原核生物、真核细胞）中复制的载体,有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,有真核生物的自主复制序列（ARS）和选择标记基因,蓝藻穿梭质粒载体,可诱导植物产生瘤细胞(Tumor-inducing,Ti)，,3、Ti质粒（Tiplasmid）载体,一种细菌质粒,存在于土壤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens）中,冠瘿瘤（growngalltumors)。,根据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，可以分成四种类型：,1）Ti质粒的类型,农杆菌素碱型（agrocinopine）,章鱼碱型（octopine）,烟脂碱型（nopaline）,农杆碱型（agropine）,或称琥珀碱型（succnamopine）,2）Ti质粒的结构,该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关,T-DNA区转移DNA（transferred-DNAregion）,农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA,该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性,Vir区毒区（virulenceregion）,T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一,该区段上存在细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。,Con区接合转移编码区,冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移,（conjugationencodingregion）,该区段基因调控Ti质粒的自我复制,Ori区复制起始（originofreplication）,使用无毒（non-oncogenic）解武装（disarmed）质粒作载体，又称Onc载体法。,3）Ti质粒的构建,共合载体法,Onc载体缺失T-DNA由常用质粒取代。并通过同源重组与相应的载体形成共合载体。,将带有外源基因的T-DNA和vir区安置在不同的质粒载体上。,双元载体,4、酵母2m质粒载体,共价闭环DNA分子(cccDNA),平均周长2m,每个酵母细胞里约有100个拷贝,5、T-克隆载体和U-克隆载体,Taq酶常在延伸PCR产物3末端加上一个非配对的碱基A。,TA克隆(载体),利用5端带有不配对碱基T的线性质粒（T-克隆载体），对PCR产物以AT配对连接进行的克隆,5端带有一个不配对碱基U的线性质粒。,T容易与其他碱基发生非特异配对。用突出的U末端代替T末端，由于U碱基能够有效减低和其他碱基（T、C、G）非特异退火的几率，因而能有效提高PCR产物的克隆效率。,U-克隆载体,二、噬菌体和病毒载体,1、噬菌体载体,线状双链DNA全长49kb（48502bp）,DNA进入寄主细胞后，粘性末端互补配对形成双链环状分子，结合处称为cos位点。,(1)噬菌体的特点,1)具cos位点,粘性末端（cohesiveend,cos),线状两端5各有12个核苷酸的单链突出,DNA可以整合到寄主细胞染色体，以溶源状态存在，并随染色体的复制而复制。,2）温和噬菌体,当紫外线或45处理，释放出DNA，被外壳蛋白包装，成为溶菌状态迅速增殖。,噬菌体能包装原DNA长度的75-105%，约38-54kb。,3）中间为非必须区,不进行改造，允许承载5kb的外源DNA。,中间有约20kb的区域对噬菌体生长不是绝对必须的。,4）D、E包装必须基因,5）DNA上具多个限制性内切酶识别序列,当外源DNA片段插入后使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶菌周期。,（2）噬菌体载体的构建,1）插入型载体,免疫失活插入型载体,带有外源DNA插入的重组体只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的噬菌体形成混浊的噬菌斑。,载体基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码-半乳糖苷酶基因lacZ。,-半乳糖苷酶失活插入型载体,外源DNA插入到lacZ区段上，阻断了-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列。,在噬菌体基础上改建的，在其中央部分有一个可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。,2）替换型载体取代型载体,(substitutionvector),DASH和FIX替换型载体,2、M13噬菌体载体,环状单链DNA，6407bp,M13mp18,7429bp,含有8kb大小的双链DNA病毒,3、CaMV基因克隆载体,花椰菜花斑病毒（CaMV）,最大装载大于CaMV-DNA300bp,由缺陷型CaMV同辅助病毒组成。缺陷型CaMV仅具病毒少数功能基因，而辅助病毒携带其他CaMV基因。,（1）CaMV载体的构建,互补载体系统,把组装有外源DNA的CaMV-DNA插入Ti质粒载体，通过根癌农杆介导，转移到植物细胞内。,混合载体系统,CaMV的DNA在植物中高水平转录35SRNA，其启动子是一强启动子。,CaMV35S启动子融合基因载体系统,将不含启动子的外源目的基因组装在35S启动子的下游，构建成可在植物中高效表达的载体。,感染啮齿动物细胞后，病毒DNA可整合到寄主细胞的染色体DNA上。,4、SV40载体,SV40病毒,一个含5243bp环状双链DNA的猿猴空泡病毒40,用外源DNA分子取代SV40中部分DNA,（1）SV40(SimianVirus40)载体的构建,取代型重组病毒载体,晚期取代型,早期取代型,分为,SV40不能包装大于原DNA的重组DNA分子,用SV40的部分DNA片段与质粒重组而成,重组型病毒质粒载体,进入细胞后，RNA反转录DNA，通过两端的长末端重复序列（LRT）整合到染色体DNA上，成为原病毒。,4、反转录病毒克隆载体,反转录病毒（retrovirus）,一类RNA病毒,三、柯斯质粒（cosmid）,“cossite-carryingplasmid”缩写而成。,1、柯斯质粒,人工构建的含有DNA粘性末端位点（cos）序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。,CosmidpJB8,Cosmidc2XB,克隆外源DNA的柯斯质粒可高效转导对噬菌体敏感的寄主细胞，进入细胞后可环化（cos位点），因不含全部噬菌体DNA的基因，不能进入溶菌周期,2、柯斯质粒的特点,1）具有噬菌体的特点,具质粒的复制子，能够像质粒一样进行复制，具抗菌素抗性基因,插入的外DNA片段可达30kb以上,2）具有质粒的特点,3）具有高容量的克隆能力,（site-specifichomologusrecombination）,四、染色体定位整合载体,1、靶位,受体细胞基因组中外源DNA定位整合的DNA区域（位置）。,2、基因打靶（genetargeting）,基因定位同源重组,自主复制序列（一个或多个）,五、人工染色体克隆载体,1、酵母人工染色体,染色体（Chromosome）的结构元件,着丝粒,端粒（两个）,具有酵母的着丝粒序列、自主复制序列、端粒序列,Ampr,MCS,酵母人工染色体（YeastArtificialChromosome,YAC）,可接受1001000kb的外源DNA片段。,多克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因,YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具,2、细菌人工染色体(BacteriaArtificialChromosome,BAC),细菌细胞内能自我构建复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段,F因子,可用于克隆100kb以上的DNA片段,基于细菌的育性因子（F因子）构建的载体,细菌人工染色体,具有质粒的特点,六、几种特殊用途的克隆载体,1、启动子探针载体（promoter-probevector）,质粒载体的必备元件,检测部件,失去启动子的标记基因,多克隆位点,2、诱导型表达载体,（inducibleexpressionvector）,锌结合在位于应答性基因起始位置上游的启动子序列中的一个或几个金属调节元件(MetalregMlatoryelement，MRE)位点上对基因转录进行调控。,锌与MTF(MRE结合转录因子，MRE-bindingtranslationfactor)结合，然后转移进入细胞膜内，MTF识别MT基因启动子的特异序列MRE(Mentalresponseelemnt，金属反应元件)，并与DNA结合，启动基因转录。,3、组织特异型表达载体,（tissue-specificexpressionvector),rice,4、反义表达载体,目的基因,基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和得到表达产物的基因,第三节目的基因,目的基因一般为结构基因，也就是能转录和翻译出多肽（蛋白质）的基因。,一、结构基因的组成,作为个转录和翻译的结构基因,转录启动子（Promoter）,基因编码区（encodingregion）,转录终止子（terminator）,转录mRNA的第一个碱基，通常为A，以此作为序列的+1。,启动子,DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列,转录起始位点,基因编码区,起译码ATG,开放阅读框（openreadingframe,ORF）,终止码（TAA、TAG或TGA）,能编码蛋白质的密码子，但不包括终止密码子,提供转录停止信息的核苷酸序列,转录终止子,不同类型基因组的基因组成稍有不同,1、原核生物结构基因的组成,完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一启动子的调控之下，下游同具一个终止子，,多数以操纵子形式存在,不同基因分别有起译码ATG和终止码TAA（TAG或TGA）。,保守区5TTGACA3，提供RNA聚合酶识别的信号,原核生物的启动子,-35序列（Sextama框）,保守区5TATAAT3，DNA双链从此解开转录,-10序列（Pribnow框）,除启动子外，往往还有一些调控转录的其他因子，如乳糖操除启动子(Promoter)，还有调节因子(Regulator)和操纵基因(Operator)。,操纵子,原核生物基因在起译码的ATG上游约4-13处，有一富含嘌呤核苷酸的序列保守序列,SD（Shine-Dalgarno）序列,一般为AGGA，由此区转录的序列是翻译时核糖识别、结合mRNA的位置,核糖体由此位置向前移动，寻找起始码AUG,原核生物基因转录终止之前有一段回文序列（反向重序列，Palindrome),终止子,使RNA聚合酶减缓移动或停止RNA的合成,但不是所有的回文结构都是终止子。,强终止子,依赖蛋白质辅助因子（因子）,辅助因子称为释放因子,不依赖蛋白质辅助因子（因子）,弱终止子,真核生物染色体基因组的基因是单独存在,编码序列,2、真核生物结构基因的组成,两个基因间有很长的间隔序列区,内含子,起译码与终止码之间除编码区外还有一个至多个非编码序列间隔区,外显子,卵清蛋白基因,-30序列,TATAbox,+Inr序列,起始子（initiator）,真核生物结构基因的转录启动子,polymeraseII核心启动子,DNA双链在此开始解开,通常是含3个保守区,TATA框（-20至-30序列区）,与RNA聚合酶结合有关,CAAT框（-75序列区）,在更上游，某些转录调控因子结合的序列,GC框,polymeraseII启动子,真核生物基因终止码序列下游有一保守的AATAAA序列提供转录产物的释放信号,转录释放信号,“帽子”7