（动物学专业论文）caenorhabditis+elegans+cdc42与par极性蛋白之间的相互作用及其对寿命的影响.pdf

c a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s c d c - 4 2 与p a r 极性蛋白之间的相互作用及其对寿命的影响 摘要 c d c 4 2 属于r h o 家族中的类r a sg t p 酶成员。本文通过r n a 干扰、c d c 4 2 的表达与纯化、免疫定位、寿命检测和免疫共沉淀这5 个方面，利用模式生物 c e l e g a n s 对c d c 4 2 的定位及其功能进行了研究。 通过干扰之后我们发现c d c 4 2 对于早期胚胎细胞分裂的极性有一定影响。 并且能够调控p a k - 2 和p 撩6 的定位，有可能调控p a r - 3 定位，对p a r - 5 没有 影响。 利用p e t 表达了重组c d c 4 2 ，我们对其表达条件进行了优化，并大量表达、 纯化了c d c 4 2 ，免疫小鼠得到抗血清，检测效价，在野生型和p a r 突变体虫体 中利用w e s t e r nb l o t 检测了c d c 4 2 的含量，发现在p a r - 4 突变体中c d c 4 2 表达 减少，其它突变体中也有变化。 通过对c d c 4 2 在野生型和p a r 突变体胚胎中的免疫定位研究，发现在野生 型胚胎l 细胞时期精核和卵核还没融合时，c d c 4 2 均匀的分布在细胞质中。到 了2 、4 细胞时期，c d c 4 2 依然均匀的分布在细胞质中。前期染色较为明亮。 后期胚胎细胞中，c d c 4 2 在外周细胞中表达较多。在快形成虫体时，c d c 4 2 在外周皮层富集。在p a r 基因突变后，c d c 4 2 在胚胎中的表达量都有所下降。 在p a r - 2 突变体( k k l l 4 ) 和p a r - 6 突变体( k k 8 1 8 ) 胚胎中表现的尤为明显， 证明p a r - 2 和p a r - 6 可以调控c d c 4 2 。p a r 突变体( k k 2 8 8 ) 中c d c - 4 2 的表达 减少但一直维持恒定，表明p a r - 1 对c d c 4 2 的影响是持续的，并且不可恢复。在 p a r - 3 突变体( k k 2 3 7 ) 、p a r - 4 突变体( k k 3 0 0 ) 、p a r - 5 突变体( k k 2 9 9 ) 胚胎 中，c d c 4 2 的表达量初期很少，但随着胚胎细胞数目增加，表达量也出现恢复。 意味着它们可能只是间接影响c d c 4 2 的表达。 利用c d c 4 2 的r n a 干扰食物对c e l e g a n s 进行干扰并检测其寿命，发现野 生型虫体c d c 4 2r n a 干扰后寿命没有显著性变化，说明干扰c d c 4 2 对野生型线 虫的寿命没有影响。d a f - 2 突变体线虫在c d c 4 2r n a 干扰后平均寿命缩短2 9 天， 缩短了2 3 8 。d a f - 1 6 突变体线虫在c d c 4 2r n a 干扰后寿命相对突变体平均寿 命缩短o 7 5 天，说明喂食c d c 4 2r n a 干扰食物可以有效缩短d a f - 1 6 突变体的平 均寿命，平均寿命缩短1 0 。与野生型寿命相比较，d a f - 2 突变情况下寿命有所 c a e n o r h a b d i t 括e l e g a n sc d c - 4 2 与p a r 极性蛋白之问的相互作用及j e 对寿命的影响 延长，而在d a f l l 6 突变下寿命会变短。c d c 一4 2 干扰后，虽然野生型寿命没有改变， 但d a f - 2 和d a f - 1 6 突变体寿命明显缩短。两个突变体的平均寿命在c d c 4 2r n a 干扰下都有所减少，意味着c d c 4 2 对寿命影响依赖于d a f - 2 的胰岛剃g f 一1 信号 通路。 对c d c 4 2 进行免疫共沉淀研究，并利用质谱分析得出了大量的可能与之相 互作用的蛋白。这些蛋白中包括，产卵缺陷家族成员，蛇型受体u 家族成员， n a n o s 相关基因家族成员和很多猜想蛋白。 关键词：c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ；c d c 4 2 ；免疫染色；寿命；免疫共沉淀 2 c a e n o r h a b d i t i se l e g a n sc d c - 4 2 与p a r 极性蛋亡j 之间的相互作用及其对寿命的影响 t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc d c 4 2a n dp a r p r o t e i na n dc d c 4 2a f f e c tt h el i f e s p a no f c a e n o r h a b d l t i se l e g a n s a b s t r a c t r h o - f a m i l yg t p a s ep l a y a l li m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n tc d c 4 2i sa m e m b e ro fs m a l lg t p a s ef a m i l y i tg e t si n v o l v e di nm a n yp r o c e s s e so fd e v e l o p m e n t t h r o u g hc d c 4 2r n a i ，c d c - 4 2e x p r e s s i o n a n dp u r i f i c a t i o n ，i m m u n o s t a i n i n g ， l i f e s p a na n a l y s i sa n dc o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，w es t u d yt h ei n t e r a c t i o no fc d c - 4 2 w i t hp o l a r i t yg e n ea n dd a f - 2 ，d a f - 16 a f t e rc d c 一4 2 ( r n a i ) ，t h ed i v i s i o no fc e l e g a n so n e - c e l le m b r y oc h a n g e d c d c 4 2c a nr e g u l a t et h el o c a t i o no fp a r 2a n dp a r - 6 c d c 一4 2m a yc o n t r o lt h e p o s i t i o no f p a r 一3a n dh a s1 1 0e f f e c to np a r 一5 a f t e re x p r e s s i o no fr e c o m b i n e dc d c - 4 2 ，o p t i m i z e dt h ee x p r e s s i n gc o n d i t i o na n d p u r i f i c a t i o n ，i m m u n et h em o u s et og e tc d c - 4 2a n t i b o d y , w ed e t e c tt h eq u a n t i t yo f c d c 一4 2o nn 2a n dp a rm u t a n t sb yw e s t e r nb l o t t h er e s u l t ss h o wc d c - 4 2 e x p r e s s i n gd e c r e a s e di np a r 4m u t a n t a f t e rc d c 一4 2 ( r n a i ) ，t h eq u a n t i t yo fc d c 一4 2i s d e c r e a s e di nn 2w o r m t h r o u g ht h ei m m u n o s t a i n i n go fc d c - 4 2a n t i b o d yo nce l e g a n sw i l dt y p ea n d p a rm u t a n t s ，t h er e s u l t ss h o wt h a tc d c - 4 2d i s t r i b u t e di n t e n s e l yi nt h ec y t o p l a s mo f o n ec e l le m b r y oi nw i l dt y p e t h ed i s t r i b u t i o no fc d c - 4 2b e c a m ee n r i c h e di nt h e c o r t e xo ft h el a t ee m b r y ot i l lt ot h em o r p h o g e n e s i s t h ee x p r e s s i n go fc d c - 4 2i n p a r 2 0a n dp a r - 6 0m u t a n t sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y i ti m p l i e dp a r - 2a n dp a r - 6m a y r e g u l a t ec d c - 4 2e x p r e s s i n g i np a r - l m u t a n t ，t h ee x p r e s s i n go fc d c - 4 2 d e c r e a s e dt i l l t ot h em o r p h o g e n e s i s i ti m p l i e dt h a tp a r jc a nr e g u l a t ec d c 4 2e x p r e s s i n g i n p a r - 30 、p a r - 4 ( - ) a n dp a r 5 ( - ) m u t a n t s ，c d c 一4 2e x p r e s s i n gi si n c r e a s e dw i t ht h ec e l l n u m b e ri n c r e a s e di nt h ee m b r y o a tt h em o r p h o g e n e s i ss t a g e ，t h eq u a n t i t yo fc d c 一4 2 r e c o v e r e dp r o v e dt h a tp a r - 3 、p a r 一4a n d p a r 一5m a y a f f e c tc d c - 4 2 i n d i r e c t l y c a e n o r h a b d i t 括e l e g a n sc d c 4 2 与p a r 极性蛋白之问的相互作用及】e 对寿命的影响 t ot e s tt h el i f e s p a no fc e l e g a n sa f t e rc d c 一4 2 ( r n a i ) ，t h er e s u l t ss h o wt h a t c d c 4 2d o e sn o te f f e c tt h el i f e s p a no fw i l dt y p en 2w o r m b u ti nd a f - 2m u t a n t ，k n o c k d o w nc d c 一4 2 ，t h em e a nl i f e s p a no fd a f - 2m u t a n tw o r n l ss h o r t e n e d2 9d a y s a n di n d a f - 1 6m u t a n t ，k n o c kd o w nc d c 一4 2 ，t h em e a nl i f e s p a no fd a f - 1 6m u t a n ts h o r t e n e d o 7 5d a y c o m p a r e dd a f - 2 ( - ) a n dd a f - 16 ( - ) w i t hn 2 ，t h el i f e s p a no fd a f - 2m u t a n ti s e x t e n d e da n dd a f - 16m u t a n ti ss h o r t e n e d w i t hc d c 一4 2 ( r n a i ) ，t h el i f e s p a no fd a f - 2 ( - ) a n dd a f - 16 ( - ) a r eb o t hs h o r t e n e d ，i ti m p l i e dt h a tc d c 一4 2c a ne f f e c tt h el i f e s p a no f c e l e g a n sd e p e n do ni n s u l i n i g f - 1p a t h w a y u s i n gc d c 4 2a n t i b o d yv i ac o i m m u n o p r e c i p i t a t i o ni nw i l dt y p en 2a n dp a r m u t a n t s ，a n dc o m b i n e dw i t hm a l d i - t o fa n s l y s i s ，i tp r o v e dal o to fm o l e c u l e sm a y i n t e r a c tw i t hc d c 一4 2 t h e s ep r o t e i n si n c l u d em110 3 ：h y p o t h e t i c a lp r o t e i n y 8 7 g 2 a f e g gl a y i n gd e f e c t i v ef a m i l ym e m b e r ( e g l - 4 ) ；s e r p e n t i n er e c e p t o r , c l a s s u f a m i l ym e m b e r ( s r u 一，2 ) ；f 5 8 8 3 7 ；d 2 0 6 3 2 ；n a n o sr e l a t e df a m i l ym e m b e r ( n o s 一3 ) ； c e l e g a n sp r o t e i nc 2 7 h 2 2 c k e y w o r d s ：c a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s ； c d c - 4 2 ； i m m u n o s t a i n i n g ；l i f e s p a n ； c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n 4 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 丰另三袋 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 牛匀三袭) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 垒互；f 己男 ) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：影炙 z z 口口7 年7 月2 7 日 y 静讥 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () i 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：誓夕灸 2 俨曷年7 月27 日 c a e n o r h a b d i t i se t e g a n sc d c 4 2 与p a r 极性蛋白之间的相互作用及其对寿命的影响 第一章前言 1 1 简介 秀丽小杆线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ，c e l e g a n s ) 属于小杆亚纲( r h a b d i t i a ) 、 小杆目( r h a b d i t i d a ) 、小杆总科( r h a b d i t o i d e a ) ，是一种常见的、自由生活的小 型土壤线虫，在世界的许多地方都有分布，以细菌为食，在理想的条件下生命周 期大约为3 周。c e l e g a n s 成体长约1 1 5 毫米，身体直径约7 0 微米，全身共有 9 5 9 个细胞。目前，秀丽小杆线虫已经成为现代发育生物学、遗传学和基因组学 研究的重要模式材料。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度 的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。由一个受精卵发育成为成熟的 成体只要二天多一点( 2 5 时需5 2 小时) 。从卵到成体每个细胞的命运以及它们 沿着一定的程序，在特定时间的分裂和迁移都已十分清楚。 c e l e g a n s 有一对性染色体和5 对常染色体，是一个染色体数很少的二倍体 ( 2 n = 1 2 ) ，其基因组也很小，仅有8 1 07 b p ，约为人类基因组的3 ，约有1 3 5 0 0 个基因。在真核生物中基因都是产生单顺反子m r n a ，但唯有c e l e g a n s 与原核 相似，有2 5 左右的基因产生多顺反子m r n a ( p o l y c i s t r o n i cm r n a ) ，通过反 式剪接使下游基因表达。c e l e g a n s 基因组中非重复序列很高，达到8 3 ，而高 等的真核生物都在5 0 以下，e c o l i 为1 0 0 ，c e l e g a n s 在这些特点上都较接近 原核生物，这也反映其在进化中的地位较为原始。这种蠕虫大部分是x x 型，是 可以自体受精的两性体( h e r m a p h r o d i t e s ) ，大约每5 0 0 个蠕虫有1 个是x o 型的 雄体，此是染色体不分离的结果。 作为实验研究用的通常是c e l e g a n sw i l d t y p ev a r b r i s t o l ( s t r a i nn 2 ) 。幼虫孵 化和发育经过4 个幼虫阶段，其间由蜕皮所间断。第四次蜕皮后的成熟成体繁殖 大约4 天，然后再继续生活l o 1 5 天。线虫生活在土壤间水层，所以在实验室中 极易培养。又因为全身透明，研究时不需染色，即可在显微镜下看到线虫体内的 器官如肠道、生殖腺等；若使用高倍相差显微镜，还可达到单一细胞的分辨率。 2 0 0 2 年诺贝尔生理学或医学奖授予悉尼布雷内等三人，他们获奖的原因是 在2 0 世纪6 0 年代初期正确选择线虫作为模式生物，发现器官发育和“程序性细 胞死亡”过程中的基因规则。布雷内是分子生物学的奠基者之一，他在1 9 6 5 年第 c a e n o r h a b d i t i se l e g a n sc d c - 4 2 与p a r 极性蛋白之问的相互作用及j e 对寿命的影响 一次研究线虫，直到1 9 7 4 年才发表第一篇有关论文，其中经历了长达l o 年左右 默默无闻的基础研究工作时间。直到2 0 世纪8 0 年代后，线虫研究才逐渐受到国 际认可，目前一些国家的科学家已经丌始利用布雷内三人的成果，研究可以治疗 多种疾病的新方法。 1 2r n a i 及其作用机制 r n a i 及其遗传机制的发现是c e l e g a n s 对当代生命科学发展的又一重要贡 献。r n a i 现象的发现始于三十多年前，当时人们发现反义r n a 可以抑制内源 性m r n a ，并认为这是由于反义r n a 与m r n a 互补形成双链r n a 干扰了m r n a 的表达。但真正开始r n a i 的研究却始于转基因植物中的一个发现。1 9 9 0 年，n a p o l i 等【i 】为了加深矮牵牛的紫色，用强启动子引入一个色素基因，结果发 现出现了色彩斑驳，甚至白色的花，内源性的m r n a 水平也下降了，这种现象 被称为共抑带l j ( c o s u p p r e s s i o n ) 。后来在多种植物及真菌中都发现了共抑制现象， 但其原因令人困惑。1 9 9 5 年，g u o 和k e m p h u e s 2 】在利用反义r n a 来抑制线虫 p a r - 1 基因的表达时，注意到作为对照的正义r n a 也可以抑制基因的表达，他 们认为这可能是由于当中有部分的反义r n a 的污染所致。虽然文章发表在当年 的c e l l 上，却遗憾地错过了生命科学史上的一个重大发现。1 9 9 8 年，f i r e 等【3 j 将正义和反义r n a 的混合物注射到c e l e g a n s 中，发现其对内源基因的抑制效果 比注射单链正义或反义r n a 还要显著，因而作出了双链r n a 是基因沉默的诱 因这一论断：他们提出了r n a 干扰这一概念。f i r e 等的发现具有划时代意义， 不仅为降低或沉默生物体内特定基因的表达提供了一种简单而有效的方法，而且 为治疗基因表达失调导致的多种疾病提供了一种可能的治疗手段。2 0 0 6 年f i r e 和m e l l o 获得诺贝尔医学奖。 之后，科学家们相继在植物中发现了s i r n a 4 1 ，在果蝇培养s 2 细胞中发现 了d i c e r 5 1 及r i s c 复合体【6 】。现已发现，外源双链l a ( 或由体内异源d n a 产 生的双链r n a ) 进入生物体后，先被r n a 酶d i c e r 切割成长度为2 1 - - 2 5 个碱基 的双链r n a 。这种小分子r n a 被称为s i r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a ) 。随后双链 s i r n a 与其他一些蛋白形成r i s c 复合体( i ai n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ) 。在复 合体中，s i r n a 的一条链( a n t i g u i d es t r a n d ) 被a r g o n a u t e 蛋白a g o 2 降解；另一 条链( g u i d es t r a n d ) 贝0 与靶m r n a 通过碱基配对结合，从而引导a g o 2 识别并降 6 c a e n o r h a b d i t i se l e g a n sc d c 4 2 与p a r 极性蛋白之间的相互作用及其对寿命的影响 解靶m r n a ，造成基因沉默【7 ，8 l 。剪切双链r n a 前体的d i c e r 是一个进化上非常 保守的r n a a s e l i i 家族成员，c e l e g a n s 只有一种d i c e r 即d c r 1 。而r i s c 复合 体的主要成分是a r g o n a u t e 蛋白，也是进化上十分保守的蛋白家族成员。线虫的 a r g o n a u t e 蛋白r d e 1 和r d e 4 类似于果蝇的相应蛋白a g o 1 和a g o 2 。a g o 2 是果蝇r i s c 中的惟一成分，并且具有r n a 内切酶活性 9 1 。在r n a 干扰时， r d e 一1 和r d e 一4 对于亲代虫体r n a 干扰非常重要，但在子代中并不是必需的。 在r d e j 突变体中，r n a 干扰不能产生【i o j 。r d e 4 可能在识别双链r n a 并将其 传递给d i c e r 而形成s i r n a 的过程中发挥作用；而r d e 1 则可能识别s i r n a ， 并与其他蛋白一起形成r i s c 复合体。除了s i r n a 之外，真核生物体内还存在一 类内源性的小r n a ，在细胞的多种生命活动中起着重要作用，这就是m i r n a 。 m i r n a 及其作用机制的研究是当前生命科学领域的研究热点之一。第一个 m i r n a 基因l i n 4 也是在c e l e g a n s 中发现的【】。l i n 4 是一个转录后形成6 1 b p 和2 2 b p 的时序调控基因，它的突变体不能从第一期幼虫进入第二期。其中2 2 b p 的r n a 分子通过与，f 聆j 4 的m r n a 互补配对，从而抑制l i n 1 4 蛋白的翻译， 进而影响发育进程。当时人们认为这可能只是一个特例而已，并没有引起太大的 轰动。直到r u v k u n 实验室发现了线虫的第二个m i r n a 基因比f 7 后2 。，人们才 认识到了m i r n a 的重要性。 m i r n a 形成的分子机制与s i r n a 非常相似【1 3 】，不同之处在于前者来源于基 因组中的内源基因转录所形成的发央状r n a 前体。与r n a i 相似，m i r n a 被 认为是多细胞生物基因表达调控的一种普遍方式。以前人们认为动物细胞的 m i r n a 只抑制靶m r n a 的翻译，不会引起m r n a 的降解。最近的研究发现， c e l e g a n s 的m i r n al i n 4 和l e t - 7 也可以降解各自的靶基因的m r n a t h j 。因此， m i r n a 可通过降解m r n a 来调控基因表达。r n a i 及m i r n a 的发现为疾病治 疗提供了潜在的新手段。如用针对癌蛋白b c 刚a b l 融合位点的双链r n a 转染 k 5 6 2 白血病细胞，可以降低细胞内b c r a b l 融合基因m r n a 的表达量，并诱 导大量细胞凋亡【1 5 】。另外r n a 干扰在抗病毒侵染方面具有很大的应用前景。已 有研究表明，s i r n a 可以有效抑制h i v - 1 在培养细胞中的复制6 1 。 c e l e g a n s 为研究对象的实验室都在通过全基因组范围的r n a i 筛选来寻找 新的功能基因。比如，r u v k u n 实验室通过r n a i 筛选，找到了4 0 0 多个与脂肪 7 c a e n o r h a b d i t i se l e g a n sc d c - 4 2 与p a r 极性蛋白之问的相互作用及其对寿命的影响 代谢相关的基因，它们中的大多数在哺乳动物中都有同源基因存在。这项研究也 为治疗肥胖症及相关疾病提供新的靶位【 】。c e l e g a n s 的蛋白质相互作用网络也 已初步建立【1 8 1 ，在此基础上，结合r n a i 等反向遗传学手段，可以有效地开展功 能研究。 1 3c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s 中c d c 4 2 和极性蛋白在胚胎中的作用 c e l e g a n s 是很好试验体系，可以在显微镜下观察到细胞分裂。可建立生物 发育的系统树，使线虫的各种体细胞的来龙去脉一目了然。c e l e g a n s 的卵细胞 受精后产生的合子称为p 0 细胞，p o 细胞是一个长形的不对称的椭圆形细胞，第 一次分裂垂直于前后轴，产生两个子细胞，前面的细胞较大，称为a b 细胞，后 面的细胞较小，称为p 1 细胞。第一次分裂产生的两个子细胞是很重要的，它意 味着子细胞已进入了分化的特殊角色。a b 细胞的后代分化为大部分皮肤细胞和 神经系统中的大部分神经原细胞。而大部分的肌肉细胞，整个的消化系统和生殖 细胞都是由p l 细胞形成的。用荧光标记的特殊细胞质颗粒叫颗粒将生殖系 的“命运”从p 0 细胞到p l 、p 2 、直至p 4 连系起来。这些颗粒在第一次分裂时 合并在一起进入p l 细胞，p 1 细胞分裂时也是不对称的，p 颗粒再进入p 2 细胞， 同样在以后的分裂中再进入p 3 、p 4 细胞。只有p x 细胞分化为线虫的生殖系统， 其他的细胞分化为体细胞。p 颗粒的不对称分布是依赖微丝的作用。当用细胞松 弛素( c y t o c h a l a s i n ) 来处理p o 细胞的右侧，阻断肌动蛋白聚合成微丝时p 颗粒 在p o 细胞的两个子细胞中分布是对称的。当肌动蛋白被破坏时，命运决定就变 得不规则，细胞便不能正常发育分化，结果导致胚胎的早期死亡。 c e l e g a n s 早期胚胎发育见图1 1 。 8 堕竺塑竺! 坐型! 堕兰里坠! 堂堂童旦三苎塑塑皇堑生些三翌墅塑塑墅堕 晒 猡 ? 、 力 。剑够 渝，翁 岁 缝汐 图】一】c e l e g a n s 早期胚胎发育 ( 引自m o n i c a g a t t aa n dj u l i e a h r i n g e r2 0 0 1 ) ( a ) 新的受精卵。圉的左边是前端，目的右边为后端。前端挤压出的两个极体( 灰色 箭头表示) 表明减数分裂已经完成。卵子和精于核( 空圈) 重新转变，精于中心体( 红色圆 圈) 放射出星状微管蛋白( 黑线) 。p 颗粒( 蓝色圆点) 在这个阶段是随机分布的。( b ) 卵母细胞核向精于核迁移。在此迁移过程中，内部细胞质流向后端，而皮层细胞质流向前端 ( 红色箭头) ，出现一个明显的假裂口( 以黑箭头表示) 。p 颗粒开始迁徙走向后端。( c ) 两个核在后端见面厉，逐渐穆动到细胞中心。在这个迁移过程中，前拨一中心体复合体的旋 转9 09 ，引导纺锤体描着_ d 轴。( d ) 前核中心体复合体在中央和中心体沿着a - p 轴。p 颗粒定位在后端。( e ) 在后期( 椭圆形代表了d n a ) 纺锤体转移到了后端。m 末期( 深蓝 色圆圈代表末期d n a ) 纺锤体己非对称形态，有一个圆形前端星体及后端的扁平星体。( g ) 第一次分裂带来了两个不同大小的子细胞；较大的前端细胞a b 和一个较小的后端细胞p 1 。 c a e n o r h a b d i t i se l e g a n sc d c - 4 2 与p a r 极性蛋白之间的相互作用及其对寿命的影响 p 颗粒完全隔离到了p 1 细胞。0 1 ) 中心体在a b 和p l 中复制，并开始沿核的周围迁移，直 到它们均相对。( i ) 迁移最后的中心体的位置将决定a b 细胞有丝分裂纺锤体的定向，并与第 一次分裂方向垂直。这次分裂将决定背腹轴。在p l 细胞中，核中心体复合体旋转0 ( 箭 头表示) 来使纺锤体定向沿着a - p 轴。这大概是通过皮层端捕捉的星体微管实现的。( j ) a b 细胞先于p l 细胞分裂。p 1 的核中心体复合体旋转9 0 。，因此纺锤体顺着a 巾轴构成【l ”5 i 。 c d c - 4 2 是一种重要的g t p 酶，属于r h o 家族中的类r a sg t p 酶【2 6 j 。这些 蛋白作为分子开关回应于外源性和或内源性信号并传递这些信号来激活下游生 物途径中的分子。c d c - 4 2 转换信号促使肌细胞骨架的起始，维持极性生长和调 控激活状态的有丝分裂原蛋白的形态形成。在酿酒酵母里，c d c - 4 2 在多种的肌 动蛋白形态发生中扮演重要角色。如芽的出现、杂交接触的形成和伪菌丝的伸长。 在哺乳动物细胞中，c d c - 4 2 调控了大量依赖肌动蛋白的事件和诱导j n k s a p k 蛋白激酶级联，从而导致核内活化转录因子。现在才刚刚开始了解c d c - 4 2 通过 与众多下游效应器相互作用介导这些过程的数量和规律。c d c 4 2 通过和调控子 与下游效应器相互作用被证实与一些人类疾病相关。大多数r h o 蛋白在c 端含 有脂质修改位点，与一个典型的序列类型c a a x ( a = 1 个脂肪族氨基酸和x = 任 意氨基酸) 。脂质连接对于膜上的附着装置是必不可少，这是大多数r h o 蛋白 的一个主要特点。 c d c 4 2 可以被鸟嘌呤核苷转化因子( g e f s ) 交换核苷而活化，在g t p 酶活性 蛋t j ( g a p s ) 帮助下水解g t p 到g d p 而被抑制。在活性状态时，c d c 4 2 可以结合 和调控一些含有c d c 4 2 r a c 相互作用结合域( c 砒b ) 的一系列下游影响因子r 7 2 8 】。 这些分子大多具有调控细胞功能，包括细胞骨架的组织、转运小泡的运输、细胞 周期的调控和极性建立 2 9 - 3 。尽管p a r - 6 并不含有一个完整的c r i b 结构域， 仍然在哺乳动物细胞中展现了活化c d c - 4 2 的能力，并不完全需要c r i b 和p d z 蛋白区域 3 2 - 3 6 1 。 g 蛋白信号传导在将细胞极性信息转变成命运决定因子分布和纺锤体定向 中起着重要作用。c d c - 4 2 介导了在多种生物中极性的建立【3 7 】。例如在移动细胞中 c d c - 4 2 作用于定向和形态上的极性保持，而在上皮细胞中，c d c 4 2 参与了致密连 接的构成。转运极性蛋白时c d c - 4 2 还参与了极性小泡的运输。目前已经了解清 楚作为r h og t p a s c s p s , 3 9 家族之一的c d c - 4 2 是一种对细胞骨架有调节作用的蛋 白，c d c - 4 2 可以促进细胞内肌动蛋白聚合。而且在c d c - 4 2 缺失后p a r 蛋白复合 体和a p k c 也出现缺乏m o 。p a r 蛋白现在已经证实在胚胎分裂中起着决定性作 1 0 丝! 塑! 唑! ! 竺! 里型! 兰堂堂堡墨! 兰型塑塑兰堑生丝墨翌重堕些墅堕 用，而c d c 一4 2 与其关系密切。 在cp 岫渺中基因家族包括p 卵，到阳 6 六种基因，除p 舻0 以外，其余 几种在ce l e g a n s 、果蝇、哺乳动物中部有同源物存在。p a r 基因的突变会导致受 精卵极性以及很多早期不对称现象消失。除此之外眦在细胞连接、代谢和癌症 方面也有重要意义。在c e l e g a n s 中p a r 蛋白的不均匀分布，建立了胚胎细胞的极 性。当胚胎细胞发育时，全部的p a r 蛋白质是不对称地分布于皮层或者靠近皮层 4 1 1o 一细胞时期p a r - 3 和p a r - 6 富集在前端p a r 一1 和p a r 一2 富集在后端，p a r 4 和p a r 5 在这个阶段均匀定位于皮层和细胞质【2 q 。图i - 2 为c e l e g a n s 早期胚胎中 细胞极性的建立和传导。 i 兰10 、g q 峨 圈1 - 2c e l e g a n s 合子中极性的起始和传递模犁 ( 引f l m o n i c a g o t l aa n dj u l i e a h r i n g e r2 0 0 1 ) 最上面是成虫性腺的一部分。卵母细胞排成一捧，最老的含有精于的受精囊。成熟的时 候这卵母细胞迁移到受精囊中，精子进入。通常，精于进入受精囊末端。新的受精卵离开 受精囊井迁移剑子宫。在这时，卵母细胞和精子的核都是压缩的( 受精卵末端的蓝色点) 。 在卵母细胞中，p a r i 和p a r - 2 蛋白均匀分布在皮层( 红) 2 4 2 o 减数分裂捧出2 极体( 自口端灰色 圆形在中间板) t 然后卵母细胞和精于核解除浓缩。精子中心体通过决定p a r 蛋白不对称分 布的镟管( 黑线) 成核，也许还决定 p a r - 2 的位置邮i 。p a r 蛋内的定位模式依然取决于它 们自身( 箭头) 。 出 c a e n o r h a b d i t i se l e g a n sc d c - 4 2 与p a r 极性蛋白之间的相互作用及其对寿命的影响 p a r 1 1 2 1 和p a r - 4 是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。这类酶是磷酸转移酶、丝氨酸 或苏氨酸特异的激酶亚家族成员。这些蛋白激酶在催化域的激活区域被特异残基 的磷酸化控制，有时在c 端的t l 动调整尾巴上结合了可逆的构象变化。 p a r - 2 是一种含有锌指结构的蛋白m 。锌指结构域是一个独特类型的结构 域，含有4 0 至6 0 个氨基酸残基并结合两个锌原子；由横条图表示就是 c - x 2 c - x ( 9 3 9 ) 一c - x 0 3 ) h - x ( 2 3 ) - ( n c h ) - x 2 一c x ( 4 - 4 8 ) c - x 2 - c ；锌指结构可能 涉及介导蛋白之间相互作用；在蛋白质中锌指结构被证实了范围广泛的功能，如 病毒复制、信号转导与发育；有两个变种gc 3 h c 4 型和c 3 h 2 c 3 型( r i n a - h 2 f i n g e r ) ，其中的不同之处在于半胱氨酸组氨酸的格局和指环的一个子环与 b b o x e s ( c - x 2 h x 7 c x 7 c - x 2 ch x 2 h ) 的联合。 p a r - 5 是一种1 4 - 3 3 蛋白【4 5 1 。1 4 3 3 蛋白是在所有真核细胞中表达的调控 分子保守家族。1 4 3 3 蛋白的一个突出的特点是它们具有结合众多功能多样的信 号蛋白的能力，包括蛋白激酶、磷酸酶、跨膜受体。1 4 3 3 蛋白在细胞很多重要 的调控过程中发挥作用，对大量相互作用的蛋白进行调控，如有丝分裂信号转导、 细胞凋亡和细胞周期调控。 p a r - 3 和p a r - 6 是两个含有p d z 结构域的蛋白质 4 0 3 。p d z 结构域存在于多种 后生动物信号分子中，往往是串联排列。负责特异蛋白的相互作用，大部分p d z 结构域可以结合c 末端的多肽和内部( 非c 端) 多肽，甚至结合脂类。这个亚家 族的p d z 结构域中n 末端的b e t a - s t r a n d 可以形成多肽结合凹槽区域，p d z 结构域的 循环排列形式也发现于蛋白酶中。 在哺乳动物上皮细胞中，p a r - 3 、p a r - 6 和p k c 3 相互结合构成一个复合体 并具有活化c d c - 4 2 的反应【柏1 。这些分子都被发现在m d c k 细胞中的致密连接里 起重要作用。过度表达p a r - 6 或者c d c - 4 2 可以产生p a r - 3 的错误定位和致密连接 的破坏。此外，极性化的星体中c d c - 4 2 ，p a r - 6 和p k c 3 对于微管组织中心的重 新定向有着重要的作用，并且在细胞骨架和高尔基体朝向正确方向生长起关键作 用【4 7 】。c d c - 4 2 定位在核周边缘区域，在细胞中和p k c 3 和p a r - 6 类似。和活化的 c d c - 4 2 结合可以被看作是对于果蝇上皮细胞顶端的p a r - 6 定位建立所必需，但 在成神经细胞中没作用i 铝1 。位点激活的c d c - 4 2 可以恢复p a r - 6 和a p k c ，进而指 导细胞极化。因此，p a r 蛋白和c d c - 4 2 同时作用于调控多种细胞中的极化，尽 1 2 管对于这些保守的机制目前了解的还不是很清楚。所有的证据都暗示t p a r 一3 、 p a r - 6 和c d c - 4 2 相互作用于同一机制，而这种机制对于后生动物来说是相当保 守的。在ce l e g a n s 里用r n a i 的方法敲除了c d c - 4 2 导致了极性缺失以及p a r - 6 和 p a r - 2 的错误定位 4 9 1 。此外，在酵母里p a r - 6 甚至一个含有不完全的c r i b 和p d z 的结构域能和活化的c d c 4 2 相结合，暗示了这个复合体存在于线虫中【4 9 】。 c d c 4 2 对于极性的作用是在和p a r - 6 的相瓦作用中，还是在发育中过程如卵子 发生或早期胚胎发育中体现目前还不明确。图1 3 所示为ce l e g a n s 单细胞胚胎内 p a r 蛋白的定位以及对下游蛋白的调控。 、 图1 - 3 c e l e g a r 婢细胞胚胎内p a r 蛋白定位和对一些其它下游蛋白的调控机制 ( 引自k e m p h l i e s2 0 0 0 ) ( 顶部) 精于贡献核和中心体- 使微管俄核在右边。箭头所示弛r - 2 以类似肌动球蛋白收 缩方式协助皮层的延伸。( 底部) 有丝分裂的纺锤体采井j 一种受到p a r 蛋白控制的不对称的位 置。黑线显示遗传学的相互作用：短灰白线表示生化的相互作用。灰色显示蛋白质不仅仅存 在丁胚胎的一端。 c d c - 4 2 可能在保持p a r 不对称方面和在激活p a r - 3 一p a r - 6 - p k c 3 复合体方 面有作用；