（食品科学与工程专业论文）珍珠河蚌肉营养成分及酶解制备ACE抑制肽研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i nic o n v e r t i n ge n z y m e 。a c e ) 抑制肽具有降血压的作用， 本文以三角帆蚌( h y r o m sc u m i n g i i1 肌内为研究对象，选择合适的蛋白酶进行水解制备a c e 抑制 肽。 分析蚌肉营养成分，结果表明蚌肉蛋白质含量较高，达6 5 1 ；氨基酸组成合理，氨基酸评 分为7 4 5 ；9 种组成a a z 抑制肽的氨基酸占氨基酸总量的4 0 3 9 ，适于制备a c e 抑制肽 改进了a c e 抑制率的体外检测方法，该方法具有良好的精确性，适用于样品的a c e 抑制率的 检测 以a c e 抑制率为指标，选用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 和胰蛋白酶6 种蛋白酶，在各种酶的最适条件下水解蚌肉，筛选出胃蛋白酶作为制备a c e 抑制肽 的最佳用酶。 选用胃蛋白酶水解蚌肉，采用四因素二次通用旋转回归设计，以a c e 抑制率和水解度为指标。 对胃蛋白酶水解蚌肉的条件进行了优化，得出胃蛋白酶水解蚌肉制各a c e 抑制肽的最优条件为t e ：s 为6 ，水解温度3 4 c ，p h i l 3 ，水解时阃7 h ，在此条件下获锝水解物的i ( 轴值为0 9 5 7 m g m l 同时发现水解度和a c e 抑制率之问没有明显的相关性 采用3 0 0 0 分子量孔径超滤膜对a c e 抑制肽进行分离处理，a c e 抑制率i c 5 e 值降低了2 5 8 ， 经以下工艺：河蚌肉原料一采肉一打浆一蛋白酶水解一灭酶一真空浓缩一冷冻干燥一产品，得到 的a c e 抑制肽冻干耪的收率为1 1 1 关键词：河蚌肉，酶解，a c e 揶毹眭 中国农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t a n g i o t e m i nic o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i n l u b i t o r yp e p t i d e sw c r ep r o v e dt oh a v ea ni m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a lr o l eo nr e g t t l a t i n gb l o o dp r e s s u r e t h ea c ei n l f f o i t o r yp e p t i d e sw e i p r e p n r e df r o m t t y r i o p s i sc l n n i n g i im u s c l ew i t l ap r o t e a s eh y d r o l y s i s t h en u t r i t i o ne o m p o s i t i o no ft h em u s c l eo fh y r i o p s i se u m i n g i iw a sa n a l y s e d t h em u s c l ec o n t a i n s a b u n d a n tp r o t e i n , 6 5 1 t h ea m i n oa c i ds c o l r ei s7 4 5 a c ei n l a i b i t o r yp e l 喇i d e ss t m c t l l r ea m i n o p h e n o l a e e o t u 啦f o r 4 0 3 9 * 锄d i s s u i t f o r p r e p a r i n g a c e i n l 曲i m m y p e p t i d a r e l i a b l ea s s a ym e t h o do f a c ei n l a l i b i t o r yp e p f i d e sw i t hh i g ha c e u l a c yw a sm o c t i f l e d ，a n dc a nb eu s e d t o d e t e r m i n e t t a c e i n h i b i t o r y a c t i v i t i e s o f t l a es a m p l e s t a k i n ga c ei q l a i b i t o r ya c t i v i t y t h et a r g e t , p dm u s s e lm t t s e l ew h y 出o l y t e aw i t t aa l e a l a s e , n e u t r a , , a c i dp r o t e a s e ，p i 喊p 锄n n dt r y p s i n , a t t e rs c r e e n i n go ft h e6c o m m e r c i a ll n o t e a s e s ， p e p s i n w a s t h e b e s t p r o t e a s e s u s e d t o h y d r o l y z e m u s s e l f o r t h e p r o d l l c l i o l l o f a c e i 血 b i t o r y p e p t i d e s t a k i n ga c ei n h i b i t o r ya c t i v i t ya n dt i l ed e g r o fh y d r o l y s i ja st a r g e l s , t o t a l l y , t m i f o r mp t t c i s i o l lc e n t r a l c o m p o s i t er e g r e s s i o nd c , s i g no ft h es e c o n dp o w e ro f 如f a c t o r sw u s e d t oo p t i m i z em ch y d r o l y s i s c o n d i t i o n so fm m s e lw i t hp e p s i nt h eo l r a m a lh y d r o l y s i sc o n d i t i o n sw e f e ：e n z y m et os u b s l r a t er a t i o 麟，t e m p e m u r e3 4 ，p i - 1 3 ，h y d r o l y s i st i m e7h o u r s u n d e rt h e s ee o n d i t i o t e ，p e a r ln m s l h y d r o l y s a t e si c s o _ m0 9 5 7 , g m l i j l l r a f i l t r a t i o nw a sa t 口p l i e dt oi s o l a t e da c e i n h i b i t o r yp e p t i d e s a t t e r3 k d am e m b r a n eu l t r a f i l t r a t i o n , t h e i c s od e c l i n e dt o0 7 1 0 r a g n i la f t e rt h ep e a dm u s c l ev g , i 班e s s e d 撼f o l l o w s ：刚m u s c l e m a t e r i a l s - - , p i e k i n gm u s e l e - - * m a k i l l gp l a s m - - , p r o t e a s el a y d r o l y s i s 唧d 自擅n 扯= 6 0 l 卜_ v a c u 咖 恤n 垃撕o n _ 在i 驾- d 咖舀m ey i c i dr a t i oo f a c l ii n h i b i t o r y p e p t i d e sl y o p h i l i z e d p o w d e r i s1 1 1 k e ”v o r d s ：p e a r l m m s e l m u s c l e ，e i l z y l f l a a t i c h y & o l y s i s ，a c e i 血酗t o l c ) r p c p 喇崦 i i 中国农业大学硕士学位论文 缩略词表 缩略词表 m - 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：易彩 时间：弦7 年月止角 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：嘻夕勿 导师签名： 时间：7 年钼加 时间：声归7 年月 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 高血压病是对人类健康危害极大的一种疾病，潜伏期长。卫生部统计资料表明高血压患病率 男性高于女性，城镇居民高于乡村居民。2 0 0 2 年中国居民营养与健康状况调查结果显示，中国成 年人高血压的患病率为1 8 8 ，且城乡差距已不明显由于药物疗法存在副作用，天然食物中的 降血压功能因子将成为高血压非药物治疗的重要组成部分。虽然来源于食物的a c e 抑制肽比人 工合成的a c e 抑制剂作用弱，但是它有其独特的优点i l j ：不会产生降压过度的问题：安全性高， 无副作用；除降压功能外，往往同时具免疫促进、抗凝血、易消化吸收、抗肿瘤等功能；具有较 好的酸热稳定性、水溶性等优点，易于作为功能因子添加剜各类食品中。 鱼贝肉蛋白是人类膳食蛋白质的重要来源，含有人体生长发育所必需的营养成分鱼贝内蛋 白生物学效价高并且含有丰富的必需氨基酸鱼贝肉蛋白包含有多种生物活性物质，用适当的蛋 白酶水解并从鱼贝肉蛋白中释放出来之后。成为具有生理活性的肽段通过酶解鱼贝肉蛋白生产 生物活性肽，与化学合成法和基因工程方法生产生物活性肽相比，其成本低、安全性好、易于产 业化生产 齄着人民生活水平的提高，膳食结构的改变，我国高血压患者越来越多来自食物中的a c e 抑制肽，安全性高、无毒副作用，动物实验证实具有调节血压作用，通过长期服用可达到预防、 抑制、缓解和治疗高血压的作用。功能性食品的开发和生产已成为食品工业的热点。利用天然产 物作为原料来开发功能性食品是较佳的途径。浙江省诸暨市是全国最大的淡水珍珠养殖基地。每 年采珠后约产生7 0 0 余吨蚌肉，大部分作为饲料添加剂，蚌肉远没有得到充分的利用。本课题以 珍珠河蚌肉为原料开发具有调节血压作用的a c e 抑制肽，可为河蚌肉的开发利用提供新的方法， 使河蚌肉的价值得到较大的提升。增加珍珠养殖户的收入。 1 2 高血压 高血压病是以动脉血压升高为主要临床表现的一种常见心血管疾病，分为原发性高血压和继 发性高血压，其中原发性高血压患者约占高血压患者9 0 以上，常引起心、肾和脑的病变并出现 相应的临床表现。而继发性高血压是由于急慢性肾炎、甲状腺功能亢进等疾病引发的高血压田 衰1 1血压水平分类 t a b l e l 1 g r a d e o f b l o o d p r e s s u r e l e v e l 近年来随着超重人群的增加和生活压力的增大，高血压趋于“年轻化”高血压病一般起病缓 慢。可有头痛、头昏、注意力不集中、心悸，乏力、耳鸣、失眠等多样症状，并反复多变，晚期 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 引起心肌梗塞，中风，肾功能衰竭等严重症状，危害极大 按1 9 9 9 年世界卫生组织国际高舡压协会商血压治疗指南) 中规定，1 8 岁以上成人的血压 按不同水平分类见表1 - 1 嘞 普遍采用的高血压诊断标准为：在未服抗商血压药物的情况下，在不同的时间内，三次测量 血压，取平均值，收缩压1 4 0 毫米汞柱和( 或) 舒张压踟毫米汞柱就为高血压1 3 j 目前我国高血压病防治存在的问题是三高：患病率高、死亡率高，致残率高：三低：本人血 压知晓率低、服药率低、控制率低；三个误区：认为没有症状就无需治疗，血压一旦正常就停药， 认为合适别人服用的降压药就适合自己因此，预防和治疗高血压病是一个重要的课题。 1 3a c e 与高血压的关系 1 3 1a c e 血管紧张素转化酶( a n 西o t e n s m i m 盯t h l g 朗z 邓舱。a c e ；n i a 豫e c 3 4 1 5 1 ) 亦 称二肽羧基肽酶l 翎，是一种含盈p 的的结合于细胞膜的金属蛋白酶，包括穿过细胞膜的部分、细胞 内延伸部分及细胞表面结合的碳氧基团，为肾素血管紧张素系统的关键酶。相对分子质量约为 1 2 9 i c d a 或1 4 0 k d a l m 口l ，根据测量方法不同而有所不同，在人体组织及血浆中广泛存在，主要存在 于血管内皮细胞内，在肺毛细血管中含量最为丰富嘲。e d l a 、c d b n 、血管紧缩素缓激肽等 是此酶的抑制剂，但是e d l a 的抑制作用可在伴有金属离子的透析作用下得到逆转研 1 3 2a c e 对血压的调节作用 高血压是升、降压机制与血压调控物质的平衡失调产生的，在肾性升降压机制中，肾素血管 紧张素( r a s ) 是被研究的最多和比较肯定的嗍a c e 对血压的调节作用见图1 1 i 己a s 是一套升压系统，血管紧张素原在肾素的作用下转化为血管紧张素i 血管紧张索i 在a c e 的作用下转化为血管紧张素，刺激血管收缩，造成血压上升。同时促使醛固酮分泌，直接对肾 脏起作用，造成钠储量和血溶量增加，也使血压升高；与此相反， 陵飞匕 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 8 a l u g m l 。分子量分别为1 1 0 0 和4 5 ( f s a l t a k a y a n a g i 等人( 1 9 9 9 ) 测定了六种葡萄酒( m u s c a tb a i l e y 丸c a b e m e ts a u v i g n o n , c h a r d o n n a y , k o s h u , s e m i l l o n tr i e s l i n g ) 的a c e 抑制活性。其值分别为：1 5 1 ，1 6 0 ，1 1 9 ，1 3 9 ， 1 3 4 和1 2 2 ( m l u m l ) 其中2 种红葡萄酒( m u s c a tb a i l e ya ，c a b e m e ts a u v i 髓o n ) e j 勺活性高于 其余4 种白葡萄滔就m u s c a tb a i l e ya 葡萄酒而言，这种葡萄果肉部分的活性高于其他部分， 并且m u s c a tb a i l e ya 葡萄在发酵的头两天活性较高，随后降低p l i 。 戴军等人( 2 0 0 5 ) 利用超滤、大孔吸附树脂柱层析和反相色谱将绍兴黄酒中的肽类组分进行 分离制备，并进行了a c e 的活性抑制试验，通过高效液相色谱电喷雾电离质谱联用分析和氨基 酸组成分析鉴定出一种a c e 活性抑制肽的氨基酸序列为g h - s e r - g b - f r o r m 1 - 4 2 上来源于蛇毒的a c e 抑制肽 1 9 6 5 年f e r r e i r r a 首次从巴西蝮蛇i ( 8 0 t h r a p s 如肌哪蛇毒中分离出a c e 抑制肤i l 田此后 o n d e t f i ，c i n t m 等人对其结构和功能进行了研究阻锄。 刘绵林等( 1 9 9 5 ) 用离子交换和凝胶过滤等方法从中国五步蛇毒中分离提纯出一种a c e 抑 制剂，经豚鼠回肠测定能加强舒缓激肽的效应，再经高压纸电没、高效液相色谱和氨基酸组分分 析鉴定为不舍脯氟酸的1 3 肽。分子量约为1 4 2 1 0 a ，a c e 抑制i c a o 值为1 1 0 u m o f l 属竞争抑 制类型闭 宴会根( 2 0 0 0 ) 将蕲蛇粗毒流经强瞬离子交换色谱p o r o s 2 0h q 柱，经毛细管电泳仪检潮， 5 个蛋白峰具有a c e 抑制活性，对活性堆强的峰进行p a g e 切割电泳的分离，第三条带( a i - 3 ) 具 有a c e ! 抑制活性该组分的分子量为2 0 2 0 0 ( 非还原) ，加二硫苏糖醇处理后，分子量为2 5 9 0 0 其 i ( h 值为o 1 0 m m o l l l s q 此外，亦有许多学者从猪骨胶原蛋白、酪朊酸钠、鸡肉、卵清蛋白、鸡蛋黄、人血浆、牛血 浆、牛肉等动物源性厥科中通过酶解制得了a c e 抑制肽眇m 踟 1 4 3 来源于水产蛋白的a c e 抑制肽 对于从水产蛋白中获取a c e 抑制肽，中日韩学者研究的铰多 f u j i t a 等( 1 9 9 9 ) 从鲣鱼中分离出8 条a c e 抑制肽。其中五驮k “邪册o a 辄蛐t 抑制a c e 的活性最高，其i c 啦为2 4 u m o l f l ，静脉注射s h r ，注射剂量为3 1 7 u g k g 体重，血压降低了 5 0 m m i - i g ，以鲤鱼水解物作临床交叉实验，在6 1 位自愿临界高血压和轻度高血压受试者中，3 0 名受试者每人按1 2 s m 璐g 体重服用永解物3 1 位受试者掇用安慰剂。5 周后，摄用水解物的受试 者收缩压下降了1 1 ，7 m m h g 。舒张压下降t 6 g m mh g 。随后服用安慰剂的3 1 位受试者服用水解 物，服用水解物的3 0 名受试者服用安慰剂，交叉后服用水解物收缩压下降t g 4 m m h g ，舒张压 下降了4 6 m m h g 。同时发现所有的受试者体质指数没有任何明显的变化，表明水解物对人体没 有副作用i 删。 j e o n 等( 1 9 9 9 ) 研究了鳕鱼捧酶解得到的多肽的a c e 抑制活性。发现a c e 抑制活性随其相 对分子质量降低而显著增加，相对分子质量为3 0 0 0 的多肚具有最强的a c e 抑制活性。其l c 值达 0 0 8 m g m u 6 1 虬 b y u n 等( 2 0 0 1 ) 用蛋白酶水解从鳝鱼皮中获取的明胶，其水解物具有较高篚1 a c e ：孵制率， 通过超滤租液相色谱从水解物中分离出g l v p r p l e u 和a y p m m e t 两条具有抑制a c e 活性的短 肽，其i c s o 值分别是2 6t i m 和1 7 1 3 u m 。作者采用定向复合酶解技术，从鳕鱼皮、罗非鱼皮等的 胶原蛋白中分离得到相对分子质量为1 0 0 0 左右的具有a c e 抑制活性的寡肽，并得出序列中含有疏 水性氨基酸的肽有较高活性的结论。此外，这此b _ a c e 抑制肽具有很好的水溶性，且无苦味，易于 4 - 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 投入实际应用嘲 1 c h i m u r a 等( 2 0 0 3 ) 从发酵鱼酱中分离出了a c e 抑制肽a l a - p r o , l y s - p r o , 和a r g - p r o ，以及其 他5 种活性较弱的含脯氢酸的抑制肽，饲喂自发性高血压大鼠表现出降压趋势嘲 f a h m i 等( 2 0 0 4 ) 评价了源于海鲤鳞水解物胶原肽对a c e 的抑制活性使用碱性蛋白酶，水 解率为9 2 ，此肽的半抑制浓度为0 5 7 m g m 1 对自发性高血压大鼠进行3 0 0 i 】嚷，k g 饲喂，降压效 果显著随后用层析法从水解物中分离了4 条肽。分离肽的抑制活性为未纯化水解物的5 至2 0 倍 其序列为g l y o t y r ，w i - t y r ，g l y - p h e 及v a 】羽i v 删 黄艳春( 2 0 0 4 ) 使用a s l 3 9 8 中性酶、f l a v o r z y m e 、a l 1 a 5 e 和p r o t a 】删鱼肉蛋白进行了 酶解研究，f l a v o r z y m e1 2 t j 、时的水解产物的水解度和a c e 抑制率高于另外三种酶，而且鱼香味 浓郁、没有苦味水解物复3 s e p h a d e xg - 1 5 凝胶色谱分离出8 个组分，前4 个组分有a c e 抑制活性， 分子量在7 0 0 - 1 0 0 0 d a z 问。此外还对不阿淡水鱼，不同部位鱼肉酶解产物的a c e 抑制效果进行了 研究【嘲。 朱志伟等( 2 0 0 4 ) 以罗非鱼内为材料，利用t r y p s i n 、a l c a l a s e2 4 l 、p r o t a m e x 、木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶、f l a v o u r z y m e 和k o j i z y m e 酶解制备血管紧张索转化酶抑制肽( a c e w ) 。其中 t r y p s i n 、a l c a l a s ez4 l 、p r o t 锄钗对罗非肉控制酶解制备a c e 抑制肽的效果较好，酶解产 物( 稀释2 0 倍) 的虽大i 值分别为9 1 2 ( 酶解l h ) ，9 0 9 ( 酶解3 t 1 ) 嗍 j u n g 等人( 2 0 0 6 ) 使用a , 中有详细记载：味 咸、甘、性寒。无毒。主治镇心点目，去肤翳障膜涂面，令人润泽好颜色；涂手足，去皮肤 逆胪。棉裹塞耳，主聋i 研，古时珍珠靠人工采集，产量极低我国于1 9 6 5 年开始培育淡水无核 珍珠，目前江浙地区和洞庭湖区以及湖北等地成为我国淡水珍珠主要产地，淡水珠产量占世界 7 0 近年的研究表明珍珠及其相关制品具有镇痛、镇静、消炎、促进微循环、抗胃部及皮肤溃 疡，止血促进伤口愈合等作用l t r , s 4 1 。 而作为淡水珠的母体，河蚌同样具有相当的保健功效，本草纲目上同样有记载：味甘、 成，性冷，无毒能除热止渴，解酒毒，清肝热耳聪目明、轻身。使人肌肤润泽。待力旺盛， 不易衰老嘲。近代研究表明河蚌肉提取物能增加小鼠巨噬细胞吞噬指数提高小鼠血清溶血素水 平，抑制迟发型超敏反应，延长小鼠的游泳时间，提高小鼠耐缺氧能力，具有明显的镇痛作用嘲 崔悦礼等人研究表明河蚌多糖能增强巨噬细胞吞噬能力，具有抗炎作用嗍童朝阳及胡水根等人 研究表明蚌提取物具有一定的抗肿瘤作用l e t , s s l 而孙良英等人的临床研究表明河蚌具有治疗高血 压的作用嗍此外还有研究表明三角帆蚌多糖具有抑瘤作用l 蚰】。 2 2 材料与设备 河蚌肉由浙江省诸暨市珍珠养殖场提供，原料去内脏、外套膜，分装，- 1 8 ( 2 冻藏备用。 2 3 试验方法 2 3 1 一般营养成分测定 水分：壹接干燥法挪】 灰分：高温灼烧法嘲 蛋白质：凯氏定氨法i 捌 脂肪：索氏抽提法嗍 总碳水化合物；计算法 2 3 2 原料蛋白质氨基酸组成 样品经6 m o l lh c l 水解后，采用日立8 3 5 - 5 0 型氨基酸分析仪测定1 6 种氮基酸，色氨酸以 4 2 m o l l n a o h 水解，胱氨酸以过甲酸氧化法处理测定。 - g 中国农业大学硕士学位论文第二章河蚌肉营养成分分析与评价 2 3 3 氨基酸评分计算方法 将所测得的氨基酸组成中必需氨基酸换算成每克蛋白质中氮基酸毫克数，根据1 9 8 5 年w h o 推荐的2 - 5 岁人群氨基酸评分模式，按下列公式计算氨基酸评分罔 氨基酸评分= 秀丽雨害琶錾冀妻霎言轰辜暑雯妻蓍蓑霎萎i ； ；弋面蛆o o 2 4 结果与讨论 2 4 1 河蚌肉一般营养成分 河蚌肉一般营养成分如表2 1 所示。除水分外，蛋白质含量最高，为1 5 7 5 若以干基计， 灰分为2 5 ，蛋白质为6 5 1 ，脂肪为拍，总碳水化合物为2 9 9 。同食品营养成分表中鲜 9 6 1 、鲍鱼、牡蛎、文蛤、毛蚶0 7 1 的数值相比较，蚌肉的蛋白质和碳水化合物的含量是最高的， 而脂肪含量高于鲜贝和鲍鱼，低于牡蛎、文蛤和毛蚶这是因为蚌肉的水分含量较低。因此其他 成分，如蛋白质和碳水化合物含量偏高故蚌肉具有较高的利用价值 表2 1 河蚌肉一般营养成分( ) t a b l e 2 - 1n u t r i t i o n c o m p o s i t i o n o f f y r o p s s c u m i n g i i m u s c l e 袭2 - 2 常见软体动物营养成分 t a b l e 2 - 2 n u t r i t i o n c o m p o s i t i o n o f f a m i l i a r m o l l u s k s 2 4 2 河蚌肉蛋白质氨基酸组成 前人的研究表明a c e 抑制肽的结构与其抑制活性有很大的关系，一般认为c 末端是脯氨酸、 苯丙氨酸、苏氨酸，或序列中含有疏水氨基酸( 色氮酸、苯丙氮酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 蛋氨酸、脯氨酸和丙氨酸) 可维持a c e 抑制肽高活性i l 删从表1 2 中a c e 抑制肽的氨基酸 组成我们也可以发现这个规律。分析蚌肉的氨基酸组成，上述的9 种氨基酸含量为5 9 3 ，占氨 基酸总量的4 0 3 9 ，故蚌肉酶解后有可能产生具有a c e 抑制活性的肽段，蚌肉适宜用作制备 a c e 抑制肽的蛋白质源。 9 一 中国农业大学硕士学位论文第二章 可蚌肉营养成分分析与评价 襄2 - 3 河蚌冉蛋白质氨基酸组成 t a b l e 2 - 3 a m i n oa c i d c o m p o s i t i o n o f h y r o m i sc u m i n g i i m u s c l e p r o t e i n 1 6 1 4 l f z l 0 8 0 6 0 4 0 2 o h i si l rl 即l y $ 崛t + p 髓t 腿v 札t r p c y si y r 田2 - 1 河蚌肉氨基酸评分 比较标准：1 鳃5 年w h o 推荐蛋白质模式( 2 - 5 岁) f i g u r e 2 - 1 9 l l t i n o a c i d s c o r e o f t h e m u s c l e o f 蜘o p s s c u m i n g i i b a s e d m w h o s “g g e a e d l e v e l ( 1 篼s ) 1 0 陆 几u n u几ununun川u几u 中国农业大学硕士学位论文 第二章河蚌肉营养成分分析与评价 从蛋白质的营养价值来看，以1 9 8 5 年w h o 推荐的蛋白质模式中的必需氨基酸含量( 2 巧 岁) 为基准，计算出蚌肉蛋白质的氨基酸评分，如图2 1 所示，第一限制氨基酸为色氨酸，其氨 基酸评分为7 4 5 ，第二限制氨基酸为组氨酸( 8 3 1 ) 氨基酸评分高，组成合理，易为人体吸收 在蚌肉的氨基酸组成中，谷氨酸含量最高，占氨基酸总量的1 7 5 8 谷氨酸是中枢神经系统内的 重要神经递质，通过与其受体作用。调节正常脑内几乎所有的功能，包括学习和记忆i 研赖氨酸 含量也比较高。占蚌肉的0 9 7 6 。根据必需氮基酸在生长中的需要量，赖氨酸捧在各必需氨基酸 之酋0 0 0 而且我国居民膳食以谷物为主。谷物中缺乏的赖氨酸造成谷物蛋白质利用辜降低，增加 赖氨酸的摄入可提高总体蛋白质利用率，形成互补作用故河蚌肉蛋白质营养价值高。是优质韵 蛋白质源。 2 5 本章小结 河蚌肉蛋白质含量高，氨基酸评分为0 7 4 5 ，是优质的蛋白质源，蛋白质的氨基酸组成中，9 种特征氨基酸占氨基酸总量的如3 9 。河蚌肉含丰富的蛋白质和合理的氨基酸组成，适宜作为制 备a c e 抑制肽的原料淡水珠养殖业快速发展产生的蚌肉急待加工利用，而蚌肉加工利用附加 值的提高又可以促进淡水珠养殖业的发展，形成良性循环 中国农业大学硕士学位论文第三章a c e 抑制肽体外检测方法的确定 第三章a c e 抑制肽体外检测方法的确定 3 1 前言 原料蛋白质经酶解反应后生成了众多的短肽和游离氨基酸，其中只有一部分短肽具有降血压 活性。由于动物实验费用昂贵且耗时，因此建立一套体外测定降血压肽活性的实验方案尤为重要 1 9 7 1 年c u s h m a n 等建立了紫外光度法1 9 , 1 0 1 1 ，a c e 在3 7 ，p h 8 3 的条件下催化分解血管紧张素i 的模拟物h i p p u r y l 锄s t i d y l - i 删l d n e 产生马尿酸，该物质在紫外2 2 8 n m 处具有特征吸收峰。当加 入a c e 抑制剂时，a c e 对h h l 的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少通过测定加入 抑制剂前后所生成马尿酸紫外吸收的大小差别即可计算出抑制活性的大小但该方法对实验操作 要求较高，实验易产生误差后来许多学者对其进行了改进：色谱法是在紫外分光光度法的基础 上发展而来的，通过高压液相色谱仪及色谱柱检测产物中h i p 的含量1 1 0 2 j 该方法具有灵敏度高， 准确性好的特点。目前有关a c e 抑制肽的研究多采用这种方法还有人将底物换成了f u r a n a c r y l o y l p h e g l y g l y 0 a p c , g ) 7 z i m i 。e 峨本身带有蓝色，在a c e 作用后光吸收减弱， 不用乙酸乙酯浸提，不用高压液相色谱检测，更为方便实用 动物实验是评价降血压肽效应的有效方式降血压肽生物学效应评价的实验动物一般是自发 性高血压大白鼠( s h r ) 降血压肽的动物试验一般采用口服或静脉注射的方式。以不同剂量喂 食或注射s h r ，同时做a c e 抑制药物对照组比较不同剂量对s 珉血压的影响，并与a c e 抑制药 物的降压效果进行比较【1 0 q 。值得注意的是，许多短肽在体外实验中对a c e 具有抑制活性，但在 体内实验中却无降压效果。许多学者认为，这是由于a c e 抑制肽摄入体内后存在一个消化降解 的过程，有可能降解为无活性的片段。也有报道认为，这些抑制肽只是a c e 的底物，不是真的抑 制剂，所以它们在体外实验测得的活性较高，而在体内无效。另外也有些a c e 抑制肽体外实验活 性不高，但动物实验结果却表明其有明显的降血压效果这可能是a c e 抑制肽被摄入体内后被胃 肠道的消化酶降解，生成了有降血压活性的片段 由于时间的原因，难于随时对承解产物的降压效果进行动物实验，此处采用1 9 7 1 年c u s h m a n 等人建立的紫外分光光度法，在s i g m a 公司药品质量控制检测程序的基础上对反应体系的大小、 萃取量等进行了一定的改进，对水解产物的a c e 抑制效果进行体外检测 3 2 材料与设备 3 2 。1 原料和主要试剂 材料名称 血管紧张素转化酶( a c e ) 马尿酰组胺酰亮氨酸( 唧l ) 乙基呱嗪乙磺酸( h e p e s ) 盐酸 乙酸乙酯 氯化钠 氢氧化钠 来源 s i g m a ，美国 s i g m a ，美国 a m r e s c o ，美国 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化学试剂公司 - 1 2 一 中国农业大学硕士学位论文第三章a c e 抑制肚体外检测方法的确定 3 2 2 主要仪器设备 仪器名称型号生产厂家 分析天平a惶20岛津制作所 恒温水浴锅 w 2 0 1 上海申生科技有限公司 ph计phs-2f上海精密科学仪器有限公司 高速台式离心机1 g l l 6 c上海安亭科学仪器厂 紫外可见分光光度计 u v - 2 1 0 0 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 旋涡混和器x w a江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公可 3 3 试验方法 3 3 1 原理 h i p - h i s - l e u + h 2 0 塑l 专h i p p u r i ca c i d + l - h i s - l - l e u 反应体系中a c e 抑制剂存在时。马尿酸的生成量会减少。通过紫外吸光法测量反应结束后 体系中马尿酸的含量，可以表征抑制j f l 活性的大小。 其中：h i p - l - h i v l - l e u 。h i p p u r y l - l - h i s t i d y l - l - l e u c i n e ，马尿酰组氨酰亮氨酸 a c ea n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，血管紧缩素转化酶 l - h i s - l - l e u i , - h i s t i d y l - l - l e u d n e ，组胺酰亮氨酸 h i p t h i p p u r i ca c i d ，马尿酸 条件：t = 3 7 ，p h i 8 3 , m ，光程l c m 3 3 2a c e 抑制肽的体外检测方法愧t 哪 药品配置： 含3 0 0 m mn a c l 的5 0 m mh e p e s 盐酸缓冲液，3 7 c 下用1 m 盐酸调至p h 8 3 3 m g m lh i p p u r y l - l - i - - i i s t i d y l - l - l e u c i n e ( h h l ) ，溶于试剂 1 m 盐酸溶液 乙酸乙醑 a c e ：溶于冷的去离子水中，0 i u m l ，用前配制 a c e 抑制剂：河蚌肉酶水解上清液或一定浓度的冻干粉溶液 根据表3 - 1 将各试剂加入到试管中， 表3 1a c e 抑制肚的体外检测 t a b l e3 - 1a s s a ym e t h o do f a c e i n l u b i t o r yp e p t i d e s 1 3 一 中国农业大学硕士学位论文第三章a c e 抑制肽体外检测方法的确定 单位：m l 麟锄制率= 等嚣订o o 3 4 结果与讨论 可靠性研究 同一水解物的冻千粉配成四个相同的稀释浓度，在完全相同的条件下，即所用试剂、反应条 件、检测设备完全相同的条件下进行a c e 抑制率的检测试验结果见表3 - 2 褒3 - 2 测定方法研究 t a b l e3 - 2r e s e a r c ho f a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t ya s s a ym e t h o d 在a c e 抑制率的测定中，( a t e s t - a h l h i b i t ) 表示反应中加入a c e 抑制剂后所产生的马 尿酸的量，( a m t e s t - a b l a n k ) 表示完全反应时产生的马尿酸的量，二者的比值表示酶解液的 a c e 抑制活性。同时根据李朝静- 1 l 的方法对上述四份水解物的a c e 抑制率进行检测，结果见表 3 - 3 寰