（分析化学专业论文）金属离子及其配合物与生物大分子相互作用的研究及分析应用.pdf

山东人掌硕卜学位论史 摘要 机体是由数以亿力计分子量大小不等的分子组成。蛋白质和核酸是体内主要 的生物大分子。核酸是遗传信息的载体，是生物物种延续、物种进化的决定因素； 蛋白质担负着各种生理功能，是生物性状的直接表达者。它在人体代谢中扮演极 为重要的角色，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行，人类绝大多数疾病都 是由蛋白质异常引起的因此核酸与蛋白质的定量分析在生命科学，生化药物， 食品分析及临床检验中都有着重要作用。深入研究小分子物质与核酸和蛋白的作 用，建立核酸，蛋白快速简便的分析方法，对分子水平上阐明生命的奥秘、开发 新型药物、攻克许多疑难病症以及促进信息科学的发展都具有重要的意义，是当 前生物分柝化学研究的前沿和热点。 本文致力于寻找新的核酸和蛋白质探针，以建立灵敏的定量检铡的方法，以 荧光和共振光散射技术为主要研究手段同时应用吸收光谱技术，表面张力测定 技术，电势电泳技术，透射电子显微技术等手段进行了机理研究和讨论。本文共 五部分。第一部分综述了核酸和蛋白质发光探针的基本原理、研究进展、发展趋 势。 在论文的第二部分，我们以e u 3 + b a 的配合物为探针建立了灵敏的核酸分析 方法研究表明。在c t m a b 存在下。核酸的加入能显著增强e u b a 配合物中 e 矿+ 的荧光。且荧光增强程度与核酸的浓度在一定范围内成正比在最佳实验条 件下，f s d n a 、c t d n a 和r n a 的线性范围分别为1 0 x 1 0 l 5 0 x 1 0 七g m i 。、3 0 ) c l o * - 1 0 x 1 0 e g m l 和8 0 x l 旷1 o 1 0 r 6 9 m i 。它们的检出限分别为0 3 3 、0 2 1 和0 9 9 n g m l 该方法用于实际样品拟南芥中d n a 含量的测定，结果令人满意机理 研究表明，c t m a b 与d n a 所形成的离子聚合物为e 矿+ b a 配合物提供了疏水 的微环境，从而使其荧光增强。另外，我们推测形成e u 3 + - b a 配合物之后多余 的队分子可以通过疏水作用进入到c t m a b 与d n a 所形成的离子缔合物中， 并通过分子问作用力将能量转移给e u 3 + 离子所以我们认为，体系的荧光增强源 于疏水微环境的形成和分子间能量转移 论文的第三部分中，1 矿b a 配合物被用作蛋白质的荧光探针，研究了蛋白 质与配合物间的作用机理实验表明，在s d b s 存在下，蛋白质的加入能显著增 山东人学碗卜学位论_ 盘= 白质的测定。b s a 、e a 和h s a 的检出限分别为3 9 ) c 1 0 9g m l 、4 0 1 0 。9g m l 和 8 5 i o - 9g m l 。机理研究认为b s a - s d b s 为t b 3 + - b a 配合物提供的疏水环境能够 减少配合物与水分子之间的碰撞而导致的能量损失，因而有利于体系荧光的增 强。另外，过量的b a 也可能通过分子问能量转移将能量传递给t b 3 + 离子，从而 迸一步增强体系的荧光 在论文的第四部分，我们报道了一个用金属配合物作共振光散射探针测定蛋 白质的y 3 + t r a - b s a s l s 新体系。实验指出，在p h 为7 5 0 的t r i s h c i 缓冲溶 液中。b s a 和s l s 可以增强y t 1 a 体系的共振光散射强度。体系共振光散射 强度增强的程度在一定范围内与蛋白质的浓度成正比，可用于蛋白质的测定 b s a 、h s a 和e a 的检出限分别为5 4 、5 0 和6 7n g m l 该方法己用于实际样 品的测定，并取得了满意的结果。研究认为，带正电荷的y 3 0 r 1 a 的配合物能 与带负电的b s a 和s l s 形成一个大的离子缔合物从而导致共振光散射强度的增 强。 在论文的第五部分，研究了a l 弘和b s a 的楣互作用。在p h 为5 7 5 的h m t a 缓冲溶液中，a l ”和b s a 的溶液混合后形成了大的聚集体，从而导致较强的光 散射强度，且光散射的强度与蛋白质的浓度在一定范围内成正比，该法可用于蛋 白质的测定b s a 、h s a 和e a 的线性范围分别为8 0 x 1 0 s i 0 x 1 0 一g m l 、 1 0 x 1 0 7 1 0 x 1 0 。5 9 m e 和1 0 x 1 0 7 i 0 x 1 0 巧g m l 。 本论文的主要特点是： 在已报道的核酸及蛋白质的测定体系中，其探针大多为染料本论文主要以 金属离子及配合物作为发光探针来测定生物大分子 i 以三种稀土一一双酮配合物为探针，分别利用荧光和共振光的方法定量测 定核酸和蛋白质，实验证明这些方法简便、快速，且有较高的灵敏度。 2 建立了以金属离子a l 弘为探针定量测定蛋白质的简便的光散射方法，该方 法的建立还为直接研究某些无机离子与生物大分子的相互作用提供有益的借鉴。 3 本文以分析化学，分子生物学为研究背景，利用荧光技术、光散射技术、 吸收光谱技术、电视显微电泳技术以及透射电子显微技术等手段研究了体系作用 的机理 山东人学帧f 学位论文 上述研究为蛋白质和核酸的检测提供了新的灵敏发光探针。 关键词：核酸，蛋白，稀土离子，荧光，共振光敖射，芦丁，苯甲酰丙酮， 噻酚甲酰三氟丙酮 l 钉 山东人学硕i 学位论史 a b s t r a c t o r g a n i s mi sc o n s t i t u t e db yh u n d r e d so fm i l l i o n so fm o l e c u l e sw i t hd i f f e r e n t m o l e c u l a r w e i g h t n u c l e i c a c i d sa n d p r o t e i n s a r et h e m o s t i m p o r t a n t b i o m a c r o m o l e c u l e n u c l e i ca c i di st h ec a r r i e ro fg e n e t i ci n f o r m a t i o n i ti sa l s ot h e d e t e r m i n a t i o nf a c t o rf o rs p e c i e s c o n t i n u a t i o na n de v o l u t i o n p r o t e i n sa r et h ec a r r i e ro f m a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，a n da r ea l s ot h ed i r e c te x p r e s s e ro fp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r s p r o t e i np l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h em e t a b o l i s mo fh u m a nb o d y , a n dt h e m o s td i s e a s eo fh u m a nb e i n gi sc a u s e db yt h ea b n o r m a lo f p r o t e i n s ot h eq u a n t i t a t i v e a n a l y s i so fn u c l e i c a c i da n dp r o t e i na r ei m p o r t a n ti nl i f es c i e n c e ，b i o c h e m i c a l m e d i c a m e n t , f o o da n a l y s i sa n dc l i n i ca n a l y s i s i ti sv e r yi m p o r t a n tf o rr e s e a r c h e r st o e x p l o r et h e s e c r e to fl i f e ，t od e v e l o pn e _ t , vf u n c t i o n a lm e d i c i n ef o rc u r i n gm a n y d i f f i c u l td i s e a s e sa n dp r o m o t et h ed e v e l o p m e n to fi n f o r m a t i o ns c i e n c e w h a tw e s h o u l dd oi st of b r t h e rp e n e t r a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n dn u c l e i c a c i d sa n dp r o t e i n ，a n dt od e v e l o pr a p i da n dc o n v e n i e n ta s s a y sf o rn u c l e i ca c i d sa n d p r o t e i n t h e r e f o r e ，i ti sah o tp o i n ti nb i o a n a l y t i c a lc h e m i c a lr e s e a r c h t h i st h e s i sf o c u s e do nt h ed e v e l o p m e n to fn e wp r o b e so fn u c l e i ca c i d sa n d p r o t e i n sa n d t oe s t a b l i s hs e n s i t i v em e t h o d sf o rt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no ft h e m ， u s e dt h ef l u o r e s c e n c ea n dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) a st h ep r i m a r yt e c h n i q u e t h ea b s o r p t i o n , d e t e r m i n a t i o no fs u r f a c et e n s i o n , e l e c t r o p h o r e s i sb yt v ，t e m t e c h n i q u e sw e r ea l s ou s e dt os t u d yt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m i nt h ef i r s tp a r to ft h i s t h e s i s ，w ec o m m e n t e do nt h eb a s i ct h e o r ya n dp r o g r e s so fl u m i n e s c e n tp r o b e sf o r n u c l e i ca c i da n dp r o t e i n t h ed e v e l o p i n gt e n d e n c yo ft h i sa r e aw a sa l s oi n c l u d e di n t h i sp a r t i nt h eo t h e rp a r t s ，f o u rs y s t e m sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d sa n d p r o t e i n s i nt h es e c o n ds e c t i o n w ed e v e l o p e de d + - b e n z o y l a c e t o n e ( b a ) c o m p l e xa s f l u o r e s c e n tp r o b et od e t e c tm i c r oa m o u n t so f n u c l e i ca c i d s t h es t u d yi n d i c a t e dt h a ti n t h e p r e s e n c eo f c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t m a b ) t h ei n s t r i n c f l u o r e s c , c n e ci n t e n s i t yo fe u 3 + i ne u s + - b e n z o y l a c e t o n e ( b a ) c o m p l e xc a nb eg r e a t l y 山东人擘颤i 学位论文 e n h a n c e db yt h ea d d i t i o no fn u c l e i ca c i d s b a s e do nt h i s as e n s i t i v em e t h o df o rt h e q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d s w a se s t a b l i s h e d u n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n s , t h e r ei sal i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e e n h a n c e m e n to ff l u o r e s c e n c e i n t e n s i t ya n dt h ec o n c e n t r a t i o no f n u c l e i ca c i d si nt h er a n g eo f1 0 1 0 4t o5 0 l 矿+ g m lf o r h e r r i n gs p e r md n a ( f s d n a ) ，3 0 1 0 母t o1 0 x 1 0 6g m lf o rc a l ft h y m u s d n a ( c t d n a ) a n d8 0 1 0 母t o1 0 1 0 正g m lf o ry e a s tr n a ( y r n a ) a n dt h e i r ； d e t e c t i o nl i m i t sa r e0 3 3 0 2 1a n d0 9 9n g m l 。r e s p e c t i v e l y t h i sm e t h o dc a nb eu s e d t od e t e r m i n et h ec o n t e n to fd n a ( d n ao fa r a b i d o p s i sl h a l i a n a ) ，i na c t u a ls a m p l e # a n dt h er e s u l ti ss a t i s f a c t o r y t h em e c h a n i s ms t u d yi n d i c a t e st h a tt h ec t m a b n u c l e i c a c i da s s o c i a t i o nc a np r o v i d eah y d r o p h o b i cm i c r o c n v i r o n m e n tf o rt h ee u 3 + b a c o m p l e x ，w h i c hn 】a k 髂t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h el a t t e re n h a n c e da n dt h e e x c e s s i v eb am o l e c u l e sc a ns o l u b i l i z ei n t on u c l e i ca c i d c t m a bi o n i cc o m p l e xb y h y d r o p h o b i cf o r c ea n dt r a n s f e rt h e i re n e r g yt oe u 弘t h r o u g hi n t e r m o l e c u l a re n e r g y t r a n s f e r s ow ec o n s i d e rt h a t i t i st h e s y n e r g i c e f f e c to f h y d r o p h o b i c m i c r o e n v i r o n m e n to fn u c l e i ca c i d c t m a ba n dt h ei n t e r m o l e c u l a re n e r g yt r a n s f e rf o r t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ti nt h i ss y s t e m i nt h et h i r ds e c t i o n , w ef o u n dt h a tt b ”一b ac o m p l e xc a nb eu s e da sp r o t e i n d e t e r m i n a t i o np r o b e sa n ds t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np r o t e i n sa n dt h ec o m p l e x e x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c ei m e n s i t yo f n ，i i lt b 3 + b as y s t e mc a nb e g r e a t l ye n h a n c e db yp r o t e i ni nt h ep r e s e n c eo fs d b s ，a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y e n h a n c e m e n tw a si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) f o rb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，e g ga l b u m i n ( e a ) a n dh u m a ns e r u m a l b u m i n ( h s a ) a r e3 9 x 1 0 4g m l ，4 0 1 0 母, g m la n d8 5 1 0 母g m l ，r e s p e c t ! v e l y s o t h i si sas e n s i t i v em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n w es t u d i e dt h em e c h a n i s m o ft h es y s t e m i ti sc o n s i d e r e dt h a tb s a - s d b ss y s t e mp r o v i d e sam i n i m u mp o l a r i t y f o rt b 3 + - b ac o m p l e x w h i c hc a np r e v e n tt h ec o l l i s i o nb e t w e e nc o m p l e xa n dw a t e r , a n dd e c r e a s et h ee n e r g yl o s so f t h et h 3 + b a s d b s b s as y s t e m t h e r e f o r et h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fr b + b ac o m p l e xi sg r e a t l ye n h a n c e d i na d d i t i o n t h e e x c e s s i v eb am o l e c u l e ss o l u b i l i z e di n t ob s a - s d b sc l u s t e rb yh y d r o p h o b i cf o r c e ， w h i c hw i l lb em a k ef o rt h ei m e r m o l e e u l a re n e r g yt r a n s f e rf r o mb at on 弘a n dr e s u l t v i n t h ee r d a a n c e m e n to ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y i nt h ef o u r t hs e c t i o n ，w er e p o r t e dak i n do fm e t a lo r g a n i cc o m p o u n da st h er l s p r o b ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n s i ti sf o u n dt h a ti nt h e ir i s h c ib u f f e r ( p h = 7 5 0 ) t h ew e a kr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) o fy 3 + r i aw a se n h a n c e d g r e a t l yb yt h ea d d i t i o no fp r o t e i na n ds l s t h ee n l 5 _ a n c e dr l si n t e n s i t yw a si n p r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i n t h ed e t e c t i o nl i m i t sf o rb s a , h s a a n de a a r e5 4 ，5 0a n d6 7n e m l ( s n = 3 ) ，r e s p e c t i v e l y s ot h i sm e t h o dh a sh i g hs e n s i t i v i t y a = l e t u a ls a m p l e sw e r ed e t e r m i n e ds a t i s f a c t o r i l y a sf o rt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m , w e t h i n kt h a tt h ep o s i t i v ec h a r g e dy r , 力力c o m p l e xc a r lc o m b i n e dw i t ht h en e g a t i v e c h a r g e db s aa n ds l st of o r mal a r g ei o n i cc o m p l e x ，w h i c hw i l l r e s u l ti nt h e e n h a n c e m e n to f r l s i nt h ef i f t hs e c t i o n , i nt h eh m t ab u f f e rs o l u t i o n ( p h = 5 7 5 ) ，a f t e ra i + a n db s a a r em i x e dt o g e t h e r , al a r g ea s s o c i a t i o nc o m p l e xo fb s a - a i + f o r m e db ye l e c t r o s t a t i c f o r c e ，w h i c hw i l ll e a dt os t r o n gl i g h ts c a t t e r i n g t h el i g h ts c a t t e r i n gi n t e n s i t yw a si n p r o p o r t i o n t ot h ec o n c e n t r a t i o no fb s a , h s aa n de ai at h e r a n g eo f 8 0 x 1 0 l i 0 x 1 0 # m e ，1 o x l o 7 1 0 x 1 0 一g m l ， 1 0 x 1 0 l i 0 x 1 0 一 e , m l ， r e s p e c t i v e l ya c t u a ls a m p l e sw e r ed e t e r m i n e ds a t i s f a c t o r i l y t h e r e b y as i m p l ea n d r a p i dn e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f m i c r oa m o u n to f p r o t e i ni se s t a b l i s h e d 1 h ec h i e fc h a r a c t e r i s t i c so ft h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： m o s to ft h er e p o r t e dp r o b e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i d a 糟o r g a n i cd y e s i nt h i st h e s i s 。w ee m p l o y e dm e t a la n dm e t a lo r g a n i cc o m p o u n d 鹋 p r o b e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f b i o l n a c r o m o l e c u l e s it h r e e1 3 - d i k e t o n er a r ee a r t hc o m p o u n dw e r eu s e da sl u m i n e s c e n tp r o b e sf o rt h e d e t e r m i n a t i o no f b i o m a c r o m o l e c u l e s t h e s em e t h o d sa 弛s i m p l e ，r a p i d ，a n dh a v eh i g h s e n s i t i v i t y 2an e wa n ds i m p l es y s t e mw a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nb y l i g h ts c a t t e r i n gm e t h o d v i 山东人学碗i 学位论文 3b a s e do nt h er e s e a r c ho f a n a l y t i c a lc h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ，m a n y e s e a r c ht e c h n i q u e s ，s u c ha sf l u o r e s c e n c e ，r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，a b s o r p t i o n , ：l e c t r o p h o r e s i sb yt va n dt e m w e r eu s e dt op e n e t r a t et h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo f h e s es y s t e m s t h ea b o v er e s e a r c h e sp r o v i d es o m en e ws e n s i t i v ef l u o r e s c e n c ep r o b e sf o rt h e l e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n sa n dn u c l e i ca c i d ( e y w o r d s ：n u c l e i ca c i d ，p r o t e i n ，r a r ee a r t h , f l u o r e s c e n c e ，r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ， r u t i n , b c n z o y l a c e t o n e ，t h e n o y l t r i f l u o r o a c e t o n e v i i 山东大学顾学位论文 符号说明 f s d n a ：鱼精子脱氧核糖核酸 c t d n a ：小牛胸腺脱氧核糖核酸 y r n a ： 酵母核糖核酸 b s a ：牛血清蛋白 h s a ：人血清蛋白 e a ：鸡蛋清白蛋白 c t m a b ：十六烷基三甲基溴化铵 c p b ： 十六烷基溴化吡啶 t x 1 0 0 ： 曲拉通x 1 0 0 s d b s ： 十二烷基苯磺酸钠 s d s ：十二烷基磺酸钠 s l s ：十二烷基硫酸钠 h m l a ：六次甲基四胺 t r i s ：三羟甲基胺基甲烷 i ，： 空白体系荧光强度 i f ：样品体系荧光强度 a i f ：加入样品后体系荧光强度的增强值 i m s o ： 空白体系共振光散射的强度 i p , d u s ： 样品体系共振光散射的强度 h l r l s ：加入样品后体系共振光散射光强度的增强值 b a ： 苯甲酰丙酮 t r a ： 噻酚甲酰三氟丙酮 t e m ：透射电子显微镜 ( ：电动电势 v l l i 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：塾丛叁日期：丝：竺：丝 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留，使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：奎 丝壅导师签名：塞整日期：坦：丝笪 山东人学坝f 学位论文 第一章绪论 机体是由数以亿力计分子量大小不等的分子组成。蛋白质和核酸是体内主要 的生物大分子，各自有其结构特征，并分别行使不同的生理功能。核酸在生命的 起源，生物的遗传变异，物种的进化等方面起着决定性的作用。近年来，现代分 子生物学的发展以及分子生物学在临床诊断中的应用，已证明许多疾病的发生， 尤其是目前困扰人类的癌症等都与体内的遗传物质一核酸的变化有着密切的关 系 1 。而蛋白质几乎涉及所有的生理过程，整体上维持生物体新陈代谢活动的 进行，是生物性状的直接表达者。因此研究机体的分子结构与功能必须先深入了 解这两类生物大分子。而探针技术是研究核酸和蛋白质结构、功能、定性、定量 的重要手段 众所周知，荧光分析法最大的优点是其高灵敏度，此外还有选择性好，方法 简捷，重现性好，取样少，仪器设备不复杂等，使其越来越成为一种重要的分析 方法 2 。荧光技术在核酸、蛋白质的研究中有着广泛应用，该法可提供很多参 数如激发光谱、发射光谱、发射峰的位置、荧光偏振、能量转移、荧光寿命、荧 光强度等，这些参数能提供核酸、蛋白质荧光生色团的结构及其所处的微环境等 的有关的信息。共振光散射技术是在普通荧光分光光度计上进行测量的光散射分 析技术在研究生物大分子的识别组装和聚集时出现丰富而灵敏的信号 3 7 ， 因而在生物分析化学研究中具有广阔的前景。本部分主要介绍一下核酸和蛋白质 发光探针研究的现状和发展趋势。 第一节核酸荧光探针的研究进展 核酸主要包括脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 和核糖核酸 ( r i b o n u c l c i ca c i d , r n a ) 两大类，它的基本单位是核苷酸( n u c l c o t i d c ) 1 9 5 3 年 w a t s o n 和c r i c k 建立了d n a 双螺旋结构模型，并根据这个模型从分子水平上阐 述了遗传信息通过d n a 的半保留复制进行传递的设想，被认为是2 0 世纪自然科 学的重大突破之一，它揭开了分子生物学研究的序幕，为分子遗传学的研究奠定 了基础；而d n a 重组技术的建立和基因工程学科的诞生，使之成为进一步揭示生 山东人学坝i 学位论文 命奥秘的有力武器，并在工业、农业、医学、药学等领域展示出巨大的应用前景。 从生物分析化学的角度研究核酸的结构、定性、定量检测方法及其与探针作用机 理仍然是人们关注的重要课题之，如果通过较简单的测试方法快速、准确地提 供生物体内核酸浓度或其结构方面的信息，将会对疾病诊断、新型抗癌药物的筛 选，以及最终战胜人类的死敌一癌症都有重要的意义 8 ，9 。 核酸含量的测定方法很多，如色谱法、探针技术法，显微光度法，免疫分析 法、分光光度法、荧光光度法以及共振瑞利散射法等。荧光光谱检测方法是定量 测定核酸的一种常用方法。但是由于核酸的天然荧光很弱，直接用其天然荧光来 研究核酸受到限制 1 0 ，1 1 ，因此人们一直在探索利用一些荧光探针来研究核酸。 荧光衍生法可为研究核酸提供灵敏的探针，但该法操作繁琐，费时，应用受到一 定限制 1 2 ，1 3 。目前，用于核酸研究和测定的常用荧光探针包括：金属离子及 金属配合物，有机染料、光化学荧光探针等。 一、金属离子荧光探针 近年来，以会属离子作为荧光探针标记和测定核酸得到了很大的发展。尤其 是三价镧系离子，它们与生物大分子问的亲和力大。当核酸三线态与镧系离子激 发态能量匹配时，可发生从核酸到镧系离子的能量转移 1 4 】。从而发射镧系离子 的特征荧光镧系离子其特征荧光具有线宽窄、激发态寿命长、s t o k e s 位移大等 优点，已成为核酸分析中常用的金属离子荧光探针 1 5 常用作核酸探针的镧系 离子有t b ( i i i ) ，e u ( i ) 1 6 - 1 8 ，这些金属离子与核酸作用后能使自身荧光增 强，并在一定的范围内与核酸浓度成正比，据此可用于核酸含量的测定。 慈云祥小组研究了1 口+ 与d n a 和r n a 的相互作用，发现t b ”离子可以与变性 的d n a 作用产生1 分+ 的特征荧光，而r n a 直接可以与t b 如作用产生其特征荧光，且 f , n a 变性前后荧光差别不大由此可进行d n a 与r n a 的同时测定。且此文采用酸变 性的方法比常用的热变性的方法简单，快速，增强效果好 1 6 杨频等 1 7 用t b 3 + 探针用来探测一些会属离子与d n a 结合部位，取得了令人 满意的结果，拓展了t b ”探针的应用范围。杨景和等用t b 3 + 作为荧光探针，通 过碱基向t b ”的能量转移增强其荧光，建立了r n a 高灵敏度的测定方法 1 8 。近 年来又将稀土共发光效应应用到核酸的研究中 1 9 ，伎核酸测量的灵敏度提高了 山东人学颂i 学位论文 一个数量级，该法不仅能测定r n a 还能测定d n a 。 c e ( i ) 2 0 也是一种较好的金属离子探针，由于c e ( i i i ) 具有其独特的荧光 性质，在弱酸性( p h 4 3 6 8 ) 的n a c l 介质中，c e ( h 1 ) 的荧光( x e x = 2 5 4 0 r i m 。x e m = 3 5 0 0 r i m ) 为多种核酸所猝灭吴霞等 2 1 利用在h ：s o | 介质中，核酸的加入可使c e ( ) 被还原为c e ( m ) 而发射三价铈的特征荧光。三磷酸盐对体系荧光有明显 的增强作用，建立了灵敏的核酸测定方法该方法的检测限达到n g 级 二，金属配合物荧光探针 金属离子一有机配体形成配合物的发光光谱特性，与配合物中有机配体和金 属离子中那些较低电子激发态能层的相对位置及性质有关 1 、金属离子发光的探针：如果配合物中金属离子的激发态m 能层在配合物的 t i 能级之下，则可能发生电子从配体三重态向金属离子激发态的非辐射跃迁( t i m ) ，然后发生m _ m + h u 的辐射跃迁，发射金属离子的敏化荧光。金属离子发 光的配合物荧光探针主要是稀土离子矿和e u 3 + 的配合物 慈云祥等的研究表明在p h6 8 7 2 的t f i s h c i 缓冲溶液中。稀土金属离子 t b ( ) 能与邻菲咯啉和核酸、变性核酸、核苷酸、多核苷酸等 2 2 ，2 3 形成三元 络合物，其荧光强度( k x - 2 9 8 n m , x e m = 5 4 3 5 r i m ) 远远强于二元络合物t b ( m ) 一 邻菲咯啉，t b ( ) 一核酸，分析认为是p h e n 的存在增强了核酸未配对碱基向t b ( m ) 的能量转移，其原因可能是形成了大的能量绝缘壳 2 4 广谱抗菌素四环素及其衍生物是一类亲癌化合物，近年来己成为诊断、治疗 肿瘤的一种常用的荧光探针，并用于临床检查和治疗中 2 5 3 。慈云祥 2 6 ，2 7 等 对e u ( ) 一四环素类配合物作为d n a 荧光探针进行了研究，并应用时间分辨荧光 技术来检测核酸，其检出限达到5 o n g m 1 ，且当有r n a 存在时，不干扰d n a 的 测定 杨景和小组研究了e u ( h i ) 一土霉素配合物与核酸的作用，e u ( i ) 一土霉素配 合物能与双链d n a 作用，导致荧光增强( x e x = 3 8 8 n m ，k m = 6 1 2 n m ) ，且d n a 增 强程度远大于r n a ，可在r n a 存在下选择性测定d n a 。检出限达1 1 2 n g m l 2 8 喹喏酮类药物是近年来发展迅速和广泛应用于l i 缶床的新一代广谱抗菌素，它 山东人学霸i 。学位论文 们通过抑制细胞d n a 的复制来杀死细菌 2 9 江崇球等 3 0 用氧氟沙星一铽配合 物为探针检测脱氧核糖核酸，其检出限1 7 x l o m o l l 金属配合物对于核酸的测定多是基于荧光增强效应，而在p h 为6 9 六次甲 基四胺一h c i 缓冲溶液中，核苷酸、多核苷酸和核酸能猝灭t b ( i ) 一钛铁试剂( t r ) 配合物的荧光( 地x - - 3 1 7 r i m , l c m = 4 9 0 h m 5 4 7 n m ) 掘此建立了测定核苷酸、多 核苷酸和核酸的灵敏方法 3 1 2 、配体发光的探针：如果金属离子( m ) 的激发态m 能层在配体s l 能级之 上，则配体分子发光是可能的配合物的形成增大了配体的刚性结构，有利于增 强配体与核酸之间的相互作用。而它们之间的相互作用改变了配合物荧光探针的 微环境，提高其荧光量子产率这类配合物的荧光与配体本身的荧光相比，向长 波方向移动 前人对于核酸的荧光配合物探针的研究较多涉及到过渡元素及稀土元素的 荧光配合物，而且配体以n n 一配位的配体( 如邻菲咯啉类衍生物) 为主，黄承志 等认为许多金属离子一8 一羟基喹啉荧光配合物具有与邻菲咯啉配合物类似的八