（光学专业论文）比率荧光系统检测ca2i中的影响因素分析及应用.pdf

中文摘要 摘要 钙离子( 口+ ) 是细胞中非常重要的第二信使，它可以介导信号的传递，在细 胞生命活动中具有非常重要的作用。许多生命现象如细胞增殖、分化、凋亡等都 与之相关。各种检测细胞内c a 2 + 浓度( 【c a 2 1 i ) 的方法与技术也随之发展起来。比 率荧光测量方法就是目前最先进的【c a 2 1 i 检测方法之一。 本文首先介绍了各种检测【c 矛1 的方法与技术，列举了比率荧光检测系统的 优点以及需要改善的地方，并就此提出了本文的研究目的与意义。 在本论文中，主要做了以下工作： 1 、对待测细胞h e p a l - 6 ( 小鼠肝癌细胞) 的荧光探针( f u r a 一2 a m ) 的标记时间和标记 浓度进行了参数筛选。通过实验，比较不同的标记效果，发现5 z m o l l 的标记浓 度和3 0 m i n 的标记时间为实验系统中f u r a 2 a m 的最佳标记参数。 2 、对计算公式【2 + 】一户k d 恹一r 曲) ( r 一r ) 中的两个定标参数r 一与 r 曲进行了体内校正，并对可能影响到这两个参数的因素做了相应分析，使测定 过程中的定标更加精确，测定结果更加接近生物体的实际水平。最后综合分析了 在不同细胞密度和不同标记浓度下测得的r 。与r 响，确定r 一- 1 9 2 0 0 3 7 6 r m 一0 4 8 0 0 0 4 1 3 、应用改善后的实验系统检测并分析了激动剂k c i 对非兴奋细胞的【c a 2 + 】j 的影 响。发现1 0 m m o l lk c i 即可引起h e p a l 一6 细胞的【c a 2 1 i 上升；当k c l 浓度上升 至3 0 m m o l l 和5 0 m m o l l 时，所引发的【c a 2 1 j 变化同1 0 m m o l l k c i 的作用没有 显著差异。 关键词：比率荧光系统；细胞内钙离子浓度( 【c 0 1 i ) ；f u m - 2 ：r m 。；r m i n 英文摘要 a b s t r a c t c a l c i u mw a sa ni m p o r t a n ti n t r a c e l l u l a rs e c o n dm e s s e n g e rw h i c hp l a y e dak e yr o l e i nn u m e r o u sc e l l u l a rp r o c e s s e s , s u c ha sc e l lp r o l i f e r a t i o n , d i v i s i o n , a p o p t o s i sa n ds o o n v a r i o u sm e t h o d sa n dt e c h n i q u e sf o rm e a s u r e m e n to fi n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u m ( c a 2 + i ) w e r ed e v e l o p e df o rr e c e n ty e a r s r a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n c et e c h n i q u ew a so n e o ft h ep o p u l a rm e t h o d s f o r c a 2 1 im e a s u r e m e n t i nt h i sp a p e r , v a r i o u sm e t h o d sa n dt e c h n i q u e sw e r ei n t r o d u c e df i r s t ；t h ea d v a n t a g e s a n dt h ei m p r o v e m e n to ft h er a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n c es y s t e mw e r ee n u m e r a t e d ，t h u s t h ep u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c ef o rt h i sp a p e rw e r ep r e s e n t e d i nt h i sp a p e r , t h em o s t l yr e s e a r c h e sa sf o l l o w ： 1 t h ep a r a m e t e r so fl o a d i n gt i m ea n dl o a d i n gc o n c e n t r a t i o nf o rf l u o r e s c e n c ep r o b e ( f u r a - 2 a m ) w e r es c r e e n e di nh e p a l - 6c e l l s t h eb e s tl o a d i n gp a r a m e t e r s ，5 m o l l a n d3 0 m i n , w e r ed e t e r m i n e db ye x p e r i m e n t s 2 r a n dr m ，t h ep a r a m e t e r si nf o r m u l af o r 【c a 2 1 j w e r ec a l c u l a t e di nv i v o a n d t h ef a c t o r sw h i c hw e r el i k e l yt oi n f l u e n c et h ep a r a m e t e r sw e r ea n a l y z e d , w h i c hm a d e c a l i b r a t i o ni nm e a s u r e m e n tm o r ep r e c i s e t h er e s u l t sw e r em o r ec l o s et or e a l i t yo f c e l l s f i n a l l y , r 帆 a n dr 曲w e r ec a l c u l a t e ds e p a r a t e l yb ya n a l y s i so nt h er e s u l t s o fd i f f e r e n tc e l ld e u s i t ya n dl o a d i n gc o n c e n t r a t i o n 3 t h ee f f e c to fk c l0 1 1n o n e x c i t a b l ec e l l sw a sa n a l y z e db yi m p r o v e ds y s t e m t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t1 0 m m o l lo fk c lc o u l dm a k e c a 2 + io fh e p a l 6c e l l sr i s e a n d c o m p a r e dw i t h1 0 m m o l lo fk c i ，t h e r ew e r ei l os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e so ft h ec h a n g e o f 【口+ 】i a r o u s e d b y 3 0 m m o f l a n d 5 0 m m o l l o f k c i k e yw o r d s ：r a t i o m e t f i cf l u o r e s c e n c es y s t e m ；i n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u m ( 【c a 2 + 】i ) ； f u r a - 2 ；r ；r m 缸 玎 主要符号说明 缩写、 【c a 2 1 i e r i p 3 m v d a c 疆 n a d p h a m l - g i n b s a n m d a d m s o s r c i c r 主要符号说明 汉语英文全称 细胞内钙离子 浓度 内质网 三磷酸肌醇 i n t r a c e l l u l a rf r e ec a z * c o n c e n t r a t i o n e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m i n o s i t o lt r i p h o s p h a t e p r r 孔道p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o np o r e 电位依赖性 阴离子通道 v o l t a g ed e p e n d e n t a n i o nc h a n n e l 腺苷酸移位酶a d e n i n en u e l e o t i d et r a n s l o c a s e 还原型烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸磷酸 乙酰甲基 b 谷氨酰胺 m i c o t i n a m i d ea d e n i n e d n u c l e o f i d ep h o s p h a t e a c e t o x ym e t h y l l - g h t a m i n e 牛血清白蛋白 b o v i n es e r u ma l b u m i n n - 甲基d 天冬氨酸 n - m e t h y ld - a s p a r t i c 二甲基亚砜d i m e t h y s u l f o x i d e 肌质网 s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m 钙致钙释放 c a 2 + _ i n d u c e dc a 2 + r e l e a 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： ，丞亟垒指导教师签名：至丛荔，绪 触f 年6 月f 口日年 月日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在沦文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 撅 7 堋年；月多曰 第一章引言 细胞是生物体进行生命活动的基本功能单位，它时时刻刻都在感受着来自 生物体内外环境的各种信息，并根据这些信息调节自身的行为，这一过程称为 细胞的信号转导( s i g n a lt r a n s d u c t i o n ) 。钙离子( 口+ ) 是细胞中的第二信使，是细 胞进行各种生命活动的主要调节枢纽之一，其信使系统往往处于多条信号转导 途径的中心位置。肌肉收缩，细胞增殖、分化、凋亡等诸多生命现象均与之相 关。伴随对c a 2 + 作用的深入研究，各种检测细胞内c a 2 + 浓度( 【c a 2 + 】i ) 的方法与技 术也随之发展起来。其中，由于具有可实时观测【c a 2 1 i 的动态变化，消除光漂 白效应等优点，比率荧光检测方法成为目前最先进的检测【c a “】i 的方法之一。 0 1 1 有关【c a 2 + 】i 最初认识到c a 2 + 与细胞功能相关是在1 8 8 2 年，当时发现心脏收缩离不开c a 2 + 的参与【1 1 。到上世纪2 0 年代后期，人们已知道激素作用于机体细胞引起细胞反应 ( 如：分泌或运动) ，其中间环节离不开c a 2 + 的参与。h e i l b m n n 在1 9 3 7 1 9 5 2 年 发表的著作中提出，c a 2 + 在生物系统中具有复杂和多功能性的观点，认为利用 c a 2 + 是所有活细胞的基本特征1 2 】。但细胞内c a 2 + 的具体作用机制仍不十分清楚。 进入年代，荧光分析技术的快速发展，使检测细胞内c a 2 + 的含量成为可能， 这也逐步揭开了c a 2 + 作用机理的神秘面纱。大量研究表明，作为联系外部刺激和 细胞内反应的第二信使，【c a 2 + 】i 的改变是其信使系统调节细胞各种反应的关键， 进而引发细胞内一系列下游事件的发生( 如：细胞增殖或凋亡【3 】) 。许多疾病都伴 随【酹+ 】i 的异常，特别是在肿瘤等病理状态下，钙离子浓度( 【c a l ) 的研究十分 引人注目。 不同种类的细胞，其在静息状态下的【c a 2 + 】会有所不同。通常情况下， c a 2 1 i 约为l o - 7 m o l l ，细胞外的【c a 2 + 】约为l o - 3 m o l l ，彼此相差3 4 个数量级1 4 | 。当 一种外部刺激到达细胞表面，并引发细胞外c a 2 t 勾流时，就可以大幅度提高 【c a 2 + 】i 。这种细胞外c a 2 + 的高速内流主要依赖相应的c a 2 + 通道来完成。 c a 2 通道是一种膜结合蛋白，它通过构象的变化来转换通道的开与闭，控制 第一章引言 c a 2 + 的流动。现在已知的c a z + 通道，主要有以下五类： 由细胞膜两侧的电位变化控制c a 2 + 通道的开启与关闭，调控c a 2 + 的流动，称 为电压操纵型c a 2 + 通道( v o c s ) 。 c a 2 + 通道因细胞外配体作用于细胞上的某种受体而被激活，称为受体操纵型 c a 2 + 通道( r o c s ) 。 由信号物质引发的第二信使激活相应通道，称为第二信使操纵型c a ：+ 通道 ( s m o c s ) 因硬性机械力而激活的通道，是机械操纵型c a 2 + j i 匾道( m o c s ) 。 细胞外c a 2 + 以非特异渗漏的方式进入细胞，是背景c e + 通道( b c s ) 。 除了上述c a 2 + 通道可以调节细胞外与细胞内c a 2 + 流动外，细胞内还拥有富含 c e + 的细胞器，称为钙库( c a l c i u ms t o r e s ) 。内质网( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ，e r ) 和线 粒体( m i t o c h o n d r i a ) 就是细胞内两个重要的钙库。 三磷酸肌醇( 口3 ) 是一种水溶性分子，可作用于e r ，开启e r 上的c e + 通道， 释放c a 2 + 到细胞质。此过程几乎发生在所有的真核细胞中，并参与许多正常的生 理活动吲。 7 线粒体中的【c a l 不是很耐6 】，但由于线粒体数量众多及其潜在的c a 2 + 摄取 能力，使它与e r 被认为是细胞内重要的钙库。线粒体上的p t 孔道( p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o np o r e ，m ) ，是由电位依赖性阴离子通道( v o l t a g ed e p e n d e n ta n i o nc h a n n e l ， v d a c ) ，即孔蛋白r i n ) 、腺苷酸移位酶( a d e n i n en u c l e o t i d et r a n s l o c a s e ，a n t ) 以 及亲环素d ( c y p d ) 复合物在内外膜交接处构成的一种复合结构。它允许相对分子 质量， 1 5 0 0 k d 的小分子物质自由通过阴。砷化合物、氮氧化合物、氧化胁迫、 低浓度的三磷酸腺苷( a t p ) 和高浓度的c a 2 + 均可使f t p 长时间开放，使c a 2 + 由线 粒体转移到细胞质。 除c a 2 + 通道的开启与钙库的释放，能使【c 矛+ 】i 升高f 8 】，外部激动剂( 如：k c l ) 的刺激也可激活相应的c a 2 + 通道，剐- c a 2 + 】i 水平【9 - 1 1 1 。 1 2 常用【c a 2 + 】i 的检测方法与技术 常 c a 2 1 i 的检测方法包括以下几种： 一激活生物发光蛋白法 1 9 6 7 年，r i d g w a y 和a s h l e y 用从水母( a c g u o r e a f o r s k a l e a ) 中分离出的一种蛋 白质一水母发光i 白( a c g u o r i n ) ，首次成功地检测了活细胞的【c a 2 + 】i 【1 习。水母发光 蛋白与c a 2 + 结合后激发产生蓝色荧光( 4 6 5 岫) 。在0 1 l 叽m o 札的【口1 范围内， 荧光强度与【c a 2 + 】成正相关，是目前应用较广的一种c a 2 + 生物发光指示剂【1 3 l 。 c a 2 + 生物发光指示剂不受光漂白效应影响，对细胞无毒性。但其不足之处在 于：高浓度c a 2 + 会使其不可逆转地失效；输出光弱，平均每6 个水母蛋白分子至 少结合1 2 个c a 2 + ，却只发射一个光子【1 4 1 ，检测较小的单细胞的【c f l i 较为困难 1 1 5 ；分子量大，必须采用微注射的方式导入细胞，并且不易在胞浆中迅速扩散； 发光高峰到达迟缓，比相应的生理过程慢，【c a 2 + i 的瞬态变化难以检测，因而限 制了其广泛的应用。 近年来，采用基因工程方法，将光降解的水母发光蛋白基因导入动、植物细 胞，并在其中表达，成功解决了负载时人工注射时的困难以及对细胞造成损伤的 问题。同时，与细胞器特异靶蛋白的结合导入，还实现了细胞器、细胞核内【c a l 的测定i x 6 - 1 s l 。但由于细胞器是不均匀的以及高浓度的c a 2 + 不仅会使光辐射增强， 还会摧毁发光蛋白l 临堋，因此，采用水母发光蛋白测定e r 的c a 2 + 水平尚有争议。 o 有机显色剂法 应用有机显色剂测定【c a 2 + 】i 是从2 0 世纪6 0 年代后期发展起来的。现在常 用的有机显色剂主要有紫脲酸铵类和偶氮类。 1 9 6 6 年j o b s i s 和o c o l m o r 首次应用紫脲酸铵测定了肌浆中的 c a 2 q ，报道 了受刺激后肌浆中【c a 2 + 】的升高【1 9 1 ，但因其检测灵敏度低1 2 0 l ，不能用于正常细 胞静息态的【c a 2 + 】j 的测定。此后相继出现其衍生物t e t r a m e t h y l m u r e x i d e ( t m x ) ， p u r p u r a t e - 3 ，3 - d i a c e t i c a c i d e ( p d a a ) 和1 ，l - d i m e t h y l p u r p u r a t e 3 ，3 - d i a c e t i c a c i d e ( d m p d a a ) ，均为低亲和力的c a 2 + 光吸收指示剂，常用于观察肌纤维细胞受刺 激时游离【c a 2 + 1 的瞬态变化【2 1 1 。 偶氮类有机显色剂主要有a r s e n a z o i i i 乜2 3 l 和a n t i p y r a l a z o i i i 2 4 2 5 1 等。此 类试剂与紫脲酸铵类试剂相比，具有较高的灵敏度和良好的对比度。1 9 7 5 年 3 第章引言 b r o w n 等首次采用注入a r s 印配o i i i 的方法测定了鱿鱼巨轴突细胞的【c a 2 + 】i 变化 后1 2 2 ，a r s e n a z o i i i 成为应用最广泛的显色剂。但该试剂受酸度影响大，使用中 需严格控制酸度。 c a 2 + 有机显色剂与c a 2 + 反应快，驰豫时间短，可用于检测快速生理反应。 但其不能透过质膜，须采用微注射法直接注入细胞，易对细胞造成损伤。此外， 其与c a 2 + 亲和力低，化学计量关系复杂，受m 9 2 + 的干扰严重，易与还原型烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( m i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e ，n a d p h ) 和 巯基作用，产生自由基和超氧化物i 抓明。 o 微型化学传感器法 微型化学传感器包括电化学传感器和光化学传感器。 1 9 6 7 年r o s s 首次应用c a 2 + 选择微电极【嚣j ；1 9 7 1 年w a l l e r 将离子交换剂微 电极技术应用于【c 矛+ 】i 的检测，使该领域的研究工作得到迅速发展【拽刈。此法 通过将c a 2 + 敏感膜灌入微电极，微电极尖端后接内充液，当细胞内c a 2 + 选择性 地向膜相迁移时，就在内充液和细胞之间产生电位差。理想情况下，电位差是 c a 2 + 活度对数的线性函数，即遵循n e r n s t 方程。其优点在于：具有极宽的线性 范围；可直接实时、连续地反映胞内任意部位【o a 2 + 】的动态变化。其不足在于： 电极响应时间比一般的生理过程慢；易受介质离子强度的影响；只适用于测定 静息状态的【c a 2 + 】i ，无法测定【c a 2 + 】i 的快速变化。 光化学传感器是采用适当的方法将c a 2 + 选择性指示剂固定在传感器的探头 上，传感器探入细胞后，通过荧光强度的变化来检测【c a 2 + 】i 。其不足之处是响 应时间较长、体积较大。 示踪技术 利用放射性同位素示踪测量c a 2 + 单向流量，进而分析其通过细胞膜的转运速 度和浓度大小。目前此法主要用于测定跨膜c a 2 + 流动和代谢动力学；可定性、定 量地分析直径较大细胞的【c a 2 + 】变化。但测定静息【c a 2 + 】并不理想，且实验过程繁 琐，易受干扰因素影响，技术复杂，需要特定的同位素测定仪。 4 比率荧光系统检测f c a 2 1 ；中的影响因素分析及应用 核磁共振法( n m r ) 核磁共振法是一种新的、非光学技术的【c a 2 1 j 的检测方法【3 。4 - f 衍生物在 1 9 f - n m r 中有一个共振，与c a 2 + 结合时光谱会发生移动，光谱移动与所结合的 c a 2 + 的量呈线性关系，且在p h 4 5 7 5 范围内不受影响，进而可以确定游离的 【c a 2 + 】。n m r 的最大优点是对生物样品没有损伤，测定时没有本底信号的干扰， 有望推广到体内大量组织，显示完整有机组织的【c a 2 + 】i ，但此方法成本较高。 回荧光标记法 c a 2 + 荧光指示剂有游离酸和乙酰甲基( a c c t o x ym e t h y l , a m ) 酯化两种形式。游 离酸形式的指示剂不能透过细胞膜，却可以与c a 2 + 结合；而a m 酯化形式的指示 剂虽不能与c a 2 + 结合，却可以通过细胞膜进入胞浆。采用将细胞与a m 酯化形式 的指示剂温孵的方式，使指示剂分子进入细胞，随后胞浆中的酯酶将其水解成游 离酸形式，再与游离c a 2 + 结合，形成复合物，同时指示剂的激发光谱峰位产生位 移。由于荧光强度与 c a 2 + 成比例，且荧光指示剂易与c a 2 + 解离，通过检测荧光 强度的变化，就可反映【c a 2 1 i 的变化p 2 1 。 第一代c a 2 + 荧光指示剂是于1 9 8 2 年，由美籍华裔科学家，加利福尼亚大学的 t s i e nr y 等【3 3 】合成，包括q u i r t - 1 、o u i n 2 、q u i n - 3 。其中以o u i n 2 的准确度较高， 且对c a 2 + 亲和力高，适于测定静息态 c a 2 + i o 但该荧光指示剂的离子选择性较差， 仅在含有较高c a 2 + 浓度时才能测型卅。 此后，他们又相继合成了第二代和第三代c a 2 + 荧光指示剂。第二代荧光指示 剂有6 种，其中以f u r a 2 性能最佳。f u r a - 2 是典型的双波长荧光指示剂，与c a 2 + 未 结合时，它的激发光谱峰位在3 8 0 h m 处；与c a 2 + 结合后，它的激发光谱峰位转移 至3 4 0 h m 处，两波长的发射光谱峰位均位于5 0 5 n m 处。通过两波长对样品的交替 激发，应用比率荧光计算公式，就可计算出样品的 c a 2 + i ，具有较高的准确度。 第三代c a 2 + 荧光指示剂有5 种，以f l u o 3 性能为佳【3 5 l ，是一种激发光波长位于 可见光区的单波长指示剂。它可避免细胞自发荧光的干扰和对细胞造成损伤，但 与c a 2 + 结合后荧光峰位无变化，故不能采用双波长比率法进行检测。 常用c a 2 + 荧光检测技术有以下几种： 第一章引言 多参量数字图像显微术 多参量数字图像显微术可分析由多种特异性分子探针标记单个活细胞所获 得的多参量荧光信掣蚓。多参量数字图像显微术由配有微分干涉和位相光学仪的 倒置显微镜、i c c d ( i n t e n s i f i e dc h a r g e d - c o u p l e dd e v i c e ) 数字相机、图像记录仪、 图像处理工作站、氙灯和汞灯以及主机控制系统构成。通过分析各分子探针随时 间变化而产生的位相、微分干涉以及荧光图像信号，便可对单个活细胞进行时间 与空间分辨的多参数定量分析【3 7 删。 o 激光扫描共焦显微法( c t s 脚 c l s m 利用置于光路中与激光焦点位置共轭的针孔抑制离焦区的荧光和杂 散光，通过在样品上移动扫描点，收集通过针孔的发射荧光而获得图像，因此提 高了成像的纵向空间分辨率( l z m ) ，实现对目标区域进行三维成像【3 9 1 。它的主要 优点是成像清晰，可对单细胞进行测量，可进行活体实验和三维重组。其不足之 处在于激发波长有限( 常用光源为氩离子或氩氪激光器) ，且时间分辨率不高。在 c a z + 检测方面，c i _ s m 主要应用于单波长c a 2 + 荧光指示剂。 双光子激发激光扫描显微术 双光子激发是指荧光物质同时被两个光子激发。对于同一对能级，双光子激 发与紫外单光子激发相比，激发光波长加倍，可使大部分入射光到达样品焦点， 提高了测量的穿透深度，并减少散射对荧光测量的干扰i 删。此外，双光子激发能 用红外或近红外光代替紫外光，且只在焦点附近激发并产生荧光，大大减弱离焦 区的光化学作用，减小对活细胞的损伤。 双光子激发荧光成像需超快激光器作为激发光源，且操作较为复杂。但随着 小型全固化固定波长超快激光器的出现，它将大大拓宽多光子激发荧光成像的应 用范围。 脉冲激光成像 脉冲激光成像采用瞬时( 3 0 0 - 3 5 0 n s ) 、高强度( 0 2 5 j ) 脉冲激光激发，用视频相 机记录发射荧光，将重复受激过程中不同延时获得的单个图像叠加，从而获得较 高的时间分辨率。脉冲激光成像的空间分辨率可达亚微米、时间分辨率可达毫秒。 f e r n a n d e z 将脉冲激光成像应用于研究细胞受激分泌和细胞受激收缩中c a 2 + 信号 的快速变化【4 1 郴】。 回时间分辨荧光寿命图像显微术 荧光寿命( t ) 是染料分子跃迁回基态前停留在激发态的特征时间。当两种t 不 同的染料被同一短脉冲激发时，受激分子的发射荧光与两种染料的t 均有关。t 不受散射、背景衰变、染料浓度、光漂白效应等因素影响，但t 对染料的化学结 构变化非常敏感。每种c a 2 + 指示剂中结合c a 2 + 和未结合c a 2 + 的t 值不同m ，且t 值不随【c a 2 1 变化，但它们对t 平均值的贡献随【c a 2 + 】而变化。时间分辨荧光寿命 图像显微术利用纳秒门多路图像放大器得到一个二维图像，每个像素值反映了荧 光探针的t 平均值。这种方法的优势在于定标简单。由于c a 2 + 指示剂的荧光强度 受环境因素影响较大，普通荧光显微方法的定标显得较为复杂，而c a 2 + 指示剂的 t 值受环境因素的影响却很小。 流式细胞仪法 流式细胞仪法利用水压使细胞悬浮液通过一根极细的小管，排成单列流过激 光束区域，使细胞产生荧光，用特定的滤光片和光电倍增管对细胞进行荧光测定。 这种方法可将特定的细胞亚群从细胞群中分离出来。它的局限性在于分析药物对 【c a 2 + i 的影响时，药物加入点与【( 矛1 j 测量点之间存在延时，无法精确测量药物 加入细胞内部后，c 0 2 + 的瞬时响应，而且流式细胞仪法仅适于测量整体细胞的 c a 2 + 响应。 比率荧光成像法 比率荧光成像法主要应用于双波长荧光指示剂的测定，所使用的仪器是比率 荧光光谱仪。光源为普通的氙弧灯，可产生两种不同波长的激发光，它们以交互 的方式激发置于倒置式显微镜载物台上的样品，样品发出的荧光经c c d 同步接 收以获取高分辨率的图像。系统运行均由计算机控制，数据的采集和分析由软件 7 第一章引言 完成。同时，相应的软件还可以加工处理去除聚焦平面以外的杂光，来获得精确 的聚焦效果。此法可对单细胞或多细胞内离子的动态变化进行实时观测。 常用c a 2 + 荧光指示剂的负载方式有以下几种： ( - ) 常温孵育法 被酯化后的荧光指示剂分子，易穿过质膜进入细胞内，在非特异性酯酶的作 用下，水解形成离子型指示剂，与游离c a 2 + 结合。由于植物细胞壁中存在非特异 性酯酶，荧光探针在进入细胞前即被分解，这种方法多用于动物细胞。 显微注入法 显微注入法包括离子微电泳注入和压力注入两种方式。前者适于带电荷低分 子量指示剂的导入；后卷则适于中性或在电场下不会发生移动的荧光指示剂。但 这种方法会对细胞造成一定程度的损伤，且不适于批量细胞和体积较小的细胞。 圆酸化导入法 在酸性介质条件下，指示剂与周围的氢离子结合处于不带电荷的非解离状 态，可通过细胞膜进入细胞内部，在p h 值较高的细胞质中，指示剂发生解离， 与细胞质中的游离c a 2 + 结合。这种方法对细胞无害，适用于植物细胞。 低温导入法 低温导入法的原理是：在低温条件下，细胞壁中的酯酶活性受抑制，无法水 解酯化型指示剂，而指示剂分子扩散进入细胞内的过程受低温的影响并不大。指 示剂分子穿过细胞质膜进入细胞内部，以低温处理一段时间后，可以积累到一定 数量。回到常温后，细胞内酯酶活性回升，将已进入胞内的指示剂分子水解成离 子形式，继而与c a 2 + 结合，并在一定波长激发光的激励下产生荧光1 4 5 1 。这种方法 在植物细胞的检测中具有良好的效果。 除上述方法外，还有a t p 诱导渗透法，阳离子输送法等装载方式。 比率荧光系统检测【c a 2 】i 中的影响因素分析及应用 1 3 比率荧光系统 通过上述简介，不难发现采用比率荧光成像技术可以应用双波长荧光指示 剂，对单细胞或多细胞内离子的动态变化进行实时观测。采用荧光标记法和常 温孵育的负载方式能够减少对细胞造成的损伤。因此目前本实验室采用的检测 【c a 2 * i 的实验系统是最为先进的方法之一。下面是本实验系统的详细介绍。 1 3 1 装置及主要检测原理 ( 一) 系统装置 比率显微荧光测量系统实验装置如图1 1 所示，主要包括：荧光光谱分析 仪( 美国p 1 1 公司) 和荧光倒置显微镜( 日本奥林巴斯i x 7 0 型) 。实验系统以高压 连续短弧氙灯为光源，由计算机程序自动控制单色仪和光阑，交替产生3 4 0 n m 和3 8 0 h m 的紫外激发光，经光纤至倒置荧光显微镜，经物镜后到待测样品。系 统采用f u r a - 2 专用物镜镜头以确保对激发光的良好透过率。发射荧光通过中心 波长为5 0 5 r i m 的窄带滤波片后，传输至增强型c c d ，经数据采集卡处理形成 6 4 位荧光图像，并利用随机图像处理软件i m a g em a s t e r 对比率图像进行实时数 据采集，根据计算公式【c 4 2 + 】= 声k 。伍一r 。) 伍。一r ) ，即可得到【c a 2 + 】 值。同时，倒置显微镜系统的一个侧光口还配备了数码相机，可方便获取高品 质图像。 图l - 1 ：比率荧光检测系统 9 1 、氙弧灯 2 、狭缝 3 ，单色仪 4 、传导光纤 5 、光纤适配器 6 、倒置显微镜 7 增强型c c d 第一章引言 ( 二) 系统主要参数 高压连续短弧氙灯 额定功率：7 5 w 椭球反射镜收集效率( e l l i p s o i d a lr e f l e m o rc o l l e c t i o ne f f i c i e n c y ) ： 6 7 激发光单色仪( 由计算机高速随机控制输出波长) 波长范围( w a v e l e n g t hr a n g e ) ：2 5 0 6 5 0 n m 最佳扫描范m ( s a n n i n gr a n g e ) ：3 0 0 6 0 0 n m 传输速度( t r a n s i t i o ns p e e d ) ： 2 m s ，p o i n t - t o - p o i n t 分辨率( r e s o l u t i o n ) ： 1 0 r 6 m o l 1 0 的c a “，其检测范围是l o - 4 1 0 o m o l l 。 与q u i n 2 相比，f u r a 2 的激发波- 长：( 3 4 0 n m 3 8 0 n m ) 与发射波长( 5 1 m 叨) 较长， 其光分解效应较小。 第一章引言 1 4 本文的研究目的与意义 由于 c a 2 + 】i 的改变与诸多细胞生理反应相联系，因此能否准确测定【c a 2 + 】i 及其变化是研究c a 2 + 作用的重要前提。 通过对常用检测【c a 2 + 】i 的方法与技术的介绍，联合应用比率荧光成像技术和 荧光标记法构建的比率荧光实验系统，在测定c a 2 + 的选择性和灵敏度等方面具有 许多优点。同时c a 2 + 荧光探针f u r a - 2 发光效率较高，使用技术相对成熟、便于应 用。在测量过程中，采用常温孵育的负载方式进行标记，既维持了细胞膜的完整 性，又避免对细胞造成损伤。 但是每一种检测系统都不可能尽善尽美，外部环境的变化( 如：荧光探针的 标记时问与浓度) 以及其它因素( 如：温度、p h 值等) 的作用，都可能对测量的最 终结果产生不利影响。 对于比率荧光检测系统，影响其测定的因素主要有以下几个方面： 温度：温度能引起f u r a 2 荧光强度的改变。温度升高则分子运动加剧，分 子问的相互碰撞会使荧光减弱；同时，温度不同，值也不同。 p h 值：荧光物质发光的最有利条件是它们的离子化状态，p h 值可影响荧光 物质的离子化程度。当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的p h 值对荧光物 质的荧光强度有较大影响。此外，细胞内p h 值升高。可抑制c a 2 + 峰值的出现， 使 c a 2 q i 降低；而p h 值降低，可升高【c h l i ，因此应严格控制溶液的p h 值。 生理条件下，p h 值的变化( 7 0 7 4 ) 对f u r a 2 的荧光光谱影响不大。 溶剂的极性与粘性：当f u r a 2 进入细胞后，溶剂的极性是影响荧光峰位改 变的主要机制。细胞内环境的粘性会影响f u r a 2 的荧光强度，粘性与光的吸收、 散射以及胞内结合型和游离型染料的相对峰位的改变相关。 f u r a 2 a m 水解：f m a - 2 a m 进入细胞后，可否被胞内酯酶完全水解为f u r a - 2 o 是比率荧光准确测量的一个重要条件。如果f u r a 2 a m 水解不完全，或除f u r a 2 外，还存在其它对c a 2 + 敏感的代谢产物，测量的准确性就会受影响。此外，f u r a 2 的泄漏，也会影响测量的准确性。而对f u r a 2 a m 来说，它的温孵参数( 浓度和 时i a j ) 将直接影响其水解程度。 1 2 f u r a - 2 光漂白：如果激发光能量过强会造成荧光探针的化学键断裂，从而损 失荧光。 房室化效应：部分f u r a 2 a m 进入亚细胞器官( 如：e r 、线粒体、分泌囊泡 等) ，水解成f u r a 2 ，后者与f u r a 2 荧光相似，却无( 0 + 结合能力，从而影响测 量的准确性。 在本论文中，针对上述因素，主要做了以下工作： 对待测细胞h e p a l 6 ( 小鼠肝癌细胞) 的荧光探针( f u r a - 2 a m ) 的标记时间和标 记浓度进行了参数筛选，得出最佳的标记条件 对计算公式【c 口2 + 】一声j 毛伍一r 。) 伍一一只) 中的两个定标参数r 。与 r m i n 进行了体内校正。同时，对可能影响到这两个参数值的因素做了相应分析， 使测定过程中的定标更加精确，测定结果更加接近生物体的实际水平。 应用改善后的实验系统检测并分析了激动剂k c i 对非兴奋细胞的【c a 2 + 】i 的 影响。 第二章比率荧光系统检测【c a l i 中的影响因素分析 第二章比率荧光系统检测【c a 2 + 】i 中的影晌因素分析 针对前一章所列举的影响因素( 如：温孵参数等) ，在本章中主要对荧光探 针( f u r a - 2 力气m ) 的标记条件进行参数筛选以及对计算【c a 2 + 】公式中的定标参数 r 。与r m i n 进行体内校正和分析。 2 1f u r a 2 简介鳓及其温孵参数 ( 一) f u r a 2 简介 f u r a 一2 ( 如图2 1 ) 化学名称为2 - 6 双乙 酸基- 5 - ( 2 一双乙酸氨基) 一5 - 甲苯胺乙氧基卜2 一 苯骈呋喃基5 嗯唑酸五钾盐，属于第二代 荧光探针。 f u r a ，2 具有较强的亲水性，难以自由 通过细胞膜进入细胞内部。在其负性基团 部分，结合上亲酯的乙酰羧甲基酯，就成 为f u r a 2 a m 。 通常采用将f u r a 2 a m 与细胞共同温 孵的方式处理一段时间，f u r a 2 a m 即可透 过细胞膜进入胞浆，随后被胞浆内的酯酶 水解为f u r a 2 ，后者再与游离c a 2 + 结合， 形成f u r a 2 c a 2 + 复合物。 f u r a ，2 与f u r a 2 c a 2 + 复合物的最大激 发光波长分别是3 8 0 r i m 和3 4 0 r i m ，且两者 的最大发射光波长均位于5 0 5 n m 。由于荧光 o 嬲一rxxxii 删矶。自 一l i r a - 2 图2 1 ：f u r a - 2 分子结构 图2 2 ；f u r a - 2 荧光强度 强度与【c a 2 + 】成比例， c a 2 + 】i 愈高，f u r a - 2 与c a 2 + 结合形成的复合物就愈多，由 激发波长3 4 0 n m 激发产生的荧光强度( f 3 4 0 ) 就愈强，而由激发波长3 8 0 h m 激发 产生的荧光强度( f 3 舯) 就愈弱( 图2 2 ) 。因此，通过计算由两波长激发产生的荧光 强度比值( f 偈8 0 ) ，即可反映【c a 2 + l 及其变化。 1 4 ( 二) f u r a - 2 a m 温孵参数 在实验过程中，采用3 7 c 恒温孵育，以保持细胞的良好生理状态和相同的 硒值；调节负载液的p h 值在7 0 7 4 ，使f u r a - 2 的荧光光谱不受其影响。对 h e p a l - 6 细胞，荧光探针的水解是否完全，可否与细胞内的游离c a 2 + 充分结合， 是影响探针标记效果最主要的因素，以下将对f u r a - 2 a m 的标记时间与标记浓 度进行筛选。 2 1 1 浓度与时间参数筛选 。实验材料 细胞培养 将h e p a l 一6 细胞( 小鼠肝癌细胞) 接种于9 0 d m e m ( g i b c o 公司) + 1 0 新生 牛血清( 四季青公司) + i l g i n ( a m r e s c o 公司) 和双抗( 青、链霉素，i o o u i m l ) 的培养基中，在3 7 c 含5 n 落c 0 2 的饱和水蒸气恒温培养箱中培养，取对数生长 期的细胞进行实验。 实验试剂 1 h a n k s 贮存液( 1 0 ) 配方：n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 00 6 舀k h 2 p 0 40 6 9 , m g s 0 4 7 h 2 02 n a c i8 0 0 9 ，葡萄糖1 0 0 9 ，三蒸水( t d w ) 9 0 0 m l ； c a c l 2 6 h 2 01 4 9 ，t d w l 0 0 m l ；用5 n a h c 0 3 调p h 为7 2 7 4 。 2 负载液：使用时将h a n k s 贮存液( 1 0 ) 稀释1 0 倍，过滤除菌，同 时加入终浓度为0 1 牛血清白蛋白( b s a ) 。 3 f u r a 一2 a m ( 0 5 m g ) ：s i g m a 公司产品；用d m s o ( - - 甲基亚砜。s i g m a ) 溶解f u r a 2 a m 后避光分装( 1 m m o l l ) 置2 0 保存。 所有未注明试剂均为分析纯。 o 实验流程 分组 f u r a 2 a m 标记浓度( 终浓度) ：l t z m o l l 、趴m o