（化学工程专业论文）阶梯生物催化协同提取薯蓣皂苷元及其洁净工艺研究.pdf

中文摘要 天然药物是现代新药发现的重要源泉，对天然药物进行化学与生物学活性研 究，发现具有开发前景的结构新类型作为先导化合物，利用适当的分离纯化手段， 将其提取出来，进行结构修饰和优化以发现新药，成为目前制备合成药物和中药 一类新药的重要发展方向。 利用生物酶催化技术实现天然药物先导化合物的提取和分离是一项新兴的 技术。植物的细胞壁以及黏液质、果胶、淀粉等杂质是提取有效成分的主要屏障， 这些成分影响植物细胞中活性成分的浸出，如果选用恰当的酶，通过酶催化反应 使这些杂质成分水解或降解，则可加速有效成分的释放提取。 本文选用根茎类植物的典型代表盾叶薯蓣作为研究对象，考察在提取盾 叶薯蓣有效成分一薯蓣皂苷元的过程中，多种生物酶阶梯分步加入的工艺条件及 其对产品收率和质量的影响，同时对薯蓣皂苷元生产废液以及废粗纤维渣的综合 利用进行了研究，对阶梯生物催化协同提取工艺和其它四种提取工艺作了简要的 对比。本文还对酶的催化机制作了初步探讨。 利用阶梯生物催化协同提取薯蓣皂苷元技术时，依次加入纤维素酶和果胶酶 复合酶制剂、淀粉酶、糖化酶，各种酶的最佳作用条件依次为纤维素酶和果 胶酶复合酶制剂：液用量为1 0 ( 1 9 原料加0 0 0 1 m l 的酶液) ，作用时间为2 h ， 反应温度为5 0 ，反应液p h 值为6 o ；淀粉酶：液用量为1 5 ，反应温度为 7 5 。c ，反应液p h 值为5 5 ，其催化终点根据碘试剂的显色反应来确定，当碘试 剂遇反应液不再显蓝色时视为终点；糖化酶：液用量为1 0 ，作用时间为2 h ， 反应温度为6 0 ，反应液p h 值为5 5 。 薯蓣皂苷元的生产废液经过中和、活性炭脱色、浓缩、结晶等工序后，可以 提取出葡萄糖；薯蓣粗纤维渣可以采用乙醇水的有机溶媒体系，以氢氧化钠为 碱化剂，一氯乙酸为醚化剂来制取c m c 。 与其它四种工艺相比，阶梯生物催化协同提取工艺产品收率最高，达到2 7 9 ；该工艺能够将薯蓣植物中9 8 的薯蓣皂苷元提取出来，所得皂苷元产品与 标准品的红外谱图像吻合，经h p l c 测定纯度达9 5 以上，熔点为2 0 2 4 c 一2 0 4 ， 符合陕西省优级品标准。 本文说明生物酶技术在天然药物有效成分的提取中具有广阔的发展前景。 关键词：天然药物；盾叶薯蓣；薯蓣皂苷元：生物酶；阶梯生物催化；熔点；红 外光谱：h p l c a b s t r a c t n a t u r a lp r o d u c t sa r et h es i g n i f i c a n ts o u i c a eo fn e wm e d i c i n en o w a d a y s n l c c h e m i c a la n db i o l o g i c a lp r o p e r t i e so f n a t u r a lp r o d u c t sa r es t u d i e di no r d e rt of r e dl e a d c o m p o u n d sw i t hg r e a tp r o s p e c t , w h i c hb l l u c t u r ec a l lb em o d i f i e da f t e rs e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n i ti sa ni m p o r t a n tm e a n so f d e v e l o p i n gn e wm e d i c i n e i ti san e wt e c h n o l o g yt oe x t r a c ta n ds e p a r a t ea c t i v ec o n s t i _ t i l e n t sf r o mn a t u r a l p l a n t sw i t he n z y m ec a t a l y s i s c e l lw a l l s ，p e c t i n s t a r c ha n do t h e r sa r ec o m m o n i m p u r i t i e si np l a n t s ，w h i c hd oh a r mt ot h ee x t r a c t i o no fe f f e c t i v ec o n s t i t u e n t s i f p r o p e re n z y m e sa r ee m p l o y e dt oa c to nn a t u r a lp l a n t s ，t h ei m p u r i t i e sa b o v ec a nb e d e c o m p o s e d ，w h i c hi so f g r e a ta d v a n t a g et ot h ee x t r a c t i o no f e f f e c t i v eo n e s d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sc h w r i g h tat y p i c a lm e d i c a lp l a n t ，w a sc h o s e nt ob e s t u d i e di nt h ep a p e r n l ep r o c e s sc o n d i t i o n so fs t e p w i s ee n z y m ec a t a l y s i sa sw e l la s t h ei n f l h e n c eo fi to nt h ey i e l da n dm e l t i n gp o i l l to fd i o s g e n i nw e r es t u d i e d m e a n w h i l e ，t h er c h s eo fw a s t el i q u o ra n dr e s i d u ei np r o d u c t i o np r o c e s sw a sd i s c u s s e d i nt h ep a p e r , c o m p a r i s o no ft h i sm e t h o da n do t h e r sw a sa l s om a d ea c c o r d i n gt ot h e y i e l da n dm e l t i n gp o i n to fp r o d u c t n 嵋m e c h a n i s mo fe n z y m ec a t a l y s i sw a sd o n e s o m er e s e a r c ho nh e r e c e l l u l a s ea n dp e c t i n a s ec o m p o u n d , a m y l a s ea n dd i a s t a t i ce n z y m ew e r ea d d e di n o r d e ri nt h em e t h o do fs t e p w i s ee n z y m ec a t a l y s i s ，a n dt h e i ro p t i m u mc o n d i t i o n s r e s p e c t i v e l yw e r e ：d o s e1 0 ，1 5 ，1 ，t e m p e r a t u r e5 0 c ，7 5 c ，6 0 。c ，p h 6 0 ，5 5 ， 5 5 t h er e a c t i o nt i m eo fc e l l u l a s ea n d p e e t i n a s ec o m p o u n da n dd i a s t a t i ce n z y m ew a s 2 ha n d6 h b u tt h a to fa m y l a s ew a sd e t e r m i n e db yc o l o rr e a c t i o no fi o d i n e ，w h i c h m e a n te n dp o i n tw h e ni o d i n ed i 血tt u r nb l u e g l u c o s ec o u l db ee x t r a c t e df r o mw a s t el i q u o ra f t e rt r e a t m e n to fn e u t r a l i z a t i o n ， d e c o l o r i z a t i o no fa c t i v a t e dc a r b o n , c o n d e n s a t i o na n dc r y s t a l l i z a t i o n c o a r s ef a b r i co f t h ep l a n tc o u l db em a d ei n t oc m c a ni m p o r t a n tc h e m i c a l 谢t l l 晰d eu s e a f t e rb e i n g a l k a l i f i e da n de t h e r i f e d c o m p a r e dw i t ho t h e rm e t h o d s ，i tc a ni m p r o v et h ey i e l da n dq u a l i t yw i t hl e s s e n e r g yc o n s u m p t i o n 9 8 d i o s g e n i nf r o mp l a n t si se x t r a c t e d i rs p e c t r t n no ft h e p r o d u c ti si na c c o r d a n c ew i t ht h a to ft h es t a n d a r d , t h ep u r i t yo fi ti sm o r et h a n9 5 a c c o r d i n gt oi t sh p l cc h r o m a t o g r a m ，a n di t sm e l t i n gp o i n ti s2 0 2 - 2 0 4 。c ，w h i c h r e a c h e st h ef i r s t g r a d es t a n d a r d t h ep a p e rs h o w st h a te n z y m et e c t m o l o g yh a sab r o a dp r o s p e c ti nt h ee x t r a c t i o no f a c t i v ec o n s t i t u e n tf r o mn a t u r a lp l a n t s k e yw o r d s ：n a t u r a lm e d i c i n e d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sc h w r i g h t d i o s g e n i n f f 珂r n ec a t a l y s i s s t e p w i s eb i o c a t a l y s i s m e l t i n gp o n i rs p e c t r u mh p l c c h r o m a t o g r a m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他入已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤注盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：童象青签字日期：力印万年二月多7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫盗盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 亘寺、青 导师签名： 签字日期：础2 月矽日 签字日期： 叼日 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 天然药物是现代新药发现的重要源泉 大自然种类繁多的植物、动物和微生物，为人类造就了各式各样的天然药物， 这些天然药物是现代新药发现的重要来源。 对天然药物进行深入系统的化学与生物学活性研究，对于发现临床上有用的 原型药物存在着极大的机会；发现具有开发前景的结构类型，并对其结构进行修 饰和优化以发现新药，更是一条容易取得的成功道路。 1 2 我国天然药物的发展与新药创制 新药研究与开发是一项高技术，多科学，高投入，高风险，长周期的复杂系 统工程，是指新药从选题立项，实验室研究到投产上市，扩大临床应用的整个过 程等。 1 2 1 我国的新药创制现状 我国药学有长远的历史，在科学发展史上曾经有过灿烂辉煌的一页。神农 本草经和本草纲目至今仍被各国人民所称颂【1 1 。近年来，我国药学研究及 医药工业迅速发展，建立了学科齐全的科研机构，创造了现代制药工业。 我国新药研究与开发自1 9 8 5 年实施药品管理法后，开始走上法制化，规 范化和科学化的轨道，但应该看到，我国新药研究开发的总体水平和世界发达国 家相比还处于落后的状态，新药创新在指导思想上长期以仿制为主。2 0 0 3 年上半 年。报送国家食品药品监督管理局药品注册司申请注册的绝大多数品种都是国内 制药企业仿制其他国内制药企业过了保护期的药品 2 1 。我国与国外的差距主要是 新药创制能力不强，战略转轨迟，资金不足启动慢，研制过程缺乏标准化，制剂 品种少、质量差等。 我国“入世”后，开放国内市场，逐步取消对外国投资领域的各种限制，外 商可更自由的参与中国市场的竞争。这意味着我国包括医药行业等很多行业将会 经受严峻的考验。一方面，由于涉及到知识产权和新药专利的保护，我国的西药 制药企业的生产项目因大部分不具备自己的知识产权，将受到致命的打击。另一 方面，医药产品的进口关税要降低到5 5 6 5 的水平，国外高品质的药品将会 第一章文献综述 增加进口量，药品价格也会相应下降 3 1 。此外，将会有更多的外商直接到中国大 陆办厂，技术、资金的优势加上中国廉价的劳动力将使得他们的产品成本进一步 降低，更具有市场竞争力。这一切，将使国产药品市场受到极大的冲击。但同时 这也是一种难得的机遇。入世后，国外对我国中医药的种种限制将取消或放宽， 从而有利于中医药走向世界。入世后，国际资本的大量投入，先进国家的产业生 产和管理经验，世界一流的技术水平等的进入，都将为我国新药开发研制注入新 的活力。入世后，我国市场将与国际市场更好的接轨，我国医药企业会有更多的 机会参与国际竞争【4 】。我国的医药工业必须痛下决心，借此契机尽快扭转以仿制 为主的被动局面，建立创新机制，尽快向自主研制开发转轨。 1 2 2 天然先导化合物与新药创制 针对我国药品发展面临的新形势，首先在战略上要把药品生产从仿制为主转 变到以创新为主的轨道上来。研制新药的指导思想以创制新药为重点，以与国际 规范接轨为导向【”。 新药研究是复杂的多学科协作的系统工程 6 1 。其关键的切入点是必须发现先 导化合物( 具有生物活性和药效的化合物) ，这是创新药物的前提，也是影响创 新药物周期的决定性因素【7 1 。先导物的来源有多种途径，从天然药物中寻找先导 物来研究创制新药，是公认的有效途径之一i s 】。仅从不完整的资料统计，在美国 出售的药品中，有近1 4 的药品至少含有一种来自植物的活性成分。目前各国新 药创制工作者仍在继续积极开展研充正在掀起新的天然药物研究高潮，以寻 找防病治病新的先导化合物1 9 j 。 天然先导化合物的发现为新药的目标化合物提供了结构模式，从天然结构活 性成分出发，经结构修饰，类似物的合成及系统的活性研究，总结结构与活性( 毒 性) 的相关性，可为设计新药目标化合物打下基础。 我国特有的自然条件培育的生物多样性，导致其代谢产物结构复杂多变，蕴 涵无穷尽的结构多样性，因此，我国天然资源，尤其是中草药资源极其丰富，更 加可贵的是中医中药有五千年的历史，民间更有丰富的用药经验，这对发现天然 先导物会提供无价的背景资料 9 1 。我国已经积累了数量庞大的天然药物资源，为寻 找天然先导化合物提供了极为宝贵的来源。 从天然药物创制新药应该把握好以下几个方面 1 0 - 1 2 ： 更新观念，用创新思维改革传统天然药物研究模式 目前天然药物化学的研究程序【6 】一般是，化学预试、分离纯化、结构鉴定、 化学合成或结构改造等。这种做法存在以下问题：样品用量大，周期长，耗资大， 研究结果具有很大的不确定性。组合化学的兴起和发展能为合成巨大数目的化合 2 第一章文献综述 物提供活性筛选，构建化合物库，从而加快发现先导物的速率i l3 1 4 o 用组合化 学的方法，发扬天然药物来源的生物多样性，从而保持分子骨架多样性的优势， 将天然资源中所含有的多种成分，经组合色谱技术，高效快速分离，使其分离为 尽量多的组分或成分，并反复经高通量筛选，以发现先导化合物【l ”。 重要中草药中先导物的成分研究【1 司 总结过去从中草药中寻找活性先导物所进行的工作，大多缺乏原创性，这主 要是因为在寻找先导物时，没有真正实行以生物活性跟踪和化学导向的技术方 法，缺乏能表达中草药特色或优势的药理学实验模型，从而无法发现具中草药特 色的药效成分。在进行天然先导化合物研究中必须严格执行生物活性跟踪并结合 化学导向的研究路线，在具体进行发现生物活性先导物工作中必须采取化学成分 分离与生物活性测试融为一体的机制。 已知结构的重要天然药物的结构改造，类似物合成和活性研究 对某些已知结构的天然先导物进行结构改造或修饰以及类似物合成是创新 药物研究的一个重要途径【1 8 ，1 9 j 。这类工作尽管多不具原创性，但从创新药物角 度，也还有其特点，主要是原结构母体多具某种生物活性，以针对性的结构修饰 或改造或类似物合成使其发生各种各样结构变化，产生新的生物活性化合物的几 率大为增加。 1 3 天然药物中先导化合物的提取分离 天然先导化合物大都具有显著的生理活性，一般是存在于某些植物某种器官 中的特殊成分，如生物碱类、黄酮类、皂苷类、强心苷、葸醌类、挥发油、有机 酸、香豆素、木质素等。除此之外，天然药物中还普遍含有糖类、蛋白质、植物 色素、树脂、挥发油和无机盐等成分。我国天然资源十分丰富，但是由于产地和 采收季节上的差异，先导化合物的含量往往会不同，并且，提取分离方法不同， 含量也会相差很大。为了有效、合理地利用天然资源，对天然药物中先导物的提 取分离的研究就显得十分必要。 1 3 1 传统的提取分离技术 传统的提取方法有溶剂浸提法、分馏法、吸附法、沉淀及j ；| ；：析法、升华法、 结晶和重结晶法、膜分离法、水蒸气蒸馏法【2 0 】等。这些方法在提取有效成分方 面，存在着损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点。 第一章文献综述 1 3 2 提取分离新技术 为了发展我国医药工业，推动中药现代化进程，将生物工程和化学工程的新 型技术应用到天然药物中先导物的提取分离中是目前该领域的主要发展方向。为 了解决提取过程存在的问题，一些新技术、新方法开始应用于天然先导物的提取 分离。其中包括：超| 缶界流体萃取技术、超声波提取、半仿生提取法、酶工程技 术、大孔树脂吸附分离技术、超滤技术、高速逆流色谱分离技术、微波辅助萃取 技术等【2 0 】。这些新技术解决了天然药物成分复杂不易鉴定分析提纯的问题，在 很大程度上促进了天然药物与中药的发展，并取得了良好的经济效益和社会效 益。 1 4 生物酶催化法提取天然药物中的先导化合物 坚固的植物细胞壁是提取植物中先导物的主要屏障，特别是当植物中含有大 量黏液质、果胶、淀粉时，这些成分一方面影响植物细胞中活性成分的浸出，另 一方面也影响提取液的澄清度。如选用恰当的酶，通过酶反应使细胞壁的组成成 分和部分液质等杂质成分水解或降解，则可加速先导物的释放提取。 1 4 1 生物酶的分子结构 任何生物体( 包括细胞) 要生长、发育、繁殖以进行复杂的新陈代谢，都离 不开酶的参与。酶是结构特异的蛋白质，它除了具有蛋白质结构的共性外，还有 自己独特的结构特性。 1 4 1 1 酶蛋白和辅酶或辅基 就酶分子组成而言，一些酶蛋白需要有某些辅助因子存在时j 唷催化活性。 这些辅助因子与酶蛋白结合的紧密程度并不相同。两者结合紧密且不易分离的辅 助因子称为辅基。两者结合较为松弛，在酶反应过程种与酶蛋白易分离的辅助因 子，则称为辅酶或称为“辅助底物”。酶蛋白与辅酶或辅基形成的复合物称为全 酶。 1 4 j 1 2 酶蛋白的分子结构 酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊 蛋白质，因此它的分子结构与其它蛋白质结构概念一样，有所谓的一级、二级、 三级和四级结构概念。酶的一级结构即为基本结构，是由许多氨基酸按照特定顺 4 第一章文献综述 序排列成肽链，氨基酸之间通过肽链( 一c h 2 - 士i h 一) 连接。各种氨基酸按照 不同的排列次序、以不同数量、形成种类繁多的蛋白质或酶。2 0 世纪5 0 至6 0 年代 对蛋白质空间结构取得了一系列突破性研究成果，l p a u l i n g 币l j 用x 射线衍射技术 研究提出了所谓蛋白质二级结构，是肽键盘绕成特定的弘螺旋及不同长度的6 一 折叠，再加上一些没有规则的肽链段落装配而成。在此基础上再盘绕成更高级的 三级结构或三级结构作为一个亚基，构成更完整更严密的空间构象称为四级结 构。并非所有的蛋白质都有四级结构，但调节功能的蛋白质一般具有此结构。蛋 白质具有特定的立体空间构象，才会有特定的生理功能。任何破坏稳定二级结构 的氢键或稳定的三级结构的二硫键、盐键、酯键、范德华力、金属键等，均会使 空间构象受到破坏，导致蛋白质结构松散，溶解度降低，从而失去生物学功能， 这称为蛋白质变性作用。 ：到目前为止，许多酶的基本化学结构一一级结构已经研究清楚，有的二级、 三级和四级结构也已经阐明。大多数酶只有一条肽链组成，有的酶有两条，三条 或者多条肽链组成，这种由多条相同或相似的肽链组成的酶呈现四级结构，其中 每一条肽链称为一个亚基。具有四级结构的酶通常含有2 - 6 个亚基，个别的含有 几十个。四级结构被破坏时，亚基即分离。 1 4 1 3 酶的活力部位 经研究认为，在酶蛋白分子上，不是全部组成多肽的氨基酸都起作用，而只 有少数的氨基酸残基与酶的催化活性直接相关。这些特殊的氨基酸残基，一般比 较集中在酶蛋白的一个特定区域，这个区域称为酶的活力部位或活力中心。按照 1 9 6 3 年k o s h l a n d 的提法，活力部位是由酶蛋白分子中少数几个氨基酸残基( 包含 辅基、辅酶、金属离子的酶) 组成，它们在蛋白质一级结构上的位置可能相差甚 远，当肽链折叠、盘绕时，使得它们在空间位置很接近，构成一个小的中心区域。 酶的活力部位包括底物结合部位和催化部位。前者只有与相适应的底物分子 才能结合( 如底物分子大小、形状及电荷等) ，决定着酶的专一性。而后者是催 化反应中直接参与电子授受关系的部位( 含酶的辅酶或金属部分) 。 1 4 2 酶的催化特性 生物酶催化剂是结构特异的蛋白质，这决定了与化学催化剂相比，它具有独 特的性质。 第一章文献综述 1 4 2 1 高度专一性 酶的结构决定了其高度专一的催化特性。酶结构中的结合部位处于与底物 结合的位置，决定生物酶的高度专一性，即一种生物酶只能催化一种底物或一类 底物的特定反应。对底物分子的结构，包括立体结构，取代基或作用键的位置、 构型等也有极高的选择性。甚至底物分子中含有相同的可作用基团或键时，只选 择作用于某个特定位置的基团或键。因此，生物催化反应的副反应少，收率高， 产物分离提纯简便，产物纯度高。 1 4 2 2 极高的催化效率 酶的底物结合部位和催化部位互相配合，使其具有极高的催化效率。一个酶 分子每分钟可催化1 0 0 0 ，最大可达1 0 0 万以上的底物分子发生反应。生物催化剂一 的高反应速率，使其具有催化的反应时间短，收率高的特点。 1 4 2 3 温和的反应条件 许多化学反应需在高温或低温、强酸或强碱、高压或真空等条件下进行。因 此耗能高，对设备要求高，设备投资也高。而酶催化反应一般在2 0 - - 4 0 、p h 4 9 的条件便可顺利进行。相对来说，能耗低，设备要求低，并且无需特殊的专 用设备，条件比较温和。 并且酶催化反应一般是在水溶液中进行的，所需试剂简单。反应液中除了生 物催化剂、反应物和产物以及在大多数情况下还需要一些无机或有机盐类作p h 缓冲剂外，很少用其它试剂。因此产生的环境污染要轻得多。 1 4 2 4 反应底物来源广泛 酶催化的反应物可以是化学品，也可以是农、林、畜、牧、渔业的产品或副 产品，甚至是它们的废水或是废物等。 1 4 3 生物酶催化在天然药物( 中药) 中的应用1 借助现代高新技术，改革传统制药工艺，从天然药物( 中草药) 中获得高质 量的先导化合物，使之符合现代医药的严格要求，已成为当务之急。由于酶制剂 具有专一性、特异性，在常温、常压条件下就能起催化作用，能有效提高天然药 物( 中草药) 中稀有先导物的含量，且减少了污染物的排放，实现了“绿色中药 工业”。 中草药成分复杂，有活性成分，也有如蛋白质、果胶、淀粉、植物纤维等非 6 第一章文献综述 活性成分，这些成分既影响植物细胞中活性成分的浸出，又影响中药液体制剂的 澄清度。传统的提取方法提取温度高，收率低，成本高，消耗大量溶剂，向环境 中排放众多污染物，对人体产生危害。而选用恰当的酶，可通过酶反应较温和地 将植物组织分解，并将淀粉、蛋白质、果胶等杂质分解去除，加速有效成分地释 放提取。 1 4 3 1 利用酶技术实现天然先导化合物的提取和分离 利用酶制剂或酶工程法提取天然先导化合物的研究是在2 0 世纪9 0 年代兴起 的新技术。酶技术用于中药有效成份的提取和分离已有报导。目前，对酶法在中 药提取中的应用主要在纤维素酶的作用上。由于大部分中药材的细胞壁都是由纤 维素构成的，有效成分往往包裹在细胞壁内，用纤维素酶可以破坏b d 葡萄糖链， 有利于有效成分的提取。侯嵘峤吲首次将工业纤维素酶应用于中药及药渣中， 结果表明：在5 0 ，p h 4 5 ，底物浓度为1 5 的条件下，4 8 d 时可酶解得5 以上 的葡萄糖。 1 4 3 2 利用酶技术体内增加天然先导化合物的含量 许多药用植物先导物含量很低，并且在植物体内合成途径复杂，通常有十余 个甚至几十个酶参与才能完成，故人工仿制合成很困难。应用酶分析技术，结合 同位素示踪的方法，可以阐明药用活性成分在生物体内合成途径，找出限速步骤， 再利用基因工程技术克隆这一关键步骤催化酶的基因，然后高效表达该基因，使 先导物含量增加田】。大部分中药中含有的次级代谢产物是其药理作用的物质基 础。因此加强次级物质代谢途径调节的研究非常重要，在弄清复杂的次级代谢途 径后，我们可以通过纯化关键酶，对代谢途径进行操作，从而加强我们需要获得 的较多的活性成分，或是终止我们不需要的代谢途径，去除或减少不必需的或有 毒的成分l t a j 。 1 4 3 3 利用酶技术体外提高天然先导化合物的转化 酶的专属性很强，利用酶催化水解苷键时，所用条件温和，可以保护糖和苷 元的结构不变，还可保留部分苷键得到次级苷，同时可知苷元与糖、糖与糖的连 接方式。2 0 世纪8 0 年代，很多学者开发稀有人参皂苷产品，但并未找到合适的生 产方法。近年来，已证实糖链在皂苷的生物活性方面起着重要的作用，皂苷糖分 子越少，其活性越高。赵立亚 2 5 1 等利用从微生物中分离得到一种人参皂苷一葡萄 糖苷酶，改变人参中含量较高的二醇组皂苷r a 、r e 和r d 等糖基，使之定向转化为 第一章文献综述 具有强抗肿瘤活性的人参稀有皂苷r h 2 ，纯度大于9 0 。 1 4 4 存在问题与展望 生物酶催化提取天然先导化合物，均有较高的收率，具有较大应用潜力，但 该技术也存在着局限性。酶的蛋白质本性决定了它的一些不可避免的缺点，例如 稳定性差，环境条件( 如温度、p h 值、金属离子或盐浓度) 的剧烈变化，会引 起生物催化剂活力的丧失。因此，在使用生物酶时，对实验条件要求较高，为使 酶发挥最大作用，并将其用于工业化时，必须综合考虑酶的浓度、温度、p h 、 作用时间、底物浓度等对提取物的影响。 同时，某些物质能使酶的活性增强，成为酶的激活剂，某些物质能使酶的活 性降低，成为酶的抑制剂，这些因素应引起重视。 在某些生物催化反应中，反应物浓度比普通化学反应低，特别是不溶于水的 有机化合物的反应，虽可采用有机溶剂提高反应物浓度，但由于许多有机溶剂对 生物酶有变性作用，因此选择适用的有机溶剂，同时又要能满足各种反应条件的 要求有一定的难度。由于反应物溶解度低，或由于反应物或产物浓度高时对生物 催化反应有抑制作用等原因，不得不在较低的反应物浓度下进行反应。因此，反 应器体积大，今后要在反应器设计及工程方面加以研究解决。 随着酶技术在天然药物( 中药) 中日益广泛的应用，今后研究的主要方向应 集中在对次级代谢产物的产生进行调控；一些重要中药化学成分的酶转化 【3 川；建立酶反应产物药理活性的快速筛选；酶反应产物结构的快速测定； 特殊活性酶的筛选【2 ”。总之，酶技术应用为开展天然药物( 中药) 研究提供 了新的机会和方法，应该加强酶技术的应用研究。 1 5 薯蓣属植物中的薯蓣皂苷元 自1 9 4 9 年发现可的松具有抗风湿病效用后，甾体激素的化学研究和工业生产 迅速发展，经过结构改造，合成了类型众多的甾体激素类药物，并利用从动植物 中提取出的原料进行大量生产。曾先后利用胆酸、去氧胆酸、麦角甾醇、胆固醇 和大豆甾醇等原料合成可的松、黄体酮、甲基睾丸酮等甾体激素药物。1 9 3 5 年f u j i i 和m a t s u k a w a 首次在薯蓣植物中发现了薯蓣皂苷元，2 0 世纪3 0 年代，日本藤井胜 也等人从山萆中分离出薯蓣皂苷元。1 9 4 3 年m a r k e r 研究证明薯蓣皂苷元是合成甾 体激素药物的原料，自此以后，薯蓣属植物的开发利用在全世界迅速展开。至2 0 世纪5 0 年代初，m a r k e r 汞j 用霉菌氧化作用，在甾核1 1 位引入了羟基，加之薯蓣皂 苷元具有5 、6 位双键和3 位羟基的特点，为生产甾体激素类药物奠定了良好的物 第一章文献综述 质基础吲。 。 薯蓣皂苷元是合成多种甾体激素和甾体避孕药较理想的前体，世界各国生产 的甾体激素类药物中6 0 以上以此为原料r g 。甾体激素应用广泛，发展迅速，美 国仅皮质激素一类就有6 0 多种药品上市，全球以薯蓣皂昔元为原料生产的甾体激 素类药物达1 0 0 多种。甾体避孕药对我国计划生育基本国策的实行有着重要作用。 从1 9 5 8 年开始，我国就建立了以薯蓣皂苷元为主要原料的甾体激素药物工业，目 前国内以薯蓣皂苷元为原料合成的口服避孕药、肾上腺皮质激素和性激素达5 0 多种，是医药工业中仅次于抗菌素的一个重要领域。随着甾体医药工业的迅速发 展，薯蓣皂苷元已成为合成甾体激素药物和避孕药物的重要工业原料，并在山西、 湖南、湖北、江西、四川i 、陕西、浙江等地建有薯蓣皂苷元提取工厂，产品供不 应求，价格已由1 9 9 3 年的2 7 万元t ，上涨到目前的5 0 万元t 以上。 1 5 1 薯蓣植物资源的研究 世界上薯蓣科植物共9 属，约6 5 0 种，分布于全球的热带和温带，我国和墨西 哥为主要生产国。我国有1 属约6 0 余种，全国大多数省市均有分布，但以西南各 省为多，我国含薯蓣皂苷元的根状茎植物有1 7 种、1 亚种、3 变种p ”“j 。我国对 薯蓣植物资源的开发利用始于2 0 世纪5 0 年代，1 9 6 4 1 9 7 4 年被列入国家重点项 目，。先后调查了全国2 0 个省区，6 2 0 个县，基本摸清了我国薯蓣植物的资源及其 分布状况，其中以盾叶薯蓣( d i o s c o r e a z i n g i b e r e n s i sc h w r i g h t ) 和穿龙薯蓣 ( d i o s c o r e an i p p o n i c am a k i n o ) 的品质最好。 目前，我国医药工业中主要以盾叶薯蓣、穿龙薯蓣为原料，其次以黄山药( d p a n t h a i c a p r a i ne tb u r k ) 、纤细薯蓣g r a c i l l i m a ) 、叉蕊薯蓣( d c o l l e t t i o 、粉背薯 蓣( d c o l l e t t i 矿v a r h y p o g f u a c a ) 和三角叶薯蓣( d d e l t o i d e a ) 等为原料提取薯蓣 皂苷元。薯蓣属根状茎组1 7 种植物中，薯蓣皂苷元含量以盾叶薯蓣为最高，达5 9 3 ；穿龙薯蓣、黄山药、三角叶薯蓣、粉背薯蓣、纤细薯蓣和山革含量均在2 左右；细柄薯蓣和叉蕊薯蓣为1 左右，其余7 种含量极低【3 3 】。 近年来，对分布区资源调查彤】发现，由于过度采挖，重采收，轻保护，使 资源破坏十分严重；同时对野生薯蓣采挖周期的缩短，使资源恢复期缩短，不仅 使其质量降低，而且也使种质退化严重。在2 0 世纪6 0 一7 0 年代调查中曾发现盾 叶薯蓣皂苷元含量有高达1 6 1 5 的单株，9 1 0 的单株也较易采挖到，而今最 高的仅含3 左右。并且，很多厂家由于设备简陋，工艺落后，管理水平不高， 使得薯蓣皂苷元的产率仅达到0 7 ( 常规酸水解提取法的平均收率为1 1 ) ， 且产品质量参差不齐，导致资源极大的浪费，野生薯蓣资源流失、退化严重，很 多品种濒临灭绝。因此必须对薯蓣进行人工培育，并探索新的生产工艺以提高皂 9 第一章文献综述 苷元收率以来推动薯蓣产业的快速发展。 1 5 2 薯蓣皂苷元和皂苷的化学结构 薯蓣属植物含有3 7 种以上的皂苷元，主要有薯蓣皂苷元、亚莫皂苷元、山 草皂苷元、细柄薯蓣皂苷元、3 5 - 去氧替告皂苷元、菝葜皂苷元、表一菝葵皂苷 元、杨诺皂苷元等，各种植物还含有多种相关的甾体皂苷成分 3 5 , 3 6 。 盾叶薯蓣根茎中所含的皂苷元主要是薯蓣皂苷元。薯蓣皂苷元( 俗称薯蓣皂 素，5 异螺旋甾烯3 b 醇，其化学结构如图1 1 所示) ，是异螺旋甾烷的衍生物， 在植物体内以皂苷的形式存在的，即在c - 3 位和c - 2 6 位通过皂苷键与糖链相连。 薯蓣皂苷元是特定的2 7 个c 的甾体皂苷元，其结构特征是甾核上有单个双键5 和具有3 1 3 o h ，与c - 2 5 相连的c - 2 7 甲基为a 定向，即c - 2 5 为r 构型。5 和具 有3 8 o h 的结构用以制备妊娠双烯醇酮酯，进而合成各种甾体抗炎药和女用口 服避孕药。c 11 上可由霉菌氧化引入羟基以生产各种皮质激素。 o r 7 延龄草苷 图1 - 1薯蓣皂苷元的化学结构 f i g 1 1 c h e m i c a ls t r u c t u r eo f d i o s e g n i m r = d 葡萄糖 1 0 爹 状( - 剐人 第一章文献综述 纤细皂苷 r = d 葡萄糖一d 葡萄糖- l 上量糖 薯蓣皂苷元双葡萄糖苷r = d 葡萄糖! d 葡萄糖 薯蓣皂苷r = l - 鼠李糖l 上d 葡萄糖 i ： 【广鼠李糖 图卜2干燥盾叶薯蓣中皂苷的化学结构 f i g 1 - 2 c h e m i c a ls t r u c t u r eo f s a p o n i n si nd r yd z i n g i b e r e n s i s 薯蓣中皂苷的种类很多。不但不同植物中所含的皂苷种类不同，而且同一类 植物也会因为产地的不同或者采收季节，储藏方式的不同而含有结构略有差异的 皂苷唧。以盾叶薯蓣为例，干燥的盾叶薯蓣根茎中主要有四种皂苷【3 7 】：延令草 皂苷( t r i l l i n ) 、纤细皂苷( g r a c i l l i n ) 、薯蓣皂苷元双葡萄糖苷( d i o s g e n i n d i g l u e o s i d e ) 及薯蓣皂苷( d i o s e i n ) ( 化学结构如图1 - 2 ) 。 。r 原盾叶皂苷r = d 葡萄糖 原纤细皂苷r = l 一鼠李糖 2 7 l，o - 葡萄糖 批2 f “ l 三d 葡萄糖 l 逸糖 ! d 葡萄糖 。捻 图1 3新鲜盾叶薯蓣中原皂苷的化学结构 f i g 1 - 3 c h e m i c a ls t r u c t u r eo f p r o s a p o n i n si nf r e s hd z i n g i b e r e n s i s 第一章文献综述 一些研究表明，在新鲜的盾叶薯蓣根茎中，( 异) 螺甾烷类皂苷实际上并不 存在，它们只不过是在植物的干燥、储存过程中产生的。它们的原皂苷( 化学结 构如图1 3 ) 是f 环开环后，o h - 2 6 苷化成的呋喃烷型皂苷。这些原皂苷在o h 一2 6 位上所连接的糖都是葡萄糖，它们很容易用酶或者酸水解下来，失去c - 2 6 位葡 萄糖的原皂苷f 环自动环合后得到相应的( 异) 螺旋甾烷型次级皂苷。呋喃甾烷 皂苷在早期的工作中并没有发现，主要原因是新鲜的薯蓣内含有水解原皂苷的 酶，以致在分离之前原皂苷已经被转化为相应的次级皂苷。 1 5 3 薯蓣中皂苷与糖的鉴定 皂苷类化合物属于水溶性化合物，且结构较为复杂。因其极性大，需用水、 醇或其混合物将其提取出来。目前，在实验室进行皂苷类化学成分研究时，通常 是用甲醇或工业乙醇提取，减压浓缩所得的提取液，再用氯仿或乙酸乙酯与水分 配，除去脂溶性成分，最后用水饱和的正丁醇与水分配，浓缩所得的正丁醇溶液， 即可得总皂苷。为获得纯度更高的皂苷，需进一步采用色谱方法。如大孔吸附树 脂色谱、硅胶色谱、反相色谱、液液分配色谱等。 康阿龙1 3 8 】等人从薯蓣植物中提取总皂苷用的是极性溶剂浸提法。将干燥的 薯蓣粉碎，用甲酵或9 5 的乙醇充分回流提取，所得到的提取液浓缩后得浸膏 一总皂苷的粗品。用大孔吸附树脂对总皂苷的粗品进行精制，以除去色素等杂质， 得到较纯净的总皂营。用含0 3 c m c n a 的硅胶g 薄层板，以氯仿- 甲醇一水( 6 5 ： 3 5 ：1 0 ) 为展开剂对总皂苷进行分离后，对斑点进行单波长反射式线性扫描，条 件：波长5 1 0 n m ，狭缝尺寸6 0 m i n x l 0 r a m 。结果发现干燥的盾叶薯蓣中含有盾 叶新苷和薯蓣皂苷。 胡湘春 3 0 1 等人将硅胶柱层析得到的穿山龙皂苷洗脱液收集起来，用旋转蒸 发器蒸干后得到粉末产品，然后用反相液相色谱检测其构型和纯度。将样品和对 照品用甲醇溶解后，注入色谱柱中。色谱柱：l i c h r o s p h e r c l 8 柱( 5 斗m ， 2 5 0 m i n x 4 6 m m ) ；流动相：乙腈水( 5 0 ：5 0 ) ；流速：l m l m i n ；紫外检测器 检测波长：2 1 0 n m ，进样量：l o u l 。检测结果是穿山龙中主要含有薯蓣皂苷。 薯蓣中皂苷元连接的糖链结构复杂，其测定工作主要包括确定糖的种类和单 元数；糖的连接位置；糖的连接顺序等。 1 一般来讲，将连接皂苷元和糖链的苷键断裂后，用有机溶剂将皂苷元萃取出 来，剩余的水溶液可用于进一步鉴定皂苷中糖的种类、比例等。在酸水解皂苷时， 除去皂苷元后的水溶液用碱或阴离子交换树脂中和，然后采用纸色谱、薄层色谱 或气相色谱与标准品比较鉴定水解生成的单糖。 用硅胶薄层色谱检测皂苷中糖的种类时是将水解所得的糖溶液与糖的标准 1 2 第一章文献综述 品进行对照。所用的展开剂可为氯仿甲醇水、乙酸乙酯正丁醇水等三元系统。 显色剂可以用硫酸的水或乙醇溶液。巨勇【帅】等人在研究盾叶薯蓣的皂苷结构时， 将皂苷的酸水解溶液与糖的标准品同时在硅胶薄层上展开，发现存在鼠李糖和葡 萄糖，所用的展开剂为氯仿甲醇水( 5 ：4 ；1 ) 。 气相色谱由于灵敏度高，又可同时进行分离、定性和定量，自从2 0 世纪5 0 年代末用于糖的结构分析以来，一直是皂苷研究的重要手段1 4 l j 。但是由于糖的 极性大，难挥发，不能直接进行气相色谱分析，必须预先制备成甲醚、三甲硅醚 或乙酰化物等易挥发的衍生物后进行检测。由于糖的端基异构体的存在，通常是 将全甲基化的化合物水解，经硼氢化钠还原，乙酰化，然后再进行气相色谱分析。 1 6 薯蓣皂苷元的提取分离工艺 目前用于提取薯蓣皂苷元的工艺主要有以下几种：直接酸水解法、分离法、 超临界c 0 2 流体萃取法、自然发酵法、纤维素酶解法。 1 6 1 直接酸水解法 自本世纪5 0 年代末，我国开始建立生产薯蓣皂苷元的工厂，其生产方法采 用r o t l l i o c k 【4 2 】首创的直接酸水解法生产薯蓣皂苷元的工艺。即先用硫酸或盐酸水 解薯蓣根茎，水解物用水洗涤至中性，然后干燥至含水7 - 1 2 ，再用溶剂汽油 提取。在酸水解过程中，值得注意的问题是常有副反应发生，一是若用盐酸水解则 有可能发生羟基氯代，故有人建议最好用硫酸。二是薯蓣皂营元易脱水转变为其 它的化合物，其所得量可随酸的浓度、供试品稀释程度增加而增加，而且苷比苷元 更容易形成脱水产物【4 3 1 。此外，还可发生2 5 s 转2 5 r 构型的差向异构化，产生c - 2 5 差向异构体和