（凝聚态物理专业论文）离子束诱变环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株选育.pdf

郑州大学博十学位论文 离子束诱变环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株选育 摘要 环糊精葡萄糖基转移酶( c ”l o d e x 缸g l y c o s y l n 锄s f e r a ，c g l 缸e ) 及b 环糊 精( b c y c l o d e x t r i n ，b c d ) 具有较大的应用价值。工业用c g t 船e 均由微生 物发酵产生，而b c d 是应用c g t 嬲e 转化淀粉进行生产。我国c g t a s e 及b c d 的生产虽有2 0 多年的历史，由于生产菌种发酵产酶水平较低，c g l 瓠e 及b c d 的生产成本过高导致市场价格偏高而使其应用受到一定的限制。 目前国内厂家生产菌种发酵3 0 4 0 h ，产酶水平为2 0 0 0 4 0 0 0l u i i l l 。 c g t 船e 的生产成本约占b - c d 整个生产成本的一半。应用离子束注入诱变技术 对c g t a s e 产生菌进行诱变，选育高产菌株，并研究高产菌株发酵产酶的最适发 酵条件，以降低c g l 砸e 和b d 的生产成本。 经过能量3 0 k e v 、剂量范围1 1 0 1 4 1 1 0 1 6 i o n 眈m 2 的氮离子注入诱变选 育，得到产酶水平是出发菌株1 6 2 倍的高产菌株且蹭h a _ 1 ，该菌株经中科院微 生物保藏中心鉴定为一新菌株。 经过发酵条件的优化，得到两个适宜的培养基配方和最佳培养条件。配方i 为糊精2 、玉米浆5 、k 2 h p 0 4 0 2 、( n h 4 ) 2 s 0 4o 0 2 ；配方1 i 为玉米粉2 、 玉米浆5 、k 2 h p 0 4 0 2 、m g s 0 4o 0 2 。在培养基起始p h8 9 ，温度2 8 。c 的培养条件下发酵酶活力最高，增加接种量可以缩短发酵周期。应用配方i ，以 1 0 接种量接种，在最佳培养条件下，高产菌株最s p h a 1 摇瓶发酵2 4 h 产酶水 平在6 0 0 0 i u m l 左右，4 0 h 产酶在7 0 0 0 t ，瑚i ，以上，最高达到8 0 0 0 i u ，m l 。 研究了高产菌株丑s p h a 1 产酶的传代稳定性。连续传2 0 代，f 2 f 2 0 代 产酶水平是f 1 代的9 8 1 l 1 0 2 6 6 ，表明该菌株产酶具有良好的传代稳定性。 比较高产菌株和出发菌株产生的c g t 舔e ，发现两者之间的分子量或比活力 均没有差异，认为诱变后菌株产酶水平的提高可能与c g t 鹊e 基因的转录与表达 增强有关。 对产自且s p h a 1 菌株的c g t a s e 进行纯化和酶学性质研究，结果表明该酶的 分子量为7 1 9 k d a ；在6 0 。c 活力最高，5 5 。c 以下稳定性好，6 5 的半衰期约为1 h ； 在p h5 6 时活力最高，p h5 1 1 范围内较为稳定：金属离子z n 2 + 、a g + 、h 9 2 + 、 c u 2 + 、f e 2 + 、a 1 3 + 对c g r i b e 的活性具有抑制作用。 郑州大学博士学位论文 利用c 0 1 砸e 转化淀粉生成b c d 的研究表明，在转化过程中加入有机溶剂可 以显著提高转化率，应用l o 环己烷( l 瓜g 淀粉) 可将转化率提高2 倍左右。 经过对丑s p h a 1 菌株l o l 罐发酵的研究发现，培养基溶氧、p h 变化及菌体 产酶与菌体生长有着密切关系。菌体进入对数增长期，发酵液溶氧及d h 迅速下 降，菌体开始产酶。对数增长期结束，发酵液溶氧及p h 回升至初始水平，酶产 量也趋于稳定。在菌体对数增长期，发酵液溶氧较低，发酵处于相对低氧状态。 采取在菌体进入对数增长期时适当提高转速、同时直接通入氧气的措施使发酵液 溶氧维持在1 0 0 ，可使菌体产酶到达高峰的时间大为缩短，由原来的4 0 h 左右缩 短到1 6 h 左右。 高产菌株b s p h a - l 对不同产地的原料具有良好的适应性。该菌株及c a j 缸e 的生产工艺已成功转让并应用于工业生产，5 l n 3 生产罐发酵，2 4 h 产酶水平在 6 8 0 0 i u m l 以上，达到国内同类研究的领先水平。应用发酵产生的c g t a 在3 0m 3 转化罐中转化2 5 木薯淀粉( 纯度为8 2 6 ) 生产b c d ，6 h 和1 2 h 的转化率分别 为7 2 5 和8 5 。转化成品8 七d 的含量测定为9 8 9 ，其它各项性能指标均优于 中国药典2 0 0 0 年版的标准规定。 关键词：环糊精葡萄糖基转移酶，b 环糊精，氮离子注入，诱变选育， 发酵条件， i i 郑州大学博十学位论文摘要 b r e e d i n go fc y c l o d e x t r i ng l u c a n o t 腿n s f e m s eh i g h ) r i e l ds t 豫i n b yi o ni m p l a n t a t i o n a b s t r a c t c y c l o d e x 血g l u c 锄。扛趾s 断舔e ( c g t 髂e ) a n db - c ”l o d e 妯f i n ( b - c d ) h a v e i m p o r t a i l tv a l u ci na p p l i c a t i o n t h ec g t a u s e di ni n d u s 时i ss y n t h e s i z e db y b a c t e r i a ，趴dc a nc o n v e r ts t a r c ho rr e l a t e ds u b s 廿i 札e si n t 0b - c d t h e r ca r em o r em a n t w e n 谚y e a r si n o u rc o u i l 在yt ob e g i nm ep r o d u c t i o no fc g r a s e 姐db c d n l e c g t 鹊ea c t i v i t yo fv a r i o l l ss 仃氇i 璐u s c di n 自c t o r ya r ea b o u t2 0 0 0 4 0 0 0i u ，m lw h e n c u m v a t c df o r3 0 4 0 h 1 kc o s to f c g t 船ep r o d u 砸o ni sh a l f o f t l l a to fb - c d 1 1 圮 l o w e rc g l 钒ea c t i v 蚵l e v e lo fs 劬l i l e a d st ol l i g h e rc o s to fc g t a s ea 1 1 db - c d p r o d u c t i o n t h ea p p l i c a t i o no ft h c 抑op m d u 吣a r ef e s 廿i c t e db yt l l e i rr c l 撕v d yl l i g h p i i c e ， n ec o t a s e - p m d u c i r l gs 乜a i nw 勰m u t 芒喀e n i z e db yi o ni m p l 锄t 州。丑t e c h n 0 1 0 9 y t ob m dh i g h - y i e l ds 湘j n ，a n dt l l ef e 瑚e n 旺m o nc o n d m o n so f 伦扯g h - y 主e l ds 柏j i l w e r cs t u d i e d ，s o 船t 0r e d u c et l l ec o s to fc g t a 锄db c dp r o d u c t i o n t h eh i 曲- y i e l ds 吼n 丑s p h a - 1 ，w m c hc g t 雒ea c t i v i 够l e v e lw 勰1 6 2 一f o l do f m a to ft h e 耐g i r l a ls h 证nw 船蛐e da & ri o ni m p l a n 拓岖o n 皿e 口s p h a - 1 曲面n w a si d e n t i 丘e da san e ws t r a i nb yc h i l l ag e n e m l l i c f o o i _ g a i l i s mc o n s e r v ec e n t e r i t 啷 f o u n dt h a tm u t a g 洫i i l ge f r e c t 、船v e r y9 0 0 du n d e ri i n p l 舡i 怔岫o nd o s e 丘锄1 1 0 1 4 i o n s c m 2 t o1 1 0 1 6 i o n 砒m 2a n dl l n d e ri l i l p l 舭1 嘶o nc n e r g y3 0 k c vw h 髓i m p l a n 叫o n i o n 、嬲n + a n e ro 洳i 删o no ff e m l e n t a _ d o nc o i 删o n s ，t w oo p 血a l 罂啪m e d i u mm l d t l l eb e s tc u l t l l r ec o n d i t i o nw e r co 阮i i n e d o mo 硼【m a lg r o w c l lm e d i 眦w a sc 伽叩r i s e d o f2 d c x t r i 玑5 c o m 帜pl i q u o r o 2 ，k 2 h p 0 4a n d0 0 2 ( n h 4 ) 2 s 0 4 a n o t l l e r o p t i m a lg r o w l l lr n e d i 眦w 船c o m p r i do f2 9 钯o mr n e a l ，5 哆缸o mg t e e pl i q u o r ， o 2 k 2 h p 0 4a l l do 0 2 m g s 0 4 t h eb e s tc l l l t u l ec o n d i t i w 硒廿m t 廿弛b a 曲e r i 眦 w a sc u l t i v a t o d i n t l l eg r o w m m e d i 啪w h e n t h e i 面t i a lp h 、m u e m g e d 吣m8 t o9a t 2 8 i th a da l s ob e 吼f o 衄dt l m ti tr e h e dm ep e a ko f e n 巧m e 删啦n l c he a r l i e r w h e n 口s p 姒一1s 锄【i l lw 髂f e 瑚e i l t e d 诵t l lh i 曲e r 咖o u mo fi n o c u l a t i o n u n d c f 廿l e i 郑州大学博士学位论文 摘要 b e s tc u l t u r ec o n d i t i o i l ，w h e n 曰s p h a - 1 、a sg r o w ni nt l l ef 璐to p t i m a l 罂d w t l l m e d i u mi n l es h a k e nf l a s k s ，i n 、v ! i l i c hm e 踟。咖to fi n o c l l l a d o n 、v a sl o ，1 e cg f i 、勰ea c t i v i t yr c h e dt 0a1 e v e lo f6 0 0 删，m lw h e nc u m v 劬e df o r2 4h 山e c g t a s e a c t i v i t y o b t a i n e d d l l r i n g跏i o n a r yp h a s e w 鹊 h i g h e r 龇 7 0 0 0 i u m l ，s o m e t i m e se v e n 船l l i g ha s8 0 0 0 i u m l t h ec g t i s ea c t i v n yo f f 2 f 2 0w e r ef a n g e di n9 8 1 1 1 0 2 6 6 c o m p a r e d t ot h a to ff 1 t h ec o n t i n u o l l s2 0g e n e m t i o n st c s ts h o w e d m tm em 吡m t b s p h a - 1 w a ss t a b l ei n 也ec g t a s cp r o d 咐t i o n c o m p 雒e d 也ec g t a s ep r o d u c e db yb s p h a - 1 觚d 曰s p 0 2 - l 2 9 ，也c r ew c r e n od i f r e r e n c ei nm o l e c l l l 盯w e i g h to rs p e c i f i ca c t i v i t y t h e 洫l p r o v e de m 罩7 m ea c t i v i t ) r o f t h em u t a l l ts t r a i l lm a yb er e l a 回t 0t h ee n h a n c e m 蚰to f c g t a s eg e n c 廿刁m s f c ra n d e x p r e s s i o n p u r i f i c a t i o n 趿dc k i r a c t e r i s a t i o no fc g t 勰e 劬m 召s d h a 1w e 坤s t u d i e d 1 km o l e c u l a rw e i g h tw 船7 1 9 l ( d a t h em a 】( i m a lc c ea c t i 嘶w 勰i n c n s m t e da t 6 0 。c ，a n ds o i t w 硒w h e n p h v a l u e w 船5 o0 r 6 o 1 1 l ee n 巧i n e 硎斑n c dh i g l l 枷v n y u p t o5 5 。c ，锄d i t s 埘f l i f ea t6 5 w 鹬籼u to n e h o u r 1 t w 龋s 协b l ew h 胁p h 砌l l e r a n g e df r o m5 ot ol1 o 1 1 1 ee n 巧i n ca c t i v i t yw 豁i n l l i b i n e db yz n 2 + ，a - g + ，h 9 2 + ，c u 2 + ， f e 2 + a l l d a l 3 + u s i l l gc g t a t op r o d u c eb - c dw 鹊s 缸l m c d a d d i n ga 锄a l la m o u n t ( 1 0 v v ) o fh c x 锄e t h y l e n ea 1 k y lr e s u h e di n a i li n c r e a s eo fb - c dy i e l d ，a n dt i l e t r a n s f o r m a t i o nr a l ec o m db e 蛔碑o v e da b o m2 一f o l d sc 叩啪dt ot h ec o n 乜0 1 t h ef 咖e 啦d o nm l eo f b s p h a - 1s t r a i l lw h e nc l l l 6 v a t 耐i nt a 1 k so f1 0l i 打e s w a ss m d i e d ns u g g 懿t e dt h a 士t 1 1 ed i s s o l 埘o no x y g e n 趾dp ho f m e d i 啪，a sw e l l 嬲t h e c g t a s ca c t i 讥t yw c r cc l o s e l yr e l a l e dt o 血c 鲫、柚o f b a c t 咖m s i i l c e 血e e x p o 嘲1 l i a le ) 【p o n e l l t i a lp h a b e g a l l ，t h ed i s s o l 埘o no x y g c n 趾dp ho f 蛳d i 啪 d r o p p e ds h a r p l y ，锄dt l ec n z y m eb c g 卸t ob es y n t h e s i z e d a f t c rt l ee x p o n 酬a l e x p o n e 小i a lp h a s e 、v a so v e r ，t l l ed i s s o l u t i o no x y 窘ma n dp ho fm e d i 啪咒t 眦e dt o m e i ro r i 百n a ll c v e l ，a n dt l l ea p p x i m a t cm a x i m a lo g t a a c t i v i 够w 鼬m e 璐删a t m et i m e t h ed i s s o l i i t 圭o n0 x y 辱mo fm e d i 唧w 邺7l o w 砒m ee x p o f 瑚m a l e x p o r l e 蚯a 1p h a s e ，a n dt l l ef a m e 址啪s 证as t a t e o fr e l a t i v c l y1 0 w e ro x y g e n i v 郑州大学博士学位论文摘要 a c c o r d i n g t ot h cf e r m e n t a t i o nm l e ，w ei n c r e a s e dt i es p do fr 0 捌i o np r o p e r l yw i l i l e f i l l i n gi no x y g e nd i r e c t l y t h ed i s s o l 商o no x y g e no f m 棚啪w 踮k e p t a b o u tl o o i n m ew 1 l ec o u 黜0 f 南嬲e n t 献i o na n d 勰ar e s m to f 也缸t h c 石m _ e l l s e d t or 髓c 量i 也e m a ) ( i m a lc ( 玎a s ea c t i v i 哆、a ss h o r t e n e dg r e a n y nw 鹊s h o n 髓e d 五ma _ b o m4 0 h o u r s t o1 6 h o u r s b s p h a 一1h a dg o o da d a p t a b i l i t yt om a t 耐a lo fd i 瓶：r e n ts o u r c e s t h el l i 曲- y i e l d s t r a j i la 1 1 dm ec g t 勰ep r o d u 嘶v et e c h l l i c sw e r ea l m a d ya p p l i 酣i ni n d l l s 扛y s u c c e s s 如l l y 曰s p h a 1s t r a l i l lw 嬲f e m l 即帕dj j l5 m t 锄k s 柚di t sc g t a s ea c t i v 埘 w a sd b o v e6 8 0 0 i u m lw h e nc l l l 心r a t e df o r2 4h o u r s w m c hw 硒t h ea d v a n c e dl e v e li n o l l r c o u n 缸y u s i n g2 5 t a p i o c as t a r c h 诚map u r i t yo f8 2 6 t op m d u c eb - c d c a t a l y s e db y n l e c g t 融e ，豳r 6 锄d 1 2h o u r s t l 坨呦s f o 耻觚o n 眦w a s7 2 5 蛆d 8 5 ，r c s p e c t i v e l y 1 1 1 ep u r i t yo f 6 - c dw 嬲m e m u m l e da s9 8 c i t h 髓c 印a b i l m e so f 0 一c dw e r es u p e r i o rt o 也es 恤d a r d sw h i c hw 髓eo r d a i n 融b yc h i 】噙曲哪m a c o p o e i a p u b l i s h e di n2 0 0 0 k e yw o r d s ：c y c l o d e x t r i ng l u c 锄蝴矗啪睇， p - c y c l o d e x n 姐，卜ri o nb e a i i l i i n p i a i l t a t i o n ，m u t a g e n i z i n g 锄db r e e d i i l g ，f a m e n t 鲥o nc o n d i t i o n v 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄 袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则，本人愿意承担由此产生的一切 法律责任和法律后果，特此郑重声明。 一 学位论文作者( 签名) ：乡 阳f 年 j片沌，。 ，t ， 面目 郑州大学博士学位论文弓l 言 引言 利用环糊精葡萄糖基转移酶( c g l b e ) 可将来源丰富、价格低廉的淀粉类 物质转化成b 一环糊精( b c d ) 。b c d 是由七个葡萄糖通过1 ，4 糖苷键连接 形成的环形低聚糖。由于b c d 具有内亲水、外疏水的特点，能包结多种客体分 子，起到增溶、缓释、富集及保护被包结物免受光、氧分解等作用，因此具有分 子囊的美称。b c d 作为添加剂或包埋材料在食品、医药、化妆品、农药及环保 等领域用途广泛。我国b - c d 的生产虽有2 0 多年的历史，但由于生产菌株酶产 量低及b c d 生产成本过高导致市场价格偏高而使b c d 的应用受到限制。在目 前的b - c d 工业生产中，c g t 瓠e 的生产成本约占整个成本的一半。 c g t 髂e 除可用于生产b - c d 外，还可利用c g 亿e 的偶联与歧化作用进行分子 间糖基转移反应，如将淀粉或环糊精的葡萄糖基转移到一些受体分子上，从而改 变受体的化学性能，如增加甜度、水溶性和稳定性。因此c g t a s e 及b c d 具有较 大的潜在应用市场及研究开发意义，国内外需求量逐年增加，前景非常看好。 检索国内外文献发现，对各类菌产生的c a n l s e 酶学性质及b c d 的应用研 究报道较多，而对菌种发酵条件及发酵工艺等生产方面的报道相对较少。国内 19 9 3 年张心平等人报道n 】q 31 菌株在5 l 小罐发酵2 4 h 产酶最高为3 9 2 01 1 ，m i ，。 1 9 9 3 年陕西省微生物研究所报道的环2 2 8 菌株产酶活力为5 0 0 0h ，m i ，( 成】 9 3 2 1 8 5 0 7 ) 。2 0 0 3 年曹新志等人报道应用紫外线诱变和y 射线诱变后得到的高产 菌株7 1 2 摇瓶发酵4 0 h 产酶活力为5 6 1 3n ，m i 。目前，国内生产用菌种产酶水 平大体情况是：发酵3 0 4 0 h ，产酶水平2 0 0 0 4 0 0 0r u m l 。 离子注入诱变育种是近年来兴起的一种新型诱变育种方法，具有诱变率高、 突变谱广的特点，已在农作物及工业微生物菌种的诱变育种领域取得丰硕成果。 本研究首次采用其中的氮离子注入技术对c g e 产生菌进行诱变，选育高产菌 株。主要研究内容包括：1 建立诱变和筛选体系，并根据诱变效果选择离子注 入合适的能量和剂量；考察高产菌株产酶性状的遗传稳定性；通过高产菌株与出 发菌株产酶能力、酶产物的对比研究，探讨离子注入诱变后高产菌株产酶性状改 变的机理。2 通过研究发酵培养基配方中碳源、氮源和无机盐离子的种类、浓 度配比对发酵产酶的影响，优化高产菌株发酵培养基配方；通过研究起始p h 、 温度、接种量及装瓶量对发酵产酶的影响，优化高产菌株培养条件。3 研究高 i x 郑州丈学博士学位论文 引言 产菌株发酵产生的c g t a s e 的酶学特性，包括酶的纯化及分子量研究，温度、p h 、 金属离子对酶活性和稳定性的影响研究及酶催化淀粉生成b c d 最佳反应条件 的研究。4 研究高产菌株发酵罐发酵产酶规律，根据发酵规律改进和优化发酵 工艺。5 高产菌株的生产应用研究。 经过氮离子注入诱变及发酵条件优化，使c g i b e 产生菌摇瓶发酵水平提高 了1 1 9 倍，得到的高产菌株丑s p h a 1 ( 经中科院微生物保藏中心鉴定为一新菌 株) 在5 m 3 生产罐发酵2 4 h 产酶水平可以达到6 8 0 0n i m i 以上，达到了国内同 类研究的领先水平。应用发酵产生的c g r i 缸e 转化浓度高达2 5 的木薯淀粉( 纯 度为8 2 6 ) ，在3 0m 3 生产转化罐中转化1 2 h 生成b c d 的转化率可达到8 5 。 与国内文献报道的c g l b e 产生菌及目前生产用菌种相比，该菌株不仅产酶水平 高且发酵时间明显缩短，能大幅度节约发酵能耗。目前，该高产菌株及c g ，r a s e 的生产工艺已成功转让并应用于工业化生产，同时就相关研究申报了一项专利。 该研究使得c g l b e 及b c d 的低成本生产和大规模使用成为可能。对年产 c g t 缸e5 0 吨、食品级及药用辅料级b c d6 0 0 吨规模的生产来说，可年创产值 2 5 0 0 万元左右，利税8 0 0 万元。该研究为生物转化工艺，生产过程中无有害废 水，废气的排放，生产过程产生的少量滤渣主要为茵体，含较高蛋白质，经处理 后可加工成饲料进行利用，符合国家环保和清洁生产的要求。该研究在c g l b e 及b c d 的生产中可以发挥重要作用，推广应用具有较高的经济效益和社会效 益，因此具有广阔的工业应用前景。应用本研究成果可将c g 协e 的生产成本降 低一半以上。本研究的工业化生产，可大大促进我国食品、医药等多个行业产品 质量性能的改善，促进相关产业的发展。 x 郑州大学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献- 述 微生物发酵在人们的日常生活及生产中起着很重要的作用。利用微生物发酵 可生产微生物菌体细胞，为人类所用，包括单细胞酵母和藻类、蕈菌、疫苗和微 生物杀虫剂等；微生物发酵可用于酶制剂的生产，与动植物来源的酶相比，既易 于进行大规模生产，又便于改造工艺，提高产量。目前工业应用的酶大多来自微 生物发酵，如糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、过氧化氢酶及部分药用 酶。本文研究的环糊精葡萄糖基转移酶是由微生物发酵产生，目前工业生产及应 用的此酶均来自于微生物发酵；微生物产生的初级、次级代谢产物种类繁多，如 发酵生产的各种氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类及碳水化合物等为微生物 的初级代谢产物，抗生素、色素、激素、毒素、生物碱等为微生物的次级代谢产 物。这些产物在人类的生活中都起着很重要的作用。另外，利用微生物发酵还可 以消除环境污染，如将工业、农业、林业和食品等部门的许多废弃物利用微生物 发酵加以处理和综合利用，变害为利，不仅可减轻环境污染还可以生产单细胞蛋 白；利用微生物发酵对秸秆类物质进行分解和转化改造可提高粗饲料的营养价 值；利用微生物还可以溶浸金属，处理稀有贵重金属矿、废矿、表外矿或用常规 冶炼处理不经济的富矿。总之，利用微生物发酵可提供种类繁多的产品满足人们 的物质需求，可以用来生产化学合成法无法或很难实现的产品，并且与同类产品 的化学合成相比还可减少对环境的污染，使生产更为经济、清洁、有效地进行。 应用微生物进行发酵生产的核心技术包括两部分，即微生物菌种的生产性能 和与微生物优良生产性能发挥作用有关的设备系统和最佳环境条件。菌种性能优 良与否是产量提高的关键，是生产企业的“命根子”。因此，优良菌种选育是微 生物发酵生产的基础，而好的育种方法可起到事半功倍的作用。随着物理、化学 等学科与生物学的交叉渗透发展，各种新的诱变方法不断出现，为人类改良微生 物菌种提供新途径、新方法，使微生物发酵创造更多的资源、更好地为人类服务。 1 1 微生物诱变育种方法简介 诱变育种是通过人工诱变方法诱发微生物的基因突变，人为地改变其遗传结 构和功能，通过特定的筛选方法，选育出产量高、性状优良的突变株，使其在最 郑州大学博士学位论文 第一章文献综述 适条件下合成有效产物。由于诱变育种操作简便，速度快、收效大而且诱变方法 多种多样，是科研及生产上最为常用的高产菌株的育种方式。通常可将诱交育种 的方法分为两类，即化学诱变和物理诱变。 1 1 1 化学诱变 主要是利用碱基类似物( 5 b u 、2 a p 等) 、烷化剂( e m s 、n t g 等) 和吖啶 类移码突变剂等化学诱变剂对出发菌株进行处理，筛选高产突变株。 1 1 2 物理诱变 主要是利用紫外线v ) 、x 射线( x r a y ) 、y 射线( y - r a y ) 、快中子( f n ) 、 6 0 c o 、激光、电场磁场等物理诱变因子对出发菌株进行辐照。新近发展的离予 束注入诱变技术近年来在微生物诱变育种领域功效显著，使得离子注入诱变育种 成为微生物诱变育种中的一种新方法。各种物理诱变手段都成功地得到了产量较 出发株有不同程度提高的高产株，各具特点。 1 1 2 1 紫外线 关于紫外辐射诱变的作用机制有很多解释，但较为确定的是紫外辐射使 d n a 分子形成嘧啶二聚体，妨碍双链的解开，阻碍碱基正常配对，因而影响 d n a 的复制和转录，从而引起突变或死亡。利用紫外诱变的方法已选育出大量 产量高的优良微生物菌种。如周建琴【1 】等用康乐霉素c ) 产生菌( ，0 r 硪口聊甜 妇r 阳艘fv a r 崖叼加琳括1 7 4 7 6 4 ) 的自然突变株s t _ 9 1 为出发菌株，采用u v 诱变 和自然选育的方法，筛选出的突变株u 1 0 s - 4 ，产生k - c 的能力比出发菌株提高 4 6 0 倍。随着原生质体技术的发展，利用紫外线对原生质体直接诱变处理，能在较 短时间内较大幅度地提高菌种的变异率。王筱虹翻等将红霉素产生菌红色链霉菌 ( 跏印0 叼怊e s 叼肭r p 淞) 的原生质体用紫外线照射后筛选得到比对照菌株效价提 高2 2 5 8 的高产菌株h p 3 。紫外诱变技术是诱变和筛选优良菌株的常规育种 方法，其操作安全简便，被广泛地应用于微生物诱变。 1 1 2 2 激光 激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合作用，直接或间接 地影响生物有机体，引起细胞d n a 或r n a 、质粒、染色体畸变效应、酶的激活或 钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。不同种类的激光辐射生物有机体，所 表现出的细胞学和遗传学变化也不同，这绘生物诱变育种提供了有利条件。赵 郑州大学博士学位论文第一章文献综述 炎生【卅等对比了紫外、h e - n e 激光、n d ：y a g 倍频脉冲激光对脱落酸产生菌 ( 肋嘲出c 加p ，p 口u u d 1 ) 的诱变效果，发现n d ：y a g 倍频脉冲激光诱变效果最 好，所得高产菌株效价提高率可达6 0 以上。王卫卫f 4 】等采用h e n e 激光诱变孢 子和对原生质体直接进行诱变，从一株产y 亚麻酸( g i a ) 的原始菌株少根根霉 ( r 厅拓印姗口砌拓淞) r 8 中选育出突变株r c 3 7 8 ，比原始菌株油脂含量提高了 1 3 0 8 ，g l a 含量提高了2 7 6 7 。 1 1 2 3 _ r 一射线 y 一射线与x 射线由光子组成，是间接电离辐射。一般具有较高的能量，能产生 高速运动的次级电子，因而直接或间接地改变d n a 结构。廖爱芳1 5 】用青霉素、超 声波对庆大霉索产生菌棘孢小单孢菌( 舭r d 用口玎d e 即me 曲咖阳) 2 3 1 8 的孢 子进行预处理，再用6 0 c o 进行辐射诱变，筛选出的高产菌株7 9 、1 6 7 ，摇瓶发酵效 价比亲株2 3 1 8 提高2 0 ，发酵周期缩短l o 小时，且生产能力稳定。魏赛金【曰等采 用不同剂量的6 0 c o 射线，对南昌霉素产生菌- 南昌链霉菌( 勋唧岫7 ，1 ) 栅， 阳”c 口，伊珊担) 8 0 5 3 - 1 1 6 菌株的孢予进行处理，结果表明，3 万伦琴的诱变剂量具 有较好的诱变效应，连续四批摇瓶发酵试验突变株平均产量比出发菌株提高5 0 以上。 1 1 2 4 电离辐射 具有贯穿性能的电离辐射对细胞的作用是十分广泛和深刻的。辐射能量的吸 收和传递使细胞中精密组织的生物大分子产生激发和电离状态，特殊的生物结构 使电子转移和自由基链式反应得以进行，导致原初生化损伤。亚细胞结构损伤引 起酶的释放，代谢方向性和协调性的破坏促使原初损伤进一步扩展。 1 1 2 5 离子束 重离子属于带电粒子，能直接引起电离。在与生物材料相互作用中，由于重 离子束具有高传能线性密度( l e t ) ，且在射程的末端还有尖锐的电离峰均g g 峰) ，使其能在生物介质中产生高密度的电离和激发事件，同时产生的高活度自由 基对生物体造成间接损伤，从而引起较强的生理生化作用。离子注入除了像一般 辐射一样由于能量作用引起d n a 链断裂外，还由于质量、电荷的协同作用引起受 体原子移位、重组，形成新的分子结构和基团t 羽，产生丰富的基因突变，因而可以获 得较高的突变率。另外在峰值范围内，注入离子与生物的相互作用是局部的、不 郑州大学博士学位论文第一章文献综述 易修复的，因此产生的突变体性状稳定较快。又由于重离子诱变参数的多样性，因 此可获得较广的突变谱。这些参数包括：离子种类、离子电荷态、离子具有的能 量、剂量及剂量率等。由于离子束生物技术本身具有独特的技术原理和简单的操 作程序，虽作为一种新方法起步较晚，但随着其好的诱变效果被越来越多的研究 成果所证实，在微生物育种领域应用日益广泛。 1 2 离子束生物工程的研究及应用现状 1 2 】离子束生物工程兴起与发展 随着低能加速器和离子注入技术的发展，低能离子与物质相互作用研究对半 导体工业、微电子和材料科学产生了重大影响。2 0 世纪8 0 年代中期，中国科学院 等离子体物理所研究人员发现了离子注入水稻的诱变作用，证实了质量( 粒子) 沉积生物效应的存在，开辟了低能离子与物质相互作用新的研究方向【9 - 1 1 j 。离子 注入生物效应发现不久，根据低能离子与生物体相互作用原理，离子束诱变育种 技术和离子束介导转基因技术很快发展起来，并在农作物和工业微生物育种领域 得到了广泛的应用和丰硕的成果，为生物的遗传改良开辟了一条新途径，引起 了国内外学者的关注。 1 2 2 离子束生物工程与诱变育种 离子束在遗传改良上应用研究工作开展最早的是诱变育种。研究发现，将带 电的离子束注入生物体后，会产生多种效应，其中包括物理效应、化学效应和生物 效应。首先载能离子束使生物体局部产生刻蚀，形成特定的通道，进而发生能量传 递、电荷交换、分子碰撞、质量沉积等物理效应和化学效应，引起沉积离子和本 底离子的重排和化合，产生出新的分子和大量的自由基【1 2 17 1 。在化学反应中涉及 到细胞内遗传物质的损伤和修复 】埘，酶的激活或失活”9 】，代谢途径的变化甚至最 终代谢产物发生改变等等。物理效应和化学效应都发生在分子水平上，由此造成 的损伤是基本的微观损伤，再经过一个不可逆的生物放大过程，就会产生宏观的生 物效应。生物学效应涉及到因生物大分子受到损伤而导致代谢紊乱，如生物合成 的前体物质供应不足、许多重要的生化代谢受到干扰、细胞质膜或细胞核膜遭到 破坏、分生组织不能进行正常的有丝分裂、生长发育受到刺激或抑制，从而引起 生物体发生性状变异等等。低能离子束注入产生的诱变作用能够创造出各种各样 的突变体，其中包括形态学上的突变体和生理生化特性方面的突变体等。通过对 4 郑州大学博士学位论文 第一章文献综述 突变体进行鉴别和筛选之后，可望选育出光合效率高和抗逆性强、早熟高产优质 和综合性状优良的农作物新种质或合成所需代谢产物产量高的微生物新菌株。 1 2 _ 2 1 在农作物育种上的研究及应用 目前，在农作物诱变育种方面，离子注入改良的范围几乎涉及所有的主要粮食 和经济作物。经离子注入获得的有实用价值的育种材料已有3 0 0 0 余份，从中选育 出的优良品种已在安徽、山东、浙江、江西、河南等省推广。已经通过审定的两 个水稻新品种d 9 0 5 5 和s 9 0 4 2 ，米质比原品种提高1 2 个等级，对多种病虫害的抗性 提高l 3 级，d 9 0 5 5 还被评为优质米新品种。这两个品种已在安徽、江西、湖北 等省累计推广1 1 0 0 万亩，平均每亩较当地栽培品种增产3 0 5 0 k g 。后期通过省 级审定的新品种中粳6 3 和晚粳m 3 1 2 2 的产量均较对照增产1 0 以上，而且米质优， 抗逆性、抗病虫性好。 经离子束诱变选育的小麦品种皖麦3 2 号已通过品种审 定，皖9 2 1 0 在区域试验中表现突出。河南省离子束生物工程重点实验室联合省 内一些主要的农业研究单位，进行了大量的离子束诱变小麦育种研究，短短三年 时间内，在小麦诱变育种方面已有1 个品系参加省区试验，1 8 个晶系进行品 比，1 0 8 个品系进行鉴定，并获得5 7 0 个优良材料。研究选择区域性较好的品 种( 系) ，用离子束进行辐照处理，通过对辐照后约四十万粒小麦的田间综合表 现结果的研究，发现离子束诱变小麦育种有以下特征1 2 “2 2 】：1 离子注入变异率高 且当代变异突出。2 变异类型多，突变谱宽。变异类型中不仅有数量性状变异， 且有质量性状变异。从植株形态性状来看主要变异类型有株高、株型、叶型、叶 色及穗型变异，从幼苗习性上看有冬春性分离，从籽粒性状看出现有籽粒颜色和 色泽的变化，另外还有熟期和育性的变异。3 子二代分离少，子三代、四代稳 定快，可有效缩短育种年限。其它作物如玉米、大豆、烟草、甜菊、林木、茶树、 甘薯、谷子等经离子束辐照后，都获得了一批具有推广价值的新品系。安徽农业 大学的研究表明，离子注入在诱导棉花变异的产生方面效果很好。另外，离子束 在蔬菜育种上也显示了其应用价值【2 4 ，2 5 1 。 1 2 2 2 在微生物育种上的研究及应用 离子束在改良微生物方面已取得丰硕的成果。很多现有生产菌株对以往常用 的物理化学诱变方法已经表现出不同程度的抗性，而离子束作为一种新的诱变源， 表现出很好的应用效果。目前，离子束诱变技术应用于微生物菌种改良。多种工 郑州大学博士学位论文 第一章文献综述 业微生物发酵产物的产量得到了大幅度的提高，已有多个微生物菌种投入生产使 用。姚建铭等在1 9 9 3 年首次将离子注入技术运用在洳淀粉酶产生菌的诱变选育工 作中，获得了成功，菌种发酵水平由3 5 0 l l ，m g 提高到5 3 0 妇一冽。1 9 9 8 年姚建铭 等用离子束诱变技术诱变利福霉素产生菌，地中海拟无枝菌酸菌口仞脚括 胁击，8 r ，馏n p 一7 旷、2 4 2 4 ，又得到了高产株2 9 5 3 。，其发酵水平较对照提高了3 5 以 上，7 t 罐发酵试验中，效价最高可达6 8 0 0 i u m l 【捌。2 0 0 0 年姚建铭f 2 引等利用离子 束注入生物技术对花生四烯酸产生菌( 胁，f f e 旭肋础，协口) n 7 ，进行诱变高产菌筛 选。筛选到高产菌1 4 9 n 1 8 ，该菌每升培养液可得生物量3 0 8 0 9 ( 约4 的含水量) ，干 菌体油脂含量为2 5 8 ，其中花生四烯酸的含量占总脂的4 5 3 7 。3 0 l 和2 5 0 l 发 酵罐发酵试验，该高产菌的花生四烯酸得率为4 o l ，与国外专利( 9 6 1 9 2 0 0 2 5 ) 文 献报道相比得率提高近1 倍。麦角甾醇是脂溶性维生素d 2 的前体，经紫外线光化 学反应生成维生素d 2 。谢立青【2 9 】用心注入处理生产菌种一庆大霉素产生菌和卡 那霉素产生菌，选出的高产菌株己用于生产，提高幅度分别为2 0 和1 2 5 ，经济效 益显著。陈宇【3 0 】等应用n + 离子注入红霉素产生菌( 唧f d 惴e 啪阳淞) ，筛选 得到了高产突变菌株，摇瓶发酵表明高产突变菌株产量可提高2 0 以上。许安【3 ” 等利用离子注入技术诱变巨大芽孢杆菌( 肋c j 池s 州髫口船r f 删) 和氧化葡萄糖酸 杆菌( g ，“d n d 施m r 印) ，选育出遗传性状较为稳定的维生素c 前体2 2 酮基2 l2 古 龙酸高产菌系i p p m2 1 0 28 ，其转化率较出发菌提高1 8 8 。涂友斌f 竭用n + 注入野 生型联合固氮菌粪产碱菌( 4 抛，埘，2 醒删括) 1 4 8 8 ，筛选出抗5 1 6 i 岫o l l 乙二 胺的泌铵突变株e m l l 0 5 ，它以k n 0