（动物学专业论文）两种纤毛虫皮层微管胞器及其组分的研究.pdf

两种纤毛虫皮层微管胞器及其组分的研究 专业：动物学 方向：动物细胞与分子生物学 硕士生：高巍 导师：顾福康 论文摘要 细胞骨架是真核细胞中的蛋白质纤维网架体系，是当前细胞生物学研究中最 活跃的领域之一。广义的细胞骨架包括细胞外基质、细胞膜骨架、细胞质骨架和 细胞核骨架，它们在结构上相互连接、形成贯穿于细胞的网架体系。细胞骨架在 维持细胞形态，保持细胞内部结构的有序性中起到重要作用，而且与细胞运动、 物质运输、能量转换，信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化等生命活动密 切相关。目前细胞骨架的研究已从形态观察为主迅速推进到分子水平。原生动物 由一个单细胞构成，并行使生命活动的全部功能，因此原生动物细胞的复杂程度 是多细胞生物中的一个细胞远不能及的。以腹毛目纤毛虫为材料研究原生动物的 细胞骨架，对了解原生动物的细胞功能、揭示种属之间的进化关系有重要的意义。 在原生动物中不同类群纤毛虫的细胞微管骨架排列和分化程度不同。腹毛目 纤毛虫具有复杂的微管骨架结构。包括纤毛和纤毛器骨架，皮层微管骨架以及其 他胞质微管骨架。这些骨架结构对细胞形态和功能的维持都具有重要作用。异毛 虫( a l l o t r i c h ac u r d s i ) 和尖毛虫( o x y t r i c h as p ) 分别隶属于侧毛虫科 ( p l e u r o t r i c h i d a e ) 和尖毛虫科( o x y t r i c h i d a e ) ，均是腹毛目内分化较高的类群， 两者在亲缘进化关系上存在一定差异。本文以这两种纤毛虫为材料，采用f l u t a x 直接荧光标记与免疫荧光标记相结合的方法，对其形态和形态发生及其休眠细胞 纤毛结构的分化进行探索，显示腹毛目尖毛虫和异毛虫在不同生命周期中皮层微 管骨架，揭示它们的发生、分化及定位的规律。并利用生化抽提结合s d s p a g e 电泳的方法对其蛋白组分进行了初步分析。结果如下： l 、异毛虫无性生殖周期中微管胞器的形态及形态发生 f l u t a x 直接荧光标记和抗a 微管蛋白抗体免疫荧光标记显示，异毛虫细 胞微管胞器由口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛、背触毛等皮层纤毛器、 纤毛器基部附属微管组成。其中腹面皮层纤毛器基部附属微管包括小膜托架、小 膜附属微管、波动膜骨架；额腹横棘毛基部围棘纤维篮、额腹横棘毛和左右缘棘 毛基部前纵微管束、后纵微管束和横微管束，他们以各自的纤毛器基部为中心， 分别向皮层不同方向发射，在细胞皮层内形成一个复合三维结构微管网；并且， 左、右缘棘毛基部横微管显示非镜像对称的图像，横棘毛基部微管前纵微管束向 前伸展后其前端并非聚集在一起。无性生殖过程中，后口仔虫口围带原基在表膜 下首先发生，此后突出表膜形成相应的纤毛器原基，经历一系列的发育分化过程 而成为新仔虫的纤毛器。腹部纤毛器发育包括口围带、波动膜、额腹横棘毛发生 瓦解，新纤毛器在细胞皮层的特定位置发生，从相应纤毛器原基发生、分组、迁 移，至最终形成前、后两套新的纤毛器，新结构的形成和老结构的瓦解是一个相 伴相随的过程。 2 、尖毛虫皮层微管类细胞骨架的组成和形态发生 利用f l u t a x 直接荧光标记和抗a 微管蛋白抗体免疫荧光标记显示，尖毛 虫( o x y t r i c h as p ) 细胞微管胞器由口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛、 背触毛等皮层纤毛器及纤毛器基部附属微管组成。纤毛器微管和基部附属微管按 照“口围带额腹横棘毛左右缘棘毛 的皮层模式定位，所有这些结构对于支持 细胞运动，维持细胞背腹面的分化具有重要作用。无性生殖过程中，额腹横棘毛 原基分别在老的口围带和新口围带的右侧出现两套，之后逐步分化发育形成前后 仔虫的相应结构，部分老的额棘毛和横棘毛在新的结构出现之后才最终瓦解。 3 、 异毛虫与尖毛虫细胞蛋白组分的比较 采用异毛虫和尖毛虫为实验材料，利用生化方法抽提处理得到两种纤毛虫的 骨架蛋白( c y t o s k e l e t o np r o t e i n , e k ) 、不可溶性蛋白( i n s o l u b l ep r o t e i n , c ) 和可溶性 蛋i 圭l ( s o l u b l ep r o t e i n , s ) ，进行电泳分析，用以研究两种淡水类纤毛虫骨架蛋白的 差异。结果发现：异毛虫和尖毛虫骨架蛋白的表达主要集中在4 3 6 6 k d a 区间， 充分证明q 微管蛋白在纤毛虫微管类细胞骨架中具有一定的保守性。而两种纤毛 虫不可溶性蛋白的表达具有一定差异。 关键词：异毛虫，尖毛虫，微管胞器，荧光紫杉醇衍生物，抗c i 微管蛋白抗体， 形态发生，聚丙烯酰胺凝胶电泳 s t u d i e so nt h em i c r o t u b u l a ro r g a n e l l ea n d p r o t e i nc o m p o n e n t s o ft w ok i n d so fh y p o t r i c h o u sc i l i a t e m a j o r ：z o o l o g y s p e c i a l i t y ：c e l la n dm o l e c u l a rb i o l o g y s t u d e n t ：w 西g a o d i r e c t o r ：p r o f f u k a n gg u a b s t r a c t c y t o s k e l e t o ni st h ep r o t e i nf i b r en e t w o r ki nc u k a r y o t i cc e l la n db e c o m e saf o c u s o fa t t e n t i o ni nc e l lb i o l o g yr e s e a r c h i ng e n e r a lt h ee y t o s k e l e t o nw h i c hc o n t a i n s c y t o m a t r i x ，m e m b r a n es k e l e t o n , c y t o p l a s ms k e l e t o na n dn u c l e a rs k e l e t o n , f o r m s n e t w o r ks y s t e mr u n n i n gt h r o u g ht h ew h o l ec e l l t h ec y t o s k e l e t o np l a y sa ni m p o r t a n t r o l ei nk e e p i n gt h es h a p eo fc e l la n dh o l d i n gt h eo r d e ro fc e l li n n e rs t r u c t u r e , a l s o c l o s e l y r e l a t e sw i t hc e l lm o v e n l e n t ，m a t e r i a lt r a n s p o r t a t i o n , e n e r g yc o n v e r s i o n , i n f o r m a t i o nt r a n s m i s s i o n , c e i ld i v i s i o n , g e n ee x p r e s s i o n , c e l ld i f f e r e n t i a t i o n , a n do t h e r l i f ea c t i v i t i e s c u r r e n t l yt h ec y t o s k e l e t o nr e s e a r c hh a sr a p i d l ya d v a n c e df r o mt h e m o r p h o l o g yo b s e r v a t i o nt ot h em o l e c u l a rl e v e l t h ep r o t o z o ac i l i a t ew h i c hc o n s i s t so f as i n g l ec e l l ，e x e r c i s ea l lf e a t u r e so fl i f ea c t i v i t i e s s oi ti sm u c hm o r ec o m p l e xt h a n t h eo n ec e l lf i o mm u l t i - c e l lo r g a n i s m s i th a si m p o r t a n ts i g n i f i c a n c et oi n v e s t i g a t et h e c y t o s k e l e t o no fp r o t o z o a , u n d e r s t a n dt h ef u n c t i o no ft h ec e l la n dr e v e a lt h ee v o l u t i o n r e l a t i o n s h i pb e t w e e nd i f f e r e n tg e n u sb yu s i n gh y p o t r i c h o u sc i l i a t ea st h em a t e r i a l s d i f f e r e n tg r o u p so fc i l i a t e sh a v ed i f f e r e n tc y t o s k e l e t o na r r a n g e m e n ta n d d i f f e r e n t i a t i o n t h eh y p o r t r i c h o u sc i l i a t eh a sc o m p l e xm i c r o t u b u l es t r u c t u r e , i n c l u d i n gt h ec i l i aa n dt h ec i l i a t u r e - s k e l e t o n ，c o r t i c a lm i 盯o m b d es k e l e t o na n do t h e r c y t o p l a s m m i c r o t u b u l es k e l e t o n t h e s es k e l e t o nh a v ea l l i m p o r t a n t r o l ei n m a i n t e n a n c et h ec e l l sf o r ma n df u n c t i o n a l l o t r i c h ac u r 凼ia n do x y t r i c h aa r e a d v a n c e ds p e c i e si nh y p o r t r i c h o u sc i l i a t e s i nt h i sp a p e r , w eu s et h e s et w ok i n d so f c i l i a t ea sm a t e r i a l st od e t e c tt h e i rc i l i a - s t r u c t u r ed i f f e r e n t i a t i o ni nt h et e r mo f m o r p h o l o g y , m o r p h o g e n e s i s a n d c y s tt h r o u g ht h em e t h o d o ff l u t a xd i r e c t f l u o r e s c e n t 1 a b e l e da n da n t i - at u b u l i na n t i b o d y w ef o u n dt h a tt h ec o r t i e a lm i c r o t u b u l e s k e l e t o ni sd i f f e r e n ti nt h ed i f f e r e n tl i f e c y c l e t h i sr e v e a l e dt h el a wo fi t s m o r p h o g e n e s i s , t u b u l i nd i f f e r e n t i a t i o n a n dp o s i t i o n i n g a n dw ea l s ou s et h e b i o c h e m i c a le x t r a c t o na n ds d s p a g et oa n a l y z ei t sp r o t e i nc o m p o n e n t s t h er e s u l t s a l ea sf o l l o w s ： 1 m o r p h o l o g ya n dm o r p h o g e n e s i so f a l l o t r i c h ac u r d a i t h em i c r o t u b u l a ro r g a n d i e si nt h eh y p o r t r i c h o u sc i l i a t ea l l o t r i c h ac u r d s iw e r e a n a l y z e d 、析t l lf l u o r e s c e n c el a b e l i n go ff i ，i ，t a xa n da n t i - at u b u l i na n t i b o d y t h e s e m i c r o t u b u l a ro r g a n d i e sc o n s i s t e do fa d o r a lz o n eo fm e m b r a n e l l e s ( a z m ) ，u n d u l a t i n g m e m b r a n e s ，f r o n t a l - v e n t r a l - t r a n s v e r s ec i r d ( f v t c ) ，l e f ta n dr i g h tm a r g i n a lc i r r i ( l - & r m c ) ，d o r s a lk i n e t i c s ( d k ) a n dt h eb a s e - a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e so ft h e c i l i a t u r c s t h eb a s e - a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e si nt h ev e n t r a lc o r t e xo fc i l i a t u r e c o m p r i s e dm e m b r a n e l l e b r a c k e t sa n di t sb a s e - a s s o c i a t e d m i c r o t u b u l c s ，u m c y t o s k d e t o n , f i b r i l l a lc i r r r a lb a s k e t ( f c b ) l o c a t e da tt h eb a s eo ff v t c ，a n t e r i o r l o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s ( a l m ) ，p o s t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s ( p l m ) a n d t r a l 岱v e r s em i c r o t u b u l e s ( 1 m ) s i t u a t e da tt h eb a s eo ff v r c l m c ，a n dr m c s e n d i n g f r o mt h eb a s eo fc i l i a t u r e sa n de x t e n d i n gt od i f f e r e n td i r e c t i o n si nt h ec o r t e x ，t h e s e m i c r o t u b u l c sf o r m e dac o m p l e xt h r e e - d i m e n s i o n a lm i c r o t u b u l a rn e tu n d e r n e a t ho f c o r t e x i na d d i t i o n , t h ea r r a n g e m e n to ft r a n s v e r s em i c r o t u b u l e s ( t m ) a tt h eb a s eo f t h el m ca n dr m cd i s p l a y e dan o n - m i r r o rs y m m e t r i c a li m a g e , a n da n t e r i o r l o n g i t u d i n a lm i e r o m b u l e s ( a l m ) a tt h eb a s eo ft h et ce x t e n df o r w a r d sa n dj u s td i d n o tc o n v e r g et o g e t h e r d u r i n gt h et e r mo fm o r p h o g e n e s i s ，t h eo r a lp r i m o r d i u mo ft h e o p i s t h ew o u l do r i g i n a t e du n d e r n e a t ht h ec e l le l l i c l e , p r o t r u d i n gf r o mt h ec e l lp e l l i c l e t of o r mc o r r e s p o n d i n gc i l i a t u r ep r i m o r d i u m ，w h i c ht h e nd e v e l o p e si n t on e wc i l i a t u r e t h r o u g ht h ep r o c e s so fd i f f e r e n t i a t i o n 卫地d e v e l o p m e n to fv e n t r a lc i l i a t u r ec o n s i s t s t h ec o l l a p s eo fa z m ，u m ，f v t c n e wc i l i a t u r eo r i g i n a t e di nt h eg i v e nc o r t e xo fc e l l g r o u p sa n dm o v e sf o r mc e r t a i nc i l i a t u r ep r i m o r d i u m , a n df i n a l l yb e c o m e sn e w c i l i a t u r e 2 t h ec o n s i s t e n c eo f m i e r o t u b u l ec y t o s k e l e t o na n d m o r p h o g e n e s i si no x y t n c h as p 。 m i c r o t u b u l a lo r g a n d i e so fp r o t o z o ao x y t r i c h a 1 1 s p w a sa n a l y z e d w i m a n t i - a t u b u l i n a n t i b o d ya n df l u t a x t h er e s u l t s s h o wt h a tt h em i c r o t u b u l a l o r g a n d i e s c o n s i s t e d o fa d o r a l z o n eo fm e m b r a n e l l e s ( a z m ) ， u n d u l a t i n g m e m b r a n e s ( u m ) ，f r o n t a l - v e n t r a l - t r a n s v e r s ec i r r i ( f v t c ) ，l e f t a n d - r i g h t - m a r g i n a l c i r r i ( l r m c ) ，d o r s a lk i n e t i c s ( d k ) a n dt h e i rb a s e - a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l c s t h e c i l i a t u r em i c r o t u b u l ea n di t sb a s e - a s s o c i a t e dm i e r o m b u l ew h i c ho r i e n t e di ns u c h c o r t i c a lf o r m ：a z m - f v t c - l r m c ，p l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei n s u p p o r t i n g t h e m o v e m e n to f c i l i a r yo r g a n d i e sa n ds u s t a i n i n gt h ed o r s o v e n t r a ld i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g t h et e r mo fb i n a r yf i s s i o n , t w o 辩t so ff v t cp r i m o r d i ao c c u r sb e s i d et h eo l da n dt h e n e w 删，t h e nf o r mc e r t a i ns t r u c t u r e so fo p i s t h ea n dp r o t e r s o m eo l df ca n dt c f i n a l l yd i s a p p e a r e da l t e rt h en e ws t r u c t u r ef o r m e d 3 a n a l y s i s0 1 1t h ep r o t e i nc o m p o n e n t so f a l l o t r i c h ac u r d s ia n do x y t r i c h a 1 1 l ed i f f e r e n c e so fc y t o s k e l e t o np r o t e i nc o m p o n e n t sb e 时蹦la l l o t r i c h ac u r d s i a n do x y t r c h aw a si n v e s t i g a t e du s i n gb i o c h e m i c a le x t r a c t i o na n dd e e t r o p h o r e s i s n e r e s u l t s 玳嬲f o l l o w s ：t h ec y t o s k e l e t o np r o t e i nc o m p o n e n t so ft w ok i n d so fc i l i a t e e x p r e s sb 晚w 蹦l4 3 k d at o6 6 k d a t 1 1 i ss h o w e dt h a ta - t u b u l i ni sc o n s e r v a t i v ei n m i c r o t u b u l ee y t o s k d e t o no fc i l i a t e h o w e v e rt h ei n s o l u b l ep r o t e i nh a ss o m o d i f f e r e n c e sb e t w e e nt w ok i n d so fc i l i a t e k e yw o r d s ：a l l o m c h ac u r d s o x y t n c h a , a - m b u l i na n t i b o d y , m o r p h o g e n e s i s ，s d s p a g e 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：i 量盏日期：竺2 墨：鱼； 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名：南毙 日期：型q 叁：鱼：! 三 导师签名： 日期： 2 0 0 8 年华东师范大学硕上学位论文 第一章两种纤毛虫皮层微管胞器的形态及形态发生比较 第一节异毛虫无性生殖周期中微管胞器的形态及形态发生 摘要：f l u t a x 直接荧光标记和抗洳微管蛋白抗体免疫荧光标记显示，原生动 物腹毛目纤毛虫异毛虫( a l l o t r i c h ac u r d s i ) 细胞微管胞器由口围带、波动膜、额 腹横棘毛、左右缘棘毛、背触毛等皮层纤毛器、纤毛器基部附属微管组成。其中 腹面皮层纤毛器基部附属微管包括小膜托架、小膜附属微管、波动膜骨架；额腹 横棘毛基部围棘纤维篮、额腹横棘毛和左右缘棘毛基部前纵微管柬、后纵微管束 和横微管束，他们以各自的纤毛器基部为中心，分别向皮层不同方向发射，在细 胞皮层内形成一个复合三维结构微管网；并且，左、右缘棘毛基部横微管显示非 镜像对称的图像，横棘毛基部微管前纵微管束向前伸展后其前端并非聚集在一 起，这与目前报道的其他腹毛目纤毛虫如贻贝棘尾虫、魏氏拟尾柱虫同种结构的 定位特征不一样。无性生殖过程中，后口仔虫口围带原基在表膜下首先发生，此 后突出表膜形成相应的纤毛器原基，经历一系列的发育分化过程而成为新仔虫的 纤毛器。腹部纤毛器包括口围带、波动膜、额腹横棘毛发生瓦解，新纤毛器在细 胞皮层的特定位置发生，从相应纤毛器原基发生、分组、迁移，至最终形成前、 后两套新的纤毛器，新结构的形成和老结构的瓦解是一个相伴相随的过程。 关键词：腹毛目纤毛虫；异毛虫；纤毛器基部微管；荧光标记 原生动物纤毛虫含有复杂的皮层细胞骨架结构。早期，应用银浸法【i 】、蛋白 银方法【2 】及超微结构技术显示纤毛虫皮层中以纤毛基体为主要成分的骨架结构， 探讨皮层纤毛器的形态及其结构形成机理，成为原生动物学和细胞生物学领域的 重要研究内容。从2 0 世纪9 0 年代起，针对微管蛋白的直接荧光标记【3 。7 】与间接 免疫荧光标记【3 】等方法探索纤毛虫细胞的微管胞器及其微管蛋白组分，研究微管 胞器的功能，又成为所在领域的热点。目前，继对膜口类纤毛虫草履虫 ( p a r a m e c i u m ) 、四膜虫( t e t r a h y m e n a ) 等纤毛虫细胞微管结构研究之后 9 - u 】， 应用荧光标记方法对体纤毛基体紧密排布、微管胞器更为复杂的腹毛目纤毛虫贻 贝棘尾虫( s t y l o n y c h i am y t i l u s ) 、魏氏拟尾柱虫( p a r a u r o s t y l aw e i s s e i ) 等纤毛虫 中微管类细胞骨架的研究也取得了初步进展f 1 2 。1 3 1 。本文采用荧光紫杉醇 ( f i ，i m x ) 直接荧光染色以及抗a 一微管蛋白抗体间接免疫荧光方法，显示了 腹毛目纤毛虫异毛虫( a l l o t r i c h ac u r 凼i ) 皮层纤毛器基部微管，取得了一些迄 今未见报道的结果，现报告如下。 2 0 0 8 年华东师范大学硕t 学位论文 l 材料与方法 1 1 材料 异毛虫于2 0 0 6 年6 月采自浙江省双溪景区，分离后，应用麦粒液发酵获得的 细菌作为饵料，建立纯系培养。将纤毛虫培养至较高密度后，取不同时期生长状 态良好的细胞作为实验材料。 1 2 实验主要试剂 ( 1 ) f l u t a x 一2 ：7 - ( ) i ( n ( 4 - f l u o r e s c e i n c a r b o n y l ) 一l - a h n y 0t a x o l ( i n v i t r o g e n 公司购得) ；规格：5 0 m g ；用二甲亚砜( d m s o ) 配制成l m m o l l 的母液，分 装放至于一2 0 的冰箱中。 ( 2 ) 抗洳微管蛋白抗体 一抗：鼠抗a 一微管蛋白单克隆抗体( 购自s i g m a 生物试剂公司，产品编号： 1 - 9 0 2 6 ) 。一抗稀释倍数为1 ：1 0 0 0 ，利用含3 b s a 的p b s 缓冲溶液稀释，稀 释后分装放至于一2 0 的冰箱中。 二抗：f 丌一羊抗小鼠i g g ( 购自s i g m a 生物试剂公司，产品编号：f 4 0 1 8 ) ， 使用时用p b s 稀释1 0 0 倍，分装放至于一2 0 的冰箱中。 ( 3 ) 防猝灭剂，( s i g m a 生物试剂公司购得，a n t i f a d er e a g e n t ：c i t i f l u o rm o u n t i n g m e d i a 产品编号：1 9 4 7 0 ) 。 ( 4 ) p h e m 缓冲溶液( p h ：6 9 ) p p e s6 0m m o l l h e p e s2 5m m o l l 乙二醇双( 2 - - 氨基乙基) 四乙酸1 0m m o l l m g c l 2 6 h 2 0 。 6m m o l l ( 5 ) p b s 缓冲溶液( p h 7 4 ) n a c i 8 9 k c l 0 2 9 n a 2 h p 0 4 1 4 4 9 khzpo0249 d d h z o加至1 0 0 0 m l 定容 ( 6 ) 抽提缓冲溶液( p h6 8 ) 蔗糖 0 1m o l l m g c l 2 + 6 h 2 0 2 5m m o l l l l0 1m m o l l e d t alm m o l l h e p e s1 0m m o l l 2 2 0 0 8 年华东师范大学硕士学位论文 ( 7 ) 和微管蛋白抗体稀释液 称取3 9 小牛血清，p b s 缓冲液定溶至1 0 0 m l ，现配现用。 ( 8 ) 8 9 6 多聚甲醛固定液( 母液) ： 称取8 9 多聚甲醛，p h e m 缓冲液定溶至1 0 0 m l ，4 c 冰箱保存，使用时稀释 至工作浓度。 ( 9 ) 0 2 的t r i t o n 渗透液和o 2 9 6 的抽提t r i t o n 渗透液： 0 2 m lt r i t o nx 一1 0 0 ，p h e m 缓冲液定溶至1 0 0 m l 即得0 2 的t r i t o n 渗透液； 0 2 m lt r i t o nx 一1 0 0 ，抽提缓冲液定溶至1 0 0 m l 即得0 2 的抽提t r i t o n 渗透 液。 ( 1 0 ) 0 5 5 皂苷溶液： 称取o 5 9 皂苷，p h e m 缓冲液定溶至1 0 0 m l ，4 1 2 冰箱保存。 1 3 实验主要仪器 ( 1 ) 万能显微镜( l e i t zo r t h o p l a n ) ( 2 ) 体视显微镜( 撕w i l d m 5 ) ( 3 ) 荧光显微镜( o l y m p u sb x 5 1 ) ( 4 ) 玻璃吸管 ( 5 ) 移液器( d r a g o nm e d 公司购得) ( 6 ) 清洁液清洗过的载玻片及盖玻片 ( 7 ) 电子分析天平( m e t t l e r - t o l e d o 公司购得) ( 8 ) p h 校准计 1 4 方法 f l u t a x 直接荧光标记，采用本实验室改进的f l u t a x 法【。主要步骤为： ( 1 ) 将材料放入o 5 的皂苷中渗透l m i n ，用p h e m 清洗一次； ( 2 ) 将渗透后的细胞放入4 多聚甲醛中固定3 0 s ，p h e m 清洗一次并将细胞 转移至涂有多聚赖氨酸的载玻片上； ( 3 ) 0 2 t r i t o nx 一1 0 0 处理3 0 s ，p h e m 清洗一次； ( 4 ) l l m o l lf l u t a x 一2 染色l o m i n ，0 0 1 m o l l 的p b s 漂洗，盖片。o l y m p u s b x 荧光显微镜观察，c o o ls n a p - p r o 数码相机照相。 抗a - 微管蛋白抗体免疫荧光标记，采用本实验室报道的方法n 船，主要步骤 为： ( 1 ) 将材料放入0 5 皂苷渗透2 m i n ，p h e m 清洗一次； ( 2 ) 4 多聚甲醛固定l h , 3 2 0 0 8 年华东师范大学硕十学位论文 ( 3 ) 用o 1 的t r i t o n - x 1 0 0 缓冲液处理1 3 - - 1 5 m i n ； ( 4 ) 用冷的不含t r i t o nx - 1 0 0 的抽提缓冲液快速清洗一次： ( 5 ) p b s + 3 b s a 清洗3 次，每次5 m i n ； ( 6 ) 将细胞转移至涂有多聚赖氨酸的载玻片上，用抗旷微管蛋白抗体( 鼠 抗、l ：1 0 0 0 ) 孵育l h ，p b s + 3 b s a 清洗3 次，每次5 m i n ： ( 7 ) 羊抗鼠免疫球蛋白的二抗( 1 ：1 0 0 ) 孵育l h ，p b s + 3 b s a 清洗3 次， 每次5 m i n ，三蒸水清洗一次； ( 8 ) 加防猝灭油、盖片。o l y m p u sb x 荧光显微镜观察，c o o ls n a p - p r o 数 码相机照相。 2 结果 2 1 非分裂期异毛虫的形态 荧光显微镜观察显示，异毛虫细胞由口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘 棘毛、背触毛及其基部附属微管等构成其背、腹面主要皮层微管胞器( 图i ：l 、 2 ) 。 2 1 - l 皮层纤毛器 口围带位于细胞前端，其基部起始于细胞长轴的1 2 处，向左前侧弯曲伸展， 终止于细胞右前端，含小膜5 4 - 6 0 片。波动膜包括口内膜l 片，紧邻口围带；口 侧膜l 片，位于口内膜右侧( 图版i ：1 ) 。额腹横棘毛按9 6 ( 7 ) - 5 模式排列， 其中额棘毛9 根( 3 根位于细胞前端，l 根紧邻口内膜) ；腹棘毛6 7 根，横棘毛 恒为5 根( 分为两组，一组3 根，一组2 根) 。左缘棘毛1 列，含棘毛约2 6 根； 右缘棘毛3 列，其中外侧1 列最长( 贯穿整个细胞) ，第2 列次之，内侧l 列长 度只有外侧的一半左右( 图版i ：1 ) 。细胞背面含6 列背触毛( 其中4 列背触毛 贯穿细胞全长) ( 图版i ：2 ) ；3 根尾棘毛，位于第l 、2 、4 列背触毛末端( 图 版i ：9 ) 。 2 1 2 纤毛器基部微管 口围带、波动膜附属微管 口围带骨架占整个细胞长度的1 2 ，整个口围带由领部( a z m - c ) 和翻领部 ( a z m l ) 组成，口围带小膜按序排列并弯曲成“? 状。口围带翻领部( a z m - l ) 小膜下方有横向的彼此平行排列的梯状小膜托架；在托架与波动膜之间的口腔皮 层内含口腔肋壁微管；在口围带领部( a z m - c ) ，小膜托架加粗变短，基部向后伸 4 2 0 0 8 年华东师范大学硕士学位论文 出短小的微管束，其基部发出的两束微管与相邻的微管束相互交叉呈倒。v 一字 形。波动膜骨架位于口围带小膜托架内侧，由一根粗壮弯曲的纵微管和其左侧多 根横向平行排列的微管共同形成。波动膜骨架与小膜托架通过口腔肋壁微管彼此 紧密连接在一起( 图版i ：l 、3 、4 ) 。 额腹横棘毛基部微管 在额腹横棘毛皮层区，于各个棘毛基部形成具有不规则多边形构造的围棘纤 维篮( f i b r i l l a rc i r r r a lb a s k e t ) ，由围棘纤维篮起始向不同方向发出前纵微 管束、后纵微管束和横微管束，其前纵微管束由围棘纤维篮向左前方皮层伸展， 后纵微管束由围棘纤维篮向皮层右后方伸展，横微管束自围棘纤维篮左侧在皮层 内横向伸展( 图版i ：5 ) 。其中：额棘毛具有发达的前纵微管束和后纵微管束， 前3 根近细胞前端处额棘毛的前纵微管束伸入口围带领部小膜托架内，后6 根额 棘毛的前纵微管束与后纵微管束均清晰可见，但横微管束不明显( 图版i ：3 、4 ； 腹棘毛基部的前纵微管束粗壮，横微管束细长，后纵微管柬则稍显短小；横棘毛 基部附属微管中，前3 根横棘毛基部前纵微管柬向前方伸展并汇聚形成一个三角 形微管层，后2 根横棘毛基部前纵微管束各自向前方伸展较长距离但并非汇聚在 一起，后纵微管束和横微管束均不发达( 图版i ：5 、8 ) 。 左、右缘棘毛基部微管 在左、右缘棘毛列中，每根棘毛基部向皮层发出前纵微管束、后纵微管束和 横微管束，各微管束的定位特征与额腹横棘毛基部附属微管相似( 图版i ：5 ) 。 其中：前纵微管束较粗壮，各个微管束由棘毛基部向左前方伸展，在棘毛列基部 左侧相互聚集，于细胞皮层内形成一纵贯前后的粗微管束；两者的横微管束较为 细长：左缘棘毛基部横微管束自棘毛基部向左伸展在皮层内，右缘棘毛基部横微 管束自棘毛基部亦向左侧皮层伸展；后纵微管束细小( 图版i ：5 、7 ) 。 由于细胞左侧仅l 列左缘棘毛，但细胞右侧有3 列右缘棘毛，使左右棘毛基 部微管网显示不同的特征，其中在3 列右缘棘毛基部形成一个由前纵微管束、后 纵微管束和横微管束构成的高度发达的立体微管网( 图版i ：5 、7 ) 。 背触毛基部微管 细胞背面6 列背触毛中，于每根背触毛的一个基体为中心向左前方和右后方 发出前纵微管和后纵微管，其微管起始位置的微管成分紧密包被基体。各列背触 毛的基体附属微管相互平行，形成6 列纵向的微管带( 图版i ：2 、6 ) 。 2 2 无性生殖过程中腹面皮层纤毛器及附属微管的形态发生 异毛虫在无性生殖过程中，皮层细胞按口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右 缘棘毛及附属微管等结构的顺序经历形态发生过程。分化形成前后仔虫的两套纤 毛结构。 5 2 0 0 8 年华东师范大学硕上学位论文 2 2 1 口纤毛器： 皮层的形态发生起始于腹皮层左侧l 根横棘毛与左缘棘毛之间出现后仔虫 口原基( 图版：l o 小箭头所示) 。该横棘毛逐渐瓦解，其瓦解物质融入口原基 的基体。口原基毛基体逐渐增殖，拉长直至在老口围带与横棘毛之间形成一个狭 长的口围带原基区( 图版i i ：1 l 小箭头所示) 。同时在口原基区右侧产生一个长 的条带即波动膜原基( 图版i i ：1 2 小箭头所示) 。接着，口围带小膜开始自前向 后组装、长纤毛，并自前端开始向左发生弯曲，最终成为未来后仔虫口围带。波 动膜原基经过分化最终形成后仔虫的波动膜。 通过荧光标记观察，在形态发生过程中老口围带未见明显的形态学改变。但 老波动膜发生更新，其纤毛自前向后发生退化瓦解形成新的波动膜原基。最终发 育形成前仔虫的波动膜。 2 2 2 体纤毛器： 额腹横棘毛 在前、后波动膜原基发生同时，伴随产生前、后额腹横棘毛原基。分别于所 在区域内部相应的额、腹棘毛解体，随后迅速产生各含5 列基体的前、后额腹横 棘毛原基区( 图版i i ：1 2 大箭头所示) ，通过观察显示，在前、后原基区中，自 左向右，5 列原基各分成3 、3 、3 、5 或6 、5 或6 段，每段原基均长出纤毛，并 向特定方向发生迁移和定位，最终成为前、后仔虫的额腹横棘毛( 图版i i ：1 3 小箭头所示) 。在前、后仔虫额腹横棘毛分化过程中，前、后波动膜原基均分化 出前一段形成最左侧的一根额棘毛。在虫体演化过程中，处于细胞前、后端非原 基区部分的老额腹横棘毛并无明显变化，至两仔虫分开时这些老棘毛才最终瓦解 消失( 图版i i h1 4 1 7 ) 。 左右缘棘毛 在新口围带开始弯曲成熟的同时，于左右缘棘毛的前端和中下部各有几根棘 毛瓦解，在棘毛瓦解位置形成左右缘棘毛原基( 图版i i ：1 l 大箭头所示) 。但左 缘棘毛和右缘棘毛迁移、定位的位置不同，前、后左缘棘毛原基分别在老左棘毛 内侧向后延伸，原基经过分段和长纤毛的过程，最终形成前、后仔虫的左缘棘毛， 老缘棘毛逐步被吸收。而右缘棘毛原基最初在最右侧老的缘棘毛列外侧出现，并 在此位置