（食品科学专业论文）利用酿酒酵母生物合成谷胱甘肽及其分离纯化的初步研究.pdf

摘要 谷胱甘肽是一种重要的生物活性物质，不仅广泛应用于医药、生物等领域，而 且作为食品添加剂具有广泛的应用前景。利用微生物细胞进行生物合成是其主要生 产方式。 为进一步提高酵母细胞生物合成谷胱甘肽的能力，选用一株具有较高谷胱甘肽 合成活性的酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et b 6 , 结合酵母细胞酶促合成g s h 的 活性测试，通过单因素试验和正交试验研究培养基组成对细胞生长及谷胱甘肽合成 酶系活性的影响。在优化培养基组成条件下，酵母细胞生物量及谷耽甘肽合成酶系 活性均得到提高，摇瓶试验中酶活力稳定在9 0 2 m g ( g s h ) 克湿细胞，3 0 l 发酵罐中 酶活力亦高达8 5 6m g ( g s h o 克湿细胞。 应用卡拉胶与魔芋粉混合载体固定高活力的酵母细胞，催化合成谷胱甘肽。并 对固定化细胞条件和固定化细胞生物合成的反应条件进行初步探索。实验结果表明： 反应液p h 值7 ，反应温度3 7 c ，磷酸盐缓冲液0 1 5 m o l l 的条件下，固定化细胞 具有较高的g s h 合成酶活力。 对生物合成反应液中谷胱甘肽的分离作了初步研究，考察了不同p h 溶液中还 原型谷胱甘肽的氧化情况。并对离子交换法提取谷胱甘肽的提取条件进行了初步研 究，确定了提取工艺条件：上柱最适p h 为3 0 ，洗脱用h c l 浓度为l m o l l ，洗脱速 度为3 0 m l m i n 。 在论文的实验研究过程中，为满足普通实验室的需要，工作中探索建立了种 快速简便的分光光度分析法，适用于生物酶催化合成反应溶液中与半胱氨酸共存的 还原型谷胱甘肽含量测定。样品在室湿，碱性条件下与3 甲醛反应3 r a i n 后产生干 扰作用的半胱氨酸可被遮蔽，再利用铜( i i ) 一新铜试剂对g s h 进行显色定量，在 g s h 0 3 0u e , l 浓度范围内回收率和准确性均符合一般分析的要求。 关键词：谷胱甘肽，酿酒酵母，培养基组成，固定化细胞，生物酶催化，分离 a b s r a c t g l u t a t h i o n ei sa ni m p o r t a n tb i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c e i tn o to n l yh a v e w i d ea p p l i c a t i o ni nm e d i c i n e b i o l o g ya n dc h e m i s t r y , b u ta l s oi sap e r f e c t a d d i t i v ef o r m a k i n g f u n c t i o n a lf o o d t h em a i nt e c h n i q u ef o rg s h p r o d u c t i o na tp r e s e n ti sb yb i o s y n t h e s i sm e t h o dw i t hm i c r o b i a lc e l l s ，w h i c h c o m p r i s ee n z y m a t i ct r a n s f o r m a t i o na n d m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n t oi m p r o v et h eb i o t e c h n o l o g i c a lp o t e n t i a lo fm i c r o b ec e l l st op r o d u c ea m e d i c a l l ya n dp h y s i o l o g i c a l l yi m p o r t a n tt r i p e p t i d e - g l u t a t h i o n e ，as u i t a b l e m e d i u mh a sb e e nf o u n db ym e a n so fs i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t a n d o r t h o g o n a ld e s i g nf o ras e l e c t e dy e a s ts a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et b 6 u n d e r t h es u i t a b l em e d i u m ，i n c r e a s e dc e l lb i o m a s sa n dh i g h e rg l u t a t h i o n e - p r o d u c i n ga c t i v i t yw e r eo b t a i n e d ，w i t h9 0 2 m g ( g s h ) 倌w e tc e l l si nf l a s k s a n d8 5 6m g ( g s h ) gw e tc e l l si naf e r m e n t e r ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，t h ew h o l ec e l l so fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et b 6w e r e i m m o b i l i z e dw i t hk c a r r a g e e n i n - k o n j a cf l o u r , a n dt h eg l u t a t h i o n ep r o d u c e d f r o mi m m o b i l i z e dc e l l sc a t a l y s tw a se x c r e t e di n t or e a c t i o ns o l u t i o n t h e c o n d i t i o n sf o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fy e a s tc e l l sa n dt h eg l u t a t h i o n e p r o d u c t i o nw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e t t e ri m m o b i l i z a t i o n c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：r e a c t i v es o l u t i o np h 7 ，r e a c t i v et e m p e r a t u r e3 7 。c ， r e a c t i v et i m e6 h ，p o t a s s i u mp h o s p h a t eb u f f e r0 15 m o l l a st h es e c o n dp a r to ft h ew o r k ，t h es e p a r a t i o no fg l u t a t h i o n ef r o m r e a c t i v es o l u t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h eo x i d a t i o ns t a b i l i t yo fg l u t a t h i o n ea t d i f f e r e n tp hw a sa l s od i s c u s s e d t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e o p t i m a lo p e r a t i o nc o n d i t i o no fg l u t a t h i o n es e p a r a t i o nb yi o n - e x c h a n g er e s i n c o l u m nw a sa sf o l l o w i n g ：f e r m e n t a t i o nb r o t hp h3 0 ，s a m p l ef l o w r a t e 3 0 m l m i n , e l u a n tc o n c e n t r a t i o nl m o l lh c l a na n a l y t i c a lp r o c e d u r ef o rr a p i dd e t e r m i n a t i o no fr e d u c e dg h i t a t h i o n e i nt h ep r e s e n c eo fc y s t e i n ei nb i o s y n t h e t i cp r o c e s sh a sb e e nd e v e l o p e d a f t e r r e a c t e dw i t h3p e r c e n t a g ef o r m a l d e h y d ef o r3m i ni nt h ea l k a l i n es o l u t i o n ， t h ee f f e c to fc y s t e i n ec a nb em a s k e d t h e nt h e g l u t a t h i o n e w a s s p e c t r o m e t r i c a l l yq u a n t i t a t e db y d e r i v a t i z a t i o nw i t h c o p p e r ( i i ) - n e o c u p r o i n e sr e a g e n tw h i c hf o r m sa ne a s i l yd e t e c t a b l ea d d u c tw i t hg s h g o o dl i n e a r i t ya n ds a t i s f y i n gr e c o v e r yw e r eo b t a i n e do v e rt h ec o n c e n t r a t i o n r a n g eo f 0 3 0 g s h l k e yw o r d s ：g l u t a t h i o n e ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et b 6 ，f e r m e n t a t i o n m e d i u m ，c e l li m m o b i l i z a t i o n ，b i o c a t a l y s i s ，s e p a r a t i o n 独创性声明 p 7 8 9 7 2 2 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌史学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 摹位论文作者签名：诗寸莺坡 签字日期； 2 呵年6 月1 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解。壹墨叁鲎 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文酌全部或部分内容编入有关数据库送 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 毋昏敢 签字日期：沙盯年r 月2 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：j j i 孛暂 签字日期：砷r 年r 胃三 电话 自s 编 第一章绪论 1 1 谷胱甘肽结构与性质 动植物细胞中都含有一种三肽，称还原型谷胱甘肽( r e d u c e dg l u t a t h i o n e ) ， 即7 谷酰l - 半胱氨酰甘氨酸，因为它含有游离的s h 基，所以常用g s h 来表示。 谷胱甘肽还有一种形式，称为氧化型谷胱甘肽( o x i d i z e dg l u t a t h i o n e ) ，它用g s s g 来表示。g s s g 是两分子g s h 氧化失氢后转变结合成的。在体内起重要作用的 是还原型谷胱甘肽。它们的结构式如下： f 下诮m 姻例 l 一 严璃 恤一嗨一蟋 l s 蕊上 瓿健型昝虢持羧撼s s 鼬 g s h 的分子量为3 0 7 3 3 ，融点为1 8 3 1 9 3 。c ( 分解) ，等电点为5 9 3 ，晶体 呈无色透明细长柱状。它溶于水、稀醇溶液、液氨，不溶于醇、醚和丙酮【1 】。g s h 固体较为稳定，其水溶液在空气中易被氧化 2 1 。g s h 广泛分布于有机体中，在蛋 白质和d n a 的合成、氨基酸的转运、细胞的保护等重要的生物学现象中起着直 接或间接的作用。 谷胱甘肽在高水活度下不易保存，只有将水活度控制在0 3 以下才能长期稳 定保存。有研究显示，在含有谷胱甘肽的维生素c 水溶液( p h 3 3 ) 中，由于有 维生素c 的强还原作用，溶液中的谷胱甘肽不会氧化为g s s g ，但其分解速度却 加快。而存在维生素c 水溶液中的g s s g 也不会转变为谷胱甘肽，且保存稳定 性很好 3 1 。 谷胱甘肽广泛存在于自然界中，动物肝脏，酵母和小麦胚芽中含有丰富的谷 胱甘肽，而植物组织中的谷胱甘肽含量较低嘲。 1 2 谷胱甘肽的作用机理和生理功能 谷胱甘肽是体内的主要抗氧化剂，能抵抗氧化剂对硫氢基的破坏作用，保护 细胞膜中含硫氢基的蛋白质和酶不被氧化。当细胞内生成少量过氧化氢时，g s h 在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把h 2 0 2 还原成水，其自身被氧化为g s s g 。 g s s g 在谷胱甘肽还原酶的作用下，从n a d p w 接受氢又被还原为g s h 口 。 g s 墩；一n 】 p h h i 茎壁苎堕垂曼曼2 g 弧一n p 另外，g s h 还可以和有机过氧化物起作用。这些过氧化物是需氧代谢的有 害毒副作用，谷胱甘肽在这种解毒中起着关键性作用。谷胱甘肽也参与氨基酸的 转运。一种与膜结合的酶，y 谷氨酸转肽酶( e c 、2 、3 、2 、2 ) ，催化谷胱甘肽 上的r 谷氨酰基转移至受体氨基酸如半胱氨酸或谷酰的y 氨基上的反应。了一谷氨 酸转肽酶催化部位位于肾细胞的质膜的胞外侧，谷胱甘肽被转运过质膜进行此反 应。而后卜谷氨酰氨基酸被别的器官的细胞所吸收，并环化成5 氧脯氨酸，被 转运的氨基酸则被释放出来，最后5 氧脯氨酸的肽键被水解，并需要a t p ，而 后又生成谷氨酸。 谷胱甘肽的生理功能主要表现在6 个方面旧： f 1 ) 维持红细胞膜的完整性： 公 氨甲酸磷酸激酶氰酸盐+ 磷酸盐 _ 酸溶出卜精制+ 成品 日本很旱就对发酵法生产谷胱甘肽进行了研究。发酵法生产gsh 就是选育 f 或构建) gsh 合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、 建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等，最终提高gsh 的产率 和质量。但是发酵法生产谷胱甘肽的问题是转化效率低，是由于正常情况下微生 物细胞内的表达水平低，因此选育具有高谷胱甘肽合成能力的菌株是提高谷胱甘 肽合成效率的关键。发酵法使用的一般是酵母，从酵母中提取谷胱甘肽的工艺流 程如下： 诱变剂 士 酵母晡产酵母热水抽提，离心调p h 树脂吸附卜酸 洗脱卜新鲜的c a 2 0 沉淀离心沉淀物 h 2 s 置换离心过滤浓缩 p 喷雾干燥 成晶 1 5 酶法生产谷胱甘肽的研究进展 酶法生产就是利用生物体内的天然谷胱甘肽合成酶，以l 谷氨酸、l 半胱 氨酸及甘氨酸为底物，并添加少量三磷酸腺苷来合成谷胱甘肽。目前细胞固定化 ( 或酶法) 生产谷胱甘肽的研究内容主要包括选育高表达的生产菌株，固定化材 料的选择，怎样构建一个高效的a t p 再生系统，优化生产工艺，改进分离纯化技 术等。 1 5 1 酶法生产谷胱甘肽的菌种选择 迄今发现的能积累或转化底物为谷胱甘肽的有酵母菌和大部分革兰氏阴 性菌，但作为生产菌株应该具备： ( 1 ) 细胞中g s h i 酶和g s h i i 酶含量高； ( 2 ) 较强的廉价碳源利用能力和较高的转化效率； ( 3 ) 生长较快； ( 4 ) 对人畜安全等基本性能。 f a h e y l 2 1 】等检测了各种细菌中可溶性硫醇及谷胱甘肽的含量。所有研究对象 中都检测出可溶性硫醇，而谷胱甘肽只在革兰氏阴性菌中存在。除去一些兼性厌 氧菌，革兰氏阴性菌中存在谷胱甘肽水平较低。m u r a t a 2 发现，在革兰氏阴性 菌中，埃希氏菌属和其突变菌属谷胱甘肽水平相当高，而在无色杆菌属，肠细菌 属和假单胞菌属中较低。酵母菌中假丝酵母属，酵母属，汉逊氏酵母属和裂殖酵 母属中偏低，其中酿酒酵母表现最高的谷胱甘肽合成活性。 普通酵母菌的菌体内g s h 含量一般不超过细胞干重的1 。但有一些酵母菌， 其菌体内g s h 含量高，且能长时间保持合成g s h 的能力，如：s a c c h a r o m y c e s g l y o x a z 娩f 船、热带假丝酵母1 和s a c c h a r o m y c e sc y s t i n o v o l e n s l 2 引。采用物理或 化学诱变剂处理酵母细胞，可使g s h 累积到更高的浓度。如产朊假丝酵母经亚 硝基胍处理，可得对l 或d l - 乙硫氨酸敏感的变异株，胞内g s h 的含量由原来 的o 6 5 5 增加到3 0 2 6 1 。产朊假丝酵母经紫外线、x 射线或亚硝基胍作用，得 到的蛋氨酸耐性突变株，再经同样处理，得到同时耐亚硫酸盐和乙硫氨酸的变异 株，其胞内g s h 含量可达4 0 ，而出发菌株仅为o 5 2 硎。此外还发现，用2 0 0 g m l 亚硝基胍于3 0 。c 将酿酒酵母处理3 0r a i n ，得到的1 ，2 ，4 。三唑和氰化钠 的耐性菌株，胞内g s h 含量明显增加。詹谷宇等口1 筛选出的一株假丝酵母， 经紫外线诱变、乙硫氨酸耐性筛选，突变株g s h 含量可达2 7 ，比出发菌株高 5 0 。这也是目前我国唯一的关于g s h 高产酵母选育的文献报道。 1 5 2 构建a t p 再生系统在谷胱甘肽合成中的重要作用 许多有用物质的生物合成需要a t p 作为能量供体，但由于a t p 的价格相对 贵，因此构建一个有效的a t p 再生系统就显得非常重要。谷胱甘肽的合成是一 个典型的需要a t p 酶反应过程。要实现g s h 的高效合成，a t p 的有效供给是 个必要满足的条件。a t p 再生系统可定义为一个需要a t t 的酶反应系统和一个 a t 生物合成系统所构成的耦合系统，它包括自耦合和中间耦合a t p 再生系 统。l a n g e p 川等评价了诸多a t p 再生途径的相对优劣，认为由乙酸激酶催化的 a d p 磷酸化反应是最有希望的a t p 再生途径。m u r a t a 【3 1 1 等研究了在谷胱甘肽 生产中使用乙酸激酶反应( 以乙酰磷酸盐为能量底物) 作为a t p 再生系统的可 行性。但总的来说，将大肠杆菌细胞中的乙酸激酶反应用作谷胱甘肽生产的a t p 再生系统并不十分令人满意，因为作为磷酸根供体的高能磷酸化合物这一乙 酰磷酸盐昂贵且不稳定。t o c h i k u r a t 3 2 1 等选择了酵母的糖酵解途径作为谷胱甘肽 生成的a t p 再生系统，以葡萄糖作为酵解途径的能量来源。s a w a 口3 1 等亦报道 了一种涉及到嗜热的蓝细菌属的光合成的a t p 再生系统，这一系统能利用光能 有效地把a d p 再生为a t p 。m u r a t a 州等尝试过在固定化sc e r e v i s i a e 和e c o l i b 细胞间构建一个种问耦合a t p 再生系统来合成g s h 但由于这两株菌株 均未经遗传改造，效果也不佳。 1 s 3 环境条件和前体氨基酸对生产谷胱甘肽的影响 ( 1 ) 环境条件的控制：影响g s h 的产量环境参数主要有温度、p h 、 m g c l 2 浓度、磷酸盐缓冲液浓度、菌体量、作用时间、a t p 等对g s h 的生产 都有直接的影响。国内对固定化细胞法催化合成谷胱甘肽过程中的温度、p h 、 作用时间、菌体量等环境条件的影响已有一些研究。 ( 2 ) y 谷氨酰半胱氨酸合成酶( g s h - i ) 是个调节酶，受终产物g s h 的 反馈抑制d 5 】。当g s h 在细胞中累积达定量时，g s h 与酶分子中的调节部位 结合使活性中心变构失活，从而抑制g s h 继续合成。故采用酵母细胞固定化酶 法错g 各g s h ，使转化产物g s h 能自行从胞内分泌至胞外，而减少产物对g s h - i 的反馈抑制，提高酶活。在酶反应中应设法解除或减轻该抑制以提高g s h 的 合成。延缓甘氨酸的加入，延迟g s h 的最终合成，使g s h i 在无g s h 抑制 的情况下尽可能多地合成中间体y 谷氨酰半胱氨酸，降低g s h 的反馈抑制， 提高g s h 的合成口和。 l 5 4 固定化材料的选择 固定化材料很多，有琼脂、海藻酸钠和无水c a c l 2 、卡拉胶、p v a 等材料、 它们有的可以单独用，也可混合一起用。童群义1 3 7 等人利用p v a 一卡拉胶混合载 体对大肠杆菌酵母菌混合体系生产g s h 进行了研究，确定了较好的制备工艺。 沈立新跚等人分别用卡拉胶，明胶，海藻酸钠包埋e c o l i b l 2 1 ( p t r c g s h ) 细胞催 化合成g s h ，从酶活及机械强度方面进行比较，进行了g s h 的生产。 7 1 5 5 分离与纯化方法 目前报道的分离提纯g s h 的方法主要有3 种： ( 1 ) 铜盐法，具有使用价值，但污染大。 ( 2 ) 离子交换树脂法，经济效益较高，主要根据s h 基化合物与汞有很 强的亲和作用，用含汞树脂提取含s h 基化合物能取得很好的效果。王辉口9 1 等 入将氨基苯汞乙酸连接到聚苯乙烯一二乙烯苯载体上，制得含汞树脂，用于分离 酵母提取液中的g s h ，取得很好的分离效果。 ( 3 ) 双水相分配结合温度诱导相分离，双水相分配技术是一个新型生物分 离技术，利用双水相技术可以省去细胞破碎后的固液分离操作，并利用温度诱导 相分离能实现聚合物的循环利用。梅乐和 4 0 1 等人选择用环氧乙烷环氧丙烷无规 共聚物( e o p o ) 羟丙基淀粉( p e s ) 双水相系统，结合温度诱导相分离技 术从酵母细胞中提取g s h ，g s h 的总萃取效率达8 0 以上，但双水相组成系 统一般比较贵。 1 6 酶法生产谷胱甘肽的研究展望h 1 1 4 2 4 3 4 z q 4 s 1 随着时间的推移，谷胱甘肽的许多新功能将被发现，谷胱甘肽也将变的更加 重要。从目前的研究报道分析，尽管已对谷胱甘肽生产菌的选育与改良，发酵过 程的优化控制等进行了广泛的研究。为了提高细胞固定化法( 或酶法) 生产谷胱 甘肽的效率和技术水平，下列研究工作有待于加强和突破： ( 1 ) 选育g s h 的高产菌株，提高它的合成酶系的表达水平，并使之在胞外大 量积累； ( 2 ) 构建一个高效的a t p 再生系统，提高g s h 生物合成系统的运行效率与 经济性； ( 3 ) 充分发挥固定化细胞技术的潜力，实现g s h 的连续化生产； ( 4 ) 利用基因d n a 重组技术构建高产g s h 的基因工程菌株。 1 7 本课题的研究意义 谷胱甘肽具有十分重要的生理功能，国外早在2 0 世纪2 0 、3 0 年代就开始了 对它的研究，现在已在食品加工的各个领域得到广泛的应用。我国对谷胱甘肽的 研究起步较晚，尤其是它在食品中的应用，尚属起始阶段。发达国家如日本等国 已将谷胱甘肽作为生物活性添加剂广泛用于食品加工的各个领域，如将谷胱甘肽 加入酸奶和婴儿食品中，可起稳定剂作用，并积极开发作为保健食品。随着我国 食品加工业和各种保健食品的不断发展，谷胱甘肽也将在我国得到广泛应用，因 此谷胱甘肽的生产研究具有很广阔的前景。随着谷胱甘肽应用范围的不断扩大， 谷胱甘肽的市场需求也在不断的增长。但是迄今为止国内尚未形成g s h 工业化 生产，为了社会经济和技术发展的需要，加大研究开发和生产谷胱甘肽的力度具 有实际意义。 1 8 本论文的主要研究内容和实验方案路线 1 8 1 本论文研究的主要内容 ( 1 ) 生物合成反应液中g s h 含量测定：利用铜( i i ) 新铜试剂一谷胱甘肽 体系的显色反应，谷胱甘肽和半胱氨酸对甲醛的反应特性，即在碱性条件下半胱 氨酸与甲醛反应的速度很快而与g s h 反应很慢。其原因是n h 2 及s h 基团参与 形成四氢噻唑五元环，而g s h 与甲醛反应只能形成十元环。再结合铜( i i ) 一新 铜试剂测定巯基的特点，即在室温条件下，适宜浓度的铜( ) 新铜试剂能与 g s h 快速反应使其形成稳定、易检测的衍生物。建立一种简便快速测定谷胱甘 肽的新方法，应用于生物合成反应溶液中谷胱甘肽含量的跟踪和分析。同时对 趟上0 x a n 衍生法进行了研究。 ( 2 ) 培养基组成对酿酒酵母催化合成谷胱甘肽的影响：在摇瓶培养实验基础 上考察培养基组成对酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e t b 6 生长及其谷胱甘肽合 成活性的影响。研究酵母对不同碳源、氮源的利用情况，k h 2 p 0 4 浓度对发酵的 影响。通过正交实验，优化菌体较好地利用葡萄糖，尿素的效果，确定摇床发酵 培养基的最佳组成。 ( 3 ) 探讨k 一卡拉胶与魔芋粉混合载体固定酵母细胞催化合成谷胱甘肽。利用 卡拉胶魔芋粉的复配胶为固定化材料，初步考察卡拉胶与魔芋粉配比，总胶浓 度、凝胶时间，k c i 离子浓度等条件对凝胶强度的影响。利用卡拉胶与魔芋粉复 配胶为固定化材料生产g s h ，探讨渊、温度、时间和磷酸盐浓度对固定化细胞反 应活力的影响。 ( 4 ) 探索应用离子交换法提取纯化谷胱甘肽。考察不同p h 溶液中的谷胱甘 肽的稳定性，接着对离子交换法提取还原型谷胱甘肽时的提取条件进行了研究， 最后比较了标准谷胱甘肽溶液与反应液在阳离子交换柱上的洗脱曲线。 1 8 2 本论文的实验方案路线 1 0 第二章生物合成反应液中g s h 含量测定 利用固定化微生物细胞生物转化是生产谷胱甘肽( g s h ) 的主要方式之一。 作为生物合成前体之一、浓度较高的半胱氨酸及微生物细胞泄漏物如含巯基的蛋 白质和辅酶，均可能对传统的按照巯基测定方法进行的谷胱甘肽含量分析产生干 扰。已有一些方法用于半胱氨酸共存情况下谷胱甘肽的测定，但是均存在一定的 不足或限制。如t i e t z ed t n b g s s g 循环分析法h 嘲可测定高浓度半胱氨酸存在时 谷胱甘肽含量，结果较准确，但是需要昂贵的辅酶i i 和谷胱甘肽还原酶：己二 醛酶法 4 7 1 需要复杂的技术和设备；纸层析 4 8 1 操作复杂，冗长费时；高效液相色 谱法h 9 1 需对样品进行繁琐的预处理，且多衍生化步骤；荧光光度法碡0 1 易受干扰， 误差较大。 a l l o x a n s l l 衍生法测定原理为：还原型谷胱甘肽( g s h ) 在实验条件下与 a l l o x a n 试剂( 四氧嘧啶) 作用，反应生成的物质在3 0 5 r t m 处紫外线区有最 高吸收峰。因而可以用紫外吸光光度法测定谷胱甘肽的含量。用本法测定时，半 耽氨酸上的一s h 亦与a l l o x a n 反应，但其最大吸收峰在2 7 5 n m 处，故对测定 虽有一定干扰，可以忽略不计。所以此法可用于半胱氨酸存在下的谷胱甘肽的测 定。 本文根据w r o n s k i t 5 2 1 提出的半胱氨酸、谷胱甘肽与甲醛的反应特点，即在碱 性条件下半胱氨酸与甲醛反应的速度很快而与g s h 反应很慢。其原因是n h 2 及 一s h 基团参与形成四氢噻唑五元环，而g s h 与甲醛反应只能形成十元环。再结 合铜( 1 1 ) - 新铜试剂( l ，2 ，9 - 二甲基一1 ，1 0 二氮菲) 测定巯基的特点，即在 室温条件下，适宜浓度的铜( ) 一新铜试剂能与g s h 快速反应使其形成稳定、 易检测的衍生物，探讨一种低成本、简单、快速的还原型谷胱甘肽测定方法，应 用于生物合成反应溶液中谷胱甘肽含量的跟踪和分析。 1 材料与实验方法 1 1 实验试剂 还原型谷胱甘肽( s i g m a 分装) ，新铜试剂( n e o c u p r o i n e ，a r ，上海化学试 剂公司) ，半胱氨酸( 生化试剂，上海蓝季科技发展有限公司) ，甘氨酸( 生化试 剂，上海蓝季科技发展有限公司) ，a l l o x a n 试剂( s i g m a 分装) ，其他试剂均 1 l 为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 1 2 测试仪器 7 5 2 紫外一可见分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ，p h 3 2 0 型酸度计 ( 梅特- 托利多仪器有限公司) ，恒温水浴槽( 上海医疗器械五厂) 。 1 3 溶液配制 1 标准g s h 溶液配制：准确称取0 0 1 0 0 9 g s h 以水溶解至1 0 0 m l 得到 1 0 0 z g m 1 4 标准溶液。 2 标准半胱氨酸溶液配制：准确称取o 0 1 0 0 9 半胱氨酸以水溶解至1 0 0 m l 得 到1 0 毗g m 1 4 标准溶液。 3 显色剂的配制：称取0 0 6 2 5 9 的c u s 0 4 5 h 2 0 ，以2 0 3 0 m l 水溶解，再称取 1 3 5 8 m g 新铜试剂用水溶解，两者充分混合后以蒸水定容至2 5 0 m l ，作为显色剂。 4 a l l o x a n 试剂配制：称取1 0 9 加上o x a n 试剂，用o 1 m o l l 的h c l 溶液 定容至1 升。 5 甘氨酸溶液的配制：称取7 5 0 7 9 甘氨酸，用蒸馏水定容至1 升，即得 o 1 m o l l 的甘氨酸溶液。 6 磷酸盐缓冲液的配制：分别配制o 2 4 m o l l n a 2 h p 0 4 溶液和o 2 4 m o l l 的 n a h z p 0 4 溶液，然后将两者按8 8 ：1 2 的体积比混合，即得0 2 4 m o l l 、p h 7 ，6 的 缓冲液。 7 甲醛溶液配制：甲醛溶液由分析纯试剂加适量的去离子水配制。 1 4 分析方法 ( 1 ) 将分析样品( 半胱氨酸含量不多于l o o a g m 1 ) l m l 加入到2 5 m l 容量瓶中， 然后加入3 m 1 0 1 5 m o l l n a o h 溶液，摇均匀。再加3 甲醛3 m l ，摇均匀，静止 反应3 m i n 。立即加入3 m l 显色剂，摇匀，阻水定容。用i c m 比色皿，稳定1 5 m i n 后，用试剂空白作参比，子4 5 6 n m 处测定溶液的吸光度。 ( 2 ) 样品中g s h 浓度的测定 a 将含有g s h 的样品萃取液用去离子水定容至2 5 m l ，取两支试管，分别 加入3 5 m l 的缓冲液和o 5 m l 的甘氨酸溶液，两试管中分别加入l m l 样品稀释液， 然后在试管中加入l m l 二次蒸馏水，另一管中加入i m l a l l o x a n 试剂，反应 2 0 分钟。以前者为空白，于3 0 5 r i m 处测定吸光度值a 。 b 由于a l l o x a n 试剂本身在3 0 5 r i m 处可能有少量吸收，因此需要对其 进行校正。以l m l 去离子水代替样品稀释液，同1 中操作测定a l l o x a n 试剂 的吸光度山，此值即为舢上o x a n 试剂空白值。 c 样品吸光度校正值a = a - a o ，根据a 值即可从标准曲线上查得样品 g s h 的浓度c o s h ( u m o t ) 在乘以稀释倍数，就得样品中的g s h 浓度。 2 结果与讨论 2 1a l l x o a n 衍生法测定g s h 标准盐线的制作 ( 1 ) 精确称取6 1 4 6 m g 的g s h 标准品，用4 0 乙醇溶解，定容至1 0 0 m l ，得 到浓度为2 0 0 u m o l l 的g s h 标准液。 ( 2 ) 取0 ，0l ，0 2 ，0 3 ，0 4 ，0 5 ，0 6 ，0 ，7 ，08 ，0 9 ，10 m l 上述g s h 标 准于试管中，加二次蒸溜水至1 0 m l ，配制成浓度为0 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ， 6 0 ，7 0u m o l l 的g s h 溶液。然后依次加入o 、2 4 m o l l 、p h 7 6 的磷酸缓冲液3 5 m l ， 0 1 m 0 1 l 的甘氨酸溶液o 5 m l ，以及a l l o x a n 试剂1 0 m l ，反应2 0 分钟，注意 反应时间需严格控制。 ( 3 ) 以空白管校正零点，于3 0 5 n m 处测定吸光度值a ，以浓度为横坐标，a 值为纵坐标，做g s h 标准曲线。 e 0 ，摹 j 疆0 - 4 光口，3 值a , 2 # 0o 口1 口 疆 口 鄹7 口 g s h 浓菠( m g 1 ) 图2 1a l l o x a n 法测定g s h 的标准曲线 2 2 吸收光谱 铜( i i ) 新铜试剂是二价铜离子与新铜试剂反应生成的螯合物c u ( n e o c u p r o i n e ) 2 ”，g s h - 与 c u ( n e o c u p r o i n e ) 2 2 + 的显色反应如下： 2 g s h + 2 c u ( n e o e u p r o i n e ) 2 ”一一( 孓s s - g + 2 c u ( n e o c u p r o i n e h + + 2 h + 反应后定量生成的 c u ( n e o c u p r o i n e ) 2 + 是一种橙色的配合物，在4 5 8 n m 处有 最大吸收。我们在3 7 0 6 0 0 n m 范围内对空白、标准和样品溶液进行光谱扫描， 结果见图2 2 。从图中可以看出，样品和标准的最大吸收波长均在4 5 6 n m 处。试验 中以4 5 6 n m 作为测量波长。 h m 图2 2 吸收光谱 1 谷胱甘肽标准液2 样品溶液3 空白溶液 2 3 铜( i i ) 与新铜试剂的比例 我们考察了c u 2 + 与新铜试剂的摩尔比与吸光度之间的关系，以找出c u 2 + 与 新铜试剂的最佳物质量之比。五种摩尔比不同的显色剂分别与g s h 反应，在 4 5 6 n m 处测定吸光度结果见表2l 。表21 说明，开始时，随着新铜试剂与c u 2 + 的摩尔比的增大，体系的吸光度先增大，当c u 2 + 与新铜试剂的摩尔比达到1 ： 25 时，吸光度基本稳定。这可能是因为当体系中新铜试剂与c u 2 + 的摩尔比仅 仅达到或刚刚超过 c u ( n e o c u p r o i n e ) 2 + 的配位数为2 时，体系中 c u ( n e o c u p r o i n e ) ： + 存在着相当程度的解离。随新铜试剂加入量的增大， c u ( n e o c u p r o i n e ) 2 + 的解离度减小。实验中选择c u 2 + 与新铜试剂的摩尔比为1 ： 25 ，即以o0 6 2 5 9 的c u s 0 4 5 h 2 0 和01 3 5 8 9 的新铜试剂组成显色剂。 表2 1c u ( i i ) 与新铜试剂的摩尔比对吸光度的影响 c u ( i i ) ：n e o e u p r o i n e5 6 l ：2 0 l ：2 5 l ：3 0 l ：3 5 l ：40 o 5 4 3 0 5 5 7 0 5 5 6 05 5 0 05 4 7 1 4 2 4 显色剂的用量对体系吸光度的影响 显色剂用量与体系吸光度之间的关系见图2 - 3 。从图2 3 中可以看出，随着 显色剂的用量增加，体系在4 5 6 n m 处的吸光度也随之增加，当显色剂用量达到 2 5 m l 以后，体系的吸光度基本保持不变，这表明体系中的g s h 已完全反应， c u ( n e o c u p r o i n e ) 2 + 的浓度也达到了最大值，所以实验中选择显色剂用量为3 m l 。 0 45一-一 123 456 显色鼎用量( m 1 ) 图2 3 显色剂用量对体系吸光度的影响 2 5 标准曲线的制作 取适量的1 0 0 g m l 。谷胱甘肽标准溶液，按1 4 分析方法配制成最终浓度为 2 0 、4 0 、6 0 、1 0 0 、1 2 0 、1 6 0 、2 0 0 、2 4 0 、2 6 0 、2 8 陬g m l 的g s h 标准溶 液，相对试剂空白测定它们在4 5 6 n m 处的吸光度。以y 纵坐标，表示吸光度5 6 ， 以x 为横坐标，表示g s h 浓度( z g m 1 ) ，得到回归方程：y = 0 0 3 2 9 x 0 0 0 0 4 r 2 = o 9 9 9 8 。实验说明g s h 含量在o 3 毗g m l 范围内与吸光度5 6 呈良好线性 关系。 051 01 52 0 g s h 浓度( u g m 1 ) 图2 4测定谷胱甘肽浓度的标准曲线 h舱钉巧蚰姆盯鸲 o 0 0 o o 0 o o 理景蓉 2 6 半胱氨酸、谷胱甘肽与不同浓度甲醛的反应 各取适量的半胱氨酸溶标准液和g s h 标准溶液，按1 4 分析方法分别与不 同浓度的甲醛反应不同时间后测定吸光度，以水代替甲醛作为对照。由表2 2 可 知，3 的甲醛在3 m i n 之内与半胱氨酸反应较快，几乎将其完全掩蔽，而谷胱甘 肽受影响很小。5 、1 0 的甲醛同样也能有效地掩蔽半胱氨酸，但同谷胱甘肽反 应造成的误差较大。从测量的准确性考虑，本文选用3 的甲醛反应3 m i n 作为反 应条件。 表2 2 甲醛与半胱氨酸和g s h 的反应活性 表1甲醛与半胱氨酸和g s h 的反应活性 2 7 半胱氨酸共存时g s i - i 含量分析 各取适量的g s h 标准溶液和半胱氨酸标准溶液，按1 4 分析方法测定表2 3 中的样品，同时以等体积水代替其中的半胱氨酸标准溶液作为对照。实验结果说 明在半胱氨酸共存时本分析方法可行。 表2 3 半胱氨酸共存时g s h 含量分析 2 8 实际反应体系中g s t t 的含量分析 生物合成g s h 反应体系中含有g l y 、c y s 、g l u 各2 0 3 0 m m o l l ， m g c l 2 0 0 1 m o l f l ，p h 7 0 磷酸钾缓冲液o 1 m o l l 和微生物细胞泄漏物如蛋白质、 辅酶等含巯基的物质，可能会对分析产生干扰。为检测方法的可行性，取适量的 g s h 标准溶液、半胱氨酸标准溶液和1 0 酵母细胞热抽提液，按1 4 分析方法进 行实验。实验表明，在测量生物合成反应溶液中g s h 含量时，以不加g s h 氨基 酸前体的溶液为对照，可以消除细胞泄漏物带来的干扰，即实际反应体系中本分 析方法可行。 表2 4 生物合成反应体系中g s h 含量测定 2 9 回收率实验 分别取适量g s h 标准溶液和来自谷胱甘肽生物合成反应体系的样品溶液， 配成五种不同浓度的混合溶液，同时设立不加g s h 前体氨基酸的溶液作为对照， 适当稀释后进行回收率实验，结果见表。由表2 5 可知，该方法对g s h 的回收 效率及精确度均令人满意。 表2 5 回收率实验 2 1 0 生物合成反应液中谷胱甘肽的测量 取不同的反应样品，稀释到适当倍数，按实验条件显色，在4 5 6 n m 处以试剂 为空白读取吸光度值，每个样品做六次平行测定，结果列于表2 6 中，并与荧光 法测定的结果相比较。 表2 6 反应液中谷胱甘肽含量测定 3 本章小结 3 1 对于生物合成反应溶液中g s h 浓度的测定，通过设立不加g s h 氨基酸 前体的溶液为对照可以消除可溶性细胞泄漏物等带来的干扰，一般情况下测定结 果偏低，但误差不超过5 。若样品浓度较高，将其适当稀释后再作分析可以降 低误差。 3 2 分析方法适用于半胱氨酸浓度小于1 0 0 p g m l 的样品，如果大于1 0 叩g m l ，可以稀释后再分析，也可以延长甲醛同半胱氨酸的反应时间或采用更高浓 度的甲醛，但应重新制作标准曲线。在强碱条件下，谷胱甘肽与甲醛的反应速度 会下降，可以降低甲醛与谷胱甘肽反应造成的误差，因此在实验中用n a o h 溶 液调至碱性。方法适合分析还原型谷胱甘肽，氧化型谷胱甘肽还原以后可以分析。 第三章培养基组成对酿酒酵母催化合成谷胱甘肽的影响 还原型谷胱甘肽( g s h ) 最早是从酵母或植物种子胚芽中抽提，在化学结构 确定后开始应用化学合成法生产，二十世纪七十年代以来发酵法及酶法合成 g s h 得到了很大的发展，目前国