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TCID50测定方案20121123391 简介TCID50(Tissue Culture Infective Dose)，半数组织培养感染量，又称50%组织细胞感染量，指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathic effect，CPE)的病毒量。 将不同稀释度的病毒接种到96孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变，待细胞不再病变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数，按照Reed-Muench公式计算TCID50值。2 试剂试剂来源保存条件DMEM-basic培养基Gibco，上海4保存胰蛋白酶 Gibco，-20冻存胎牛血清Fetal bovine serumHyclone，-20冻存PBS Hyclone，-20冻存3 仪器与耗材仪器规格耗材规格CO2培养箱细胞培养瓶25cm2生物安全柜无菌离心管15mL，50mL倒置显微镜一次性移液管1mL，2mL，5mL，10mL显微照相系统细胞培养板96孔高速冷冻离心机电子天平移液器液氮罐电冰箱4 细胞及培养基DF-1细胞株细胞生长液（500mL）：20%FBS（胎牛血清）+1%双抗（青链霉素）+剩余用DMEM 100mL 5mL 395mL细胞维持液（50mL）： 1%双抗（青链霉素）+ DMEM（无血清）+1%FBS 0.5mL 49mL 0.5mL细胞冻存液（50mL）：70%DMEM-basic + 20%FBS + 10%DMSO 35mL 10mL 5mL4保存备用5 病毒株及培养方法禽流感病毒（Avian influenza virus ，AIV），H5N1株；禽白血病病毒（Avian leukosis virus ，ALV），HPRS-103株；禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus ，IBV），H52株；禽传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus ，IBDV），B87株。病毒培养方法：DF-1细胞培养和鸡胚培养。6 操作步骤6.1 DF-1细胞的传代1. 吸弃细胞培养瓶中旧的培养液；2. 加入灭菌PBS 5mL清洗细胞，重复两次；3. 加入1ml 0.25%的胰蛋白酶消化；4. 约40s左右（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大），站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液10mL，反复吹打瓶壁细胞(吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散，之后取两只新的细胞培养瓶，开盖待用；5. 向原细胞瓶中再加入细胞生长液10mL，并吹吸混匀，然后吸取约7ml细胞悬液加入到2个新的培养瓶中；6. 37 5%CO2中培养3天，期间观察细胞生长情况，细胞长至占瓶壁70%-80%时可接种病毒，长满可传代。6.2 DF-1细胞的冻存1. 取生长48-72h的DF-1细胞，吸弃旧的培养液；2 .吸取无菌PBS 5mL清洗细胞，重复两次；3. 加入1mL 0.25% 胰蛋白酶消化；4. 约40s左右后，加入3mL DF-1细胞生长液终止消化，并吹打细胞瓶壁，使细胞悬浮于生长液中；5. 吹吸细胞，使混匀，之后将细胞悬液转移至50mL无菌离心管中；6. 1000rpm，室温离心10min；7. 弃上清，加入细胞冻存液，置-20、-80梯度冻存，最后保存于液氮中。6.3 TCID50的测定6.3.1 96孔板培养细胞1. 取1瓶长满的细胞，吸弃培养瓶中旧的培养液；2. 吸取无菌PBS 5mL清洗细胞，重复两次；3. 向瓶内加入1ml 胰蛋白酶消化；4. 约40s左右后（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大），站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液10mL，反复吹打瓶壁细胞(吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散； 5. 吸取一滴细胞悬液置于细胞计数板上，对细胞进行计数；6. 加入细胞生长液稀释细胞悬液至含细胞22.2万个/mL（约4万个/孔）；7. 取一块96孔板，每孔加100l的细胞悬液（枪头紧贴孔的一侧壁且不接触孔底，缓缓将细胞打下去，每加8孔，将未加的细胞悬液均匀混合），铺好后静置5min观察细胞，再放入37培养箱中培养至细胞长到70%-80%。6.3.2 96孔板接种病毒1. 将病毒室温解冻。吸取细胞维持液 9mL，再吸取1ml病毒液，用0.22m微孔滤膜过滤至15ml无菌离心管中，记为1号管；2. 另取10只1.5ml无菌离心管，编号2-11，将1中病毒悬液用细胞维持液10倍递次稀释成10-2至10-11 不同的稀释度；3. 弃去96孔板中的旧培养液（甩板法：紫外灭菌前将铺有纱布的托盘置于工作台灭菌），分别在每孔加入100l的无菌PBS洗涤，重复两次；4. 每孔接种100l上述梯度稀释的病毒液，每个稀释度接种8孔。并设置1列正常细胞对照组，每孔加100l细胞维持液，37 CO2培养箱中吸附1h。（图1）细胞对照组 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 图1 96孔板中病毒接种1：细胞对照组；2-12：为接种病毒组5. 1h后每孔加入细胞维持液100l，放入37培养箱中继续培养。6. 每日在倒置显微镜下观察细胞病变（70%以上的细胞出现CPE判为感染），记录病变程度和孔数（并拍照），待细胞病变不再继续（约72h后）后判定并记录结果（表1）。表1病毒液稀释度出现CPE孔数无CPE孔数累 计出现CPE孔所占的%CPE孔数无CPE孔数10-110-210-310-410-510-610-710-810-910-107 .按照Reed-Muench计算法计算（本实验用100TCID50/0.1ml）：距离比例（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）X：lgTCID50=距离比例稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数TCID50=10-X/0.1ml 含义：将该病毒稀释10X接种100l可使50%的细胞发生病变。示例：细胞病变情况统计及致病百分率计算病毒液稀释度出现CPE孔数无CPE孔数累 计出现CPE孔所占的%无CPE孔数CPE孔数10-180049100%10-280041100%10-380033100%10-47112596.2%10-56231885.7%10-64471263.2%10-75310844.4%10-82616315.8%10-9172314.2%10-1010