（生理学专业论文）humanin对aβ3135引起的大鼠皮层神经元凋亡的保护作用及其机制研究.pdf

山西医科丈学博士学位论文 h u m a n i n 对a1 33 1 _ 3 。引起的大鼠皮层神经元 凋亡的保护作用及其机制研究 中文摘要 阿尔茨海默病( a l z h e i m e rd i s e a s e ，a d ) 是一种常见的以进行性记忆减退、认知障碍为主 要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，病理改变以大脑皮层和海马等脑区的细胞外老年 斑形成、细胞内出现神经纤维缠结、神经突触的丢失和神经元大量死亡为特征。关于a d 的发病机制说法各异，但均无定论，因而缺乏有效的预防与治疗手段。越来越多的研究表 明，b - 淀粉样蛋白( p a m y l o i d p r o t e i n ，a 1 3 ) 在脑组织中的过度沉积可能与a d 的发病密切 相关，是a d 形成和发展的关键因素。2 0 世纪9 0 年代初，y a n k n e r 等首先观察到较高浓度的 a p l 4 2 能引起神经元死亡：之后的研究又证实a p2 5 - 3 5 ，一个小的a p 片段具有与完整肽链相 类似的毒性作用，因而认为a p2 5 3 5 可能是a p 发挥毒性作用的必需结构或活性中心。最近， 本实验室和其他学者的工作证实，ab + 。s 一个更小的肽段，也具有与完整肽链和a b2 卜3 5 相 似的毒性作用，提示这个五肽可能是a b 中更短的关键性序列结构，在a 1 3 发挥毒性作用的 过程中具有更重要的意义。s t a d e l m a n n 等( 1 9 9 8 ) 证实了a d 发病过程中神经元死亡的主要 形式是凋亡，之后的离体实验证实a p 包括a p i 越、a 艮5 - 3 5 及a 尚1 1 3 5 都可引起神经元凋亡，因 而探讨能抑s t j a l b 所致的神经元凋亡就成为预防及治疗a d 的重要途径。 n u m a n i n ( h n ) 是h a s h i m o t o ( 2 0 0 1 ) 报道的存在于a d 患者脑组织中具有神经保护作用 的多肽类物质。实验证实，h n 能有效抑制多种f a d 基因和a b 衍生物诱发的神经元的死 亡，并且证实h n 可抑制a 1 3 , m 引起的原代培养神经元的死亡，但这种抑制机制未见相关报 道。由于a bs 。m 与a b 。具有相似的毒性作用，那么删是否也能抑制a 1 3 。的神经毒性 以及作用机制如何? 本实验从以下三方面进行观察和分析：l 、观察i - i n 对a b 。致神经 元凋亡的影响：2 、对h n 拮抗a1 3 。致凋亡作用的机制进行研究分析：3 、观察h n 对a b 。；龉引起的神经元 c 。1 i 升高的影响。 第一部分h u m a n i n 拮抗a p 3 1 - 3 5 致凋亡作用的观察 文献报道，h n 能够抑制a b 。的毒性作用。本实验室及其他学者的研究结果显示，a 1 3 ”* 与a 1 3 完整肽链具有相似的毒性作用。那么h n 是否也能抑制a b + 。的毒性作用? 本 部分采用原代培养的大鼠大脑皮层神经元观察h n 对a 1 3 。致凋亡作用的影响。 方法：选用3 天的w i s t a r 大鼠，分离皮层神经元，阿糖胞苷去除胶质细胞纯化神经 元，m a p 2 鉴定神经元。在加入a d 3 l - 3 5 ( 2 5 1 a m ) 同时或提前不同时间( 8 小时、1 6 小时) 加入 不同浓度( 5 1 a m 、1 0 肛m 、2 0 i t m ) 的h n ，再加入a b 。( 2 5 1 a m ) 继续培养2 4 小时后，采用 电镜观察神经元凋亡的形态学改变；采用流式细胞术、t u n e l 法、h o c h e s t3 3 3 4 2 染色定 i j i j 医科大学陴十学伸论文 量检测神经元的凋亡率。 结果：l 、培养神经元的定性检测及神经元凋亡的形态学观察：采用神经元特异性标记 蛋白m a p 2 免疫荧光染色对分离培养的皮层神经元进行定性检测，证实9 0 以上的细胞呈 阳性反应，说明培养的神经元纯度符合要求。用透射电镜对凋亡神经元进行了形态学观察， 结果显示，f 常神经元细胞核呈圆形或椭圆形，核膜清楚，染色质均匀分布，核仁清晰可 见。加入ab ：l l - ：s r i ( 2 5 9 m ) 后神经元凋亡明显增加，凋亡神经元出现了凋亡的特征性改变， 包括核膜皱缩、染色质凝集成团块沿核膜边集、分布不均匀。胞浆浓缩，细胞器集聚并出 现退行形变。典型的凋亡细胞可见胞浆形成芽突、脱落形成凋亡小体。2 、凋亡神经元的定 量检测：采用不同的方法( 流式细胞检测、| 、u n e i 。检测乖1 1 1 0 3 3 3 4 2 染色) 刈利1 经元的凋亡 程度进行定量检测。( 1 ) 流式细胞术检测结果显示，在对照组仅有少数细胞发生凋亡，总 凋亡率( 早期+ 中、晚期) 为7 4 3 ，而在a 目：。( 2 5 9 m ) 孵育2 4 小时后引起了凋亡细 胞的明显增加，总凋亡率可达3 2 6 ，明显高于对照组( p o 0 1 ) 。之后我们观察了不同时 间点加入不同浓度的h n ( 与加入2 5 州ab 。；同时，提前8 小时、提前1 6 小时分别加入5 9 m 、 l o “m 、2 0 p m 的h n 孵育) 对ab 。所致神经元凋亡的影响，结果显示，与ab + 。同时给 予5 9 m 、1 0 9 m 、2 0 9 m 的h n 或提前8 小时给予这三个剂量的h n ，对ap 。( 2 5 9 m ) 诱 导的神经元凋亡均未产生影响，只有当2 0 9 m 的h n 提前1 6 小时给予时，才观察到h n 对a b 。致凋亡作用的抑制，神经元的凋亡率由单独a 1 3 。组的3 2 2 4 6 1 2 降至2 0 3 6 4 2 6 ，具有显著性差异( p o 0 5 ) 。进一步分析h n ( 2 0 1 x m ) 对a1 3 。导致的早期凋亡和 晚期凋亡的影响，发现：h n ( 2 0 9 m ) 提前1 6 小时孵育，神经元的早期凋亡率较ab ，。组 下降了4 8 5 ，而晚期凋亡率仅下降了1 9 3 ，说明h n 对ab 。的拮抗作用主要表现在凋 亡发生的早期。( 2 ) t u n e l 检测结果显示：对照组神经元的凋亡指数仅6 8 7 ，a0 + 。( 2 5 9 m ) 孵育组凋亡指数明显升高( 2 8 3 6 ，p o 0 1 ) ：在给予a83 1 - ：。5 ( 2 5 9 m ) 前1 6 小时用不 同剂量的h n ( 5 “m 、1 0 9 m 、2 0 m ) 孵育 i | i 经元，只确在2 0 u m 的n 组表现出对a 且。 ( 2 5 9 m ) 致凋亡的抑制作用，凋亡指数降低为1 7 5 7 ( p o 0 1 ) ，其余各组的凋亡指数 与a1 33 1 - 3 。( 2 5 9 m ) 组相比均无i 掘显改变，上述结果与流式细胞术的检测结果基本一致。 h 03 3 3 4 2 染色的结果也显示了类似的变化趋势。 本实验结果提示：1 、h n 可以拮抗a b 。一。致神经元凋亡的作用；2 、h n 拈抗a 1 3 + 。的致 凋亡作用具有剂量和时间依赖性。只有2 0 9 mh n 提前1 6 小时孵育才能抑制a b 。，。引起的 神经元凋亡；3 、h n 对ab ：1 1 - ：l f i 引起的神经元凋亡的保护作用主要表现在凋亡发生的早期。 第二部分h u m a n i n 拮抗a p 3 1 _ 3 s 致凋亡作用机制的研究 有文献报道a 1 3 一可通过活化j n k ( c j u n n - t e r m i n a lk i n a s e ，c - j u nn 末端激酶) 途径， 进而激活c a s p a s e 8 经外源性途径引起神经元凋亡。前期的实验结果已经显示h n 具有拮抗 a 1 3 。s 致凋亡的作用，那么a 1 3 + 。是否象a b 。一样也通过j n k 途径发挥致凋亡作用? 更 i l i i 西医科大学辨士学位论文 重要的是h n 是否通过抑制此途径而抑制凋亡发挥保护作用? 我们通过观察j n k 途径上的 关键基因c - j u n 、它的下游基因f a s l 蛋白的表达以及检测c a s p a s e 系统( 包括c a s p a s e 8 和c a s p a s e 3 ) 活性的的改变，旨在证实a1 3 。和h n 是否通过外源性途径实现它们的致凋 亡和抗凋亡作用。 另外，我们u i 通过检测b a x 蛋r | n 勺农达、b a xo j 线粒体的结合和c a s p a s e9 活性的改变 分析内源性途径是否也参与了a 1 3 。、。；的致凋亡和h n 的保护作用。 方法：应用生物比色法测定c a s p a s e 3 、c a s p a s e 8 、c a s p a s e 9 活性的改变。应用 w e s t e r n b l o t 方法检测a 1 3 + 。和h n 对b a x 表达以及b a x 与线粒体结合的影响，应用免疫细 胞化学技术检测a 1 3 。单独给予、a 1 3 。与h n 共同给予对c j u n 、f a s l 蛋白表达的影响。 结果：l 、h n 拮抗a o 。诱导的c a s p a s e 活性增加的作用观察：( 1 ) c a s p a s e 3 的活性检测 结果显示，对照组c a s p a s e3 的o d 值为0 0 2 4 ，a 1 33 1 - 3 s ( 2 5 ) 孵育组c a s p a s e3 的 0 d 值为0 1 1 2 ，活性明显增高( p o 0 1 ) 。a1 33 1 - 3 5 ( 2 5 t j m ) 孵育前1 6 小时给予不同浓度 ( 5 p m 、l o g m 、2 0 p m ) 的h n 预孵育时，只有2 0r a l 的h n 预孵育时c a s p a s e3 的活性降 低( o d 值为0 0 4 8 ) ，与ab3 1 - 3 f , ( 2 5 9 m ) 单独孵育组相比差异有显著性( p 0 0 5 ) 。说明 h1 3 + 通过增强c a s p a s e 3 的活性引起凋亡，而h n 通过降低c a s p a s e 3 的活性阻止了凋亡的 产生，与第一部分结果一致。( 2 ) c a s p a s e 8 的活性检测结果显示，a8 。( 2 5 9 m ) 孵育 组c a s p a s e8 的活性比对照组明显增高( 对照组o d 值为0 0 0 5 3 ，a1 3 + 。s 孵育组为0 0 2 0 p o 0 1 ) 。提前1 6 小时给予不同浓度( 5 9 m 、l o l a m 、2 0 9 m ) 的h n 预孵育时，只有2 0 p m 的 h n 引起c a s p a s e8 的活性降低，( o d 值为0 0 1 6 3 ，与a 1 3 + 。单独孵育组相比差异有显著性， p o 0 5 ) 。但降低幅度较小，仅有1 8 5 。( 3 ) c a s p a s e 9 的活性检测结果显示，对照组c a s p a s e 9 的活性较低( o d 值为0 0 1 4 ) ，ab3 1 - 3 5 ( 2 5 9 m ) 孵育2 4 小时后c a s p a s e9 的活性明 显升高( o d 值0 0 4 6 ，p o 0 1 ) ；提前1 6 小时给予5 州、l o 州的h n 预孵育时c a s p a s e9 的 活性没有改变，当给予2 0 州的h n 时，c a s p a s e9 的活性比a 1 33 1 - 3 5 ( 2 5 1 0 ) 孵育组降低 了4 7 8 ，o d 值为0 0 2 4 ( p o 0 1 ) 。降低幅度明显高于c a s p a s e8 的降低幅度( 1 8 5 ) 。 这一组实验结果说明，应用h n 后，对抗了ab 。的致凋亡作用，表现为c a s p a s e3 活性 的下降。从c a s p a s e 8 和c a s p a s e9 的检测结果看，h n 引起二者的活性都有下降，但c o s p a s e 9 的下降幅度明显高于c a s p a s e8 的下降幅度，提示h n 通过外源性和内源性两条途径抑 制h1 3 的致凋亡作用，但以内源性途径为主。 2 、h n 拮抗a0 。j 诱导的c j u , 1 、f a s l 蛋白表达增加的作用观察：结果显示： ( 1 ) h1 33 1 - 3 5 ( 2 5 m ) 提高了神经元中c j u n 的表达( 对照组i o d 值为7 8 0 2 9 3 ，ab 。组为 1 2 4 3 4 3 ，p o 0 1 ) ：h n 提前1 6 小时孵育，c j u n 蛋白的表达低于a0 ，。( 2 5 9 m ) 单独孵 育组，差异有显著性( p o 0 5 ) 。( 2 ) a b3 1 - 3 5 ( 2 5 9 m ) 增加了f a s l 蛋白的表达( 对照组i o d 值为1 3 4 3 4 3 ，a1 3 ：。组为4 4 5 7 2 8 2 ，p o 0 1 ) 。2 0 p m 的h n 预孵育组，f a s l 蛋白的表 达降低( i o d 值为2 6 1 4 5 3 5 ) ，与a 1 3 ；。1 - 3 5 ( 2 5 9 m ) 单独孵育组相比差异有显著性( p 0 0 5 ) ；但征a b 。孵育组，b a x 蛋白的含量叫显增商( 1 0 0 值为1 0 0 3 0 9 ， p 0 0 5 ) ：而在2 0 9 m 的h n 预孵育1 6 小时后加入a b 。继续孵育2 4 小时，并未抑制b a x 的 表达，因而b a x 蛋白的含量与a b 。单独孵育组相比没有明显改变。这组实验结果表明， b a x 参与了ab 。的致凋亡过程，而h n 不是通过影响b a x 的表达实现其神经元保护作用 的。( 2 ) 对b a x 与线粒体结合的分析：在剔除胞浆中的线粒体后重新检测了胞浆中b a x 蛋白的含量，发现f i n ( 2 0 p m ) 提前并随后加入ab 。孵育组与单独ab 。孵育组相比， 前者条带增宽、颜色加深；经图像分析表明，上述复合孵育组胞浆中b a x 蛋白的含量( 1 0 d 值为9 6 9 4 2 ) 高于h b 儿。；单独孵育组( 1 0 d 值为5 8 0 5 2 ) ( p 0 0 5 ) 。当加入终浓 度为2 0 州的i - i n 时，细胞内游离 c a 2 + 】i 进一步下降，与对照组相比差异有显著性( f 3 4 0 3 8 0 值为7 4 3 2 4 6 3 5 4 ，p 0 0 5 ) 。 3 、f i n 对ao 。所致神经元【c a 2 十 升高的影i 砌：1 ) h n 提前 给予对ab 。引起的 c a ” i 升高的影响：用1 0 t m 的h n 预孵育神经元1 0 分钟后再加入终浓 度为2 5 9 m 的a0 。一。仅有3 7 的神经元出现 c a 2 + 】i 增加，且增加幅度明显低于ab + 。单独孵 育组( f 3 4 0 f 3 8 0 值为9 1 8 7 8 8 5 0 7 3 ，a0 。单独孵育组f 3 4 0 f 3 8 0 值为1 0 4 2 5 6 8 3 5 4 ， p 0 0 5 ) 。如果将a1 3 。：。单独孵育组的升高幅度作为1 0 0 ，h n ( 1 0 1 t m ) 预孵育组引起【c 。2 + 升高的幅度仅为4 8 。当浓度加大n 2 0 u m 时，出现 c a 2 + 】i 升高的神经元比例进一步减少 ( 2 4 ) ，升高的幅度也进一步降f k 毛( f 3 4 0 f 3 8 0 值为8 7 6 3 4 6 5 ，5 7 ，ab + 。单独孵育组 f 3 4 0 f 3 8 0 值为1 0 4 2 5 6 8 3 5 4 ，p 0 0 5 ) 。2 0 p m 的h n 与a1 33 1 + 3 5 ( 2 5 9 m ) 同 时孵育，有4 2 的神经元出现胞内游离钙浓度的升高，且升高的幅度低于a b ，。单独孵育 组，f 3 4 0 f 3 8 0 值为8 9 8 5 6 7 6 4 6 ( ab 。单独孵育组f 3 4 0 f 3 8 0 值为1 0 4 2 5 6 8 3 5 4 ， p 0 0 5 ) 。以a1 3 + 。单独孵育组的升高幅度作为1 0 0 ，h n ( 2 0 m ) 与ab3 1 - 3 5 ( 2 5 , m ) 同 时孵育引起【c a 2 + 】i 升高的幅度仅为3 9 5 。 本实验结果提示：l 、ab 。可能是引起培养皮层神经元胞内钙超载的原因之一。2 、 h n 抑制ab + ：。引起的神经元【c a 2 + 】i 升高具有时间和剂量依赖性。 关键词：a d ，1 3 一淀粉样蛋白3 1 3 5 ( ab 。s ) ，h u m a n i n ，凋亡，c a s p a s e ，c n ，f a s l ， b a x ，胞内钙( c a “ i ) ，神经元培养，皮层丰i 1 经元，神经保护 v i h i e , i 医科火学博十学位论文 n e u r o p r o t e c t i v ea c t i o na n dm e c h a n i s m so fh na g a i n s tn e u r o n a l a p o p t o s i si n d u c e db yp - a m y l o i dp e p t i d e 3 1 - 3 5 a b s t r a c t a l z h e i m e r sd i s e a s ei st h em o s tp r e v a l e n tn c u m d e g e n e r a t i v ed i s e a s e ，c h a r a c t e r i z e db yt h e p r e s e n c eo fe x t e n s i v ee x t r a c e l l u l a ra m y l o i dp l a q u e s ，i n t r a c e l l u l a rn e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，a n d s y n a p t i cl o s s ，n e u r o n a ld e a t h i nc e r e b r a lc o r t e xa n dh i p p o c a m p u s ，a l o n gw i t hp r o g r e s s i v e i m p a i r m e n to fc o g n i t i o na n de m o t i o n a la c t i v i t i e s d e s p i t es o m ec l i n i c a lt r i a l sw i t he n c o u r a g i n g r e s u l t s ，n oc u r a t i v et h e r a p yf o rt h i sd i s e a s eh a ss of a rb e e nd e v e l o p e d i n c r e a s i n ge v i d e n c e s s h o w nt h a tp - a m y l o i d ( a 1 3 ) d e p o s i t i o ni st h el e a d i n gc a u s ef o ra d 3 - a m y l o i da r em a j o rp r o t e i n c o m p o n e n t o ft h ea m y l o i dp l a q u e sa n di si n v o l v e di nt h ep a t h o g e n e s i so fa d s u b s e q u e n t s t u d i e sh a v ed e m o n s t r a t e dt h a ta p o p t o s i si sam a j o rf o r mo fn e u r o n a ld e a t hi na dw h i c hc o u l d b ei n d u c e db y a b l - 4 2 、a 1 3 2 5 - 3 5a sw e l la s a i b 3 1 - 3 5 h u m a n i ni sar e c e n t l yi d e n t i f i e dp e p t i d et h a ts u p p r e s s e sc e l ld e a t hi n i t i a t e db ya l z h e i m e r s d i s e a s e - r e l a t e di n s u l t s i nn e u r o n a lc e l l s i n c l u d i n ga b l 啦i n d u c e d n e u r o n a ld e a t h ( h a s h i m o t o ，2 0 0 1 ) a 1 3 p 3 1 - 3 5 ，a ns m a l l e ra m y l o i dp e p t i d ef r a g m e n tr e p o r t e dp o s s e s s e st h e s i m i l a rt o x i c i t ya sf u l ll e n g t ho fa ba n df r a g m e n to fa 1 3 2 5 3 5d o t h u st h ep a r tio ft h i ss t u d yi s t oe x a m i n ew h e t h e rh np r o t e c t sn e u r o n sf r o ma i 3 1 3 5 i n d u c e da p o p t o s i s t h ep a r ti ii st o e x p l o r em e c h a n i s m so f h na g a i n s ta 3 3 1 3 5 i n d u c e da p o p t o s i s o rt od e t e r m i n ei f e x t r i n s i ca n d o r i n t r i n s i cp a t h w a ya r ei n v o l v e di nn e u r o p r o t e c t i o no fh n t h ep a r ti i ii st oo b s e r v et h ee f f e c t so f i - i no ne l e v a t i o no f i n t r a c e l l u l a rc a l c i u mc o n c e n t r a t i o ni n d u c e db ya 1 3 3 1 3 5 p a r tih n p r o t e c t sc u l t u r e dn e u r o n sa g a i n s ta p o p t o s i si n d u c e db ya i b 3 1 3 s i nt h ep r e s e n ts t u d yw ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fh no nn e u r o n a l a p o p t o s i si n d u c e db y a 1 3 3 1 - 3 5i nc u l t u r e dc o r t i c a ln e u r o n si nr a t sb ym o r p h o l o g i c a la n a l y s i s ，f l o w c y t o m e t r i ca s s a y s ， t u n e le x a m i n a t i o n sa n dh o3 3 3 4 2s t a i n i n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：1 1 a b e l i n gc u l t u r ec e l l sw i t hm a p 2 ( m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e d p r o t e i n 一2 ， m a r k e r p r o t e i no fn e u r o n s ) ，s h o w e dt h a t9 0 o fc u l t u r ec e l l sa r em a p 2p o s i t i v ec e l l sn a m e l y t h en e u r o n a lc e l l s 2 a p o p t o t i cn e u r o n s i n d u c e db ya 3 1 3 5p r e s e n t e dat y p i c a la p o p t o t i c m o r p h o l o g yb ym o r p h o l o g i c a la n a l y s i s ：t h ec y t o p l a s mc o n c e n t r a t e d ，t h ec h r o m a t i na g g r e g a t e d p e r i p h e r a l l yi n t od e n s em a s s e sa n dl a i da g a i n s tt h en u c l e a rm e m b r a n e ，t h es h a p eo fn u c l e u s b e c a m ei r r e g u l a r , a n df i n a l l yf o r mn u c l e a rf r a g m e n t sk n o w na sa p o p t o t i cb o d i e s 3 w ee x a m i n e d w h e t h e rh ni n h i b i t e da p o p t o t i ce v e n t si n d u c e db ya p p 3 1 3 5 ( 2 5 p m ) b yf l o wc y t o m e t r i ca s s a y ， t u n e la n dh o3 3 3 4 2s t a i n i n g t h er e s u l t so b t a i n e d b yf l o we y t o m e t r i ca s s a ys h o w e dt h a t1 ) 山西医科大学博士学位论文 t h ea p o p t o t i cr a t ew a su pt 0 3 2 6 w h e ni l e u r 0 1 ：l st r e a t e d 诵t l la i p 3 1 - 3 5 ( 2 5 1 a m ) w h i l et h en o r m a l w a s7 4 3 ，p 0 0 1 2 ) w h e nh n ( 5 9 m ，l o g m ，2 0 9 m ) w a sa d d e dw i t ha 1 3 3 1 - 3 5 ( 2 5 k t m ) t o n e u r o n ss i m u l t a n e o u s l y ，h nc o u l dn o tp r o t e c tc u l t u r e dn e u r o n sf r o ma p o p t o s i si n d u c e db y a b 3 l _ 3 5 3 ) p r e t r e a t i n g n e u r o n sw i t hh n ( 5g m ，1 0 1 t m ，2 0g m ) f o r8 hr e s p e c t i v e l y , p r o d u c e d n os i g n i f i c a n te f f e c t so na 1 p 3 1 3 5 一i n d u c e da p o p t o s i s ，4 1w h e ni l e u r o n sw a sp r e t r e a t e dw i t hh n ( 5 州，1 0 0 m ，2 0 州) f o r1 6 hr e s p e c t i v e l y , b o t h5g ma n d1 0 p mh nh a dn oe f f e c t s o i l a 1 3 p 3 1 3 5 - i n d u c e d a p o p t o s i s ，w h i l e t h e h i g h e rh n ( 2 0g m ) s i g n i f i c a n t l ys u p p r e s s e d a 1 3 p 3 1 3 5 一i n d u c e da p o p t o s i sw i t hd e c r e a s e da p o p t o t i cr a t eo f 2 0 3 6 ( p 0 0 5 ) t h e s er e s u l t sh a v e b e e nc o n f i r m e db yt u n e l s t a i n i n g ，t h ea p o p t o t i cr a t eo fn e u r o n sp r e t r e a t e dw i t hh n ( 2 0 9 m ) f o r1 6 hd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t ht h eg r o u po f a p 3 1 3 5 o u rp r e s e n tr e s u l t s s u g g e s tt h a th np r o t e c tc u l t u r e dc o r t i c a ln e u r o n sa g a i n s ta p o p t o s i s i n d u c e db ya 1 3 3 1 3 5 t h ep r o t e c t i v ee f f e c to fh ni st i m e d e p e n d e n ta n dd o s e d e p e n d e n t ，a n dh n i n t e r f e r e st h ee a r l ys t a g eo fa p o p t o s i s p a r trm e c h a n i s m su n d e r l y i n gh n p r o t e c t i n gc u l t u r e du e u r o n sa g a i n s t a p o p t o s i si n d u c e db ya p 3 1 - a s t oe x p l o r et h em e c h a n i s mb yw h i c ha 8 3 1 3 5i n d u c ea p o p t o s i s ，a n dh ns u p p r e s s a p o p t o s i s i n d u c e d b ya p 3 1 - 3 5 ，w eh a v ef i r s t l ye x a m i n e dt h ee f f e c t so fh no na b 3 1 3 5 一i n d u c e dc a s p a s e a c t i v i t yb yc o l o f i m o r i eb i o g e n e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：a b 3i 一3 5 i n c r e a s e dt h ea c t i v i t yo f c a s p a s e3 ，o dv a l u ew a su pt oo 1 1 2 ，w h i l et h ec o n t r o lw a so 0 2 4 w h e nn e u r o n sw a s p r e t r e a t e dw i t hh n ( 2 0 p m ) f o r1 6 h ，a c t i v i t yo f c a s p a s e3w a sd i m i n i s h e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e d 、i t l lt h eg r o u po f a 1 3 3 1 - 3 5 ，o dv a l u ew a s0 0 4 8 ( p 0 0 5 ) 2 ) a 1 3 3 1 3 5e n h a n c e da c t i v i t yo f c a s p a s e8 ，o dv a l u ew a su pt o0 0 2 0 ，w h i l et h ec o n t r o lw a s0 0 0 5 3 i n c u b a t i o no fc u l t u r ec e l l s w i t hh n ( 2 0 州) f o r16 hr e s u l t e di na18 5 d e c r e a s eo fc a s p a s e8a c t i v i t yc o m p a r e dw i t h a j 3 1 - 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j t ma n df a s l ，w h e n n e u r o n sw e r ep r e t r e a t e dw i t hh n ( 2 0g m ) f o r1 6 h ，t h ee x p r e s s i o n so f c - j a na n df a s li nn u r o n sw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t ha d 31 3 5g r o u p s 山两医科大学博士学位论文 t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so f a p 3 1 - 3 5 、h no nb a xe x p r e s s i o n ，w e s t e r - b l o ta p p r o a c hw a sc a r r i e d o u tt oe x a m i n e dt h el e v e lo fb a xp r o t e i n w e s t e r n _ b 1 0 ta s s a y ss h o w e dt h a tb a xw a se x p r e s s e d a th i g l ll e v e l si nt h eg r o u po fa 肪3 5 ( c o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o l ，p 0 0 5 ) ，b u th nd i dn o t s i g n i f i c a n t l ya l t e rt o t a lc e l l u l a re x p r e s s i o nl e v e l so fb a x ，w h e nn e u r o n sw e r ep r e t r e a t e dw i t h h n ( 2 0i x m ) f o r1 6 h ，h nc o u l dn o ti n h i b i tb a xe x p r e s s i o ni n d u c e db ya 阢l - 3 5 t od e m o n s t r a t e w h e t h e r a 1 3 3l 一3 5 、h na f f e c t e dt h ec o m b i n a t i o no f t ot h em i t o c h o n d r i a ，w eq u a n t i f i e dt h eb a x p r o t e i na f t e rm i t o c h o n d r i ae l i m i n a t e d t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a ta 3 3 1 3 5r e s u l t e di nt r a n s l o c a t i o n a n dc o m b i n a t i o no f b a xt om i t o c h o n d r i a ，w h i c hw a ss u p p r e s s e db yh n t h e s er e s u l t si m p l i c a t et h a ta p 3 1 - 3 5i n d u c en e u r o n sa p o p t o s i st h r o u g hb o t he x t r i n s i c a n d i n t r i n s i cp a t h w a y s h nb l o c ka b 3 1 3 5 一i n d u c e dn e u r o n sa p o p t o s i st h r o u g hi n h i b i t i n gt r a n s l o c a t i o n o fb a xf r o mc y t o s o lt om i t o c h o n d r i a la n d d o w n r e g u l a t i n g t h ee x p r e s s i o n so fc - j u na n d f a s l p a r t l t ie f f e c t so fi - i no ne l e v a t i o no fl c a 2 + 】i n d u c e db ya i b 3 l - 3 5 t h ed i s r u p t i o no f 【c 一+ 】ih o m e o s t a s i si sp r o p o s e da st h em o l e c u l a rb a s i so ft h en e a r o t o x i c i t y o fa p o u rp r e v i o u se x p e r i m e n th a dr e v e a l e d t h a th nc o u l ds u p p r e s sa 艮1 3 5 - i n d u c e d n e u r o n sa