（微生物学专业论文）苏云金芽孢杆菌luxs基因的克隆表达及对植物抗病的影响.pdf

硕士学位论丈 m a s t e r st t l e s i s 摘要 群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ，又称阈值敏感) 是细菌根据种群密度 大小进行细胞内或细胞问信息交流，协调群体行为并调控基因表达的一种方 式。q s 系统可分为两种典型的类型，即革兰氏阴性细菌的l u x i l u x r 型q s 系统，革兰氏阳性细菌的寡肽，双组分型q s 系统，分别以酰基高丝氨酸内酯 ( a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e s a h l ) 、寡肽( a u t o i n d u c i n gp e p t i d e ，a i p ) 为信号分 子。哈氏弧菌( h b r i oh a r v e y 0 的q s 系统很特殊，既能识别a h l 分子( a i 1 ) ， 又能识别一种新的信号分子a 1 2 。a 1 2 的结构和生物合成途径已被确定，其 产生依赖于l u x s 蛋白。目前认为a h l 和a i p 都是种特异性信号分子，可能 有助于细菌进行种内交流；而a i 2 是一种“通用”信号分子，有助于细菌进 行种间交流。对q s 系统信号分子的深入研究将有助于了解细菌与宿主的信 息交流，揭示种内和种间细胞交流以及信号传递的新机制，达到对细菌病害 进行防治的目的。 本论文研究了苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b 0 中l u x s 基因的 克隆表达及将该基因转化烟草后对抗病的影响。首先通过生物发光实验检测 到苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 的培养液可以诱导特异性检测 a i 2 信号分子的哈氏弧菌报告菌株b b l 7 0 发光。表明b t 中含有群体感应信 号分子a i 2 的合成基因l u x s 。通过比对已报道1 1 a n t h r a c i s 、b c e r e $ 的l u x s 基因序列后设计引物，采用p c r 法进行克隆，得到的片断经测序后大小为 4 7 4 b p ，与b c e r e l d $ 、b a n t h r a c i s 的l u x s 基因的核苷酸同源性分别为9 6 8 ， 9 6 6 ，氨基酸序列同源性都为9 8 7 。系统发育分析也验证了同源性比较的 结果，证明该基因为b t 的l u x s 基因。将该基因插入融合蛋白表达载体p p r o e x h t a 中，转入大肠杆菌d h 5 0 中表达后其培养液过滤上清可以诱导b b l 7 0 发光，表明该基因产物具有l u x s 蛋白活性。进一步将b t 中克隆出的l u x s 基 因构建到植物高效表达载体p c a m b i a1 3 0 5 2 中，通过根癌农杆菌介导法转 入烟草。利用哈氏弧菌生物发光实验检测到该基因在烟草中得到表达，并通 过病毒接种实验观测到转化烟草被诱导的抗性反应。 关键词：群体感应苏云金芽孢杆菌细胞交流l u x s 基因植物抗病 i m 贴a s t 靴e r s 论t h 文 ；, s ，。 a b s t r a c t q u o n l ms e n s i n g i st h e r e g u l a t i o n o f g e n ee x p r e s s i o n i n r e s p o n s e t o f l u c t u a t i o n si n c e l l - p o p u l a t i o nd e n s i t y a n da l l o w s p o p u l a t i o n s o fb a c t e r i at o s y n c h r o n i z eg r o u pb e h a v i o r s q u o r u m - s e n s i n gs y s t e m sc a nb ed i v i d e di n t o t w o p a r a d i g m a t i cc l a s s e s ：l u x i l u x r t y p eq u o r u m - s e n s i n gs y s t e m si ng r a m n e g a t i v e b a c t e r i aw h i c h p r o d u c ea c y l - h o m o s e r i n el a c t o n e ( a h l ) a u t o i n d u c e r s ， a n d o l i g o p e p t i d e t w o - c o m p o n e n t t y p eq u o r u m - s e n s i n g c i r u i t si n g r a m p o s i t i v e b a c t e r i aw h i c h p r o d u c ea u t o i n d u c i n gp e p t i d e ( a l p ) a u t o i n d u c e r s i n c o n t r a s tt ot h e t w o p a r a d i g m a t i cq u o r u m s e n s i n gs y s t e m s ，v i b r i oh a r v e y ip r o d u c e s a n d r e s p o n d s t oa i la h l t y p ea u t o i n d u c e rt e r m e da i la n dan o v e ls i g n a lm o l e c u l en a m e d a i 一2 a h la n da i pa u t o i n d u c e r s a r e s p e c i e s - s p e c i f i cs i g n a l i n g m o l e c u l e sf o r i n t r a s p e c i e s c o m m u n i c a t i o n s a i 2s e r v e sa sau n i v e r s a ls i g n a lm o l e c u l a rf o r i n t e r s p e c i e sc o m m u n i c a t i o n s t h es t r u c t u r eo fa l 一2h a si e c e n t l yb e e n e l u c i d a t e d a n di t sb i o s y n t h e s i sd e p e n d so nl u x sp r o t e i n f u r t h e rs t u d i e so f b a c t e r i a lq u o r u m s e n s i n gs y s t e m sw i l lg i v en e wi n s i g h t s i n t on o v e lm e c h a n i s m so fi n t e r s p e c i e s c e l l u l a rc o m m u n i c a t i o n s ，w i t ht h ep o s s i b i l i t yo f f i n d i n gn e ww a y so f a t t e m p t i n g t od e f c n db a c t e r i a ld i s e a s e s ， t h i st h e s i sw a sa i m e dt os t u d yt h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o no ft h el u x sf r o m b a c i l l u st h u r i n g i e n s i sa n dt h ee f f e c t so f t h ea i - 2s i g n a lm o l e c u l a rb i o s y n t h e s i so n p l a n td i s e a s er e s i s t a n c e t od e t e r m i n ew h e t h e r 晟t h u r i n g i e n s l sp r o d u c e sa i 一2 ， t h ei t h a r v e y il u m i n e s c e n c eb i o a s s a yw a su s e d c u l t u r es u p e m a t a n t so f b ts t r a i n s i n d u c e dl u m i n e s c e n c ei n 矿h a r v e y ir e p o r t e rs t r a i nb b l 7 0 。 w h i c hc a no n l y r e s p o n s e t oa i 2s i g n a lm o l e c u l a r s ，i n d i c a t i n gt h a tt h eb ts t r a i n s h a v et h el u x s g e n e b ya l i g n i n gt h en u c l e o t i d es e q u e n c e so f t h e1 1 a n t h r a c t sa n db c e r e t l sl u x s g e n e s ap a i ro fp r i m e r s w e r ed e s i g n e da n da i i4 7 4 - b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e d f r o mb ts t r a i n sb yp c r s e q u e n c e a n a l y s i so f t h ef r a g m e n t r e v e m e dt h a tt h el u x s g e n ef r o mb th a dn u c l e o t i d eh o m o l o g ss i m i l a r i t i e s o f9 6 8 a n d9 6 6 w i t h 硕士学位论丈 m a s t e r st l f f s i s b a n t h r a c i sa n db c e r e u s l u x s g e n e s ，r e s p e c t i v e l y ，a n da m i n o a c i ds i m i l a r i t i e so f 9 8 7 f o rb o t h s i m i l a rr e s u l tw a sa l s o c l e a r l yc o n f i r m e di nt h ep h y l o g e n e t i c d e n d r o g r a m w h e ne x p r e s s e di n e s c h e r i c h i ac o l id h 5ac e l l s ，t h ec l o n e d f r a g m e n t r e s t o r e da i - 2 a c t i v i t y t ot h e s ec e l l s t h e s ed a t ai n d i c a t e dt h a tt h e f r a g m e n ti s af u n c t i o n a ll u x so r t h o l o g i n 且t h u r i n g i e n s i sn e c e s s a r y f o ra i 2 e x p r e s s i o n t ot e s tt h ee x p r e s s i o no f t h e g e n ei np l a n t ，t h e c l o n e dl u x s g e n ef r o m 丑 t h u r i n g i e n s i sw a s c o n s t r u c t e di n t op c a m b i a1 3 0 5 2v e c t o r t h e r e s u l t i n gp l a s m i d w a sm o b i l i z e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i na n du s e df o rt o b a c c o t r a n s f o r m a t i o n u s i n g t h ev h a r v e y ll u m i n e s c e n c e b i o a s s a y ，e x p r e s s i o n o f t h el u x s g e n ew a s d e t e c t e di nt r a n s f o r m e dt o b a c c o i n d u c e dd e f e n c e r e s p o n s e s w e r e o b s e r v e da f t e ri n o c u l a t e dw i t l lp l a n tv i r u s e s k e y w o r d s ：q u o r u ms e n s i n g ，b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n s ，l u x s g e n e ，p l a n t d i s e a s er e s i s t a n c e 1 1 1 硕士学位论丈 m a sr e r st i l l ! s i s 第一章前言 长期以来，人们一直认为细菌以单细胞形式存在，彼此之问没有信息交流 和协作分工。但近年来越来越多的研究证据表明，为了适应复杂多变的环境， 细菌可以通过细胞内或细胞间的信息交流来协调群体的行为，使细菌能与多细 胞生物一样，行使单个细胞无法完成的功能。群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ， 又称阈值敏感) r p 是细菌根据种群密度大小进行细胞内或细胞间信息交流，协 调群体行为并调控基因表达的一种方式( m i l l e r b a s s l e r ，2 0 0 1 ) 。目前已知q s 系统能够调控细菌的多种生理生化功能。如生物发光( b a s s l e r e ta 1 ， 1 9 9 7 ) ， 生物膜( b i o f i l m ) 的形成( d o w e la 1 ，2 0 0 3 ) ，抗生素的合成( d e r z e l l ee la 1 ，2 0 0 2 ) ， 固氮基因的调控( w i s n i e w s k i e fa 1 ，2 0 0 2 ) ，t i 质粒的接合转移( o g e re la 1 ，1 9 9 8 ) ， 致病基因的表达( m i l l e r e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，群游现象( s w a r m i n g m o b i l i t y ) ( e l v e r s & p a r k ，2 0 0 2 ) 等。q s 系统赋予了细菌一些高等生物的特性，因此细菌的q s 系统 可能是单细胞生物向多细胞生物进化的早期步骤之一( m i l l e r & b a s s l e r ，2 0 0 1 ) 。 1 细菌的q s 系统 细菌在其生长过程中合成并释放一些类似激素的信号分子( p h e r o m o n e ) ，又 称自身诱导子( a u t o i n d u c e r ，a i ) 。随着种群密度的增加，环境中积累的a i 信号 分子的浓度也成比例地增高；当种群密度达到一定阈值时，细菌通过细胞内受 体感知胞外a l 的存在，对这些信号分子进行检测并与之结合来调控基因表达。 这一调控系统被称为细菌的群体感应系统。根据细菌合成的信号分予结构和感 应机制的不同，q s 系统可分为两种典型的类型，即革兰氏阴性细菌的 l u x i l u x r 型q s 系统，革兰氏阳性细菌的寡肽，双组分型q s 系统( f e d e r l e & b a s s l e r ，2 0 0 3 ) 。 1 1 两种典型的0 s 系统 革兰氏阴性细菌一般利用酰基高丝氨酸内醣( a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e s ， a h l ) 类物质作为信号分子。每种革兰氏阴性细菌的l u x i 类蛋白产生种特异性 的a h l ，其结构的区别在于酰基支链的碳原予数( 从4 到1 8 个，多为偶数，奇 硕士学位论丈 m a sr e r s 丁i i i ：s i s 数中只有7 ) 和c 3 位上的取代基( 氢、羟基、羰基) ( 图l a ) 。产生的a h l 可自由 扩散地进出细胞。l u x r 类蛋白介导a h l 的检测、结合和下游基因表达的调控 循32 a ) 。超过7 0 种革兰氏阴性细菌利用类似的这种q s 系统。 a 舡啦菇m 图1 q s 信号分子a i 一1 ( a ) 和a l 2 ( b ) 的化学结构 f i g u r e l s t r u c t u r e s o f q sa u t o i n d u c e r s a i l ( a ) a n d a i - 2 ( b ) c 图2 细菌中三种类型的q s 系统( f e d e r l e & b a s s l c r ，2 0 0 3 ) f i g u r e2 t h r e et y p e so f q u o r u m - s e n s l n g c i r c u i t si nb a 曲e r i a ( f e d e r l e & b a s s l e r ，2 0 0 3 ) 革兰氏阳性细菌一般利用寡肽( o l i g o p e p t i d e s ) 类物质作为信号分子。寡肽信 号分子( a u t o i n d u e i n gp e p t i d e ，a l p ) 以前体肽的形式合成，经加工修饰后由 a b c ( a t p b i n d i n gc a s s e t t e ) 输出系统或其它膜通道蛋白输出。a i p 一般由5 1 7 个 氨基酸组成，有时含特殊的侵0 链修饰。其氨基酸序列的差异也赋予该系统微妙 硕士学位论文 m a s t l r st i l l s i s 的种特异性。双组分磷酸传递途径( t w o c o m p o n e n tp h o s p h o - r e l a yc i r c u i t s ) 介导 a i p 信号分子的检测、信号传递和靶基因表达的调控( 图2 b ) 。双组分系统在细菌 中普遍存在r 通过一种保守的磷酸化级联系统起作用，由感受激酶和响应调控 蛋白组成。前者含保守的组氨酸残基( h ) ，后者含保守的天冬氨酸残基( d ) ，这 些残基是磷酸化位点，响应调控蛋白通常是d n a 结合蛋白，磷酸化后能改变靶 基因的表达( h a k e n b e c k & s t o c k ，1 9 9 6 ) 。 1 ，2 - - 种特殊的0 s 系统 哈氏弧菌( v i b r i oh a r v e y o 是一种能发光的革兰氏阴性细菌，但它的q s 系统 与以上两种q s 系统形成显著对比( 圈2 c ) 。哈氏弧菌通过l u x m 蛋白产生典型的 革兰氏阴性细菌具有的a h l 类信号分子a i 1 。l u x m 蛋白与革兰氏阴性细菌的 l u x i 类蛋白没有同源性，但都催化反应将酰化酰基载体蛋白的酰基部分连接到 硫腺苷甲硫氨酸( s a m ) 的高丝氨酸内酯部分，合成a i 1 。该分子不是被细胞内 l u x r 类蛋白检测，而是种位于细胞膜上的组氨酸蛋白激酶l u x n ( b a s s l e re t a 1 ，1 9 9 3 ) 。哈氏弧菌还产生另一种信号分子a i 2 ，其产生依赖于一个被称为 l u x s 的蛋( s u r e t t e e ta 1 ，1 9 9 9 ；s c h a u d e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。a i 一2 的检测需要两种蛋 自：l u x p 和l u x q ( b a s s l e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。a i 2 结合到周质蛋白l u x p 上，形成的 复合体再与膜结合的组氨酸蛋白激酶l a x q 相互作用。l u x q 和l u x n 都属于一种 杂合的双组分蛋白，包含感受激酶组分和响应调控蛋自组分。来自l u x n 和 l u x p q 的感受信息被传递给磷酸转移酶蛋白l u x u ，l u x u 再将信息传送给下游 的响应调控蛋白l u x o ( f r e e m a n & b a s s l e r 。1 9 9 9 ) 。具体来说，无信号分子( 即低 细胞密度) 时。磷酸从自磷酸化的l u x n 和l u x q 蛋白传递给l u x u ，然后再使反 应调控蛋白l u x o 磷酸化。磷酸化的l u x o 可能间接激活了荧光素酶操纵子 l u x c d a 胧自g ，抑制物的产生，能抑制发光。但在阈值信号分子浓度( a p 高细胞密 度) 时，a i 1 、a i 2 分别与l u x n 和l u x p 结合导致l u x n 和l u x q 的构象变化，从激 酶转变成磷酸酶。因此，去磷酸化发生，磷酸流反向，从l u x o 通过l 1 1 ) ( u 到l u x n 和l u x q 。去磷酸化的l u x o 不再激活抑制基因的转录。一种激活转录蛋白 l u x r ( 不同于革兰氏阴性细菌的l u x r 类蛋白) 诱导l u x c d a b e 的转录，从而发光 ( f r e e m a n & b a s s l e r ，1 9 9 9 ；f r e e m a ne t a l ，2 0 0 0 ；m i y a m o t oe t a l ，2 0 0 3 ) 。因此， 哈氏弧菌对信号分子的检测和传递与革兰氏阳性细菌的双组分磷酸传递系统 3 硕士学位论文 m a s i - i ：r st i f l s i x 类似。 2 基于l u x s a 卜2 的q s 系统 2 1 卜2 的生物测定 哈氏弧菌中a i 一2 的发现，激起了研究者更大的兴趣来研究这个新的信号分 子，试图在细菌中发现基于a i 2 的细胞交流系统。但目前没有一种生化方法 能直接检测和定量a i 2 。b a s s l e r 首先用l u x n 突变的哈氏弧菌b b l 7 0 株作为特 异的报告菌株来检测细菌培养液上清中的a i 2 活性0 3 n s s l e r e l a l ，1 9 9 7 ；b a s s l e r e t a l ，1 9 9 4 ) 。与野生型哈氏弧菌相比b b l 7 0 株不能响应a i 一1 信号分子，但 仍能以细胞密度依赖的方式响应a i 一2 。因此当有外源a i 2 存在时，与对照相 比，b b l 7 0 株能较早的被诱导发光。 2 2a 卜2 的合成途径 从s a m 要经过至少三步酶促反应产生a i 2 ( 图3 ) 。合成过程中s a m 被作 为一种甲基供体，产生的毒性中间产物硫腺苷高半胱氨酸( s a h ) 再由5 甲硫腺 苷，硫腺苷高半胱氨酸核营酶( p f s ) 水解成硫核糖高半胱氨酸( s r h ) 和腺嘌呤。 l u x s 催化s r h 裂解成d p d ( 4 ，5 - d i h y d r o x y - 2 ，3 - p e n t a n e d i o n e ) 和高半胱氨酸。 s r h 和l u x s 蛋白的反应混合物可以产生活性的a i 2 ，而且不同细菌来源的 l u x s 蛋白都能起同样的功能( s c h a u d e re t a l ，2 0 0 1 ；w i n z e re t a l ，2 0 0 2 ) 。 图3 a i 2 的生物合成途径( s e h a u d e r e ta 1 ，2 0 0 1 ) f i g u r e3 b i o s y n t h e s i so f a i - 2 ( s e h a u d e r e ta 1 t 2 0 0 1 ) 2 3l u x s 蛋白结构 来源于四种不同细菌( d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s 、h a e m o p h i l u si n f l u e n z a e 、 h e l i c o b a c t e r p y l o r i 、b a c i l l u ss u b t i l i s ) ( f jl u x s 蛋白的晶体结构已被确定，它们的 硕士学位论丈 m a s t e r st t t e s i s 基本结构非常类似，都为一种在催化位点含两个z n 2 + 原子的同二聚体酶。二聚 体酶的每个亚单位由一条多肽链折叠成一个区域，由四条反平行的b 折叠构 成，并在端有三个a 螺旋，另一端有一个短的3 l o 螺旋( 图4 ) 。由于二聚作用 而形成的两个深的口袋包含酶的活性位点，s r h 被结合到口袋中，其核糖基部 分临近z n 2 + 原子，l u x s 蛋白的保守残基紧密簇排在该区周围( l e w i se t a 1 ， 2 0 0 1 ；h i l g e r s & l u d w i g ，2 0 0 1 ；d 船e t a l ，2 0 0 1 ；r u z h e i n i k o ve t a l ，2 0 0 1 1 。 国帮 图4 b s u b t i l i s 的l u x s 蛋白结构( 从两个方向展示) ( h i l g e r s & l u d w i g ，2 0 0 1 ) f i g u r e 4 s t r u c t u r eo fr s u b t i l i sl u x s ( s h o w ni nt w oo r i e n t a t i o n s ) ( h i l g e r s & l u d w i g ，2 0 0 1 ) 2 。4 a i - 2 的结构 由于哈氏弧菌的周质结合蛋白l u x p 是a i 2 的受体，能紧密结合a i 2 ， c h c n 等利用x 射线晶体照相术确定了组成l u x p 的每个原子，结果在l u x p 蛋 白的中间发现了一个狭小的袋状腔，内含一个由1 6 个原子组成的分子，被认 定是a i 2 ，并确定其结构是一种新的呋哺硼酸二醅( f u r a n o s y l b o r a t ed i e s t e r ) 分子( 图i b ) 。 目前只有哈氏弧菌的a j 2 结构被确定。还不清楚是否所有的a i 2 结构都 是一样的。是否d p d 可以环化形成不同的呋喃衍生物从而经不同的反应产生 多种a l - 2 信号分子。使这些结构相关的a i 2 类信号分子也象a h l 类信号分 子一样形成了一个家族。可能一些细菌产生不止一种a i - 2 衍生物。且( 或) 有多 种不同的受体来感应不同的a 1 2 。a i 2 信号产生和感应的多样性可能更有助于 细菌适应在复杂的环境中生活。 2 5l u x s a i 一2 的调控功能 在基因组已测序的细菌中。至少5 5 种含有l u x s 基因，这其中既包括一些 硕士学位论丈 m a s t e r lst i f s i s 革兰氏阳性细菌又有许多革兰氏阴性细菌( f e d e d e b a s s l e r ，2 0 0 3 ) 。利用p c r 技术，即使基因组未测序也可鉴定多种细菌的l u x s 基因。用哈氏弧菌b b l 7 0 报告菌株检测可发现更多细菌的培养液中具有a i 2 活性，表明它们也具有l u x s 基因。a h l 和a l p 信号分子都是种特异性的，也就是说只有产生它的种群才 能识别并响应它，因此可能有助于细菌进行种内交流( i n t r a s p e c i e s c o m m u n i c a t i o n ) 。而如此多的不同细菌都能产生a i 2 ，表明它是一种“通用” 信号分子，所以可能有助于细菌进行种间交流( i m e r s p e c i e sc o m m u n i c a t i o n ) 。特 别是对于混居种群来说，可能种特异性的信号分子利于细菌对自身种群的识 别，避免杂音干扰。“通用”信号分子利于细菌估测自身种群所占的比例，并 根据比例的变动来调整行为( m i l l e r & b a s s l e r ， 2 0 0 1o 虽然一些革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌都能检测并感应a i 2 ，但由于 a i 2 几乎总是与其它的调控因子共同作用，因此要确定a i - 2 确切的调控功能 比较困难。一般是通过分析，“睫s 突变( 或再转入含1 w c s 的载体进行互补) ，或者 是与含或缺a i 2 活性的培养液上清共培养后再进行分析以这种方式在许多 细菌中鉴定了l u x s a i 2 调控的功能或表型( 表1 ) 。 3 q s 系统的调控 自然界中，细菌之间相互协作也存在竞争。细菌能与宿主共生也能使宿主 致病，宿主也可产生拮抗物来干扰细菌的q s 系统( w a l k e re t a l ，2 0 0 4 ) 。因此 细菌与细菌之间细菌与宿主之间可能存在a i 2 类的通用信号分子所调控的q s 过程( f e d e r l e & b a s s l e r ，2 0 0 3 ) 。对q s 系统信号分子的深入研究将有助于了解细 菌与宿主的信息交流，揭示种内和种间细胞交流以及细胞内和细胞间信号传递 的新机制。我们可以针对细菌q s 系统对细菌的某些功能进行干扰或促进，从而 达到有益于人类的目的。 已有研究结果表明，通过调控q s 系统，可以提高有用物质如抗生素的产量 f b a i se ta 1 ，2 0 0 4 ) 。但目前研究的热点是如何干扰细菌的q s 系统。一般可通过 两种方式：一是破坏细菌信号分子，使其q s 系统不能启动它所调控的基因；二 是通过产生细菌信号分子的类似物与信号分子受体蛋白竞争性结合来阻断细 菌q s 系统。 硕士学位论文 m s i e r st 1 1 f s l s 表1 l u x s a i 一2 调控的功能或表型( x a v i e r b a s s l e r ，2 0 0 3 ；f e d e r l e & b a s s l e r ， 2 0 0 3 ) t a b l e 】，f u n c t i o n so rp h e n o t y p e s r e g u l a t e db yl u x s f a i - 2 ( x a v i e r & b a s s l e r ，2 0 0 3 ； f e d e r l e & b a s s l e r ，2 0 0 3 ) 种类l u x s a i - 2 调控的功能或表型 爿c f n o b a c i l l u s a c t i n o m y c e t e m c o m i t a n s b o r r e l i ab u r g d o 咖r f c a m p y l o b a c t e r j e j u n i c l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n s e s c h e r i c h i ac o l fw 3 1 1 0 e s c h e r i c h h 7c o l ie h e c ( 0 1 5 7 ：h 7 ) e s c h e r i c h i ac o i le p e c ( 0 1 2 7 ：h 6 ) n e i s s e r i a m e n i n g i t i d e s p h o t o r h a b d u sl u r e i n e s c e n s p o r p h y r o m o n a sg i n g i v a l i s p r o t e u sv u l g a r i s s a l m o n e l l ao , p h i s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m s h l g e l l a f l e x n e r i s t r e p t o c o c c u sm u t a n s s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e s t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s 所b r i oc h o l e r a e v i b r i oh a r v e y i 阳6 r f 0v u l n 驴c u s 毒力因子：白细胞毒素，铁获取 许多蛋白的表达( 双向凝胶电泳) 运动 毒力因子，a ，k ，0 毒素 细胞分裂，d n a j 3 i 工，细胞形态，运动 毒力因予：i i i 型分泌系统，鞭毛， 志贺氏样毒索，运动，细胞分裂 运动( 鞭毛蛋白表达) 菌血症感染 抗生素产生( 氨基甲酰) 毒力因子，蛋白酶，红细胞凝集素，血晶素 获取 群游现象 生物膜形成 a b c 转运蛋白表达 控制毒力的相关转录因子 生物膜形成 毒力 毒力因子，分泌的蛋白酶溶血素 毒力因子，霍乱毒素，毒素共调节的菌毛 生物发光，菌落形态，铁载体产生 毒力 硕士学位论文 m s t i ：r si l i l s l s 对于第一种方式，如海洋指状岩褐藻( l a m i n a r i ad i g i t a t a ) j 厦过产生卤素过氧 化物酶催化卤素产生卤素氧化物( 象次氯酸h o c i ) ，它能穿透细菌的生物膜并 与a h l 信号分子起反应从而破坏它的信号功能，使细菌不能在藻类叶片上定 殖。争论贪噬菌( v a r i o v o r a x p a r a d o x u s ) 能利用a h l 分子做为唯碳源和氮源供 其生长需要，在自然环境中能抑制产a h l 细菌的生长与繁殖。一种芽胞杆菌 2 4 0 8 1 能产生降解a h l 信号分子的内酯酶a i i a 蛋白，这种酶能使a h l 分子内酯 键被打开。在青枯菌( r a l s t o n i as p ) x j l 2 b 中发现一种新的酰基转移酶a i i d 蛋白 也能把a h l 信号分子水解为内酯环与酰胺链( t a g a b a s s l e r ，2 0 0 3 ) ( 图5 ) 。此 外已经从多种细菌中克隆到能够降解a i 1 的基因( c a r l i e re ta 1 ，2 0 0 3 ；l e ee t a 1 ，2 0 0 2 ；x ue t a l ，2 0 0 3 ) 。 亿u 。 lj n 图5 a i 1 信号分子的两条降解途径 f i g u r e5 t w od e g r a d i n gp a t h so f a i - l 对于第二种方式，如海洋红藻( d e l i s e ap u l c h r a ) f l e 产生一些卤化呋喃酮 ( h a l o g e n a t e df u r a n o n e s ) ，它们是a h l 信号分子类似物，能干扰细菌的q s 系统， 使之不能在其叶表产生群聚和形成生物膜。一种革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球 菌能产生四种结构类似的a l p 信号分子，根据产生的a i p 信号分子的细微不同， 可被分为4 个亚群，每一亚群的q s 系统只能识别自身产生的a i p 分子，另) b 3 类 a i p 分子对其q s 系统具有抑制作用。其机理也是信号分子的类似物与信号分子 受体蛋白竞争性结合从而抑制q s 系统( t a g a & b a s s l e r ，2 0 0 3 ) 。对a i 类信号分 子化学结构进行修饰，获得具有抑制细菌生长潜力的a j 信号分子的类似物 ( s u g a & s m i t h ，2 0 0 3 ) 。这类化合物可以作为新的潜在药物控制细菌种群密度。 在不杀死病原菌的同时降低其致病性，或者抑制其生长，避免因大量使用抗生 黼 r 知 弋 明 删古 x。似 硕士学位论丈 m a s t i ：r st l i f s i s 素带来的细菌耐药性问题( h e n t z e re t a l ，2 0 0 3 ) 。可以预见调控q s _ f f f 号分子的 表达将会在医学，农业，环保等领域具有广阔的应用前景。 目前在植物病害防治方面，已经发现降解a i 信号分子的基因在致病菌或植 物中的表达可以干扰q s 过程，使病原物致病性降低或者植物对其抗性提高。如 在胡萝h 欧文氏菌中表达能够降解a i 1 信号分子的a i m 基因，该基因编码的内 酯酶将a h l 类信号分子降解，使细菌失去对植物的致病力( d o n ge t a l ，2 0 0 0 ) 。 如果将该基因在植物( 烟草，土豆) 表达并接种欧文氏菌后，转化植物对细菌 的抗性大大提高( d o n g e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。有趣的是在宿主中表达合成信号分子的 基因，也可以达到对细菌病害进行防治的目的( m a ee t a l ，2 0 0 1 ；f r a y ，2 0 0 2 ) 。 植物体内合成或降解a i 信号分子诱导植物产生抗病的机理目前还不清楚。从植 物自身的防御系统而言，有人认为a l 信号分子在植物体内合成后，当细菌等病 原感染植物时感受到信号分子的存在过早的导致细菌毒力基因的表达，激发 了宿主的防御反应。此外，从细菌与宿主相互作用以及信息交流而言，宿主体 内o s 信号分子的合成与降解也可以影响到细菌的生长和致病基因的表达 ( z h a n g ，2 0 0 3 ) 。目前已经有研究结果证实植物体内合成的a i 1 类信号分子能够 与细菌进行交流干扰细菌的q s 过程( f r a y e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。至于降解信号分子的 基因在植物体的表达产生抗病反应，则有可能是因为信号分子被降解后，使细 菌等的生长受到抑制，其浓度达不到一定的阈值，不能通过q s 系统表达相关的 致病基因。 通过调控q s 信号分子的合成与降解可以达到对病原物进行防治的目的，目 前的工作主要集中在a i 1 信号分子，还未有干扰l u x s a i 2 群体感应系统的相关 报道。s t y p h i m u r i u m 等能吸收a i 2 ( t a g a e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，从而消除信号分子的影 响，这为干扰细菌的信号交流提供了一种可能。a i 2 的发现使人们希望能鉴定 或合成这种通用信号分子的促效剂或拮抗物。通过抑$ 4 l u x s 的合成或拮抗信号 分子a i 2 等抗菌策略可能会干扰许多细菌的q s 系统，起到广谱抗生素的作用。 硕士学位论丈 m a s t e r s1 e s i s 第二章苏云金芽孢杆菌中i u x s 基因的克隆及原核表达 群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 是细菌根据种群密度大小进行细胞内 或细胞问信息交流，协调群体行为并调控基因表达的一种方式。细菌在其生长 过程中合成并释放一些类似激素的信号分子( p h e r o m o n e ) ，又称为自身诱导子 ( a u t o i n d u e e r ，a i ) 。随着种群密度的增加，环境中积累的a i 信号分子的浓 度也成比例地增高：当种群密度达到一定阈值时，细菌通过细胞内受体感知胞 外a i 的存在，对这些信号分子进行检测并与之结合来调控基因表达。这一调 控系统被称为细菌的群体感应系统。目前已知受q s 调控的细菌群体行为包括 生物发光，共生，毒力，感受能力，质粒的接合转移，抗生素产生，游动能 力，芽孢形成，生物膜( b i o f i l m ) 形成等( m i l l e r & b a s s l e r ，2 0 0 1 ) 。我们可以针 对细菌q s 系统对细菌的某些功能进行干扰或促进，从而达到有益于人类的目 的。 在暗氏弧菌中已较清楚的了解了其q s 过程。其信号系统产生两种小的信号 分子，a i 1 是一种高丝氮酸内醣的结构类似物，而a i 2 是一种薪近鉴定的呋喃 硼酸二酯，由，l 耐基因产物合成。当哈氏弧菌种群达到高细胞密度时，a i 1 和 a i 2 激活双组分系统调控l u x c d a 且融骥纵子，在l u x 群体感应系统的控制下表达 生物发光基因。b b l 2 0 株是野生型的哈氏弧菌，其l u x n 蛋白识另i | a i 一1 提供的信 号。哈氏弧菌b b l 7 0 株的1 w c n 基因被突变，不能检测a i 1 分子，但可被用来检 测其环境中的