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上海第二医科大学博士学位论文 小鼠胚胎发育早中期卵黄囊基因表达谱的特点及功能探讨 中文摘要 哺乳动物胚胎发育早、中期的卵黄囊在造血和血管生成的生理过 程中，起着至关重要的作用，并承担了营养和代谢的功能。卵黄囊血 岛是哺乳动物发育过程中的第一个造血部位，也是第一个血管发生的 部位。在小鼠胚胎发育的第7 2 5 天( e 7 2 5 ) ，卵黄囊胚外中胚层细胞 聚集成团，形成血岛，其中间是造血细胞，主要为红系。同时，也有 少量的巨噬细胞。该过程被称为原始造血( p r i m i t i v eh e m a t o p o i e s i s ) 。 原始红细胞体积较大，血红蛋白含量较多，且含有细胞核。卵黄囊也 是定向造l 血( d e f i n i t i v eh e m a t o p o i e s i s ) 的场所。在小鼠e 8 2 5 天时，卵 黄囊中就存在有定向红系祖细胞和巨噬细胞，到e8 5 天时，卵黄囊 中就可以检测到肥大细胞和粒单系前体细胞，说明卵黄囊中存在有 具有多向分化潜能的造血干细胞( h s c ) 。由于此时胎体与卵黄囊之间 的血液循环尚未建立起来，说明卵黄囊中的定向造血细胞并不是从胎 体迁移而来。有资料显示，卵黄囊中存在有造血干细胞( h s c ) ，并具 有重建造血系统的功能，因此，卵黄囊的造血功能一直是围内外研究 的焦点。同时，卵黄囊也是第个生成血管的器官。类似于与造血过 程，卵黄囊的肌管发育过程也经历r 两个阶段，与原始造血相对应的 是血管发生( v a s c u l o g e n e s i s ) 过程；与定向造血相对应的是血管生成 ( a n g i o g e n e s i s ) 过程。在血岛中，内皮细胞围绕着中间的造血细胞就形 成了血管的管腔。同时，内皮细胞以出芽的方式延长并形成了原始的 血管丛。在e i o 5 天，内皮细胞在原有血管的基础上又形成细小的血 上海第二医科大学博士学位论文 管，并逐渐形成树枝状的血管结构。由于卵黄囊易于取材、便于观察， 也一直用于血管发育方面的研究。 本研究所曾经应用p c r 方法构建了c 5 7 b l 6 小鼠e 9 5 、e 1 2 5 的卵黄囊和e 1 2 5 的胎肝3 个c d n a 文库，并通过e s t 测序及生物 信息学等手段描绘了它们的基因表达谱特点，为我们理解胚胎发育过 程中造血的起因提供了新线索。但是，通过建立文库和测序的方法并 不能很好地从量化上反映转录组的动态变化特点。为此，本研究拟应 用c d n a 芯片技术及其先进的生物信息学手段一c p p s o m ，来挖掘 卵黄囊转录组在胚胎发育早q t 期的特点及其变化规律，筛选出参与、 调节卵黄囊造血、血管牛成、营养、代谢等生理功能的关键基因，从 而为进一1 步深入研究人类m 液性重大疾病奠定基础。 本研究选取了e 9 5 、e i o 5 、e 1 1 5 、e 1 2 5 和e 1 3 5 天的小鼠卵 黄囊组织作为实验组，将相应胚龄的胎体组织均量混合作为对照。相 应的样本经组织胚胎学鉴定后，提取了t o t l er n a 并通过以p o l y t 为引物的反转录方式将m r n a 转化成c d n a 并整合了c y 一3 荧光染 料。对照样本也以同样的方式转化成c y 5 荧光染料标记的c d n a 。 等量混合后的样本c d n a 和对照c d n a 与含有8 ，7 2 2 条基因信息的自 带f j d , 鼠芯片杂交，并通过相应的双激光扫描仪进行图象及数据的采 集。动态性的样本表达数据经过相应的数据标准化处理后由先进的 c p p s o m ( c o m p o n e n t p l a n ep r e s e n t a t i o n i n t e g r a t e ds e l f - o r g a n i z i n g m a p ) 进行生物学意义的挖掘。该生物信息学处理方法将动态性( 多维) 的卵黄囊芯片数据进行模拟、聚类后首先投射到一个两维的图谱上。 上海第二医科大学博士学位论支 表达变化相同或相近的基因位于相同或相近的位置，而表达变化不同 的基因则位于不同的位置。然后，该方法进一步将这个两维图谱剥离 成一系列样本特异性的子图潜，并以色彩的灰度显示基因在特定样本 中的表达变化，从而形成了样本特异性的、转录组水平的基因表达谱。 通过比较这一系列样本的c p p s o m 可以动态性地跟踪卵黄囊在造血 和血管生成过程中基因表达网络的整体性变化。在所研究的8 。7 2 2 个 基因当中，有3 ，1 2 1 个基因被展示出来。根据c p p s o m 的功能分类 结果，这些基因主要分为：结构及结构相关、物质能量代谢、物质转 运、增殖凋亡、信号转导、造m 、血管发育、血栓及氧化还原等九个 类别。这些功能性集团如实地反映了卵黄囊在造血及血管生成中的主 要功能性分子网络。结合卵黄囊在不同发育时期的生物学特征，可以 推测：l 胚胎发育早中期，即e 9 5 e 1 3 5 期问，卵黄囊的能量代谢 以有氧氧化为主。2 卵黄囊合成多种运输蛋白，向胎体提供营养供给。 3 卵黄囊的增殖活性下降，但局部有活跃的增殖群落，它们可能是造 血细胞和血管生成相关的细胞。4 造血干祖细胞早期被滞留于卵黄囊 血管中，并迅速增殖，在e 1 0 5 之后才随觑流转入胎体。5 红系造血 活跃，分为原始、定向两个阶段，前者持续时间短，后者分化不完伞； 出现粒单系造血。6 卵黄囊有活跃的血管生成作用，分为血管发生 和血管生成两个阶段。7 缺氧不是该时期卵黄囊造血和血管发生的主 要起因，这一复杂的过程可能是生物体分化和发生的内在程序与外界 环境之间相互作用的结果。 关键词：卵黄囊、造血、新生血管、血管发育、基因j 藩片 上海第二医科犬学博士学位论文 g e n ee x p r e s s i o np r o f i l i n go fm o u s ey o l ks a c d u r i n ge a r l ya n dm i d g e s t a t i o n a b s t r a c t d u r i n ge a r l ya n dm i d g e s t a t i o n ，m a m m a l i a ny o l ks a cu n d e r g o e s h e m a t o p o i e s i st o g e t h e rw i t hv a s c u l o g e n e s i sa n da n g i o g e n e s i s s i m u l t a n e o u s l y , i tp r o v i d e sn u t r i e n t sa n do x y g e nt ot h ed e v e l o p i n g e m b r y op r o p e lt h em a m m a l i a ny o l ks a ci st h ef i r s t s i t eo f h e m a t o p o i e s i s d u r i n gt h ee m b r y o g e n e s i sw i t ht h ea p p e a r a n c eo fh e m a t o p o i e t i c p r o g e n i t o r s ，m a i n l yo f e r y t h r o i da n dm o n o c y t i cl i n e a g e s ，a t7d a y sp o s t c o i t u m ( 7 d p co re 7 ) t h i sp r o c e s si sc a l l e dt h ep r i m i t i v eh e m a t o p o i e s i s a n di sf o l l o w e db yd e f i n i t i v eh e m a t o p o i e s i sa te 8 5 t h ed e f i n i t i v e h e m a t o p o i e s i sp r o d u c e sm a c r o p h a g e sa n dd e f i n i t i v ee r y t h r o i dp r o g e n i t o r s a sw e l la sm a s tc e l l sa n dp r o g e n i t o r so f g r a n u l o c y t i c m o n o c y t i cl i n e a g e ， i n d i c a t i n gt h ee x i s t e n c eo f m u l t i p o t e n th e m a t o p o i e t i cs t e mc e i l s ( h s c ) h e m a t o p o i e s i si ny o l ks a ca n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so fi t si n i t i a t i o n a n dr e g u l a t i o nh a v et h e r e f o r ea t t r a c t e dg r e a ta t t e n t i o na th o m ea n df r o m a b r o a d m o r e o v e r , a st h ef i r s ts i t eo fv a s c u i o g e n e s i sa n da n g i o g e n e s i s ，t h e y o l ks a ca l w a y so c c u p i e sa ni m p o r t a n tp o s i t i o ni nt h ei n v e s t i g a t i o no f b l o o dv e s s e ld e v e l o p m e n t ，f o ri tp r o v i d e st h ea d v a n t a g eo fc o n v e n i e n t a c c e s sa n dt h o r o u g ho b s e r v a t i o n t oa d d r e s st h em o l e c u l a r r e g u l a t i o no fh e m a t o p o i e s i sd u r i n g 上海第二医科大学博士学位论丈 e m b r y o l o g y , 3c d n al i b r a r i e sw e r ec o n t r u c t e dw i t hm o u s ey o l ks a ca t e 9 5a n de 12 5a n df e t a l l i v e ra t e 1 2 5 t h r o u g hs e q u e n c i n gt h e e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ( e s t s ) a n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，g e n e e x p r e s s i o np r o f i l ew a si n v e s t i g a t e da n dt h ep o t e n t i a lr o l eo fh y p o x i ai n t h ed e v e l o p m e n to fh e m a t o p o i e s i sw a sp u tf o r w a r d ，o f f e r i n gs o m ec l u e s t ot h ei n i t i a t i n gm e c h a n i s m so fh e m a t o p o i e s i s h o w e v e r , o n ec o u l d n t e x p e c taq u a n t i t a t i v ed e f i n i t i o no ft h ek i n e t i c so ft r a n s c r i p t o m ew i t he s t a p p r o a c ho n l y t h e r e f o r e ，i nt h ep r e s e n tw o r k ，i no r d e rt og e tab e t t e r u n d e r s t a n d i n g o ft h e e x p r e s s i o np r o f i l e o fy o l ks a ci n e a r l y a n d m i d g e s t a t i o n ，as e r i e so fe x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tw i t hc d n a m i c r o a r r a yt e c l m i q u e sa n d m o r ea d v a n c e db i o i n f o r r n a t i c s ，s u c ha s c o m p o n e n t p l a n ep r e s e n t a t i o n i n t e g r a t e ds e l f - o r g a n i z i n gm a p ( c p p s o m ) t h eu l t i m a t eg o a lo fo u re f f o r ti s t of i n do u tm a s t e rg e n e s a n dc a n d i d a t eg e n e sw h i c hp l a yp i v o t a lr o l e si nt h eh e m a t o p o i e s i s ，b l o o d v e s s e lf o r m a t i o n ，n u t r i e n t ss u p p l ya n dm e t a b o l i s mi ny o l ks a c b a s e do np r e v i o u se x p e r i e n c e ，m o u s ey o l ks a c sw e r ed i s s e c t e do u ta t e 9 5 ，e 1 0 ，5 ，e 11 5 ，e 1 2 5a n de 13 5 e m b r y op r o p e r sa tt h ee q u i v a l e n t e m b r y o n i cs t a g e sw e r em i x e dw i t he q u a la m o u n tf o rc o n t r 0 1 t h ec d n a p r o d u c t sw e r ek i n d l yg i f t e db yd r g a n gj i ni nt h eu n i t e ds t a t e sa n dw e r e s p o t t e do ns l i d e sw i t ht h ew e l l e s t a b l i s h e dp l a t f o r mi nt h ei n s t i t u t e a f t e r l a b e l i n g ，h y b r i d i z a t i o n ，s c a n n i n ga n dp r i m a r yd a t ap r o c e s s i n g ，t h er a t i o s w e r eo b t a i n e da n du s e df o rf u r t h e ra n a l y s i s 5 上海第二医科大学博士学位论文 a f t e rr o u t i n ef i l t r a t i o n ，d a t af o r3121o u to f8 7 2 2g e n e sw e r ev a l i d a m o n ga 1 15g r o u p s c l u s t e r i n gw a sc a r r i e do u tw i t hs o ms o f t w a r ea n d t h er e s u l t sw e r ed i s p l a y e dw i t hc o l o r sr e p r e s e n t i n gd i s t i n c tr a t i o si na t w o d i m e n t i o n a ls y s t e m w en e x tf u r t h e ro p t i m i z e dt h es y s t e mt h r o u g h r e d u c i n gt h ei n f u e n c eo fc o n t r o lb yc e n t e r i n gt h er a t i o si nt h er a wd a t a ，i n a i la t t e m p tt ob e t t e re v a l u a t et h ef e a t u r eo fi n d i v i d u a lg e n e sa n dt h e r e f o r e t h ek i n e t i c so ft r a n s c r i p t o m e g e n e sa r ec l a s s i f i e di n t od i f f e r e n tc a t e g o r i e si n c l u d i n gc e l ls t u c t u r e a n dc e l l c o m p o n e n t ，m e t a b o l i s m ，t r a n s p o r t a t i o n ，p r o l i f e r a t i o n a n d a p o p t o s i s ，s i g n a l i n ga n de x p r e s s i o n ，h e m a t o p o i e s i s ，v a s c u l o g e n e s i sa n d a n g i o g e n e s i s ，t h r o m b o s i sa n dr e d o xh o m e o s t a s i s f o rb i o l o g i c a ld a t a m i n i n g an u m b e ro fc o n c l u s i o n sa n dh y p o t h e s i sh a v eb e e nm a d e ：1 d u r i n gt h ee a r l ya n dm i d g e s t a t i o n ，i e b e t w e e ne 9 5a n de 1 3 5 ，e n e r g y i ny o l ks a ci sm a i n l yg e n e r a t e db ya e r o b i co x i d a t i o n 。2 t h ey o l ks a c s u p p l i e sn u t r i e n t st o t h ee m b r y op r o p e rb ys y n t h e s i z i n gv a r i o u s t r a n s p o r t i n gp r o t e i n 3 o nt h ew h o l e ，t h ep r o l i f e r a t i o na b i l i t yo fy o l ks a c d e c r e a s e dg r a d u a l l ye x c e p tf o rs o m ef o c i 4 w i t hr e g a r dt oh e m a t o p o i e s i s s t e mc e i l sa n dp r o g e n i t o r sa r er e t a i n e di nt h ey o l ks a cf o rs u f f i c i e n t p r o l i f e r a t i o n b e f o r e p o p u l a t i n g t h ee m b r y op r o p e rt h r o u g hv i t e l l i n e v a s c u l a t u r e b o t hp r i m i t i v ea n dd e f i n i t i v ee r y t h r o p o i e t i cp r o c e s s e sa r e a c t i v e ，w i t ht h ef o r m e rb e i n gt r a n s i e n ta n dt h el a t t e rb e i n gi m m a t u r e i n t h em e a n t i m e ，e v i d e n c ec a nb eo b t a i n e dt os u p p o r tt h ea p p e a r a n c eo f 6 上海第二医科大学博士学位论文 h e m a t o p o i e s i st o w a r dg r a n u l o c y t i c m o n o c y t i cl i n e a g e 5 v i t e l l i n e v a s c u l a t u r ef o r m a t i o n s ，c o n s i s t i n go fv a s c u l o g e n e s i sa n da n g i o g e n e s i s ， a r ea c t i v ea sw e l l 6 t h er o l ep l a y e db yh y p o x i ai nh e m a t o p o i e s i sa n d v a s c u l a t u r ed e v e l o p m e n ti sf a rf r o mc l e a r , a l t h o u g hp o s s i b i l i t i e sf o ri tt o p r o m o t ea n d o ra c c e l e r a t et h o s ep r o c e s s e sc a n n o tb ef u l l yr e j e c t e d k e yw o r d s ：y o l ks a c ；h e m a t o p o i e s i s ；v a s c u l o g e n e s i s ； a n g i o g e n e s i s ；m i c r o a r r a y 7 上海第二医科大学博士学住论文 小鼠胚胎发育早中期卵黄囊基因表达谱的特点及功能探讨 引言 处于囊胚期的脊椎动物的胚胎由两个胚层组成，即原始外胚层和 原始内胚层。原始外胚层在背侧，生成羊膜腔，原始内胚层在腹侧， 组成卵黄囊的内面，具有营养和代谓，的功能。胚外中胚层起源于原始 外胚层，经过迁移而覆盖于卵黄囊的外面，在这一过程中，造血及形 成血管的前体细胞也由此转移，形成血岛。卵黄囊血岛是哺乳动物发 育过程中第一个造血地点，也是第一个血管发生的部位”。卵黄囊血 岛的发育是造血发生与血管发生两个事件的综合过程。有证据显示胚 外中胚层中存在有可以发育成血液和血管的双潜能前体细胞，朗血液 向管祖细胞( h a e m a n g i o b l a s t ) ，这种细胞的分子标志之一是血管内皮 细胞生长因子( v e g f ) 的受体f l k l 2 1 。即使在e 7 的小鼠卵黄囊廊岛中 也存在有f l k 1 3 - 4 。f l k 一1 敲除小鼠死于e 8 5 e 9 5 。其卵黄囊中m 细胞的发生和血管的发| 三过程均显示出异常状态5 1 。 小鼠卵黄囊的原始造血与原始血管的发生主要经过一下过程：在 e 7 2 5 天时，卵黄囊壁上的胚外中胚层细胞聚集成团，形成血岛。e 7 5 天时血岛内出现间隙，中央的细胞变图，成为造血干细胞，并进一步 分化为原始的有核红细胞。卵黄囊内侧巾胚层部分区域增厚并与内胚 层接触，从而支持造血组织生 殳。血岛周边细胞随之分化、变扁，成 为原始内皮细胞。相邻血岛的内皮细胞延伸并互相连接，内皮细胞不 断分裂增殖，以出芽方式向列周伸展、合并。在e 9 天前，原始的胚 上海第二医科大学博士学位论文 外毛细血管丛初步形成，称之为血管发生( v a s c u l o g e n e s i s ) 过程。血细 胞也以出芽的方式游离于血管腔中。由此可见，原始的造血过程和血 管生成过程是并行的。此时，卵黄囊造血以红系为主，伴有少量巨噬 细胞，称为原始造血。原始红细胞体积较大，有细胞核，合成胚胎型 血红蛋白和成年型血红蛋白6 1 。原始造血持续时间很短，大约4 8 小 时。目前发现参与卵黄囊原始造血的基因有s c l t a l 1 、r b t n 2 l m 0 2 、 g a t a 2 、c m y b 、g a t a 1 等2 1 。血管发生由两个环节构成，一是 原始内皮细胞的增殖，一是血管管腔的形成，此时的血管管腔主要由 内皮细胞构成。参与调节这一过程的基凶主要为血管内皮生长因子 l v e g f ) ) 5 其受体( f l k - 1 和f 1 t 1 等) f 1 3 - 1 5 1 。 卵黄囊也是定向造血的场所。在e 8 2 5 天时，卵黄囊中就已经出 现了巨噬细胞和定向红系相细胞以及其它如肥大细胞和粒单系祖细 胞等。此时，胎体与胎外组织之间的f f 【i 液循环尚没有建立。与原始红 系造血4 i 同，定向红系造血需经历b f u - e 、c f u e 等多步骤的分化 发育过程，产生的红细胞体积较小，无细胞核，仅合成成年犁血红蛋 白。原始红系造血具有单步骤的分化特点，所以发育所需的时间短， 维持的时问也短。日前发现参与定向造血的基因主要有c m y b 、c b f a 2 、 c b f b 、e k l f 和p u 1 酪氨酸激酶受体w ( c k i t ) 及c k i t 的配体s t e e l 等 1 6 - 2 0 l 。在卵黄囊进行定向造血的时候，在原始血管丛上形成新血管， 即血管生成( a n g i o g e n e s i s ) 过程，发育成熟的血管呈树枝状。这一过程 较为复杂，除了内皮细胞之外，还包括细胞外基质( e c m ) 、黏附分子、 蛋白酶和平滑肌等成分。有多个基因参与了这一过程，如碱性成纤维 上海第二医科大学博士学位论文 细胞生长因子( b f g f ) 、血管内皮生长因子( v e g f ) 与其受体v e g f r ， 血管生长素( a n g i o p o i e t i n 一1 、a n g i o p o i e t i n 2 ) 及其受体t i e 、纤维连接蛋 白受体亚单位5 艮等皿 。 另外，原始内胚层还分泌一些细胞因子从而调节卵黄囊的血管发 育过程，如h e d g e h o g 基因。该基因敲除的小鼠显现出卵黄囊血管发 育异常、卵黄囊出血、胚胎死于发育早、中期2 刀。其它参与了血管发 生发育过程的基因包括e n d o g l i n 、v e c a d h e r i n 、c o n n e x i n 4 5 等。这些 基因的敲除小鼠中也会引起相似的表型2 8 - 3 0 。近几年来，有关凝血因 子在血管发生、胚胎发育中的重要作用也引起了国内外的广泛关注。 几种凝f 因子及其相关基因的基凶敲除小鼠模型均出现胚胎发育早、 中期致死的表型，伴随卵黄囊出血，卯黄囊血管壁发育异常等，但相 应的分子机制仍不清楚 3 1 - 3 3 1 。 由此可见，小鼠卵黄囊足研究造血作用和血管生成的良好模型。 本研究选取胚龄9 5 天1 3 5 天的小鼠卵黄囊为研究对象，应用c d n a 芯片技术i l t 台，通过分析胚胎发育早中期卵黄囊基因表达谱的特征， 探讨该时期卵黄囊在造f 】1 发育、血管发育和营养、代谢方面的功能， 试图寻找参与卵黄囊功能发挥的关键基凶，为揭示卵黄囊的功能特点 提供新线索。 基因芯片技术是当代最具有代表性的功能基因组学研究手段。该 技术主要通过标记对照和被检r n a 样本，然后与含有成千上万种基 因信息的芯片进行杂交，可以同时观察被检测细胞样本内基因组的整 体表达变化情况，从而达到迅速r 解细胞内分子机制的目的。基因j 卷 上海第二医科大学博士学位论文 片技术的另一关键环节就是对数据的分析和理解。为了最大限度地解 读大规模数据的生物学意义和其功能性分子网络，本研究采用将成份 平面展示的方法整合入s o m ( c o m p o n e n tp l a n ep r e s e n t a t i o ni n t e g r a t e d s e l f - o r g a n i z i n gm a p ，c p p 。s o m ) 的芯片数据处理方法，充分挖掘了 s o m 的潜力，使每一个样本中所有基因的表达变化一目了然，简化 了复杂的数据分析过程。这种c p p 。s o m 数据处理方法为全面了解胚 胎发育早中期卵黄囊转录组的动态特点奠定了基础。 上海第二医科大学博士学位论文 1 小鼠取材 材料和方法 c 5 7 b l 6 品系小鼠购自上海第二医科大学动物实验部。将育龄期 雌性和雄性小鼠进行交配，以发现雌鼠阴栓的当日定为o 5 d p c 。 2 卵黄囊大体形态的观察 在9 5 d p c 、1 0 5 d p c 、1 1 5 d p c 分别用脱颈臼法处死母鼠。在解剖 显微镜下分离出胚胎，剥去胎盘组织，显露出卵黄囊，于镜下观察并 拍照。 3 卵黄囊细胞悬液的制备 同一卜，在9 5 d p c 、1 0 5 d p c 、11 5 d p c 、1 2 5 d p c 和1 3 5 d p c 分别分 离出胚胎，用p b s + 5 胎牛血清( g i b c ob r l ) 收集卵黄囊和或胎肝， 直接冷冻于液氮中，用于抽取r n a ；或用2 3 g 针头( b e c t o nd i c k s o n ) 反复吹吸制成单细胞悬液，j _ j 于检测细胞表面标记。0 2 台盼蓝染 色计数。 4 流式细胞仪检测细胞分化 取l 1 0 6 细胞，p b s 缓冲液清洗两次。加入荧光标记c k i t 抗体及 同型抗体，室温f 孵育3 0 分钟，p b s 缓冲液沈两次。流式细胞仪检 测c - k i t 阳性细胞百分比。 5 小鼠胚胎组织切片 母鼠处死后取出胚胎，但不剥离胎盘，将整个胚胎浸泡于1 0 福尔马林溶液中固定，4 。c 保存，然后包埋在石蜡中，切成薄片( 4 肛m ) ， 上海第二医科大学博士学位论文 经脱蜡后作h e 染色，镜下观察组织及细胞形态特点。 6 总r n a 的提取 用t r i z o lr e a g e n t ( g i b c ob r l ) 提g y 总r n a ，具体操作如下： ( 1 ) 每1 0 7 细胞加t r i z o l 试剂1 毫升，用匀浆器打碎组织。 ( 2 ) 加0 2 m l 的氯仿，剧烈震荡，室温放置1 0 分钟。 ( 3 ) 4 条件下，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，吸出上清转移至另一个1 5 m le p p e n d o r f 管中，加等量的异丙醇，充分混匀，室温放置1 0 分钟。 ( 4 ) 4 条件下，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟以沉淀r n a ，弃去上清。 ( 5 ) 加入l m l7 5 f i g , 醇( r n a s e f r e e ) ，4 条件下，1 2 0 0 0 r p m 离心 1 5 分钟以去除各种盐离子。 ( 6 ) 弃去上清，自然晾干，用r n a s e f r e e 水溶解，得到细胞总r n a ， 用紫外分光光度计( b e c k m a nd u 6 0 0 ) x 4r n a 定量并检测波长 2 6 0 2 8 0 比值壤定其纯度，l 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳判断r n a 的完整性。 7 总r n a 的纯化 用r n e a s yk i t ( q i a g e n ) 纯化t o t a lr n a ，具体操作如下： ( 1 ) 将小于1 0 0 b t g n 4 j t o t a lr n a 溶解至8 7 5 l 的水中，力 i b u f f e r r d d 1 0 9 l 2 乖n d n a s e2 5 p a ，混匀。室温( 2 5 ) 放置2 0 分钟。 ( 2 ) 用r n a s e f r e ew a t e r 调整r n a 标本体积到1 0 0 9 l ，加3 5 0 “l b u f f e rr l t ，混匀。d n 2 5 0g l 乙醇( 9 6 一l o o ) ，充分混匀。 ( 3 ) ： # r n e a s ym i n ic o l u m n 置2 m l 收集管( 内带) ，水平放置， 上海第二医科大学博士学位论文 将7 0 0 p 1 样本加在柱上，盖上盖，1 2 0 0 0 r p m 离一t j , 1 5 秒，弃 流出液和收集管。将r n e a s yc o l u m n 移置另一新管，吸5 0 0 9 l b u f f e rr p e j j h 在扫2 j 2 ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 秒洗柱，弃流出液。 ( 4 ) 再吸5 0 0 “1b u f f e rr p 助日在柱上，同上条件离心2 分钟( 洗柱 并使柱干燥) 。将r n e a s yc o l u m n 放在另一新2 m l 收集管，同上 条件离心1 分钟( 使柱充分干燥无乙醇) 。将r n e a s y c o l u m n 放 置在另一新1 5 m l 收集管( 内带) ，取3 0 5 0 9 lr n a s e f r e e w a t e r 直接加置柱上，盖上盖，1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟( 洗脱并收 集) 。 ( 5 ) 取溶解后的t o t a lr n a ，测浓度并电泳检测r n a 的质量。 8 芯片的制各： 小鼠的c d n a 克隆全部由金刚博士赠送，所得克隆共8 7 2 2 个，其中e s t 有4 5 7 8 个，基因4 1 4 4 个。应用g e n e r a t i o n i i i a r r a y s p o t t e rc o n t r 0 1 软件，点样模式为n o r m a l ：左右对称不重复点 样，湿度控制5 6 5 8 ，温度控制2 2 5 - - 2 4 5 。图7 为片基 l 左右两侧完全对称图，每侧共有1 2 3 2 1 2 个点。小图为 片基上两个b l o c k 的放大图像。每一个b l o c k 共有1 2 3 2 个点。 点的直径2 5 0 9 m ，点间距离3 0 j t m 。点样结束，玻片需用6 0 。c 干烤3 0 m i n ，然后经紫外交联1 5 0 m j2 m i n 固定，干燥器中避光 保存。 9 探针标记及杂交 采用直接标记法标记探针，具体操作如下： 上海第二医科大学博士学位论文 将5 个时间点的胚胎总r n a 均量混合作为对照组，标记 c y 3 d c t p ，5 个时间点卵黄囊的总r n a 作实验组，即5 个组， 标记c y 5 d c t p 。注意实验组与对照组需单独标记，杂交时每 个实验组的探针均与一份对照组探针合并，即实验组与对照组 同时杂在一张芯片上。 ( 1 ) 标记反应体系及反应时问见表l 。 表1 探针标记体系及反应条件 t b t a ir n a o l i g o d ( t ) 2 2 ( 05 9 9 n ) h 2 0 7 0 4 0 9 9 2 9 l 5 分钟 5 f i r s t s t r a n db u f f e r d t t ( 0 1 m ) d n t pm i x ( 2 m m d a t p , d o t p , d t t p ，】m md c t p ) c y 3 一d c t p 或c y 5 一d c t pfl n m o l 9 1 ) r r t a s i nr i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r ( 4 0u n i t s p i ) s u p e r s c r i p t r ”1 t ( 2 0 0u n i t s p 1 ) 总汁 4 2 7 0 n a o l t ( 2 5 m ) 3 7 4 u l 1 5 分钟 2 0 9 i ( 2 ) 纯化探针：用水补齐至5 0 0 p l 上样致m o n t a g e p c r 纯化柱 ( m i l l i p o r e ) ，1 o g 离心1 5 分钟。加水2 0 9 l ，放置1 分钟充分 溶解，反转纯化柱，1 0 g 离心2 分钟，收集探针。 ( 3 ) 杂交液体系见表2 。 ( 4 ) 杂交：将处理好的杂交液滴至已6 5 。o 预温的玻片上，盖上 盖玻片。于6 5 孵箱中放置1 2 1 6 小时。 h h 山m m 船山m 吣小路 8 4 2 l l 2 4 2 l 上海第二医科大学博士学位论文 表2 芯片杂交体系 m o u s ec o t - 1d n a ( 1 m g m 1 ) a 8 0 ( 1 m g m 1 ) 2 0 s s c0 h 7 0 ) h e p e s ( 1 m ) s d s ( 1 0 ，p h7 2 ) 纯化扁的探针 9 5 6 5 ( 5 ) 洗片 将水浴调至5 0 。c ，用3 s s c + o 1 s d s 洗液洗1 0 分钟， 共4 次。然后0 2 s s c 洗液，室温，洗1 0 分钟，共4 次。用 水平离心机甩干片子5 0 0r p m ，离心5 分钟。 ( 6 ) 扫描玻片 用a r r a ys c a n n e r ( m o l e c u l a rd y n a m i c s 公司) 扫描玻片， g r e e n ( 5 3 2 n m ) 、p m t7 0 0 v ；r e d ( 6 3 3 n m ) ，p m t 7 5 0 v 。扫描后获 得4 个图象文件，分别是l 1 ，l 2 和r 1 ，r 2 ( g e l 文件) 。 ( 7 ) 采集数据 a r r a y v i s i o n ( m o l e c u l a rd y n a m i c s 公司) 分析图象文件，得到数 据文件。用g e n e s p r i n g 软件( s i l i c o ng e n e t i c s 公司) 对数据进行标准化 处理，得到标准化之后的比值( c y 3 c y 5 ) 。 1 0 运用c p p s o m 方法对表达数据进行分析 在进行基因聚类分析之前，8 7 2 2 个被检测的数据首先经过 标准化筛选，筛除无效数据。用s o m 基因聚类软件对有效数 据进行归类，再通过c p p 对其运算输出相进行展示。 用c e n t e r i n g 方法处理原始数据，然后再用所得数值进行 1 6 钟娉叫山山山山叫分皑 l 2 6 l 1 2 2 l 上海第二医科大学博士学位论文 s o m 基因聚类和c p p 结果输出。两种分析方法得到的不同基 因用黑体表示。 l l 对数据进行生物信息学分析 所用网站主要涉及： h t t p ：r a n a 1 b 1 g o v e i s e n s o f t w a r e h t m h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v l o c u s l i n k h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v e n t r e z q u e r y , f c g i ? d b = p u b m e d h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v e n t r e z q u e r y , f c g i ? d b = o m i m h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t h t t p ：b i o i n f o r m a t i c s w e i z m a n n a c i l c a r d s 1 2 实时定量p c r ( 1 ) 以2 9 9 总r n a 为模板，逆转录合成c d n a ( t a q m a n r e v e r s e t r a n s c r i p t i o nr e a g e n t sk i t ) 。逆转录反应体系及反应时间见表3 。 表3 逆转录反应体系及反应条件 t b t a lr n a r a n d o