（环境工程专业论文）甲拌磷降解菌的筛选及其降解特性研究.pdf

、一 喊 罅 ll rl ，。叶 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 。 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一n - r _ j 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 ：也 恧。 学位论文作者签名：i 不7 f 酉群 日期：砌8 7 乡 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 、 作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后： 半年口一年口一年半口两年d 学位论文作者签名：f 荦稠群 导师签名： 差卅窆 。签字日期：冽g 7 乡 签字日期：z 。口8 、7 歹 0 东北大学硕士学位论文 摘要 甲拌磷降解菌的筛选及其降解特性研究 摘要 甲拌磷在有机磷杀虫剂毒性排名第一。甲拌磷及其代谢物形成的更毒的氧化物在植 物体内至少能保持1 2 个月；在土壤中残留期超过5 0 天。使用不当或长期连续使用会 对人体和环境造成较大的危害。我国已禁止其在蔬菜、水果、中草药上使用，目前主要 用于玉米播种时期的土壤处理、防治地下害虫和苗期蚜虫等或制成混剂使用。 本研究从长期受甲拌磷污染的土壤中筛选分离到一株甲拌磷高效降解菌j z l ，鉴定 该菌为剑菌属微生物( e n s i f e r s p ) 。其在牛肉膏蛋白胨液体培养基中4 h 后进入对数生长 期，2 4 h 进入稳定期。该菌能在p h 5 0 9 0 范围内地生长良好，最适p h 为8 0 ；最适生 长温度为3 7 。c ；最佳碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母膏；最佳n a c i 质量浓度为o 5 ， 超过8 o 时生长明显受到抑制。 针对j z l 在实验过程中出现菌种衰退的现象，采用了土壤浸出液复壮法恢复了其生 长繁殖能力，且生物学特性保持不变。 j z l 能耐受甲拌磷浓度高达2 8 0 0 0 m g l 。筛选初期2 4 h 时对2 0 0 m g l 的甲拌磷降解 率为4 2 2 ；驯化浓度达到8 0 0 m g l 后，降解率达到5 6 3 ；简易化的化学诱变和紫外 诱变处理后，降解率分别提高至6 7 8 和8 3 2 。气相色谱法测定甲拌磷的降解动态， 1 2 h - 2 4 h 内下降迅速，2 4 h 后降解率为8 3 9 9 ，此后基本维持在此水平。e n s i f e r s p 微生 物对甲拌磷具有如此高的耐受性并具有降解性能尚属首次报道。 甲拌磷的有效成分为o ，o 二乙基s 乙硫基甲基二硫代磷酸酯，根据甲拌磷被生物 降解时易断裂的键位，推测甲拌磷的降解过程为：o ，o 二乙基s 乙硫基甲基二硫代磷 酸酯首先降解为二乙基磷酸，继而转变为磷酸。微生物降解过程中，推测一部分磷元素 被微生物吸附或被用来合成菌体组成物质。 筛选初期，j z l 细胞形态为短杆状，驯化后转变成球形，继代培养l 代至1 5 代始终 保持球形，其它各项生物学指标和降解性能均与初始菌株一致，表明该菌株具有良好的 传代稳定性。 关键词：甲拌磷；剑菌属；分离筛选；降解特性；诱变 ， v 0 、一母 东北大学硕士学位论文 h o u r st o2 4h o u r sa n dd e g r a d a t i o nr a t ew a s8 3 9 9 a f t e r2 4 h o u r s i ti st h ef i r s tr e p o r ta b o u t e 琊啦rs f m i c r o o r g a n i s mw i t hag r e a th i g h l yp h o r a t e t o l e r a t i o na n dd e g r a d a t i o nc a p a b i l i t y b a s i n go nb o n dp o s i t i o n so ft h ee f f e c t i v ei n g r e d i e n to fp h o r a t e ，w h i c hw e r ee a s yt oc u t , t h ep a p e rc o n j e c t u r e dt h ed e g r a d a t i o np r o c e s so fp h o r a t ew a s ： f i r s t l y , p h o r a t ec h a n g e dt o d i e t h y lp h o s p h o r i ca c i d ，a n dt h e n ，b e c a m ep h o s p h o r i ca c i d p a r t so fp h o s p h o r u sm a yb e a b s o r b e db yj z lo rs y n t h e s i z e dt os e r t a i np a r t so ft h a l l i a tt h ev e r yb e g i n n i n g ，c e l l so fj z1w e r es h o r tb a c i l l i f o r m b u tt h e yb e c a m eg l o b a t ea f t e r d o m e s t i c a t i o na n dr e m a i n e dt h i s m o d a l i t y s i n c e t h e n m o r e o v e r , o t h e rb i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n dd e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yw e r ec h a n g e l e s sa l la l o n g i na l l ，t h er e s u l tw a st h a t j z lh a dt h ec a p a b i l i t yo fw e l lg e n e r a t i o n ss t a b i l i t y k e yw o r d s ：p h o r a t e ；e n s i f e rs p ；i s o l a t e d ；d e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ；m u t a t i o n w h 奠 妒0 东北大学硕士学位论文目录 目录 独创性声明i 摘要i i a b s t r a c t 一i i i ，第1 章绪论1 、 l 1 1 农药及其危害1 1 2 有机磷农药简介3 1 3 有机磷农药在环境中的降解转化5 1 3 1 有机磷农药的非生物降解5 1 3 1 1 吸附催化水解5 1 3 1 2 光降解6 1 3 2 有机磷农药的生物降解6 1 4 有机磷农药生物降解研究进展7 1 4 1 天然降解菌筛选7 1 4 2 工程菌构造8 1 4 3 降解酶分离9 1 5 微生物诱变选育9 1 6 研究目的、意义及主要研究内容1 l 1 6 1 研究目的、理论意义1 l 1 6 2 主要研究内容1 2 第2 章实验材料和方法1 3 2 1 实验材料1 3 2 1 1 实验药品1 3 2 1 2 实验仪器1 3 2 2 实验方法1 4 2 2 1 培养基的制备和灭菌1 4 2 2 2 菌种保存1 5 v 东北大学硕士学位论文目录 2 2 2 1 斜面低温保存法1 5 2 2 2 2 液体石蜡保存法1 5 2 2 3 降解菌筛选与驯化1 5 2 2 3 1 土样采集1 5 2 2 3 2 富集培养1 6 2 2 3 3 初筛1 6 2 2 3 4 菌株分离纯化1 6 2 2 3 5 驯化与复筛1 6 2 2 4 菌种鉴定1 7 2 2 4 1 形态特征电镜观察1 7 2 2 4 2 生理生化试验1 7 2 2 5 细菌悬浮液的制各1 9 2 2 6 菌株最佳生长条件的测定1 9 2 2 6 i 细菌生长量的测定方法1 9 2 2 6 2 生长曲线的测定1 9 2 2 6 3 最佳生长条件的测定1 9 2 2 7 甲拌磷检测方法? 2 0 2 2 7 1 紫外可见分光光度计法2 0 2 2 7 2 氯化亚锡法2 l 2 2 7 3 气相色谱法2 3 2 2 8 土壤复壮和简易化诱变2 4 2 2 8 1 土壤复壮2 4 2 2 8 2 化学诱变2 4 2 2 8 3 紫外诱变2 4 2 2 9 降解性能研究2 4 2 2 9 1 甲拌磷耐受性能2 4 2 2 9 2 降解实验2 5 2 2 9 3 底物浓度对降解率的影响2 5 2 2 9 4 降解进程曲线制作2 5 第3 章甲拌磷降解菌的筛选与生物学特性研究2 6 v i ， 产 _ 。务 j 、 p 孙 v i i 东北大学硕士学位论文目录 5 6 降解途径初探4 5 第6 章结论与建议，4 7 6 1 结论j 4 7 6 2 建议4 7 参考文献4 9 致谢5 3 项目资助情况5 4 攻读学位期间发表的论著5 5 v i i i ， 厶、 呻 t 释 舡 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 第1 章绪论 二十一世纪人类面临诸多困境：人口、食物、健康、环境、资源，其中作为人类赖 以生存的环境是所有困境的困境，而造成这一困境最重要、最直接的根源是化学污染。 化学污染最重要、最直接的根源是农药、化肥的不断追加和非理性施用，给生态环境造 成的污染和破坏与日俱增。许多农药，尤其是杀虫剂、杀鼠剂，多具很强的毒性，如不 注意采取预防措施，常可引起人、畜中毒甚至死亡。随着经济的发展和人民生活水平的 不断提高，人们对生活质量提出了更高的要求。环境污染和食品安全问题日趋成为人们 关注的焦点。无公害、无污染、安全、优质和营养的绿色食品越来越受到人们的青睐。 因此，如何有效地避免农药残留对环境及人们的损害已成为人类亟待解决的问题。 1 1 农药及其危害 按中国农业百科全书农药卷的定义，农药( p e s t i c i d e s ) 主要是指用来防治危 害农林牧业生产的有害生物( 害虫、害螨、线虫、病原菌、杂草及鼠类) 和调节植物生 长的化学药品，但通常也把改善有效成分物理、化学性状的各种助剂包括在内。农药包 括化学农药和生物农药，我们通常所说的农药一般指化学农药。农药的种类很多，根据 其在农业上的用途可分为杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀鼠剂、 熏蒸剂、除草剂、植物生长调节剂等。其中以杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂和除草剂最为常 用。农药按化学结构类型可以分为有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类。 世界人口在不断增长，粮食需求将越来越趋于紧张。估计到2 0 4 0 年，粮食的需要量将 为现在的3 倍，但耕地却有减无增。同时，随着人们的食品结构的改变，也需要有大量 的粮食。对此，只有尽力提高单位面积的产量才是唯一的出路。农药对控制农作物病、 虫、草、鼠危害，促进产品高产优质，保证农业丰产丰收具有重要的作用。据统计，世 界农作物的病虫草害，约有5 0 0 0 0 种真菌，1 8 0 0 种杂草和1 5 0 0 种线虫，使世界粮食减 产约5 0 。全国粮食作物从生产到储藏过程中因病、虫、草、鼠的危害，损失至少2 0 3 0 ；棉花损失约1 5 ；水果、蔬菜则高达2 0 3 0 t 1 1 。采用化学农药是防治病虫 草害的重要措施。目前世界上生产的农药品种主要有4 2 0 种，其中1 6 0 种杀虫剂和杀螨 剂，1 6 0 种除草剂，5 0 种杀菌剂，其余是植物生长调节剂和趋避剂。目前，我国生产2 0 0 多种农药，年产量近3 0 万吨，其中有机磷农药生产占总产量的8 0 【2 】。显然，2 1 世纪 的农业仍将离不开农药，农药的研究、生产和使用将继续得到发展。 东北大学硕士学位论文 第1 章绪论 美国科学家c a r l o s n 寂静的春天( 1 9 6 2 ) 一版之后，人们普遍关注化学农药引 起的环境公害问题。化学农药污染及其产生的危害是严重的：化学农药对大气、土壤和 水体污染，对环境质量的影响和破坏，尤是对地下水的污染问题己到了令人触目惊心的 地步；农药残留是“餐桌污染”的主要原因之一。化学农药污染的生态效应十分深远， 对生物多样性的破坏作用极大：农药本身的作用导致有害生物产生抗药性，反而影响了 有害生物的有效防治，导致人们使用更多、更毒的农药，更频繁地使用农药产生恶性循 环。其次，农药杀伤天敌，破坏了生态平衡，导致害虫再增猖狂，如世界上最大的稻米 生产国之一的印度尼西亚8 0 年代中期暴发了一场空前的蝗灾，究其原因是大量使用农 药使蝗虫天敌几乎完全消失所造成的【弘5 1 。 目前，食品质量安全问题也已成为全人类共同关注的重大课题。随着全球经济一体 化这一问题显得更为突出。在食品安全问题中，化学农药残留造成的化学污染食品质量 安全的影响愈来愈严重，据联合国粮农组织公布的调查显示：全世界每年约有2 0 0 万因 使用化学农药而中毒，其中大约有4 万人死亡( 林玉锁和龚瑞忠，2 0 0 0 ) ，我国屡见类 似报道。1 9 8 7 年7 月至1 9 8 8 年1 0 月，香港报界曾三次报道香港市民因食经深圳口岸输 港的空心菜后发生中毒事故，中毒人数达6 7 0 多人。事后检验3 0 个样本，其中1 0 个含 有严禁在蔬菜上使用的高毒农药甲胺磷。1 9 8 8 年，珠海市发生市民食用受农药污染蔬菜 的中毒事故，中毒人数达2 0 0 多人。毒者肠道内容物检验发现甲胺磷。1 9 9 8 年厦门海关 对2 0 批次蔬菜检，农药残留超标率达8 5 ；我国出口的农副产品中，因农药的残留问 题而退货的损失，1 9 9 7 年就高达7 4 亿美元。化学农药高残留已严重地削弱我国食品在 国际市场争力( 林玉锁和龚瑞忠，2 0 0 0 ) 。随着人们生活水平的提高，消费者对食品质 量安的重视与日俱增，人类对食品的要求已从温饱、口感进而转到了安全、卫生、营养 更高要求。市场上，消费者对以“安全、卫生、营养、优质 为品质核心的有机食绿色 食品和无公害农产品表现出强烈的需求欲望。2 0 世纪8 0 年代以前，农药的定义和范围 偏重于强调对害物的“杀死 ；今天，我们更注重“调节”；今后农药的内涵必然是“对 害物高效，对非靶标生物及环境安全”。尽管如此，目前生产上广泛使用的化学农药中 不乏有高毒、高残留、难降解的农药。 残留的农药具有一定的毒性，是一种重要的化学危害，对人类健康构成直接或潜在 的危害。农药因种类不同，其毒性也各异。杀虫剂的毒性一般大于杀菌剂。对动物毒性 大的农药，对人类的毒性亦大。根据农药经口对人类的危害剂量和动物实验所得的半数 致死剂量( l d 5 0 ) ，可将农药分为高、中、低、微毒四类，如表1 1 。农药的大多数品 种用于防治农业有害生物，它们一般对人体也是有害的。农药对人的毒性可分为急性和 r a 、 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 慢性，急性中毒这种情况农药一般是通过消化道、呼吸道或皮肤三个途径进入人体的， 慢性中毒这种情况农药主要通过食物进入人体，农药的蓄积性毒性属于慢性中毒范畴。 有些农药施用后，其有毒的有效成分及其有毒的降解物、衍生物和代谢物在农作物和环 境中长期滞留，污染农畜产品和环境，形成农药残留问题和环境污染问题，对人构成慢 性中毒的威胁。过去食品中有毒物质残留问题主要是重金属和持久性有机氯农药的残 留。但在我国，剧毒、高毒有机磷农药的不合理使用也造成了不少食用果实蔬菜者的急 性与亚急性中毒。 表1 1 农药的毒性分级 t a b l e1 1t o x i c i t yc l a s s i f i c a t i o no f p e s t i c i d e 1 2 有机磷农药简介 有机磷农药一直是国内外广泛生产和使用的农药产品，其产品已经达到上百种。国 内广泛使用的约有3 0 种，其中8 0 以上是剧毒农药，如甲胺磷、甲基对硫磷、久效磷、 敌敌畏等 6 1 。除少数品种( 如敌百虫) 外，有机磷农药多为油状液体，工业品呈淡黄色 至棕色，且有类似大蒜臭味。一般不溶于水，而溶于多种有机溶剂及动植物油。对光、 热、氧较稳定，遇碱易分解破坏 7 1 。在我国农药生产中，杀虫剂为大宗，占总产量的7 0 以上，而我国生产和使用的有机磷农药约有7 0 为杀虫剂，如目前最常用的对硫磷、 马拉硫磷、乐果、敌百虫、敌敌畏、甲胺磷等。绝大部分有机磷农药可制成乳油，作为 喷洒剂，对害虫有触杀或胃毒作用。有的品种水溶性强，具备内吸作用，可涂茎施药或 拌种。常温下挥发性强者可作熏蒸剂。有机磷农药对于防治农业病虫草害具有经济、高 效、方便等优点，在今后相当长一段时间内，仍将被广泛使用。 有机磷农药因其在环境中易降解、残留时间短、对地下水污染的贡献小、对动植物 体内酶的活性抑制性小、易受到酶的作用而水解等特性，一直被认为是一种污染较小的 农药【8 】。但实验发现：有机磷农药的高效伴随着高毒和高残留。有机磷农药能通过消化 东北大学硕士学位论文 第1 章绪论 道、呼吸道及完整的皮肤和粘膜进人人体。所有有机磷都具有高度经皮毒性，即使是属 于低毒类的敌百虫，也可因小量持续的吸收而引起中毒。有机磷农药的杀虫机理主要是 抑制虫害体内胆酰酯酶的活性，同样，它也会因为同样的机理引起人体的中毒，造成神 经传导介质一乙酰胆碱的大量聚积【9 】。而乙酰胆碱可以使神经系统过度兴奋并很快转入 抑制和衰竭。1 9 5 9 年摩洛哥曾发生过混入机油的食用油而使食用此油的2 0 0 0 多人瘫痪 的惨剧，事后查明是机油中含有有机磷的化合物三甲基苯基磷酸酯( t o c p ) 所致。据 报道，1 9 9 9 2 0 0 1 年，对广西7 个主要城市的蔬菜市场的2 1 个蔬菜品种进行分析，有近 5 0 的样品有机磷检测呈阳性反应【1 0 1 。施于农作物上的农药大部分进入土壤圈和水圈， 这些农药不仅对环境造成了污染而且最终会通过食物链进入人体，对人体造成损害。有 机磷农药造成的环境污染和食品污染已直接威胁到人类的生存和可持续发展，并成为发 达国家设置贸易绿色壁垒的重要手段【1 1 】。近年来，以国际绿色组织为代表的一些人士， 呼吁限制有机磷类农药的使用和生产，因其具有较高的毒性，对人、畜危害较大。鉴于 有机磷杀虫剂的效果，恐怕短时间内不能被淘汰。 甲拌磷( p h o r a t e ) ，又叫3 9 1 1 ，化学名称为：o ，o 二乙基s 乙硫基甲基二硫代磷 酸酯，分子式为c 7 h 1 7 0 2 p s 3 ，分子量为2 6 0 4 。甲拌磷的熔点低于1 5 。c ，蒸汽压为o 1 l p a ( 2 0 ) ，2 5 c 下在水中的溶解度为0 3 3 m g l ，环己酮、二甲苯中为1 k g k g ，甲醇中为 3 3 7 9 k g 。可与四氯化碳、二嗯烷、植物油、二甲苯、醇类、醚类和酯类混溶。室温下 稳定，p h 5 7 时稳定，p h 低于2 或高于9 的介质中能促进水解，水解速度取决于温度和 p h 。6 0 的甲拌磷乳油为黄色或棕色透明液体，有效成分含量至6 0 o ，酸度( 以硫酸 计) 1 o ，水分姜1 0 。 甲拌磷是一种内吸有机磷杀虫剂，其分配系数适用于穿透植物表面蜡质层及细胞质 膜，既可以从根部被吸收向顶端传导，亦可被叶部吸收向下传导。这种内吸性不仅可以 减少施药后雨水的冲刷，而且可以减少对天敌的杀伤，加之合适的剂型和施药技术的配 合，有利于保护和利用害虫天敌。它具有胃毒、触杀和熏蒸杀虫作用，对防治蚜虫和红 蜘蛛等效果最好，还可以兼治介壳虫、卷叶虫和地下害虫，特别适合于刺吸式口器害虫 如蚜虫、蓟马及植食性螨的防治。有文献表明，5 甲拌磷颗粒剂在土壤中6 0 天后消解 率达到9 5 以上，3 甲拌磷颗粒剂在土壤中5 0 天消解率超过9 3 ，而甲拌磷及砜消解 率达到9 9 5 以上需要至少1 0 0 天，说明甲拌磷在土壤中的残留期较长【1 2 4 1 。甲拌磷对 人、畜毒性极强，对大鼠i ：1 投半致死剂量为1 6 m g k g ，是有机磷杀虫剂中毒性最强的一 种。因其毒性太强，目前主要用于玉米播种时期的土壤处理、防治地下害虫和苗期蚜虫 等或制成混剂使用，其他作物不宜使用。但是目前在蔬菜中检测出甲拌磷残留的事件仍 4 一 一 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 有发生【1 5 1 7 1 。 1 3 有机磷农药在环境中的降解转化 有机磷农药含有3 个磷酯键，一般被分为两种类型，一种是磷通过双键与氧结合 ( p = o ) ，如甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等；另一种是磷通过双键与硫结合( p = s ) ，如 对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱掣1 8 】。有机磷农药进入环境后会发生 降解，其降解过程分非生物降解和生物降解，其降解产物有的毒性低，有的则毒性增强。 1 3 1 有机磷农药的非生物降解 1 3 1 1 吸附催化水解 吸附催化水解是有机磷农药在土壤中降解的主要途径。其特点是，由于吸附催化作 用，水解反应在有土壤存在的体系中比在无土壤存在的水体系中快。如丁烯磷在3 8 、 p h 为9 1 的条件下，水解5 0 需3 5 h ，而它在普通土壤中水解8 7 也只需2 4 h 1 9 1 。实验 研究表明，有机磷易于水解。在处理甲胺磷废水中发现，当反应温度由1 4 0 提高到2 0 0 时，有机磷水解率由2 5 7 上升到7 5 5 ，水解时间由0 5 h 提高到3 0 h 时，有机磷水 解率由3 6 4 上升到7 3 1 ，有机磷浓度由9 8 9 m g l 提高到55 3 0 m g l 时，有机磷水解 率由2 5 9 提高到4 6 9 2 0 1 。由此可知，有机磷农药的水解率与温度、水解时间以及有 机磷浓度呈正相关关系。 有机磷农药水解形式主要包括酸催化、碱催化，但有机磷农药碱催化水解要比酸催 化水解容易的多【1 9 1 。因为有机磷农药的水解主要是发生在磷原子与有机基团连接的单键 结构上( 这个有机基团是取代羟基或羟基上的氢原子的) ，而羟基取代有机磷农药的有 机基团要比羟基上的氢原子取代有机磷农药的有机基团要容易的多，这与农药的本身结 构以及羟基的氧化能力强有关。当发生碱性水解时，有机基团被水中的羟基所取代，当 发生酸性水解时，有机磷农药中的有机基团被氢取代。 土壤中有机磷农药的水解还可能包含另一种机制，也即与金属离子发生络合作用催 化水解反应。m o r t l a n da n dr a m a n 证实c u 2 + 可与地亚农发生络合反应，催化它的水解反 应【2 1 1 。他们的研究结果还证明，金属离子催化有机磷水解的倾向与有机磷和金属离子形 成络合物或螯合物的能力有关。地亚农等硫代磷酸酯的水解反应为： s m o a + h 2 0 r o ) 2 p o 群丽面r o ) 2 p 1 h + 群川h 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 1 3 1 2 光降解 研究表明，大多数农药能发生光降解作用而生成新的化合物，这是农药变化或消失 的一个重要途径。光化学降解是指受太阳辐射和紫外线辐射等引起的农药分解。由于农 药中一般含有c c 、c h 、c o 、c - n 等键，而这些键的离解正好在太阳光的波长范围 内，因此农药在吸收光子之后，就变成为激发态的分子，导致上述键的断裂，发生光解 反应【猫。光解产物在环境中仍会不断的分解，转化成为无毒的化合物。虽然 2 9 0 n m 太阳光的照射下，许多有机农药仍能发生 一系列的光化学反应，主要的反应有氧化反应、环氧化反应、羟基化反应、脂解反应、 异构化反应和脱卤素作用等【2 3 1 。在自然条件下，一些不易发生生物降解的有机农药却可 能易于发生光降解，如d d t 在2 9 0 3 1 0 n m 紫外光的照射下可转化为d d e 和d d d ，d d e 还可进一步光解【2 4 1 。有机磷农药多数是酯类，酯类是容易水解的，所以如有水或湿气存 在，就能使其发生光水解作用，水解发生的部位往往是在最具有酸性的酯基上。 光解作用使有机磷酸酯类农药的毒性降低，而使很多硫代磷酸酯类农药转变为毒性 更强的化合物。如乐果在潮湿的空气中可较快地发生光化学分解，其第一步氧化产物一 一氧化乐果( c h 3 0 ) 2 p ( o ) s c h 2 0 n h c h 3 比乐果本身对温血动物毒性更大。 1 3 2 有机磷农药的生物降解 有机磷农药在土壤中被微生物降解是它们的另一条重要转化途径。进入土壤中的有 机磷农药在土壤微生物的作用下，彻底分解成c 0 2 等简单化合物，从而使农药发生降解， 降解作用主要表现为酶促反应【2 5 】。由于微生物的菌种不同，破坏农药的机理和速度也有 不同，酶促反应降解方式主要有脱氧、氧化还原、脱烷基、水解、环裂解等作用【2 们。可 降解有机磷农药的酶有多种，主要包括加氧酶、脱氢酶、偶氮还原酶和过氧化物酶掣2 7 l ， 降解作用一般是在多种酶的协同作用下完成的。 土壤微生物对有机磷农药的生物化学作用方式可分为两类：一类是微生物直接作用 于有机磷农药，通过酶促反应降解农药，应用较普遍；另一类是通过微生物的活动改变 了化学和物理的环境而间接作用于有机磷农药。一般有矿化作用、共代谢作用、生物浓 缩或累计作用和微生物对有机磷农药其他的间接作用【2 引。其中，矿化是将有机物完全无 机化的过程，是与微生物生长( 包括分解代谢和合成代谢) 相关的过程，被矿化的化合 物作为微生物生长的机制和能源，但通常只要部分有机物被用于合成菌体组成物质，其 余部分形成代谢产物；共代谢作用是指微生物在有其可利用的碳源存在时，对原来不能 利用的物质也可分解代谢的现象。通常情况下，共代谢只能使有机物得到修饰或转化， 东北大学硕士学位论文第l 章绪论 不能使分子完全分解。 敌百虫、敌敌畏及乐果等都是重要的有机磷杀虫剂，由于它们容易分解，不仅无环 境污染问题，而且分解产物还是植物本身生长所需要的肥料，因此应用十分广泛；又如 敌百虫，由于它低毒高效，除了用作农药外，甚至还可以当作兽医药，适量加到饲料中， 以驱除猪、马、牛、羊等动物体内的肠胃寄生虫。 1 4 有机磷农药生物降解研究进展 化学农药的长期大面积使用是农业生态系统最大的污染，直接威胁着人类的生存和 农业的可持续发展。我国科学工作者自2 0 世纪4 0 年代开始进行研究微生物对农药的降 解，6 0 年代中期以后，这一领域日趋活跃，7 0 年代开始，人们发现有些土壤微生物对 有机磷农药具有降解作用。微生物可以将农药分子当作自身所需的碳源物质对农药进行 分解代谢，从而在代谢过程中获得生长所需的能量。这种将农药分子作为碳源物质的分 解代谢常常是在农药污染物浓度较高的情况下进行的。即使农药分子不是可以被直接利 用的物质，也可以在经过初级转化后成为碳源物质。又由于微生物具有极其多样的代谢 类型和很强的变异性，近年来的研究发现，许多微生物能降解人工合成的农药，甚至原 以为不可生物降解的合成农药，通过定向诱变也找到了能降解它们的微生物。因此我们 可以通过驯化，筛选出能够降解一些农药的微生物，再利用定向诱变原理选育出农药的 高效降解菌，以便使不可降解的或难降解的农药，转变为能降解的，甚至能使它们迅速、 高效地去除2 9 , 刈。到目前为止已发现的有机磷降解微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻 类。在这些微生物中，往往一种微生物可降解多种农药，同时，一种农药也可被多种微 生物所降解。 1 4 1 天然降解菌筛选 目前发现的自然环境中对有机磷农药具有降解作用的有细菌、真菌、放线菌、藻类 等，研究比较深入的是细菌和真菌两类。细菌包括假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、芽孢 杆菌属( b a c c i l l u s ) 、产碱菌属( f l a v b a c t e r i u m ) 、节细菌属( a r t h r o b a c t e r ) 、棒状杆 菌属( c o r y n o b a c t e r i u m ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、黄单胞杆菌属( x a n t h a m o n u s ) 、 固瘤细菌属( a z o t o m o n u s ) 、硫杆菌属( t h i o b a c i l l u s ) 、微球菌属等【3 l l 。其中，假单胞 菌属可降解的农药主要有d d t 、马拉硫磷、甲胺磷、二嗪农等；芽孢杆菌属主要降解 d d t 、甲基对硫磷、对硫磷、独莠定等农药；黄杆菌属主要对甲基对硫磷、对硫磷、2 ， 4 d 等农药有较强的降解能力；产碱菌属可降解茅草枯、抑芽丹、三氯醋酸等农药3 2 , 3 3 l 。 东北大学硕士学位论文弟1 荦绪论 真菌有曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、青霉属( p i n i c i e l i u m ) 、木霉属( t r i c h o d e r m a ) 、酵母 ( s a c c h a r o m y c c s ) 等1 11 , 3 3 】。此外，藻类对有机磷也有降解作用，如小球绿藻属( c h o r o l l a ) 可降解甲拌磷、对硫磷等。迄今为止，学者们已经分离筛选出很多有机磷农药降解菌， 如沈齐英等从施用过乐果的土壤中筛出5 株乐果好氧降解菌【3 4 】；李淑彬等发现假单胞菌 能高效降解有机磷农药甲胺磷；w a t e r w 等人分离了两株具有有机磷降解活性的革兰氏 阴性菌f l a v o b a c t e r i u ms p 菌株s c 和菌株b 1 ；j u a nj a u r e g u i 等分离出1 7 株真菌，9 6 h 内 对硫磷的降解率达到5 0 9 7 【3 乳。 1 4 2 工程菌构造 许多有机磷农药虽然可被天然菌株降解，但由于受自然条件的影响，其对农药的降 解率较低或作用较慢，因此直接利用分离的微生物菌株往往不能达到期望的效果利用生 物工程技术可以改变酶的性质如酶的细胞定位、底物特异性、动力学特征，构造符合不 同需要的工程菌或酶制剂。m u l c h a n d a n i 等将脂蛋白( l p p ) 的信号序列的前九个氨基酸 连到外膜蛋白( o m p a ) 的跨膜区，构建成l p p o m p a 基因融合系统，将o p h 展示定位 到ec o l i 的表面。表面表达o p h 的细胞可有效水解对硫磷和对氧磷，而不受细胞膜扩散 限制，比胞内同样o p h 表达水平的细胞水解活性高7 倍【3 6 l 。将非生长的细胞通过简单吸 附固定到非织物聚丙烯材料上，在补充l m m o f lc 0 2 + p h 缓冲液中，可有效、快速水解近 1 0 0 的对氧磷、二嗪磷、蝇毒磷和甲基对硫磷【3 7 1 。此方法把细胞培养与细胞固定和解 毒过程分开，培养后不需无菌环境，为建立有效、简单、廉价的有机磷化合物脱毒技术 奠定了基础。 天然降解菌株一般可以降解某一种或一类农药，采用基因工程的方法，对降解基因 进行克隆和表达，构建工程菌，可以有效的拓宽降解谱，提高细菌的降解能力，增加工 程菌的抗逆性。s h a r o n 等【3 8 】将来源于f l a v o b a c t e r i u ms p a t c c 2 7 5 5 1 的o p d 基因片段插 入到质粒p l j 7 0 2 的b g li i 位点，导入链霉菌中，得到了稳定产生对硫磷水解酶的转化菌 株，该菌株生产的水解酶已经在农药厂废水处理中得到了应用【3 9 1 。刘智等将水解甲基对 硫磷的基因转移到耐盐、苯乙酸降解菌中，构建出能降解多种生物异源性物质并耐受高 浓度盐分的工程菌 4 0 1 。闰艳春等利用抗性尖音库蚊五带亚种( c u l e xp i p i e n s q u i n q u e f a s c i a t u s ) 的酯酶b 1 基因经重组获得能高效降解有机磷等农药的工程菌，并将 工程菌进行细胞固定化研制生物反应器，已取得较好效果【4 “3 1 。 东北大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 4 3 降解酶分离 进一步研究发现这些微生物之所以能降解有机磷农药是因为它们能分泌一种能水 解磷酸酯键的酶，即后来研究的有机磷农药降解酶。2 0 世纪8 0 年代，m u n n e c k e 等( 1 9 8 0 ) 发现有机磷农药降解酶比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，酶的降解效 果远远胜于微生物本身，特别是对低浓度的农药，而且，利用酶还可以避免工程菌对环 境可能造成的危害。因此，人们的思路从应用微生物菌体净化农药污染转向利用有机磷 农药降解酶。1 9 9 1 年，d e f r a n k 等从一株嗜盐细菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶， 可被m g + 和c 0 2 + 激活，对含磷氟键的有机磷化合物作用较好，对含磷氧键的有机磷化 合物作用不好【4 4 1 。2 0 0 4 年，l j o h n1 lf o s t e r 等( l j o h nr f o s t e r ，2 0 0 4 ) 从澳大利亚分 离到一株降解乙硫磷的微生物，分离提纯了降解酶，并对它的酶动力学进行了初步研究。 这些研究使得关于有机磷农药降解酶的认识得到进一步深入，酶学机理得到进一步了 解。我国关于有机磷农药降解酶的研究起步较晚，但近年也已取得了较大进步。李顺鹏 等( c u iz h o n g l i ，2 0 0 1 ) 分离了多株有机磷降解菌，并对其进行了详细研究，分离获得 了多种有机磷农药降解酶的基因，实现了融和表达，并对酶学性质进行了分析。陈亚丽 ( 2 0 0 1 ) 等从一株假单胞杆菌w b c 3 中分离到降解甲基对硫磷的有机磷农药降解酶， 已进行x 衍射分析其三维结构。刘玉焕等( 2 0 0 0 ) 从曲霉菌中分离纯化出有机磷降解 酶，此酶对有机磷农药乐果具有很好的降解作用。 1 5 微生物诱变选育 工业微生物菌种质量的优劣对发酵工业有极其重要的影响。从自然界分离所得的野 生菌种，无论在产量上或质量上，均难适合产业化生产的要求，所以需要对野生菌种进 行菌种改良。微生物育种和高等动物育种一样，无论是人工从自然突变中选择或是人工 有计划诱变的选择，都是建立在遗传和变异的基础上的。菌种改良的基本途径是：突变 和选择，基因重组( 遗传重组) 和基因工程( 遗传工程) 。传统的诱变及筛选是最常用 的菌种改良手段。凡采用杂交、接合、转化和转导等遗传学方法，把两个形状个体内的 基因放在一起，经遗传交换，重新组合后，改变遗传结构，形成新的遗传型个体的过程， 称为基因重组和遗传重组。基因工程也称遗传工程、重组d n a 技术，是现代生物技术 的核心，以细胞外进行d n a 拼接、重组技术为基础的基因工程，是以人们可控制的方 式来分离和操作特定的基因。 微生物的诱变育种约始于1 9 3 9 年【4 5 】，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高，性状优良的突变 菌株，并且找出适合这个突变菌株的最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下 合成有效产物。利用这一方法，许多科学家已经成功选育到了有用的突变菌株，4 n 。如 青霉素产生菌特异青霉( p e n i s i l l i u mn o t a t u m ) 是由英国人f l e m i n g 在1 9 2 9 年发现，当 时的发酵单位只有1 - 2 u m l 。1 9 4 3 年，美国北部地区研究所实验室分离出产黄青霉 ( p e n i s i l l i u mc h r y s o g e n u m ) n r r l 9 5 51 ，使发酵单位上升到2 0 u m l 。在此基础上，经 过四十多年的诱变育种，目前位置，青霉素的发酵单位已达7 00 0 1 0 0 0 0 0 u m l ，比原始 菌株的产量提高了几千倍【4 引。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、 收效大、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径。这主要是微生物具有下列几 个特点：1 、微生物繁殖速度快，短期内能大量繁殖后代。2 、细胞体积小，与外界环境 直接接触，对外界环境选择作用特别敏感，容易发生变异，并遗传到后代。3 、微生物 繁殖方式简单，多为单倍体，一旦发生变异，已经变异的新的遗传性状很容易传递下去。 目前应用于微生物菌种选育的诱变剂主要有物理诱变剂，化学诱变剂，生物诱变剂及其 他新型诱变剂和方法。 物理诱变剂是通常使用物理辐射中的各种射线，物理诱变剂包括紫外线、x 射线、 y 射线、快中子、q 射线、p 射线、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等，其中 对微生物诱变效果较好、应用交广泛的是紫外线、x 射线、y 射线和快中子。物理诱变 剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传的一系列复 杂的连锁反应过程。高能辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种类不同有所差 异，电离辐射主要引起d n a 伤的基因突变和染色体的畸变；非电离辐射主要导致形成 嘧啶二聚体。紫外线是一种使用最早、沿用最久、应用广泛、效果明显的物理诱变剂， 属于非电离辐射。它的诱变频率高，在工业微生物育种史伤曾经发挥过及其重要的作用， 迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一。 化学诱变剂种类很多，从简单的无机化合物到复杂的有机化合物都能引起诱变效 应，包括碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、移码诱变剂、羟化剂、金属盐类等。化学诱变 剂是一类能对d n a 起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。化学诱变剂往 往具有专一性，它们对基因的某部位发生作用，对其余部位则无影响。突变大多为基因 突变，并且主要是碱基的改变，其中尤以转换为多数。各种具有诱变作用的化学物质和 碱基接触起化学反应，通过d n a 的复制使碱基发生改变而起到诱变作用的。化学诱变 剂的剂量主要决定于其浓度和作用时间。 早在2 0 世纪8 0 年代初，就有人提出生物诱变剂的存在。生物诱变剂包括噬菌体和 1 0 东北大学硕士学位论文 基因诱变剂。在采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体菌株时，发现常伴随者出现抗生素产量 日益提高的抗性变株。因此认为这种溶源性噬菌体就是一株诱变剂。在后来选育放线菌 抗噬菌体菌种时，同样显示出噬菌体具有明显的诱变效应。随着基因工程技术的发展以 及专一改变基因中某个或某些特定核苷酸的技术特定核苷酸的技术点突变技术在 蛋白质工程的广泛应用，特定寡核苷酸在突变技术中起着介导作用，使基因成为一种新 的分子水平的生物诱变剂基因诱变剂。基因诱变剂可以是与特定噬菌体，也可以是 与细菌质粒d n a p c r 介导中作为引物的一段寡核苷酸。 近年来，诱变育种倍受育种工作者的欢迎，而且还开发出一些新型的诱变剂用于微 生物的诱变育种，比如微波、离子注入、红外射线、激光等。微波是一种电磁波，其诱 变机理可能缘于以下几个方面：( 1 ) 微波是一株电磁波，能引起水、蛋白质、核苷酸、 脂肪和碳水化合物等急性分子转动，尤其是水分子在2 4 5 0 m h z 分子氢键和碱基堆及化 学力受损，最终引起d n a 分子