（水产品加工及贮藏工程专业论文）甘露聚糖酶产生菌的分离筛选、鉴定及产酶条件的研究.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 甘露聚糖酶产生菌的分离筛选、鉴定及产酶条件的研究 摘要 甘露聚糖酶( m a n n a n a s e ) 是一类能水解含有1 3 1 , 4 d 甘露糖苷键 的甘露多糖的内切水解酶，属于半纤维素酶类，主要来源于微生物， 植物和低等动物中。甘露聚糖酶在造纸，食品，饲料，制药和石油开 采等很多方面有重要的应用价值。微生物则是产甘露聚糖酶的重要来 源，微生物来源的甘露聚糖酶具有产量高、易控制和成本低等优点。 它是一种有一定应用前景的新型工业用酶。目前存在发酵酶活性偏低 的缺陷，导致其生产和应用成本高，限制了该酶的广泛应用。我国是 啤酒生产的大国，啤酒的年产量稳居世界第一，因此啤酒废酵母的产 量也牢牢占据世界第一的位置。酵母细胞壁中的主要成分为葡萄甘露 聚糖，链的连接方式是仅1 ，6 糖化酶苷键盘连接，侧链则通过a 1 ，2 及o l 1 ，3 键连接，属于异甘露聚糖。能降解异甘露聚糖的甘露聚糖酶 的研究极为稀少，目前国内外还未见到详细报道。因此，从事特殊甘 露聚糖酶的研究和开发有着重要的意义和光明的前景。 本研究以广东、云南等地采集的土壤样品为实验材料，经过富集 培养、分离纯化、选择性平板分离，筛选出9 8 株产甘露聚酶的菌株， 再经过平板水解圈初筛得到1 5 株酶活力较高的菌株，经过摇瓶发酵产 酶复筛，选出5 株水解圈较大且酶活力较高的菌株，对这五株菌的产 上海海洋大学硕士学位论文 酶稳定性进行试验，选出一株产酶稳定性较好且酶活力较高的菌株， 并对其进行了鉴定。随后进行单因素试验，分别研究了酵母细胞壁碳 源浓度、氮源浓度、培养基初始p h 、接种量、装液量、摇床转速以及 培养温度和培养时间对菌株发酵产酶的影响。并在此基础上进行发酵 产酶培养条件的正交优化试验，用以考察培养条件中各因素对菌株产 酶能力的影响大小。 编号为f 1 5 的菌株是胞外甘露聚糖酶的高产菌株。采用菌株的个 体和群体的形态观察、生理生化试验及1 6 sr d n a 系统发育分析手段 进行鉴定，在互联网上与其它菌株的相关序列进行比对，最终确定菌 株f 1 5 为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 。g e n b a n k 注册号为 f j 3 9 2 7 2 5 。通过单因素试验和正交优化试验，确定了枯草芽孢杆菌f 1 5 的最佳发酵产酶条件。酵母细胞壁碳源浓度为4 8 ，氮源浓度为o 5 ， 培养基初始p h6 0 ，接种量为6 ，装液量为6 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶， 转速为1 8 0 r p m ，培养温度为3 5 。c ，在此发酵条件下发酵4 8 h ，枯草芽 孢杆菌f 1 5 产生的甘露聚糖酶活力达3 3 0u m l ，是优化前的3 4 倍。 正交试验结果表明四个因素对发酵液甘露聚糖酶活性影响强度大小 为：装液量 培养温度 培养基初始p h 接种量。 本实验以啤酒废酵母细胞壁中的异甘露聚糖为原料，对能产生降 解该糖的甘露聚糖酶的产生菌进行筛选，并对发酵产酶条件的进行研 究，为以后利用啤酒废酵母实现工业化生产甘露低聚糖提供理论依据。 并可以为甘露低聚糖的来源、啤酒废酵母的有效利用和减少啤酒工业 上海海洋大学硕士学位论文 带来的环境污染提供新的思路。 关键词：甘露聚糖酶，筛选，枯草芽孢杆菌，发酵条件，优化 上海海洋大学硕士学位论文 c h a r a c t e r i z a t i o no fm a n n a n a s e - - p r o d u c i n gs t r a i na n di t s 上ie r m e n t a n a0 nl ：o n d i n o n s 1 一 j j a b s t r a c t m a n n a n a s ei sa l le n d o - w i s e 酉y c o s y lh y d r o l a s ec a t a l y z e sr a n d o mh y d r o l y s i so f b - 1 ，4 - m a n n o s i d i cl i n k a g e si nt h em a i nc h a i no fm a n n a na n di t i sak i n do f h e m i c e l l u l a s e s m a n n a n a s ei sp r o d u c e dm a i n l yb ym i c r o o r g a n i s m ，p l a n t sa n dl o w e r a n i m a l m a r u l a n a s eh a sw i d ec o m m e r c i a la p p l i c a t i o n si ni n d u s t r yp r o c e s s e ss u c ha s p a p e ra n dp u l p ，f o o d s t u f f , f i e e d ，p h a r m a c e u t i c a la n do i li n d u s t r y m a n n a n a s e sp r o d u c e d b ym i c r o o r g a n i s m si sm o r ep r o m i s i n gd u et ol o wc o s t ，h i g hp r o d u c t i o nr a t e ，a n d r e a d i l yc o n t r o l l e dc o n d i t i o n d e s p i t eh a v i n gh i g hp r a c t i c a lp o t e n t i a l i t i e s ，t h eu s eo f m a n n a n a s ei ss t i l ll i m i t e dd u et ol o wy i e l d sa n dh i g h - p r o d u c t i o nc o s t s c h i n ai sa b i g b e e r - p r o d u c t i o nc o u n t r y , s ot h ep r o d u c t i o no fw a s t eb r e w e r sy e a s ta l s oh o l d st h ef i r m p o s i t i o ni nt h ew o r l d t h em a i ni n g r e d i e n to fw a s t eb r e w e r sy e a s ti sg l u c o m a n n a n s t h em a n n a ni s a 一1 , 6 一m a n n o s i d i cl i n k a g e si n t h em a i nc h a i n , q 一1 , 2 - m a n n o s i d i c l i n k a g e sa n dq 一1 , 3 - m a n n o s i d i cl i n k a g e si nt h es i d ec h a i n i tb e l o n g st oh e t e r o m a n n a n t h ed e t a i l e di n f o r m a t i o na b o u tt h i se x c e p t i o n a lm a n n a n a s ew h i c hc o u l dh y d r o l y s i so f q - 1 , 6 一m a n n o s i d i cl i n k a g e si nt h em a i nc h a i no fm a n n a nh a v en o tb e e nr e p o r t e d a sa r e s u l t ，e n g a g e di nt h er e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fs p e c i a lm a n n a n a s ei sp r o v i d e dw i t h i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ea n dab r i g h tf u t u r e b yu s i n gt h em e t h o d so f e n r i c h i n gc u l t u r e ，i s o l a t i o na n ds e l e c t i v ep l a t ec u l t u r e ， 9 8m a n n a n a s ep r o d u c i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h es o i ls a m p l e so fg u a n g d o n ga n d y u n n a n ，w h i c hw e r eg a t h e r e df r o mn a t u r e 15s t r a i n so fh i g he n z y m ea c t i v i t yw e r eg o t a f t e rt h ef i r s ts c r e e n i n gb y o b s e r v i n g t h ec l e a rc i r c l e so ns e l e c t i v ep l a t e s t h e n5s t r a i n s w i t hb i g g e rc l e a rc i r c l e sa n dh i g h e re n z y m ea c t i v i t yw e r e g o ta f t e rt h es e c o n d s c r e e n i n gb ys h a k i n gc u l t u r e t h e no n es t r a i nw a sg o ta f t e rt h er e s e a r c ho fs t a b i l i t y a b o u te n z y m e p r o d u c t i o n i tb e l o n g st ob e t t e rs t a b i l i t yo fe n z y m ea c t i v i t ya n dh i g h e r e n z y m ea c t i v i t y , a n dt h e ni d e n t i f i e dt h es t r a i n t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e da c c o r d i n gt ot h es i n g l ef a c t o ri no r d e rt oi m p r o v et h ep r o d u c t i o no ft h e i v 上海海洋大学硕士学位论文 e n z y m e t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s i n c l u d i n g t h e y e a s t c e l lw a l ls u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n ，t h en i t r o g e ns o u r c ec o n c e n t r a t i o n ，p h 、v o l u m eo fi n o c u l u m ，c o n t e n t i nf l a s k 、s h a k i n gs p e e d 、c u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r ea n dc u l t i v a t i o nt i m e a f t e rt h a t ，t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i nw e r eo p t i m i z e da c c o r d i n gt oo r t h o g o n a lt e s t si n o r d e rt ol o o ki n t ot h ee f f e c to fc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sf o re n z y m ea c t i v i t y t h es t r a i nw i t hb i g g e rc l e a rc i r c l e sa n dh i g h e re n z y m ea c t i v i t yw a sn a m e df1 - 5 i d e n t i f i e df1 5 ，t h er e s u l t so fp h e n o t y p e ，t h et r a d i t i o n a lp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l m e t h o d ，t o g e t h e rw i n lt h e16 sr d n as e q u e n c eh o m o l o g ys h o w e df 1 5b e l o n gt ot h e g e n u sb a c i l l u ss u b t i l & c o m p a r a t i v e1 6 sr d n as e q u e n c ea n a l y s e sr e v e a l e dt h a tf 1 - 5 w a sm o s tr e l a t e dt ot h es t r a i nb a c i l l u ss u b t i l i s ( i d e n t i t i e s 9 9 ) t h es t r a i nn a m e d f1 5h a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n ku n d e rt h ea c c e s s i o nn u m b e ro ff j 3 9 2 7 2 5 t h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gm a n n a n a s eb ys t r a i nf1 - 5w e r e d e t e r m i n e da n dt h er e s u l t sa r ea sf o l l o w t h ec o m p o s i t i o n so ff e r m e n t a t i o nm e d i u ma r e ： t h ey e a s tc e l lw a l ls u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n4 8 ，t h en i t r o g e ns o u r c ec o n c e n t r a t i o n o 5 ，p h6 0 t h eo p t i m a lv o l u m eo fi n o c u l u m i s6 ，a n dc u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r ei s 3 5 c ，t h eo p t i m a ls h a k i n gs p e e di s18 0 r p mw h e n2 5 0 m lf l a s kc o n t a i n s6 0 m lm e d i u m ， 4 8 h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n st h ea c t i v i t yo fm a n n a n a s ec a nr e a c h3 3 0u m l ，j u s t3 4 t i m e sa sb e f o r e t h er e s u l t so fo r t h o g o n a lt e s t so nt h ea c t i v i t yo fm a n n a n a s es h o w e d t h a t ：c o n t e n ti nf l a s k c u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r e p h v o l u m eo fi n o c u l u m t h er a wm a t e d a l so ft h er e s e a r c ha r et h eh e t e r o m a n n a nw h i c hi si nt h ew a s t e b r e w e r sy e a s tc e l lw a l l w ew a n tt oi s o l a t eas t r a i nw h i c hc a np r o d u c tt h ee n z y m et h a t c a t a l y z e st h er a n d o mh y d r o l y s i so fq 一1 , 6 - m a n n o s i d i cl i n k a g e si nh e t e r o m a n n a n t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e da c c o r d i n gt ot h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a l t e s t si no r d e rt oi m p r o v et h ep r o d u c t i o no ft h ee n z y m e i tc a np r o v i d eat h e o r e t i c a l b a s i sf o rt h eu s eo fw a s t eb r e w e r sy e a s tt op r o d u c tm a n n o - o l i g o s a c c h a r i d e si ni n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n i tc a ne n l a r g et h es o u r c eo fm a n n o - o l i g o s a c c h a r i d e s ，i n c r e a s et h ev a l u eo fw a s t e b r e w e r sy e a s ti nu s e ，a n di ta l s oc a nr e d u c ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o nw h i c hc o m e s f r o mt h eb e e r p r o d u c t i o n t h er e s e a r c hi sg o o df o ri n v e s t i g a t i o na n ds t u d y k e yw o r d sm a n n a n a s e ，s e l e c t i o n ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ， o p t i m i z a t i o n v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：张闶 日期：沙7 年，月占日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口 学位论文作者签名： 磁阈 日期：徊罗年，月彳日 指导教师签名：芝釜孛仇 嗍：节夕日 上海海洋大学硕士学位论文 引言 植物是自然界主要的可再生有机资源，主要成分是纤维素和半纤 维素。半纤维素占植物干重3 5 ，在自然界中含量仅次于纤维素。与 纤维素( p 一1 ，4 葡聚糖主链) 相比，半纤维素结构与组成十分复杂，包括 木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种 组分，而其中又以木聚糖和甘露聚糖两种多糖与食品、饲料及制浆造 纸工业关系最大【1 卅。 甘露聚糖是以p 1 ，4 d 吡喃甘露糖苷键连结而成的线状多糖。如 果主链某些残基被葡萄糖取代，则称为葡萄甘露聚糖；或半乳糖通过 仅1 ，6 一糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称为半乳甘露聚糖；或 同时被葡萄糖和半乳糖取代，则称为半乳葡萄甘露聚糖，它们统称为 异甘露聚糖。酵母细胞壁中的主要成分为葡萄甘露聚糖，而来源于酵 母细胞壁的葡甘露糖的主链则主要以高度分枝的吡喃糖残基链进行排 列，其主链的连接方式是仅。1 ，6 糖化酶苷键盘连接，侧链则通过0 【1 ，2 及0 【一1 ，3 键连接。这些物质共同构成了植物半纤维素的第二大组分， 而这些物质的降解主要依靠的酶就是p 一甘露聚糖酶f 5 1 ，完全降解还需 要p 甘露糖苷酶( 1 3 - m a n n o s i d a s e ) 、外p d 一甘露聚糖酶 ( e x o p m a n a n a s e ) 、半乳糖苷酶( g a l a c t o s i d a s e ) 、葡萄糖苷酶 ( g l u c o s i d a s e ) 署h 脱乙酰基化酶( d e a c y t l ee s t e r a s e ) 等支链酶的协同作用 【6 - 8 1 。 上海海洋大学硕士学位论文 p 一1 ，4 d 甘露聚糖酶( 1 3 1 ，4 d m a n a nm a n n a n o h y d r o l a s e ， e c 3 2 1 7 8 ) ，又简称为p d 甘露聚糖酶或1 3 甘露聚糖酶 ( p d m a n n a n a s e ，1 3 m a n n a n a s e ) ，是一类能够水解含有p 一1 ，4 d - 甘露 糖苷键的甘露寡糖、甘露聚糖( 包括异甘露聚糖) 的水解内切酶9 1 ，它属 于半纤维素酶类，广泛存在于动植物和微生物中。 甘露聚糖酶因其良好的水解半纤维素的能力，可生成品质好的甘 露低聚糖，正成为研究的热点。在甘露聚糖酶基础研究取得重要成果 的同时，另一方面，它的应用研究也进入一个高潮。现在，甘露聚糖 酶已在食品、医药、造纸、纺织印染、石油开采及生物研究技术等多 方面得到广泛运用。此外，甘露聚糖酶作为一种工具酶类，在糖工程、 糖结构分析、植物基因工程等生物基础研究中有着重要用途。 上海海洋大学硕士学位论文 第一章1 3 一甘露聚糖酶的研究进展 1 1 3 一甘露聚糖酶的来源和诱导 d 甘露聚糖酶广泛存在于自然界中。在一些低等动物( 如海洋软体动物 l i t t o r i n ab r e v i c u l a ) 的肠道分泌物中，豆类植物( 如四棱豆、长扁豆等) 的发芽的种子 中，天南星科( a r a c e a e ) 植物魔芋萌发的球茎中都发现了p 甘露聚糖酶的存在【l m l l 】。 而微生物( 包括真菌、细菌和放线菌) 则是b 甘露聚糖酶的主要来源。已报道的如 细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌，真菌里的曲霉、木霉、酵母、青霉、梭孢 菌、多孔菌、核盘菌和放线菌中的链霉菌等都是产d 甘露聚糖酶的常见类群。表 1 1 列出了部分产生该酶的微生物。由于微生物来源的b 甘露聚糖酶具有活性高、 成本低、来源稳定、提取方便以及比动植物更广的作用p h 、温度范围和底物专一 性等显著特点，已在工业化生产和理论研究中得到了广泛的应用【l 4 1 。 大部分研究资料表明，p 甘露聚糖酶一般以胞外诱导酶的形式存在于生物体 中，只有很少的以结构酶形式存在。对于大部分产d 甘露聚糖酶的微生物，在培 养基中添加少量的甘露多糖或甘露寡糖，如魔芋粉、槐豆胶或其水解物等，就能 极大地提高产酶水平；但有时其它一些半纤维素类物质或苯酚类化合物也能有效 地增加某些微生物的b 一甘露聚糖酶的分泌水平，如植物病原菌野油菜黄单胞菌 ( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s ) 。在含有锄纤维素、木聚糖的培养基上，d 甘露聚糖 酶的合成量几乎与含有槐豆胶半乳甘露聚糖培养时相持平【1 5 】；在培养基中添加微 量的黎芦酸、阿魏酸及香草酸，能有效地提高分解木质素的真菌户怃彪6 缸r a d i a t a f r i v o7 9 的p 甘露聚糖酶产量【16 1 。据推测，这可能是由于多糖的分解一般需要多 种糖苷酶类的参与，它们的诱导与合成常常互相影响、互相关联，因此不同的诱 导物也会产生相类似的诱导效果。 21 3 一甘露聚糖酶的微生物合成 大多数产p 甘露聚糖酶的菌株都是从土壤中筛选得到1 7 - 2 3 1 。筛选产p 甘露聚 上海海洋大学硕士学位论文 糖酶的菌的方法主要是基于d 甘露聚糖酶的如下特性：p 甘露聚糖酶是一种可诱 导的细胞外泌酶凇5 1 ，它可以分泌到菌体外的培养基中，作用于培养基中的底物， 使底物降解产生单糖或二糖。常用的筛选方法有透明圈法、水解圈法【2 6 。2 7 】、降解 物着色法以及直接从可以在主要成分为甘露聚糖的槐豆胶、角豆胶、瓜儿胶、魔 芋粉上生长的菌群中分离鉴定可以产生d 。甘露聚糖酶的菌。产p 甘露聚糖酶培养 基常用的碳源有魔芋粉、槐豆胶、角豆胶和田菁胶等，氮源有豆饼粉、蛋白胨、 酵母膏、谷氨酸钠等。在培养基中添加d 甘露多糖或甘露寡糖或其水解物可提高 产酶水平，另外一些半纤维素类物质和苯酚类化合物也能有效地增加某些微生物 的产酶能力。许多微生物在合成酶时是多酶种多组分的形式出现，半纤维素和纤 维素酶也常以复合物的形式同时产生。如真菌陆生梭孢菌( zt e r r e s t r i s ) 能产生5 种 降解甘露聚糖的酶，嗜碱芽孢杆菌n 1 6 5 产生的甘露聚糖酶有3 个分子质量不同 的酶组分。 表1 - 1 部分产生d 甘露聚糖酶的微生物 t a b l e1 - 1f i - m a n n a n a s e p r o d u c i n gs t r a i n s 中文名 拉丁名中文名拉丁名 产气杆菌a e r o m o n as p 溜曲霉 a s e p e r g i l l u st a m a r i i 蜡状芽孢杆菌 b a c i l l u sc e r e u s 芽孢杆菌b a c i l l u ss p 短小芽孢杆菌 b a c i l l u sp n m i l u s 多粘芽孢杆菌 b a c i l l u sp o l y m y x a 卵型拟杆菌 b a c t e r o i d e so v a t u s 肠球菌 e n t e r o c o c c u sc a r s e l i f l a r u s 雪白根霉 r h z o p u sn i v e r u s 浅青紫链霉菌 s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s 索孢壳菌t h i e l a v i at e r r e s t r i s 棘孢曲霉 a s p e r g i l l u sa c u s e a t u s 黑曲霉 a s p e r g i l l u sn i g e r 地衣芽孢杆菌 b a c i l l u sl i c h e n i o r m i s 嗜热脂肪芽b a c i l l u ss t e r o t h e r m o p h i l u s 枯草芽孢杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i s 短芽孢杆菌 b a c i l l u sb r e v i s 变色多孔菌p o l y p o r u sr e s s i c o l o r 齐整小核菌 s c l e r o t i u mr o l f s i i 木霉t r i h o d e r m ar e e s e i 栖热孢菌t h e r m o t o g ah e a p o l i t a t e 2 1 产b 一甘露聚糖酶菌种选育的研究进展 早在2 0 世纪初就有关于分解植物甘露聚糖的报道，但直到7 0 年代，p 甘露 聚糖酶的研究才逐渐深入。尤其是近十年来对半纤维素资源的开发和甘露聚糖益 生价值的发现，以及p 甘露聚糖酶诸多用途的发现，推动了p 甘露聚糖酶研究的 发展。 1 9 5 8 年，c o u r t i o s 第一次报道了能产生p 甘露聚糖酶的真菌。1 9 6 0 年，w i l l i a m 4 上海海洋大学硕士学位论文 和d o e t s c h 报道了细菌产生的p 甘露聚糖酶。1 9 6 5 年，r e e s e 和s h i b a t a 提出了p 一 甘露聚糖酶的概念和定义，为以后的研究打下基础。7 0 年代后，大量p 甘露聚糖 酶的产生菌株被筛选、诱变，研究培养基成分特别是碳源对酶产生的影响，进行 多糖结构的分析。同时，许多不同来源的p 甘露聚糖酶被分离纯化，对酶的基本 性质研究取得了较大发展。 国内白8 0 年代开展微生物甘露聚糖酶发酵生产技术研究，进展很快。1 9 8 0 年我国李欣等首次系统研究甘露聚糖的化学组成。1 9 8 5 年以后，随着b 。甘露聚糖 酶和甘露寡糖应用领域的开发，新菌种筛选和诱导育种等相关研究竞争显著加剧。 如杨文博等【1 7 】研究了产b 甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌的分离筛选及发酵条件。崔 福绵等【2 8 】研究了枯草芽孢杆菌中性d 甘露聚糖酶的产生及性质，选育菌种的酶的 产量达到1 2 0 u i n l 。 我国另一有特色的工作是分泌p 甘露聚糖酶的极端微生物菌种的分离选育。 如中国科学院微生物研究所马延和等【2 9 】较早提出利用碱性p 甘露聚糖酶生产甘 露寡糖的方法。利用嗜碱芽孢杆菌n 1 6 5 以魔芋粉为原料，发酵生产d - 甘露聚糖 酶，发酵液的酶活力达到5 0 0 u m l ，甘露寡糖后提取收率8 0 以上( 专利申请号 9 9 1 0 2 8 3 1 7 ) 。制备的甘露寡糖主要用于保健食品。该项成果荣获2 0 0 0 年度国家 科技发明二等奖。 中国农业科学院饲料研究所丁宏标等【2 5 】人从1 9 9 5 年开始饲用酶菌种筛选工 作，分离得到一株能分泌酸性p 一甘露聚糖酶的黑曲霉。其分泌的p 一甘露聚糖酶， 工作温度范围是3 0 8 5 ，最适反应温度7 0 ，反应p h2 0 9 2 ，最适p h3 0 - 5 8 ； 摇瓶条件下酶活力达到1 5 0 u m l ，符合饲料用酶条件。该菌种、发酵工艺及甘露 寡糖和酶的应用方法也已申请中国发明专利。9 0 年代后，随着基因工程和蛋白质 工程技术的广泛应用，b 甘露聚糖酶的研究工作越来越集中在基因克隆、重组表 达和酶活性工程的研究上，并取得了很大发展。 2 2 1 3 一甘露聚糖酶基因工程的研究进展 国内外对p 一甘露聚糖酶、甘露寡糖生产方法的研究涉及酶的生产、纯化与特性 研究、基因克隆与重组表达以及甘露寡糖的酶法生产等方面。p 甘露聚糖酶基因的 克隆和序列分析，一方面可以确定酶蛋白的一级结构，从而进一步研究酶蛋白的 改性以及蛋白结构与功能的关系；另一方面可以构建重组工程菌，以获得高表达 的生产菌株和研究b 甘露聚糖酶基因的表达和调控。生产技术方面的标志性进展 有：1 9 8 7 年日本理化研究所对芽孢杆菌a m 0 0 1 的d 甘露聚糖酶，通过多种方法选 5 上海海洋大学硕士学位论文 育，酶活力由3 6 u m l 提高至0 t 4 3 0 u m l t 3 0 】。1 9 9 5 年，美国c h e m g e n 公司研制了一 种b 甘露聚糖酶，其菌种b a c i l l u sl e n t u s 的产酶能力达4 0 0 u m l ，随后开发用做饲料 添加剂，是目前美国销售量最大的饲料用酶( 美国专利号9 6 1 0 7 1 2 6 5 ) 。 b 甘露聚糖酶基因工程方面的研究已有成功报道，该方面研究国外进展较快， 国内基本没有报道。有一些b 甘露聚糖酶被克隆，并在大肠杆菌中表达，如 m e n d o z a 等【3 l 】将克隆自b a c i l l u ss u b t i l i sn m 3 9 的d 甘露聚糖酶基因转入大肠杆菌 d h 5a 表达。重组酶活力为4 9 u m l 。还有其它微生物来源的基因，如嗜碱芽孢 杆菌a l k a l o p h i l i cb a c i l l u ss p a m 一0 0 1 、极端嗜热厌氧菌、荧光假单胞菌、变青链 霉菌以及里氏木霉等，在大肠杆菌中表达成功。大多数b 一甘露聚糖酶除了有催化 功能域，同时具有纤维素结合域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n , c b d ) ，因此属于纤维 素半纤维素双功能基因家族。由于植物纤维素与半纤维素总是相伴存在，c b d 有利于酶更好的结合靶物质，也有利于破坏植物聚糖的晶体结构，促进水解【3 2 1 。 在大肠杆菌表达主要证明了酶基因的活性功能，人们也在进行d 甘露聚糖酶基 因在酵母中的表达。由于在酵母系统中表达的蛋白在糖基化、磷酸化等方面的优 越性远高于在大肠杆菌中表达，所以这些工作更有吸引力。s t e p h a np a t t u r a i a n 在 a s p e r g i l l u sa c u l i a t u s 中构建了以酵母为载体的c d n a 文库，并从中分离出5 7 个编码 p 甘露聚糖酶的全长c d n a ，发现所有克隆均为同一酶基因并可在酵母中表达，在米 曲霉中得到超表达。重组酶分子量为4 5 k d a l ，等电点为4 5 ，最适p h 值和最适温度 分别为5 0 和6 0 7 0 * ( 2 t 3 3 1 。s t a l b r a n d 等【3 4 】利用从t r i c h o d e r m ar e e s e i 克隆的b 甘露葡聚 糖酶基因在酿酒酵母中实现了重组表达。t a n g 等t 3 5 】用毕赤酵母表达来源于a g 撕c u s b i s p o r u ss t r a i nc 5 4 c a r b 8 的甘露聚糖酶基因c e l 4 ，表达量提高了3 倍。现在n c b i 的 g e n e b a n k 和e m b l 基因库中已列入近百种不同来源的p 甘露聚糖酶基因。不同来 源的p 甘露聚糖酶基因分别在原核表达系统和真核表达系统中进行了表达，其中对 于在大肠杆菌表达系统表达的p 甘露聚糖酶，活力最高的酶基因来源于一株芽孢杆 菌，酶活力可达4 1 8 u m l 。在酵母表达系统表达的d 甘露聚糖酶活力最高的酶基 因来源于一种海洋软体动物( m y t i l u se d u l i s ) 的甘露聚糖酶基因，在1 4 l 的发酵罐 中表达量达至l j 9 0 0 m g l ，酶的比活力为4 5 6 u m g t 3 6 】。总体来说，酶的表达量偏低， 达不到工业生产的要求。 31 3 一甘露聚糖酶的酶学性质 6 上海海洋大学硕士学位论文 不同微生物所产的p 甘露聚糖酶的分子质量、最适反应p h 、等电点、最适 反应温度、酶动力学常数、底物专一性等都有一定的差异。p 甘露聚糖酶的分子 质量小的只有2 2 k u ，大的可以达到1 6 2 k u ，相差十分悬殊，但大部分在3 0 k u - 5 5 k u 3 7 1 。 真菌来源的b 一甘露聚糖酶的作用范围偏酸，一般在p h4 o 5 5 之间，最适 反应温度一般在5 5 7 5 。如1 9 9 0 年j o h n s o nkg t l 2 】研究的里氏木霉，最适 p h 为5 5 ，最适反应温度为6 5 ；李江华等【1 2 】研究的黑曲霉，最适p h 为5 5 ， 最适反应温度为3 5 。细菌和放线菌来源的最适p h 却常为中性或者偏碱性，最 适反应温度为4 5 c - - 7 0 。细菌中，研究最多的是芽孢杆菌，除嗜碱芽孢杆菌高 至p h9 0 以上之外，最适反应p h 多为5 5 7 0 。马建华【1 4 】等研究的枯草芽孢杆 菌最佳反应p h 为6 4 ，最适反应温度为5 0 。相对于细菌来源的d 甘露聚糖酶， 真菌来源的酶p h 稳定性、最适反应p h 都偏低。 酶蛋白上的巯基、酪氨酸残基及色氨酸残基是维持酶活性的必需基团。巯基 是酶蛋白中重要的活性基团和结构基团，在维持蛋白构象稳定方面有重要作用。 二硫键的形成能明显增强酶的稳定性。色氨酸残基在酶反应中也起到重要的作用 【3 引。因为n b s ( n 溴代琥珀亚胺) 在酸性条件下能选择性地修饰蛋白的色氨酸残基。 吴襟等【3 9 】研究发现，极微量n b s 的修饰对酶活力有强烈的抑制作用。这表明甘 露聚糖酶中的色氨酸残基对该酶活性有重要影响。 41 3 一甘露聚糖酶的作用机制及水解产物 不同来源的p 甘露聚糖酶水解底物的方式和深度主要与a 半乳糖残基和葡萄 糖残基在主链中的位置、含量、酯酰化的程度有关，并且底物本身的物理状态也 会影响酶对底物的作用。例如，结晶状态的甘露聚糖则不易被降解。e m i s 和 s h i m a h a r a 研究以p 甘露聚糖酶作用于魔芋胶或槐豆胶证明其作用位点是多糖链 的非还原端的第3 个或第4 个糖分子，即魔芋胶经d 甘露聚糖酶作用后的产物为 m g ，g m ，g g ，m m ，m m m ，g g m ，m g m ，g m m ，m m m m ，g m m - m ， g m m g ，g g - m m 和m m m m m 。虽然不同来源的b 一甘露聚糖酶对底物的 作用深度不同，但主要产物是低聚糖，相对来说，产生单糖很少或根本不产生。 另外，不同来源的p 甘露聚糖酶对底物的要求也不一样，如瓜儿豆胶种子( g u a r g u m ) 产生的p 甘露聚糖酶，要求5 个连续的甘露糖残基( 图1 1 ) ，酶主要结合在 7 上海海洋大学硕士学位论文 b 、d 残基的羟甲基一侧，a 、c 、e 残基的2 个羟基一侧，半乳糖若与b 、c 、e 残基通过0 【1 ，6 糖苷键相连或取代其中某个残基，都将改变糖链的基团位置和构 型，进一步影响与酶的结合。c 、e 被葡萄糖残基取代，同样不被酶降解，但b 、 d 残基被葡萄糖残基取代，因为仍然有羟甲基位于相同的一侧，则不影响酶的降 解m 】。而从黑曲霉( a s p e r g i u sn i g e r ) 得到的p 甘露聚糖酶则对连续4 个残基有要求。 m c c l e a r ybv 认为，1 ，4 p d 甘露聚糖有2 重轴的缎带式结构是必要的，这种构型 只允许半乳糖在甘露聚糖主链的两侧。 貔 dy 5g 图1 - 1 甘露聚糖酶和d - 1 ，4 一i ) - 甘露聚糖链结合模式 f i g 1 1i n t e g r a t i o nm o d e lo f m a n n a n a s el i n k e dw i t h 肛l ，4 - d - m a n n a n 甘露聚糖经d 甘露聚糖酶作用后，通过h p l c 或纸层析方法分析，主要产物 是低聚糖( 一般2 1 0 个残基) ，产物聚合度的大小与酶和底物的来源有关【4 1 嘲】。 但是，相对来说，产生单糖( 甘露糖) 很少或根本不产生。生成的低聚糖进一步在p 甘露糖苷酶、外1 3d 甘露聚糖酶、支链酶的作用下形成还原糖，而测定还原糖的 方法有s o m o g y i n e l s e n 法、地衣酚硫酸法、d n s 法【4 5 1 、染色法【4 6 】等，还可以依 据粘稠性多糖在酶作用下变稀，流出粘度计的时间发生变化的性质测定酶活力 【4 7 】。必须指出，由于测定酶活力不同学者采用不同的底物、不同的方法，这种情 况造成从文献分析p 一甘露聚糖酶活力达到的水平十分困难，因而对p 一甘露聚糖酶 的分类、鉴别作进一步地研究很有必要。 5 1 3 一甘露聚糖酶的应用 5 1 在饲料行业中的应用 谷类及其副产品中普遍存在着一种抗营养因子1 3 一d 一甘露聚糖，因不能被 单胃动物消化，降低了饲料的利用率。b 一甘露聚糖酶具有能分解b d 一甘露聚糖， 降低消化道内容物黏度；破坏细胞壁的结构，使营养物质能与消化酶充分接触； 提高动物内源酶( 如淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等) 的活性；改善肠道微生物菌群 上海海洋大学硕士学位论文 和提高肠黏膜的完整性等功能。加入b 一甘露聚糖酶能分解1 3 甘露聚糖，使之成 为甘露低聚糖，从而降低b 一甘露聚糖的抗营养作用，提高饲料的利用率