（发酵工程专业论文）丝状真菌抗线虫活性物质的研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 本沦文对总状共头霉s l 菌( s y n e e p f l a a s t r u mr a o e 师o s u m ) ，“生抗线虫 活性物质的发酵条件进行了优化，并分析了发酵滤液的理化性质，对活性物 质分离进行了探讨。 通过培养基组分的单因子试验、方差和显著性水平分析，确定了最佳发 酵培养基配方为：去皮马铃薯2 0 0 9 l 煮汁，蔗糖2 0 9 l ，p h 自然；最适发酵条 件为5 0 0 m 三角瓶装量1 0 0 m l ，接种量2 ，1 7 0 r m i n ，2 6 ，培养4 d 。发酵 滤液1 2 浓度的杀线虫活性达到8 5 以上。5 l 发酵罐放大培养条件为一级种 了静置培养2 4 h ，按接种量4 接入装有3 5 l 发酵培养基的5 l 发酵罐中，起 始通气量1 ：0 5 ，搅拌转速3 0 0 4 0 0 r m i n ，发酵5 4 h 。发酵滤液1 2 浓度的杀 线虫活性达到9 5 以上。 本论文研究了菌体形态与发酵滤液抗线虫活性之间的关系，发现摇瓶条 件下形成直径2 - 4 m m 的乳白色菌球，发酵滤液抗线活性较高，菌球形态较为 稳定。又通过扫描电镜观察不同发酵条件下形成的菌丝球内部、外部形态， 发现当菌球过大时，外部菌丝纤细致密，内部形成空腔，菌丝干瘪，养分传 输受阻致使发酵滤液活性低下；当菌球过小时菌丝质地坚密，不易伸展， 影响传质，发酵滤液活性也较低；只有形成直径2 r n m 4 m m 的大小适中的菌 球，外部菌丝大多饱满，内部菌丝松软，有利于外部养分和氧的传递，发酵 滤波抗线虫活性较高。通过研究菌体形态与发酵滤液抗线虫活性之间的关系， 为发酵结果提供表观依据。 对发酵滤液的理化性质进行了研究，结果表明抗线虫活性物质是神水 溶性物质，不易溶于有机溶剂，具有热稳定性，1 2 1 处理3 0 m i n ，仍保持较高 的活性。 对发酵滤液中的活性物质进行分离，发现s r 菌产生的抗线虫活性物质包 括有机酸类物质和非有机酸类活性组分。经过h p l c 、g c m s 分析，得知有 机酸类含有草酸、柠檬酸，琥珀酸和一个未知组分，还含有长链饱和脂肪酸 和不饱和脂肪酸的可能性；通过凝胶柱g 2 5 、薄层t l c 对非有机酸类活性成 分进行分离，结合红外光谱分析初步得出其为含有氨基、糖环的多组分化合 物，有待迸一步纯化。 关键词：总状共头霉；杀线虫活性；发酵优化；活性物质分离 灭津科技大学倾上学位论文 a b s t r a c t t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so ft h en e m a t i c i d a lb i n a c t i v e s u b s t a n c e sf r o m s y n c e p h m a s t r u mf a c o m o s u m ，p r i m a r ys e p a r a t i o n a n dt h e p r o p e r t i e s o ft h e b i o a c t i v es u b s t a n c e sw e r es t u d i e d b ys i n g l e f a c t o ra n ds t a t i s t i c a l a n a l y s i s ，t h eo p t i m u mm e d i u m ，w h i c hi s c o m p o s e do f s u c r o s e2 0 9 la n dp e e l e dp o t a t o2 0 0 9 lw i t hn a t u r a lp h ，a n dt h e o p t i m a lc o n d i t i o nw e r ed e t e r m i n e d 1 1 1 e2 1 0 6s p o r e so ff u n g u sw e r ei n c u b a t e d i n5 0 0 m lc o n i c a lf l a s kw i t h1 0 0 m ll i q u i dc u l t u r a lm e d i u mu n d e rt 7 0 f f m i nf o r4 d a y sa t2 6 t h en e m a t i c i d a lr a t er e a c h e da b o v e8 5 i nt h eo n et i m ed i l u t e d f e r m e n t a t i o ns o l u t i o n d u r i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s so nf e r m e n t e rt h en e m a t i c i d a l r a t eo fo n et i m ed i l u t e df e r m e n t a t i o ns o l u t i o nr e a c h e da b o v e9 5 f r o m4 4 ht o 5 2 h ， t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h em o r p h ao fs r a n dt h en e m a t i c i d a la c t i v i t yo f t h e b i n a c t i v es u b s t a n c e sw a ss t u d i e d i tw a sf o u n dt h a tt h ep e l l e t sw i t hd i a m e t e rf r o m 2 r a mt o4 m mw e r ef o r m e du n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s o nt h eb a s i so f o b s e r v i n g t h em o r p h ao ff u n g u su n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o nw a so b s e r v e d b yt h e s c a n e l e c t r o n i cm i c r o s c o p e ( s e m ) t h er e s u l ts h o w e dt h a tw h e nt h ep e l l e tw a st o ob i g ， t h ef i l a m e n t o u sw e r ec o m p a c to nt h es u r f a c eo fp e l l e t sa n dh o l l o ww a sf o r m e d i n s i d eb e c a u s eo ft h en u t r i e n t p r o h i b i t i o n ；w h e np e l l e t w a st o os m a l l t h e f i l a m e n t o u sw e r eh a r da n dt h en e m a t i c i d a la c t i v i t yo ft h eb i n a c t i v es u b s t a n c e s w a s l o w o n l y w h e nt h ep e l l e t sw i t hd i a m e t e rf r o m2 m mt o4 m mw e r e f o r m e d ，t h e f i l a m e n t o u sw e r ep l u m pa n dt h en e m a t i c i d a l a c t i v i t y w a sh i g h 1 1 1 e g i s t o f f e r m e n t a t i o nw a s p r o v i d e db yt h es t u d yo f t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em o r p h ao f s r a n dt h en e m a t i c i d a l a c t i v i t yo f m e b i n a c t i v es u b s t a n c e s s o m e p r o p e r t i e so f t h ef e r m e n t a t i o nl i q u i dw e r es t u d i e d t l l er e s u l t ss h o w e d t h a tn e m a t i c i d a lb i n a c t i v es u b s t a n c e sw e r e w a t e r - s o l u b i l i t ya n ds t e a d yw i t hh e a t i tk e p th i g hb i o a c t i v i t ya f t e rb e i n gd e a l e d 谢t h3 0 m i ni n121 t h ep r i m a r ys e p a r a t i o no fb i o a c t i v es u n s t a n c e sw a ss t u d i e d ，t o o i tw a s c o n c l u d e dt h a tn e m a t i c i d a lb i n a c t i v es u b s t a n c e sw a s c o m p o s e do fo r g a n i ca c i d s a n dn o n a c i d s i tw a sf o u n dt h a to x a l i ca c i d ，c i t r i ca c i da n ds o m ea c i d se l s ew e r e m e t a b o l i z e d b ys r t h r o u g hh p l c ，g c m s i na d d i t i o n ，i tw a s p r o b a b l y s a t u r a t e da n du n s a t u r a t e df a t t ya c i d sw e r em e t a b o l i z e d ，t o o p r i m a r ys e p a r a t e d b y t l ca n ds e p h a d e xg 2 5 ，m eb i o a c t i v es u b s t a n c e sw e r ec o m p o s e do f c o m p o u n d s w i t ha m i d oa n dg l u c o e x c e p t i n g o r g a n i ca c i d s t h ep u r i f i c a t i o no fb i n a c t i v e i i 天津科技大学硕十学位论文 s u b s t a n c e sw a s n e c e s s a r yi nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：s y n c e p h a l a s t r u mr h c o m o s u m ； n e m a t i c i d a lm e t a b o l i t e s f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ： s e p a r a t i o no f b i o - a c t i v es u b s t a n c e 1 i 天津科技丈学硕士学位论文 前言 线虫是一类世界性分布的重要植物病原物，是农作物、林木、蔬菜、 药材和花卉的重要病原体。大多数植物寄生线虫侵染植物的根或其他地卜 部分，干扰植物吸取水份和营养物质，对植物造成直接危害。有些线虫还 能传播植物病毒，破环寄主植物对其他病原物如真菌，细菌的抗性。线 虫的寄生范围广，环境适应性强，几乎每种作物都受到线虫的侵害。每年 由于植物寄生线虫危害造成全球农作物方面的损失高达l 0 0 0 亿美元，占整 个病虫害引起损失的2 3 ，线虫危害已成为全世界农作物产量的一个不容忽 视的l 琨$ r j 性重要因素，引起了世界各国的高度重视“。1 。为了提高农作物的 产量，治理土壤及植物寄生线虫在近几年已成为一个全球性的、新的、迫 切需要解决的重要问题”。化学农药的非生物源性，降解困难，导致化学 农药在自然界和食物链中长期积累，造成环境污染，生态平衡受到破坏， 社会公害等严重后果，这不符合可持续发展农业的战略思想，因此植物线 虫病害的化学防治受到极大的限制，生物防治日益受到世界各国的普遍重 视”1 1 。国内外在研究高效、低毒、低残留农药的过程中，尤其重视生物防 治一线虫的生物防治，成为线虫病害防治研究的重点和热门”“。 1 1 概述我国的植物寄生线虫危害情况 我国地处温带和亚热带，气候适宜于线虫的活动和繁殖，世界性重要 植物线虫病害在我国均有发生”。在我国发现的对植物有害的线虫有4 0 多 种，主要有小秆线虫、根结线虫、孢囊线虫、根腐线虫等。其中对作物为害 最为严重的是根结线虫和孢囊线虫。主要受危害的作物有花生、大豆、水稻、 小麦、马铃薯、烟草、甜菜、柑桔、麻类等。一般发生就可以使这类作物减 产1 0 - 4 0 ，严重时能减产7 0 8 0 甚至绝产。目前，甘薯茎线虫在 我国的甘薯基地卢龙泛滥成灾，减产6 0 7 0 ，严重时造成绝产，当地农民深 受其害；大豆孢囊线虫在我国的发生面积常年在2 0 0 0 万亩以上，造成产量 损失1 5 2 0 ，严重的达5 0 8 0 以上：蔬菜根结线虫在保护地中造成的损失 达2 0 3 0 ，严重地可达7 0 ，甚至绝产，如番茄及黄瓜根结线虫病在华北、 西北等保护地和华南露地泛滥成灾；花生根结线虫病在山东发生有4 0 多年 历史，对花生产量影响极大，严重的减产7 0 8 0 ：目前被称为“松树癌症” 的松材线虫病在我国自1 9 8 2 年南京首先发现以来，迅速扩散，在浙江、安 徽、山东和广东等省均有发现，呈蔓延扩散的趋势，松材线虫肆虐，在距著 名风景区黄山7 0 公里的地方已有松材线虫危害而引起我国政府的高度关注。 特别是植物线虫与细菌、真菌、病毒等多种病原物共同作用造成对植物的复 前占 合侵染，其危害更严重、损失更大。植物线虫病害使我国各种作物年平均产 量损失达1 0 一1 5 。 1 2 线虫防治的研究进展及存在的问题 植物病原线虫大多数都是专性寄生物，但寄主范围广，又是土传病原 物，即使是寄生在植物地卜部分的线虫，在其生活史中，特别是越冬、侵染 都是在上壤环境中进行”f 。根据线虫的生物学特性，寄主植物的特点，以及 具体的生产条件，以“预防为主，综合防治”为植保方针，制定具体的防治 方法。目前，生产中已有的植物线虫防治方法主要是靠化学杀线剂、农业栽 培技术和培育抗性品种等。 1 2 1 植物检疫 线虫自身移动或自然因素传播的距离有限，通常是人为因素形成的远 距离传播，如带有线虫的作物种子、苗、植物产品、带土材料和包装材料等 的运输造成线虫的人为传播。由于线虫多是土传病原物、繁殖快，一旦落入 土壤中线虫便可迅速繁殖，所以线虫的传播速度很快。如引起甘薯块根腐烂 的茎线虫就是1 9 3 7 年随日本侵略者传入中国的，首先在青岛李村发现，随 后迅速传播到山东、华北、辽宁等省；素有“松树癌症”之称的松材线虫在 我国出现，可能就是随进口的松材包装箱传入的。所以，严格控制线虫的人 为传入，检疫关是第一道屏障。 1 2 2 农业技术措施防治 农业技术措施主要有以下几种对线虫进行防治： 1 ) 轮作：传统的方法是在感染线虫的地区轮作线虫的非寄主作物， 使线虫无法生存。但是当感染区的线虫有多种种类或有广泛宿主时，如根结 线虫可侵染多种寄主植物，轮作难以行效；对于经济作物和林木而言，轮作 防病也难以实施”1 。 2 ) 灌溉水淹：使线虫窒息而死； 3 ) 深翻日晒土壤：使线虫翻到土面，暴晒可以使部分线虫死亡； 4 ) 种植诱捕植物：某些植物可阻引诱线虫入侵其根部，由于对线虫 具有抗性或缺乏让线虫繁衍的必要物质，从而使线虫无法繁殖等“1 。 1 2 3 抗病育种 应用抗病品种对于防治寄生专化性较强的线虫，效果较明显。抗原多 来自野生或半野生种属，但选育工作比较困难，分离世代长。已有能抗御某 些根结线虫，如起绒草茎线虫( p i t y l e n c h u sd i p s a c i ) 的作物品种“。 1 2 4 物理防治法 1 ) 汰选：通过比较带有线虫的种子与正常种子的大小、形态差异进行 2 天津科技大学硕十学位论文 筛选或根据带有线虫的种子较正常的种予轻，采用盐水漂洗选择未染有线虫 的正常种子。 2 ) 热力处理：通过覆盖透明塑料薄膜加热土壤，灭杀大附作物内含有 的线虫；园艺卜多用蒸汽或电加热。 1 2 5 化学防治 防治线虫的药剂，称作杀线虫剂，简称杀线剂( n e m a t i c i d e s ) ”。 由于线虫体壁外层为不具有任何细胞结构的角质层，通气性、透水性和化学 离子的渗透性较差，线虫的神经系统又不甚发达，所以很难找到有效的杀线 剂。杀线虫剂的发展历史短，品种少。全世界约有3 0 种，常用的不过1 0 余 种。常见的杀线虫剂有熏蒸剂和触杀性杀线剂两类。熏蒸剂中代表性药品如 溴甲烷，英文名称m e t h y lb r o m i d e ，该药挥发性强，毒性大，处理土壤时通 常采用特别的施药器注射到土壤中，要封闭好；必速灭( 棉隆) 英文商品名 d a z o m e t ，棉隆是中国应用多年的杀虫剂，也可作为杀线剂，此药剧毒。触 杀性杀线剂主要包括氨基甲酸酯类和有机磷酸酯类，代表性药品如呋喃丹， 英文名称：c a r b o f u r a n ，内吸性触杀作用，毒性较大；涕灭威，英文名称 a l d i c a r b ，内吸性触杀作用，毒性较大；杀线威，英文名v y d a t e 等毒性都 较大。其中一部分杀线剂己从市场上淘汰( 有的杀线剂被发现有致畸、致癌 等剧毒作用，被撤销商标停用) 或正在被重新审查，如溴甲烷在一些国家已 被禁用，并且依照国际协定，计划在大多数国家从商售中完全取缔“。1 ； 1 ，3 一二氯丙烯是一种熏蒸剂，已在加利福尼亚上空的大气中被检测出来， 该处是使用杀线剂较多的地区。现有化学杀线虫剂多为剧毒农药，用量大， 成本高，只能用于高价值的作物。如陶氏公司的1 ，2 一二氯丙烯，使用价格 5 0 0 英镑h m 2 ；杜邦公司的杀线威，使用价格5 5 0 英镑h m 2 ；除此之外，有机 合成杀虫剂的广泛使用，带来了严重的3r 问题：r e s i s t a n c e ，r e s i d u e ， r e s u r g e n c e 即抗药性、药物残留、害虫再猖獗。由于化学药物存在环境污染， 人畜中毒、污染地下水源及食品、破坏生态平衡等诸多弊端，化学杀线虫剂 的应用逐步受到限制。 l _ 2 6 生物防治 随着人们环保意识的增强，消除化学农药对人类及环境的危害已成为研 究主题，引起世界的普遍重视，因此对线虫的生物防治研究成为各国线虫 防治研究的重点问题。 i 2 6 1 第一代线虫生防因子的研究 早期的线虫生物防治研究走过一段漫长曲折的道路，从试用诱捕性真 菌，专性寄生真菌和细菌到试用兼性寄生真菌，这些生防菌都必须施入土 前言 壤，对于诱捕性真菌诱捕土壤中活跃的腐生线虫如小杆线虫比较有效，对 于诱捕活动较差的植物寄生线虫效果则不明显；专性寄生菌难以在人工培 养基上生长，存没有寄主时，难以形成群体，应用困难：有些兼性寄生菌 可以侵染人和动物的眼角膜，也影响使用。 1 2 6 1 1 捕食线虫真菌 在线虫的生防研究中，有一类真菌，可以捕食、寄生或定殖于线虫上， 这一类真菌统称食线虫真菌。其中捕食线虫真菌是一类通过营养菌丝经特殊 变态产生的捕食器官捕食线虫的生物“，在自然界是影响线虫数量的主要因 子，捕食器官常见结构如粘性菌丝，粘性分枝，粘性球，收缩环和非收缩环 六种类型；其中粘性菌丝，粘性分枝，粘性球分别是真菌的菌丝表面生有的 粘性物质，形成线、面、网状结构，线虫被粘着后，粘着部位的菌丝细胞膨 大，形成特殊结构的附着孢侵入线虫体腔内，再产生营养菌丝吸收线虫体内 的内含物，最后使线虫解体。收缩环和非收缩环是由菌丝分枝细胞形成的3 个细胞的环，膨大或不膨大，待线虫进入环内时被捕捉卡住，再被菌丝侵入 分解。现已报道的捕食线虫真菌约1 0 0 多种，主要集中在接合菌的捕虫霉目 和半知菌的丝孢菌纲。接合菌捕虫霉目的s t y l o p a g o 属和c y s t o p a g e 属，半 知菌中节孢丛霉属( a r t h ， o b o t r y s ) 和指隔孢属( d a e t y l e l l a ) 等。 1 2 6 i 2 食线虫担子菌 除捕食线虫真菌外，还有以捕食和寄生的方式作用于线虫的食线虫担子 菌( n e m a t o p h a g o u sh a s i d i o m y c e t e s 。) ，食线虫担子菌约2 0 个属如丝霉 属( h y p h o d e r m a ) ，侧耳属( p i e u r o t u s ) 等，除了捕食和寄生的方式作用于 线虫，还能通过固体培养和液体培养产生杀线虫毒素，线虫生防中研究较多 的粗皮侧耳( p o s t r e a t u s ) ，菌丝具有典型的锁状联合，着生毒素球，待线 虫接触时，毒素球破裂，毒素扩散，线虫的活动减弱，菌丝侵入虫体线虫解 体。1 。 目前己经有直接利用菌体的3 种第一代商品线虫的生防制剂问世。法国 c a y r a l ”。成功的用节丛孢霉属( a r t h r o b o t r y sr o b u s t a ) 防治蘑菇生产上的 食真菌线虫( d , t y l e n c h u sm y c o l i p h a g u s ) ，提高产量2 5 以上，并制成商 品制剂r 3 0 0 和r 3 5 0 ，但防治蔬菜上的根结线虫效果不明显。 1 2 6 1 3 内寄生真菌 植物线虫生防因子除食线虫真菌还有内寄生真菌和内寄生细菌”。1 。国 际马铃薯研究所研究淡紫拟青霉( p a e e l l o m y c e sl i l a c i n u s ) 制剂，向菲 律宾的一些农民散发推广。自我国何礼远在1 9 8 9 年从国际马铃薯研究所引 进此菌种，国内对其开展了广泛的研究。淡紫拟青霉是南方根结线虫和马铃 4 天津科技大学硕上学位论文 薯胞囊线虫卯的有效寄生真菌，破环线虫卵的胚胎。张新德在生物防治测定 中证明淡紫拟青霉有较好的防治效果和促进大豆增产的作用1 。王昌家、高 学彪等人陆续对菌料防治大豆胞囊线虫和南方根结线虫的效果进行研究，均 有很好的结果瞳”22 ”3 。淡紫拟青霉现在菲律宾己形成商品“b i o c o n ”“。 除此之外，近年来由日本和美国联合开发的阿维菌素，是一种大环内酯 类杀虫剂，据报道其对根结线虫和短体线虫有较好的防治效果“。”1 。 由于第一代线虫生防因子是活菌剂，受环境影响较大，导致在不同国家 不同土壤中施用的不稳定性和不一致性。 1 2 6 2 第二代线虫生防因子的研究 早在6 0 年代，0 1 t h o f 等在观察食线虫真菌( a r t h r o b o t r y so j i g o 驴 p r o s ) 捕食线虫的过程中，提出了真菌产生杀线虫代谢物质的假说3 0 年 后，s t a d l e r 等证明了这一假说，从真菌代谢产物中得到对腐生线虫 ( c a e n o r h a b d it i s e l e g a n s ) 有活性的物质亚油酸，a n d e r s o n 等进一步证实 其代谢产物o l i g o s p o r o n 和4 ，5 一d i h y d r o o l i 9 0 0 p o r o n 对肠道线虫 ( h a e m o n c h u sc o n t o r t u s ) 有活性。1 9 8 4 年，t h o r n 等发现高等担子菌侧耳 ( p i e u r o u s s p p ) 产生毒素毒杀线虫；1 9 9 2 年，k w o r k 等证实侧耳菌株 产生的毒素为反癸烯二酸。这是从食线虫菌物中分离纯化的第一个杀线虫毒 素“。除侧耳属外，猴头菌属培养物的萃取液脂肪酸混合物，具有杀线虫活 性的，经g c m s 分析，主要组分为亚油酸、油酸和棕榈酸。1 9 9 7 年，m a y e r 和s t e r n e r 等从奥尔类脐菇分离到o m p h a l o t i n ，一种环十二缩肽物质，是有 开发价值的真菌杀线虫活性代谢物。产毒素真菌作为第二代线虫生防因 子，成为目前国内外研究的热门领域。 1 2 6 2 1 产毒素菌物及其代谢物 产毒菌物主要分布在担子菌( b a s i d i o n y c o t a ) 、子囊菌( a s c o n y c o t a ) 、 半知菌( i n c e f g a e s 以s ) 等“。 关于担子菌粗皮侧耳属的杀虫活性物质，国内外均有报道。s t a d l e r 等以 腐生线虫( ce l e g a n s ) 为供试线虫，检测出担子菌的侧耳属和猴头菌属有 活性菌株，其液体发酵抽提物对线虫有毒杀作用，随后t h o r n ，k w o k 等人陆 续发现高等担子菌侧耳产生毒素毒杀线虫，毒素为反癸烯二酸，并从其液体 抽提物中分离到6 种化合物都能毒杀腐生线虫( e l e g a n s ) 。珊瑚状猴头菌 属培养物的萃取液为具有杀线虫活性的脂肪酸混合物，经g c m s 分析，主要 组分为亚油酸、油酸和棕榈酸“。在国内，向红琼等人研究报道粗皮侧耳 ( p o u r o t u so s t r e a t u s ) 是一类高效杀线虫真菌，分离出野生型z 。其菌 丝分泌杀虫毒素，对其杀线虫活性物质和作用机理进行了研究报道。 1 前言 德国人a n k e 等人对子囊菌的研究作了大量的工作，检测2 6 7 株子囊菌的 发酵液抽提物，分离到部分杀线谱很广的代谢物如倍半萜化合物 d e r m a t o l a c t o n e 和5 - p e n t y 卜2f u r a l d e h y d e 等。 a n k e 还对半知菌纲寡孢节丛孢( a r t h r o b o t r y so l i g o s p o r o n ) 的发酵 液进行了分析，得到个杀线虫c e l e g a n s 的化合物亚油酸。此外，有人报 道腐皮镰孢( p u s a r i u z 口s o a n i ) 、( f t u c i d u m ) 代谢物环缩肽环孢菌素对南 方根结线虫有较强毒性”“。 1 2 6 2 2 杀线虫化合物的种类 至今已从5 0 多株菌中分离发现9 0 余种杀线虫真菌代谢物，其结构类型 多样，主要有醌类、生物碱类、萜类、肽类、吡喃类、呋喃类、脂肪酸类、 萘类等。 此外，还有从植物体内筛选的有杀线虫活性的这些天然化合物类别有生 物碱、苯酚、倍半萜、双萜、聚乙烯和噻吩衍生物，例如，a 一三噻吩是一种 高效杀线虫化合物，现己从万寿菊中分离得到。从植物中，尤其是精油中提 取的挥发性化合物，多数含有抗微生物和杀虫活性。最近的一项研究评价了 从2 5 种辛香料和香料植物中提取出来的精油对番茄爪哇根结线虫的杀线虫效 果。非洲山毛豆的杀虫活性成分也有多人进行研究，从该植物种子中分离 出鱼藤酮类化合物有杀虫活性。 1 2 6 3 开发杀线虫剂的筛选方法 根据杀线虫剂的作用方式和机理，设立不同的室内初筛方法。 1 、触杀法：被试线虫放入己配置好的药液中，经2 4 h ，4 8 h 或一定时间的处 理后，在显微镜下检查线虫死活的情况，计算毒力。 2 、土壤淋浴法：是从英文s o i ld r e a c bt e s t 翻译而来，国外利用这种方法 测定化合物杀线虫活性，是一种兼触杀和内吸活性测定的方法。基本程序如 下：受试植物种植在小钵内，待幼苗长3 - 5 e m 高，用配置好的药液淋土，第 2 d 接种2 龄幼虫，每小钵约5 0 0 头。待空白对照根部感病症状明显( 约2 0 d 左右) 后进行调查，目测感病程度，确定药效。 3 、叶面喷雾法( f o l i a rs p r a yt e s t ) ，是一种测定药物是否具下导性的方法。 基本程序与方法与( 2 ) 相似，仅喷药4 d 后接线虫。 4 、熏蒸法，测定具熏蒸作用的药物方法，药物和线虫放于封口的容器内，处 理2 4 h 或4 8 h 观察病块组织中线虫死活情况。 1 2 6 4 当前线虫生防存在的主要问题 从国内外的研究趋势来看，线虫防治的发展趋势是试图利用真菌、细菌 等微生物资源开发生物药剂代替化学药剂，以化学控制向生物防治转移来达 天津科技人学硕+ 学位论文 到治理线虫、保护环境的目的。在开发线虫的生防制剂方面，从第一代活菌 剂产品向着线虫生防的第二代产品一微生物次级代谢物中寻找杀线虫活 性物质转变。 1 ) 第一代线虫生防因予中研究最多的有捕食线虫真菌、内寄生真菌等， 作为第一代线虫生防制剂的活菌剂存在着受环境因素影响大、稳定性较差、 货架期短等问题，使得其离人规模生产和应用还有很大距离； 2 ) 目前，国际上十分重视真菌的次生代谢产物的研究，将其视为第二 代线虫生防因子，但有关线虫生防的第二代产品的开发多停留于实验室研究 阶段。已发现的真菌毒素大多为腊溶性，水中溶解度较差，给实际应用带来 困难，还需添加无机化学药品，有机酸、氨基酸等增效剂助溶。 3 ) 现在对防治线虫病害生物农药的市场需求量很大，但却缺少合适的 生防制剂，已开发成产品的廖廖无几，阿维菌素抗生素杀虫剂是目前我国主 要的生物农药，一些地方也用于蔬菜线虫的生物防治，但远不能满足需要， 在这方面存在很大空白。 因此，目前急需筛选高效广谱杀线虫活性物质产生菌以及其生产方法， 以便开发新型实用制剂，这将是一件十分迫切和重要的工作。 1 3 本论文的立项背景 本课题利用从土壤中筛选出的总状共头霉s r ( s y n c e p h a l a s t r u m r a c e m o s u m ) 产生杀线虫活性代谢物，对其发酵工艺进行优化以及杀线虫活 性物质进行初步分离技术，为开发新一代防治病虫害效果高，对人畜安全无 毒，不污染环境，无残留，保持生态平衡的杀线虫制剂以及工业化生产奠定 基础。 1 3 1 丝状真菌s r 菌种简介 丝状真菌s r ( s y n c e p h a a s t r u mr a c e m o s u m ) 属于接合菌门，共头霉科 s y n c e p h a a s t r a o e a e ，共头霉科共头霉属s y m c e p h a l a s t r u n ，总状共头霉 隰f a c e m o s u m ) 。s r 是土壤和粪便中常见的习居菌，分布遍及全球。“”。 总状共头霉mt a c e m o s u 协) 菌落灰黑色棉絮状，气生菌丝发达，扩展迅 速无假根。菌丝体向四周蔓延，分枝甚密，孢囊梗直立或倒伏的匍匐菌丝状， 上面还可以长出许多不定假根，基部无假根，无规则的分枝，每个分支的顶 端都有膨大的泡囊，柱状孢子囊，无囊轴，从泡囊上放射状生出，用低倍显 微镜观察类似曲霉的分生孢子头。孢囊孢子成串生于孢子囊内，扫描电镜观 察孢囊孢子黑色球形，壁有空，中央双凹陷，并具一短柄，形状类似扁荸荠 状，串状排列于柱状孢子囊内”“。 1 3 2s r 菌及其代谢物的研究情况 关于利用s r 菌进行线虫生防方面的研究在1 9 9 7 年，国内外只有本论文 的合作者本课题组报道过“。3 “，对s r 菌株代谢物杀线虫活性成份的研究尚 属首创。 曾有人2 0 0 1 年报道有些真菌可以作为抑制孢囊线虫的有效生防制剂。“1 ， 印度的喀拉啦省，香焦病株的根部发现的线虫孢囊被真菌侵染，从巾分离到 1 1 种真菌可以抑制孢囊线虫h e t e r o b e r ao r y z i c o l a ，其中包括s r 菌株。 2 0 0 3 年，r v s a m o r i m 。“”等人报道将m u c o r a j e a n 属的九株菌分别接 种于y p d 液体培养基，2 8 。c ，1 5 0 r m jr l 培养1 2 0 h ，从菌丝中提取到脱乙酰壳 多糖，其中s r 的产量最高。 关于s r 菌代谢物的研究报道较少，只有台湾h e n g c h i e nt t o ”。等人曾 报道，对s r 菌的d n a s e 和r n a s e 进行分离纯化研究，之后h e n g c h i e ni i o 等人又对s r 菌代谢物粗提物进行柱层析分离得到m r 3 8 0 0 0 的天冬氨蛋白酶， 可以断开牛血清白蛋白、r n a s e 的肽键。 1 4 课题研究的主要内容 本课题对活性菌株s r ( s y n c e p h a l a s t r u mf a c e m o s u m ) 发酵代谢产物的 杀线虫活性进行研究。本实验以危害大，分布广的松材线虫为供试线虫，在 对代谢物中杀线虫活性成分进行初步分离的基础上，对活性物质发酵工艺放 大条件及分离提取工艺进行研究。该项目涉及微生物学、发酵工程、生化工 程、病虫害生防、生物工程下游技术、代谢调控和农业植保等多学科领域。 i 4 1 研究内容包括： ( 1 ) 最佳发酵工艺及其放大条件的研究： ( i 1 ) 最佳培养基组分的确定； ( i 2 ) 发酵参数的确定：如：培养基初始p h ，接种量，摇瓶转速，培养时 间等； ( 1 3 ) 确定5 0 0 m l 摇瓶至5 l 发酵罐放大的工艺条件； ( 2 ) 培养液中活性物质的分离纯化方法的建立，以及提取工艺的确定； ( 2 1 ) 菌体分离工艺的研究； ( 2 2 ) 有机酸分离、分析方法的建立； ( 2 3 ) 利用薄膜蒸发及柱层析，对活性物质进行浓缩、分离，利用薄层 层析、高效液相、气质连用等仪器分析，确定其有效活性成分。 天津科技大学硕士学位论文 1 4 2 采取的研究技术路线 出发菌株：s r 菌株 + 发酵放大：i ：艺( 5 0 0 m l 摇瓶5 l 发酵罐) 过滤弃去菌体 i + 发酵液纸层析、薄层层析、h p l c 等方法 分离分析有机酸活性成分 浓缩( 薄膜蒸发) 粗分离 固体 ( 重结晶等方法 分离纯化，结构鉴定) 浓缩液 纸层析、柱层析、薄层层析分离分析 其他活性成分 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 ( 1 ) 活性物质产生菌 总状共头霉s r 菌( s y n c e p h a j a s t r u mr d c e m o s u m ) 由天滓师范大学 提供。 ( 2 ) 培养线虫所用菌 灰葡萄孢霉b c 菌( b at r y t i sc i n e r e a ) 由天津师范大学提供。 2 1 2 供试线虫 松材线虫( b u r s a p h e l e n c h u s x y l o p h i j u s ) ，中国林科院森保所提供。 2 1 3 主要培养基 ( 1 ) 斜面培养基( g l ) p s m 培养基：去皮马铃薯3 0 0 煮汁，蔗糖2 0 ，麦芽精2 ，琼脂2 0 ，p h 自然。0 1 m p a 灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 发酵基础培养基( g l ) p s m 培养基：去皮马铃薯3 0 0 煮汁，蔗糖2 0 ，麦芽精2 ，p i t 自然。0 1 m p a 灭菌2 0 m i n 。 ( 3 ) 发酵培养基( g l ) p s 培养基：去皮马铃薯2 0 0 煮汁，蔗糖2 0 ，p h 自然，0 1 m p a 灭菌 2 0 m i n ； ( 4 ) b c 菌和线虫培养基( g l ) c z a p e k d o xa g a r 培养基：蒸馏水1 0 0 0 m l ，n a n 0 32 ，k 。h p 吼1 ， m g s o t 。7 h 2 00 5 ，k c l0 5 ，f e s 0 4 7 h 。0 0 0 1 ，琼脂1 5 ，葡萄糖3 6 ； 2 1 4 主要药品 名称产地 马铃薯市售 蔗糖天津市化学试剂厂 麦芽精上海生生物工程有限公司 葡萄糖天津市化学试剂一厂 可溶性淀粉天津市化学试剂批发部 土豆淀粉 天津市化学试剂批发部 甘油 天津市化学试剂批发公司 乳糖上海试剂二厂 大豆蛋白胨 北京海淀区微生物培养基制品厂 天津科技大学硕士学位论文 普通蛋白胨 牛肉膏 玉米浆 硫酸铵 酵母膏 氯化铵 氯化钠 硝酸钠 k 。h p o d k c l f e s 0 4 7 i i 2 0 m g s o d 7 h 2 0 麦仁 h c l n a o h c u s 0 4 5 h 2 0 酒石酸钾钠 亚铁氰化钾 无水乙醇 9 5 乙醇 乙醚 甲酸 正丁醇 浓氨水 甲醇 磷酸 草酸 s e p h a d e xg 一2 5 茚三酮 溴甲酚绿 次甲基兰 琼脂 纤维素薄板 微晶纤维素 硅胶g f 2 5 4 浙江玉环红星生化制品厂 天津市珠江卫生材料厂 华北制药厂 天大化工实验厂 上海酵母厂 天大化工实验_ 厂 天津塘沽化学试剂厂 天大化工实验厂 天津市化学试剂六厂 天津塘沽化学试剂厂 西安化学试剂厂 天津市化学试一厂 市售 天津化学试剂三厂 天津市河北红星化工包装厂 天津信达公司 天津市佳兴化工玻璃仪器公司 天津市化学试剂二厂 天津市化学试剂二厂 天津市化学试剂二厂 天津市津东天正精细化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市四通化工厂 天津市文达试剂化工厂 天津市天大化工实验厂 天津化学试剂部 天津市四通化工厂 德国进口分装 天津市化学试剂一厂 上海新中化学厂 天津市化学试剂一厂 天津市珠江卫生材料厂 德国 上海化学试剂公司 上海化学试剂采购供应站 2 1 5 主要仪器 仪器名称 产地 5 1 自动发酵罐 超净工作台 回转式恒温调速摇瓶柜 l d 5 1 0 型离心机 t g i ，一1 6 b 高速台式离心机 电热恒温培养箱 d f 6 8 0 1 型电热鼓风机j h k c b 一3 型恒控磁力搅拌机 c r i b 型普通光学显微镜 电子分析天平 d h 计 g l 2 0 a 型高速冷冻离心机 y x q g 0 2 型电热式蒸气消毒器 银州牌立式压力蒸气消毒器 高效液相色谱分析仪 微量进样器 超纯水器 微波炉 恒温鼓风干燥烘箱 显微镜 真空泵 低速离心机 三角瓶 x m t b 恒温水浴锅 旋转薄膜蒸发仪 d w 一3 冷冻干燥机 气相色谱仪 m c 一7 5 6 紫外可见光分光光度仪 o l y m p u sb h 一2 k y k y - a m r a yl0 0 0 b 扫描电镜 德国b b r a u n 苏州净化设备厂 上海新星自动化控制设备成套厂 北京医用离心机j 。 上海安亭科学仪器厂 天津市实验仪器厂 湖北省黄石市医疗器械 温州市医疗电器厂 日本o l y m p u s 日本a n d 梅特勒一托利多仪器( 上海) 公司 湖南湘仪 山东新华医疗器械厂 铁岭市医疗器械总厂 德国b i o t r o n i k 北京青云航空仪表有限公司 北京普析通用仪器有限责任公司 格兰仕 天津市实验器材厂 日本o l y m p u s 郑州长城科工贸有限公司 北京医用离心机厂 北京玻璃仪器厂 天津中环试验电路有限公司 德国 德国 岛津 上海第三分析仪器厂 日本 中科院科仪厂 2 1 6 主要溶液 1 ) h p l c 流动相 去离子水，高氯酸调节p h 为2 5 天津科技人学硕士学位论文 2 ) 0 1 5m o l ln a c l 溶液：称取8 7 8 9n a t 溶解于1 0 0 0 m l 水中。 3 ) l m o l 1 n a o h 溶液：称取4 o gn a o h 定溶在l o o m l 水中。 2 2 实验方法 2 2 1 抗线虫活性物质发酵滤液的制备及活性检测 2 2 1 1 抗线虫活性物质发酵滤液的制备 ( 1 ) 丝状真菌s r 菌种活化培养： 将安瓿管中保藏的菌种接入斜面培养基，2 6 。c 静置培养6 d 一7 d 。 ( 2 ) 丝状真菌s r 菌摇瓶培养： 取新鲜的s r 菌斜面，加入无菌水洗下孢子，制备成1 1 0 6 个m l 的孢 子悬液，以2 接种量接于l o o m l 液体发酵培养基中，2 6 。c ，1 7 0 r m i n 同转式 振荡培养4 d 。 ( 3 ) 一级种子静置培养 将s r 菌孢子悬液以2 的接种量接入装液量为7 0 m l 的5 0 0 m l 的三角瓶， 2 6 ，静置培养，2 1 h 一2 4 h 。 ( 4 ) 5 l 发酵罐放大培养： 一级种子静置培养2 4 h ，按接种量4 接入装有3 5 l 发酵培养基的5 l 自 动罐中，起始通气量1 ：0 5 ，搅拌转速3 0 0r m i n 一4 0 0 r m i n ，发酵5 4 h 左 右。 ( 5 ) 抗线虫活性物质发酵滤液的制备 将培养好的发酵液真空抽滤，除去菌体收集滤液，用孔径0 2 2 um 滤膜