（遗传学专业论文）果蝇基因ecp的生物信息学分析及其转基因模型的建立.pdf

中文摘要 中文摘要 论文题目：果蝇基因e 印的生物信息学分析及其转基因模型的建立 研究生姓名：罗卓娟 导师姓名：谢维( 教授) 学校名称：东南大学 8 印是本实验室从野牛黑腹果蝇( d m p 自妇娩切? d g ，p ，) 中克隆的一个未知功能的 新基因，c d n a 全长1 5 7 2 b p ，含有个1 2 6 9 b p 的开放阅读框，编码4 2 2 个氨基酸。生物信息 学分析表明e c p 在真核生物进化过程中非常保守，一致性超过5 0 ，这类蛋白质n 端均含有 一个类似亮氨酸拉链的结构域，c 端含有一个e i f 一5 c 结构域，但与目前己知的所有翻译起 始因子相似性较低，属于一个新的蛋白家族。用h e k 2 9 3 细胞和h e l a 细胞进行瞬时转染 p e g f p e c p 的定位分析显示：e c p 主要定位在胞质中，其分布与细胞分裂无明显关系。胚胎 抗体染色结果也显示e c p 主要存在于胞浆中，原位杂交结果显示e c p 在果蝇胚胎发育的整 个阶段都持续广泛的高表达，因而e c p 在果蝇中直接参与转录调控以及细胞周期的可能性 较小，主要在胞浆中发挥功能。为了阐明e c p 的功能，我们构建了转基因果蝇模型，通过 u a s g a l 4 系统在特定的组织过表达或抑制e c p 来观察果蝇的表型。目前的结果表明，在果 蝇的整体水平过量表达e c p 没有引起明显的表型缺陷；而当e c p 在果蝇体内表达水平降低 后可以导致在蛹期之前死亡，p 因子插入突变的果蝇( 1 1 5 8 1 ) 出现隐性致死、生长缓慢等 翻译相关基因表达下调后出现的表型。我们的实验结果间接提示e c p 在果蝇中可能参与了 蛋白质的翻译。 关键词e c p ：果蝇模型；过表达；r n a i 英文摘要 a b s t r a c t t h e s i st 1 1 、l e ：b i o i n f 0 r m a t i c a n a l y s e so fd n 叫池g e n eg 印 a n dg e n e f a “z a t i o no f n a n s g e n i cf l ym o d e l g r a d u a t es t u d e n tn a m e ：l u oz h u o j u a n s u p e r v i s o rn a m e ：x i ew e i ( p r o f e s s o r ) s c h o o ln a m e ：s o u t h e a s tu n i v e r s i t y an o v e lg e n e ，d e s i g n a t e da sp 印( e i f 5 c - c o n t a i n i n gp m t e i n ) ，w a sc l o n e df r o md m s 叩厶妇 出肠 o g 哪耙，i no u rl a b b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i si n d i c a t e st h a tp 印c o n t a i n sab a s i cl e u c i n ez i p p e r d o m a i na ti t sn - t e r m i n a l ，e i f 5 cd o m a i na n dag t p ，a t pb i n d i n gr e g i o na ti t sc - t e r m i n a l a i t h o u g he c pc o n t a i n sa ne i f 5 cd o m a i n ，t h i sd o m a i ni sn o th i g h l yc o n s e r v e dt ot h ee i f 5 c d o m a j nj no t h e rt r a n s j a t j o ni n i t j a t j o nf a c t o r s 1 n l e 掣a t j n gt h es t u d yo fe c ph o m o l o g yg e 九e ，w e d e d u c e dt h a tt h e ym a y b eb e l o n gt oan e wp r o t e i nf a m i l ya n dp i a y e dr o l ei np r o t e i ns y n t h e s i so r c e l lc y c l e a n a l y s i sa b o u th e i ac e l l sa n dh e k 2 9 3t m n s f 色c t e dw i t lp e g f p e c ps h o w e dt h a te c p w a sm a i n i yl o c a l i z e di nc ”o s o la n di t sd i s t r i b u t i o nh a dn oo b v i o u sr e l a t i o n s h i pw i t hc e l ld i v i s i o n f u r t h e r m o r e ， w h o l e m o u n te m b r y o i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dr n ai n s i t u h y b r i d i z a t i o n i n d i c a t e dt h a te c pw a sc o n t i n u o u s l ya n dh i 曲l ye x p r e s s e dd u r i n gt h ep h a s eo fe m b r y oa n d m a i n l yl o c a l i z e di nc y t o s o lt o o s oah y p o t h e s i sc o m e st ou st h a t t h e p o s s i b i l i t yo fe c p p a r t i c i a i o ni nt r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o no rc e l lc y c j ei s 它a ka n dp o t e n t i a 】f h n c c i o n so fe c pa r e m a i n l ye x i s t e di nc y t o s 0 1 t oe l u c i d a t et h ef u n c t i o no fe cp ，w eg e n e r a t e dt r a n s g e n i cf i ym o d e l s t oa n a l y z et h e 血n c t i o no fe c p tm u t a n ta n a l y s i sw j t he c p r n a in i e sa n dp - e l e m e m ti n s e r t i o n f l i e ss h o w e dt h a td e c r e a s eo fe c pm a d et h ef l i e sr e c e s s i v el e t h a lb e f b r et h ep h a s eo fp u p aa n d r e s u l t i n gi ns l o wg r o w t h ，a c c o r d i n gw i t ht h ep h e n o t y p eo fd e f e c t i v ei nr i b o s o m a lp r o t e i n s o a n a i y s e sa b o v e dm a yp r 0 v i d eu sac l u et h a te c pm a yn o tb eat r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o nf 如t o rb u t af a c t o rr e i a t e dt op r o t e i nt r a l l s l a t i o na n dt h a ts o m en e w 如n c t i o n so fe c pw e r ed e r i v e df r o mi o n g d h a s eo f e v o i u t i o n k e yw o r d s ：e c p ；f l ym o d e l s ；e c t o p i ce x p r e s s i o n ；r n a i l i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 研究生躲萼鏖尘b 期：地 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复 印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和 纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布 ( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办 理。 研究生签名：嗲著士旨导师签名：谢赃 日期：心易多山 刖舌 刖茜 蛋白质是生命活动的功能执行体，蛋白质的翻译是细胞内最关键最复杂的生命活动之 。在真核生物蛋白质翻译过程中，以翻译起始最为复杂，是整个翻译过程中的限速步骤， 需要一系列真核翻译起始因子( e u k a r y o t i ci n i t i a t i o nf a c t o r s ，e i f s ) 的参与。因蛋白 质翻译起始因子异常导致的细胞恶性增生形成肿瘤日益受到重视。对新克隆出的人e i i 、1 的 研究表明，该基因表达减低与原发性肝细胞肝癌( h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ，l l c c ) 的发 生发展密切相关，可作为早期诊断的指标之一。e i f 4 e 的表达与乳腺癌、头颈部肿瘤的发 生、预后有关。e i f 5 作为翻译起始因子复合体的组织，与众多翻译起始因子直接或间接 作用，它的变化将会影响机体蛋白质翻译，产生病理改变。 我们实验室用编码e i f 5 c 结构域的核酸探针从野生型黑腹果蝇( 伢o s o p 如 m p a n 口船s t e 一胚胎c d n a 文库中筛选得到一个新的未知功能基因，命名为8 叩 ( e i f 5 c c o n t a i n i n gp r o t e i n ) ( g e n b a n k 登陆号：a f 3 2 5 5 2 9 ) 。该基因c d n a 全长1 5 7 2 b p ， 含有一个1 2 6 9 b p 的开放阅读框，编码的蛋白质含4 2 2 个氨基酸。 j o s hd u b n a u 等通过d n a 芯片与p 转座子突变手段，发现e c p 突变体表现为长期记忆 缺陷，据此作者认为e c p 可能与果蝇的长期记忆有关；l e e 等人认为e c p 是个进化上相 当保守的细胞骨架相关蛋白，参与神经元细胞的命运决定。但就在分子水平e c p 是如何参 与果蝇整体的发育尚未见报道。 生物信息学分析得出e c p 及其同源蛋白可能构成一个功能重要、物种间保守的新蛋白 家族，但是目前仍无有关这一家族成员在生物体内的表达及定位情况以及其确切功能尚无 具体报道。果蝇作为一个良好的模式生物，具有生长周期短、子代多、染色体数少、有很 多可以利用的遗传学工具等优势，并且其全基因组测序已完成。因此我们通过转基因果蝇 的建立以及分子生物学技术等在整体动物及细胞水平对果蝇基因日印进行分析，为研究其 整个蛋白家族的功能、表达调控以及对发育的影响等机制提供了条件基础和技术手段。 东南大学硕士学位论文 真核生物翻译起始研究进展 摘要蛋白质的合成是细胞内最重要最复杂的生命活动之一，是一个多翻译元件参与， 多步骤的过程，能够被分成起始、延伸、终止三个步骤。在蛋白质合成过程中，翻译起始 最为复杂，是整个翻译过程中的限速步骤。本文就蛋白质翻译起始复合体的形成、翻译起 始阶段的调控、翻译起始因子以及其表达水平改变引起的肿瘤等几个方面对翻译起始的过 程进行简单介绍。 关键词真核生物翻译起始因子( e i f s ) 起始复合体 基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能火部分以蛋白质形式得 以表达。同时，细胞的生长与增殖速率主要取决与蛋白质合成的速率。正常细胞能够对外 界的刺激做出迅速而适当的反应也是主要依靠蛋白质的迅速合成。而对于任何一种蛋白质， 其合成速率都是取决与翻译起始的速率i l j 。 。蛋白质生物合成概述 蛋白质合成的过程，简单地说就是遗传信息从m r n a 一蛋白质的翻译的过程，是分子生 物学的中心法则( c e n t r a ld o g m a ) ( 图1 ) 中一个主要组成部分。蛋白质是由2 0 余种不同 的氨基酸组成的多肽链或多肽链的聚合体，每种蛋白质都有特定的氨基酸序列。翻译的过 程就是m r n a 携带着转录的遗传信息附着在蛋白质合成的场所核糖体上，核糖体沿着 m r n a 这一模板，不断向前迅速合成肽链，并屉终折叠成为立体蛋白质分予。整个蛋白质翻 译过程非常复杂，需有大量的蛋白质与r n a 参与。 j 、矗 l “t i “ 差赣囊桑零糯甏鹩墨器摇盟 图1 中心法则 f i g 1c e n t r a ld o g m a 1 1 蛋白质合成的场所核糖体 一个细菌细胞内约有2 0 0 0 0 个核糖体，而真核细胞内可达1 0 6 个，在未成熟的蟾蜍 卵细胞内则高达1 0 1 2 。核糖体( r i b o s o m e ) 的基本结构是保守的，可分为大亚基( 图2 ) 2 和小亚基两部分，在蛋白质合成的间隙，它们均以分散的形式存在于细胞质中，而只有在 蛋白质合成过程中，才装配成完整的核糖体。核糖体包括至少5 个活性中心，即m r n a 结合 部位、结合或接受a a t r n a 部位( a 位) 、结合或接受肽基t r n a 的部位、肽基转移部位( p 文献综述真核生物翻译起始研究进展 位) 及形成肽键的部位( 转肽酶中心) ，此外还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。 小亚基上拥有m r n a 结合位点，负责对序列特异的识别过程，如起始位点的识别和密码子与 反密码子的相互作用。大亚基负责氨基酸及t r n a 携带的功能，如肽键的形成、从一t r n a 、 肽基一t r n a 的结合等( a 位、p 位、转肽酶中心等主要在大亚基上) 口j 。每一个亚基都含有 主要的r r n a 成分和很多不同的蛋白质分子，被形容为一个由蛋白质包围着r n a 的球体。 r r n a s 的主要功能是结构以及催化。核糖体蛋白和每种主要r r n a 的特殊位点相结合，以特 定的顺序装配成皿基。有的催化功能需要个别蛋白。但还没有一种活性能由于蛋白质的分 离或一组蛋白的分离而减少。目前也并没有证据表明核糖体蛋白直接地涉及任何催化的功 能。 图2 大亚基的原子结构 f i g 2a t o m i cs t r u c t u r eo ft h el a r g er i b o s o m a ls u b u n i t ( p o u ln i s s e n ，e ta 1 2 0 0 0 s c i e n c e ) 对于细菌和真核细胞来说，核糖体的大小及核糖体中r n a 及蛋白质的比例都有很大的 不同。在ec d j 中，小亚基( 3 0 s ) 由1 6 sr n a 和2 1 种蛋白质构成，大亚基( 5 0 s ) 由2 3 sr r n a ， 小5 sr r n a 和3 1 种蛋白质构成。除其中一种蛋白质在每个核糖体中有四个拷贝外，其余 的蛋白质都是每个核糖体一个拷贝。真核生物的核糖体比细菌的大。它的r n a 及蛋白质的 总量都比细菌的多；r n a 分子的长度更长( 称为1 8 sr r n a 和2 8 sr r n a ) ，蛋白质的量更多。 细胞器核糖体在某些情况下同细菌核糖体大小相似：在另外一些情况下，它们只有6 0 s ， 含有小于3 0 的r n a l 耳j 。 细菌中的转录与翻译是偶联的，核糖体是附着在m r n a 上，d n a 一边转录成m r n a ，核糖体 就一边结合上去，沿着57 3 方向进行翻译。而在真核的胞浆中核糖体总是和细胞骨架 或粗面内质网的膜相结合。其共同特点是核糖体在细胞中从事翻译时并不是游离的，总是 直接或间接地和细胞结构相连接。 1 2 蛋白质合成的过程起始延伸终止 蛋白质合成分为三步：起始( i n i t i a t i o n ) 包括蛋白质起始的两个氨基酸之间形成肽键 之前的反应。这需要核糖体小亚基与m r n a 结合，形成起始复合物，其中含有第一个氨酰 东南大学硕士学位论文 一t r n a 。这在蛋白质合成中是相对较慢的，通常是翻译的限速步骤。延伸( e l o n g a t i o n ) 包括 从第一个肽键形成到最后一个氨基酸掺入过程中所有的反应。氨基酸的掺入非常迅速，是 蛋白质合成中最快的步骤。在蛋白质合成的每次循环反应中都有两个t r n a 被活化；所以肽 链的延伸只涉及到核糖体覆盖的十个碱基中其中两个反应。m r n a 含有一系列密码予 ( c o d o n s ) ，这些密码子与氨酰t r n a 的反密码子( a n t i c o d o n ) 相互作用，使相应的氨基酸掺 入到肽链中，随后t r n a 再从另外的位置被排出核糖体，延伸因子不断地和核糖体结合和解 离。终止( t e r m i n a t i o n ) 包括释放完整的多肽链及核糖体与m r n a 分离。其中，起始、延伸、 终止每一步都需要不同的辅助因予参与，能量由g t p 水解提供【5 】。 1 3 d n a 指导的蛋白质合成 在2 0 世纪6 0 年代的中期，m c c a r t h y 和1 1 0 1 l a n d 发现在他们的试验体系中加入抗牛素 等条件f ，变性的单链d n a 在离体情况下可以直接与核糖体结合，指导合成蛋白质。但这 种d n a 控制的蛋白质合成是否在活细胞体内也存在，至今仍不清楚。 二真核生物蛋白质翻译起始 真核细胞蛋白质翻译起始远比原核细胞的复杂。4 0 s 核糖体小亚基通过对m r n a 序列结 构的识别首先与m r n a 结合，在到达正确的翻译起始密码子后与6 0 s 核糖体大亚基一起形成 有活性的8 0 s 核糖体复合物，起始蛋白质的翻译怕j 。蛋白质翻译速率影响到细胞整个的代谢 速率与生存状态，而在翻译过程中翻译起始是一个非常重要的步骤。 2 1 翻译起始复合体的形成 真核翻译起始需要一系列真核翻译起始因子( e u k a r y o t i ci n i t i a t i o nf a c t or s ，e i f s ) 的参 与。简单地说，首先是e i f 2 ，g t p 以及m e t _ t r n a i 三联复合体的形成，而4 0 s 小亚基与最大的 多亚基的e i f 3 相结合。三联复合体与4 0 s c i f 3 通过e i f l e i f l a 形成一个4 3 s 的复合体。此时， e i f 3 能够结合e i f 4 f 复合体以及m r n a 形成一个4 8 s 的起始复合体。e i f 4 f 是由e i f 4 g ， e i f 4 e 和e i f 4 a 组成的，e i f 4 g 先结合到e i f 3 上，为e i f 4 e 和e i f 4 a 提供一个支架的作用。 e i f 4 e 能够识别并与5 m r n al 喝结构相结合。而e i f 4 a 是一个r n a 依赖性的a t p 酶和5 非 翻译区的二级结构解螺旋有关。e i f 4 b 能够增强e i f 4 a 解螺旋酶活性加速r n a 结合。4 8 s 的 起始复合体此时能够扫描5 帽结构的下游一直到遇到起始密码子a u g 。当m e t t r n a i 遇到 a u g 密码子时，e i f 5 通过e i f 2 和e i f 3 结合到4 8 s 起始复合提上。e i f 2 一g t p 被水解提供能量。 此外e i f 5 b g t p 被6 0 s 大亚基水解提供能量。两个连续的g t p 水解发生导致了e l f 3 的释放， 大小亚基的结合多肽翻译的开始1 7j 。 2 2 蛋白质翻译起始机制 核糖体对m r n a 的识别结合是蛋白质翻译起始的关键步骤，已有的文献报道主要分为两 类，分别是核糖体对m r n a 5 一末端序列结构的识别结合即依赖帽结构的翻译起始 ( c a p d e p e n d e n ti n i t i a t i o n ) 和核糖体对m r n a 内部序列结构的识别结合( i n t e r n a l i n i t i a t i o n ) j 。具有帽结构的m r n a 通常采用依赖帽结构扫描的机制来进行翻译起始的， 文献综述真核生物翻译起始研究进展 真核生物中大部分m r n a 是以这种方式进行的。在依赖帽结构的翻译起始中，4 0 s 核糖体亚 基与m r n a 5 一末端的识别结合需要e i f 4 f ( e i f 一4 e 、e i f 4 g 和e i f 4 a 组成) 复合物的参与。 该复合体可以帮助4 0 s 核糖体识别m r n a 的5 一端帽结构，同时还需要负责与t r n a m e t ，结 合的e i f 2 和与4 0 s 核糖体亚单位相互作用的e i f 3 的参与。这些因子的参与保证了4 0 s 核 糖体亚基与m r n a 的5 末端帽结构相结合，这种结合方式即是依赖于帽结构的翻泽起始。 而某些m r n a ，如动物病毒的m r n a ，没有帽结构，5 端的非翻译区很长，存在多个翻译 其始位点，结构非常复杂，使得核糖体不能通过扫描机制来起始翻译【9 】。在这种情况下，4 0 s 核糖体亚基通过对m r n a 内部的核糖体结合位点( i n t e r n a lr i b o s o m ee n t e rs i t e ，i r e s ) 序列结构的识别，直接与m r n a 的内部序列结合【1 ”。这种翻译起始与i r e s 上的二级结构直 接相关，而不依赖于m r n a 的57 一末端帽结构，也可被称为是不依赖于帽结构的翻译起始。 有报道表明，这种核糖体与m r n a 的结合可能需要另外一些特殊的真核翻译起始因子的参 与。 2 3 核糖体对翻译起始位点的选择 结合到m r n a 上的核糖体对翻译起始位点的选择，目前为止的研究报道主要可分为两 类。一类主要是由起始t r n a ( m e t t r n a ，) 通过反密码予与m r n a 密码子的碱基配对实现的， 这时翻译由a u g 密码子或a u g 类似的密码子起始。也有报道表明存在一类不依赖于 m e t t r n a ，的翻译起始，理论上这种起始可以发生在任一密码子上。真核细胞的起始t r n a 通 常为m e t t r n a ，因此蛋白质的翻译起始位点的密码子通常为a u g 密码子，编码的第一个氨基 酸为甲硫氨酸。在研究中也发现一些类似a u g 的密码子( 如a c g ，c u g 和g u g 可以作为翻译起 始的密码了，但这些类似a u g 的密码子编码得到的第一个氨基酸并不是相应的苏氨酸，亮氨 酸或缬氨酸，而是甲硫氨酸【”j 1 “。这些可能是类似a u g 密码子与m e t t r n a ，的反密码子通过 碱基的模糊配对来实现。近些年来，也有报道认为，存在于m r n a 上的二级结构可以占据核糖 体的翻译起始p 位点，起到翻译起始t r n a 的作用，使携带者氨基酸的t r n a 可进入核糖体的 a 位点，起始蛋白的翻译【1 ”“j 。这是一种不依赖于m e t t r n a ，的翻译起始，并且翻译的第一 个氨基酸理论上可以是任一个氨基酸。这方面的研究，目前还仅有核糖体从m r n a 的i r e s 进 入并识别翻译起始位点的报道。 s a s a k i 等在2 0 0 0 年报道了一种不依赖甲硫氨酸的翻译起始方式。p s i v 是一种昆虫正 链r n a 病毒，有两个互不重叠的读码框，处于下游的读码框编码病毒的外壳蛋白。该蛋白 由基因组r n a 按核糖体内部进入位点( i r e s ) 介导的方式翻译而得。p s i v 外壳蛋白的基因缺 少a u g 起始密码子。各种缺失实验证明，翻译起始于第一个密码子c 从，翻译起始用的是c a a 编码的谷氨酰胺，而不是通常的甲硫氨酸。这是种全新的翻译起始方式，不同于通常内部 核糖体进入位点介导的蛋白质合成起始方式l l 引。 2 4 蛋白质翻译起始的调控 真核生物翻译起始的调控主要集中在两个重要的步骤：起始复合体的形成以及4 0 s 核 东南大学硕士学位论文 糖体与5 7 m r n a 帽结构的结合。 对于起始复合体形成的调节：蛋白激酶p k r ，h r i 和p e r k 能够磷酸化e i f 2 a 亚基第 51 位上的丝氨酸，这样可以导致它与e r f 2 b g t 只，g d p 交换因子的亲和力升高。通常情 况下，e i f 2 b 能够催化e i f 2 一g t p 的水解形成三元的起始复合体。而磷酸化的e i f 2 a 与e i f 2 b 亲和力增加阻碍了三元复合体的产生，抑制了整个翻译起始过程【l8 】。在细胞凋亡过程中， e 【f 2 a 也是通过被酶解失活，从而阻止了三元起始复合体的形l l 。 对于与m r n a 结合的调节：m r n a 结合到核糖体上是整个翻译起始的限速步骤，因此 也是调节翻译起始速率的关键之处。e i f 4 f 复合体的破坏导致m r n a 不能够结合到核糖体上 因而阻碍了翻译。这种复合体的破坏有可能是因为在凋亡途径中e i f 4 g 被c a s d a s e3 酶解，或 者是与h s p 2 7 相结合形成了不溶体【“，“j 。e i f 4 f 复合体的活性也取决于e i f 4 e 的活性，e i f 4 e 对于前翻译复合体与帽结构的结合是必需的。e i f 4 e 的活性是受其两个结合蛋白4 e b p l 和 4 e b p 2 调控。它们在静止期的细胞中是低磷酸化的能够与e i f 4 g 竞争结合e i f 4 e ，从而影响 到e i f 4 f 复合体的产生。当细胞接受到外界信号如胰岛素，l g f 1 和血管紧张素，以及一些 蛋白激酶的作用如( f r a p ，m a p k i n a s e s ，p k c ，a t ma n dc a s e l n k i n a s e l l ) 4 e b p l 在多个位 点的高度磷酸化【“j 。高度磷酸化的4 e b p l 释放出e i f 4 e ，使其能够参与e i f 4 f 的形成。 2 5 翻译起始时对错误的m r n a 的识别 最近有实验证明翻译起始过程能够对新近合成的有错误的m r n a 进行验证。 在这种机制下被发现的错误的m r n a 在它们能够编码出对细胞生存有障碍的蛋白质之前就 会被迅速降解。翻译起始时核糖体的扫描校对功能主要针对两种错误：终l e 密码子的缺失 以及终止密码予的提前出现。这种起始监督功能与正常的翻译起始有很大的不同，需要一 些不同因子的参与。对于缺少终止密码子的m r n a 的降解需要异三聚体s k i ( s k i 2 p ，s k i 3 p 和 s k i 8 p ) 以及s k i 7 p 的参与【”，“j 。 三蛋白质翻译起始园子 真核生物翻译起始是一个m r n a 、t r n a 和核糖体相互识别和结合的反应，其中涉及至少 1 2 个真核翻译起始因子，2 9 个不同的亚单位( 图3 ) 。主要的真核生物起始因子有：e i f l ，e i f 2 ， e i f 2 b ，e i f 3 ，e i f 4 a ，e i f 5 等( 表1 ) 。 表1 主要真核起始因子的功能( 源于：d e a n p k u e d u c n ) t 幻1f u n c t i o no f m a i ne i f s e i f s 功能 e i f 2 促进m e t t r n a m e t 与核糖体4 0 s 小亚基结合 e i f 3 最早与核糖体4 0 s 小亚基结合的促进因子，蛋白质合成反应的正常进行 e i f 4 a具有r n a 解旋酶活性，解除m r n a 模板的次级结构并使之与4 0 s 小亚基结合，形 成e i f 4 f 复合物 e i f 4 b与m r n a 模板相结合，协助核糖体扫描模板序列，定位a u g 文献综述真核生物翻译起始研究进展 e i f 4 e与m r n a5 。的帽结构相结合，形成e i f 4 f 复合物 e i f 4 g与e i f 4 e 和p o i y ( a ) 结合蛋白( p a b ) 相结合，形成e i f 4 f 复合物 e i f 5 促使多个蛋自因子与4 0 s 小亚基解体，以此帮助大小亚基结合形成8 0 核糖体，形 成翻译起始复合物 e i f 6 促进没有蛋白质合成活性的8 0 s 核糖体解离成4 0 s 和6 0 s 两个亚基 图3 翻译起始中的翻译起始因子 f i g ，3e i f sj 力p r o t e j n1 1 r a n s i a t i o n 3 1 e i f 4 e 与帽结构在翻译起始中的作用 在大多数情况下( 帽结构依赖性翻译) ，蛋白质的合成是以e 【f 4 e 与帽结构的相互识别开 始的。e i f 4 e 具有单一的a b 结构域( 包括8 条不平行的b 链形成的弯曲的b 片层，以及3 条长 的。螺旋) 。m r n a 57 帽结构与e i f 4 e 空间表面凹陷的疏水口袋中两条八个色氨酸组成的保 守残基结合，形成三文治夹心结构。e i f 4 e 背面空问凸起与e i f 4 g 或者与其翻译抑制蛋白( 如 4 e b p l 等) 特异的结合。e i f 4 e 是e i f 4 f 复合体的组成部分，e i f 4 f 还包括e i f 4 g 和e i f 4 a 。帽结 构与e i f 4 e 结合，e i f 4 e 与e i f 4 g 结合，e i f 4 g 又与e i f 3 结合，而e i f 3 可以与4 0 s 小亚基结合，使其 与起始密码子相互识别。e i f 4 a 可以在e i f 4 b 激活下通过a t p 供能解开帽与a u g 之间的一段 发夹结构，使起始密码子能被核糖体结合【25 。e i f 4 e 与帽结构的结合提供了一种稳定的蛋白 质一m r n a 结合的基础，在此基础上组装成有功能的起始复合物此外，有资料显示，通过e i f 4 e 与e l f 4 g 的结合还可以抑制无帽的m r n a 的翻译【z 6 j 。e i f 4 e 在翻译中的关键性作用，使它成 为对基因表达进行调节的极其重要的环节。转录激活因子c m y c 通过与e i f 4 e 基因的启动子 东南大学硕士学位论文 e 咱o x 相互作用，在转录水平调节e i f 4 e 的表达1 2 7 1 ：e i f 4 e 的活性还受到翻译后修饰的调控， 其自身的磷酸化可增强它与帽结构和e i f 4 g 的结合能力，从而加速翻译的进程。在给予细胞 以生长因子、激素、有丝分裂原的刺激下，e i f 4 e 常常在s e r 一2 0 9 处被磷酸化【2 8 1 ：在真核生物 体内还有一些负调节因子能调节e i f 4 e 的活性，如前所述的4 e b p ( 4 e b i n d i n g p r o t e i n ) 家 族。4 e b p 与e i f 4 g 的n 末端区域有相同的氨基酸序列，而这一段序列是e i f 4 g 刊e i f 4 e 的结合 位点，所以4 e b p 成为了e i r 4 g 与e i f 4 e 结合的竞争性抑制物i ”j 。 3 2 e i f 5 在翻译起始中的作用 e i f 5 介导e i f 2 上的g t p 水解，g t p 水解导致核糖体4 0 s 小亚基上e i f 2 、g d p 、磷酸基与其 他翻译起始因子释放，核糖体大小亚基结合，形成8 0 s 起始复合体。 不同物种的e i f 5 都有强酸性富含天冬氨酸和或谷氨酸的区域。e t f 5 与g t p 酶超家族g l g 4 特 征结构域有较低的同源性，但e i f 5 的g l 基序中有一个氨基酸的插入，提示e i f 5 可能无g t p 酶 活性，不直接水解g t p 只是g t p 酶活化蛋白，使e i f 2 或其他翻译起始因子的g t p 酶活性得以 发挥。e i f 5 羧基端3 2 6 至4 1 1 位氨基酸序列为e i f 5 c 结构域，在e i f 2 b 、e i f 4y 等蛋白质因子 中也存在，目前已发现3 6 种蛋白质具有e i f 5 c 结构域广泛分布于酵母、拟南荠、线虫、果蝇、 小鼠、人各种真核生物中。最近，p a u l i n 等【3 0 j 发现e i f 5 具有经典g t p 酶活化蛋白的标记，e i f 5 c 有一高度保守的精氨酸残基，与经典g t p 酶活化蛋白的“精氨酸指”结构域相似，“精氨酸指” 结构域的侧翼有疏水氨基酸残基包绕，e i f 5 这一精氨酸残基的周围也存在许多疏水残基，如 将此精氨酸突变为甲硫氨酸，e j f 5 将不能介导g t p 水解t 也不能在体外支持m r n a 翻译。e i f 5 氨基端的另一精氨酸残基( a 唱4 8 ) 也参与e i f 2 e i f 5 复合体g t p 酶活性位点的形成他们的结 果表明，e i f 5 确实是一种g t p 酶活化蛋白。由于e i f 5 主要作用是介导e i f 2 上的g t p 水解，人们 推测它可能直接与e i f 2 结合，这种结合是它催化g t p 水解的必要条件。继e i f 2 后，人们发现翻 译起始因子e i f 3 也可与e i f 5 结合。b a n d y 叩a d h y a y 等通过免疫亲和层析发现e i f 3 的p 4 2 亚基与 e i f 5 特异性结合，p h a n 等在酵母中也得到相似的结果。 四翻译起始因子与肿瘤的关系 有证据表明翻译起始调节的失常能够导致肿瘤的产生以及恶变。 4 1e i f 2 w a n g 等报道在肿瘤细胞系中e i f 2 有高的表达。除此之外，过量表达e i f 2 a 或者是e i f 2 a 第5 1 位的丝氨酸不能够被磷酸化，都足以导致肿瘤的恶性转化。与正常的b 细胞或是身体受 疾病侵袭时的b 细胞相比，在非h o d g k i n s 淋巴瘤中发现e i f 2 a 与e l f 4 e 的组成性过量表达。与 正常的肠胃组织相比较，e i f 2 a 在胃癌，盲肠癌以及直肠癌中表达量也是增加的【3 1r ”j 。e i f 2 a 激酶的活性下调与e i f 2 a 表达量升高一样能够被发现在上皮卵巢癌中l ”j 。 4 2e i f 3 e i f 3 是真核翻译起始因了中最大的一个，包含1 1 个不同亚基的起始因子，在翻译起始 中起着组织者的作用。其中，有5 个亚基被认为和肿瘤有着密不可分的作用。e i f 3 a ( p 1 5 0 ， 文献综述真棱生物翻译起始研艽进展 d 1 7 0 、是e i f 3 中最大的亚基，在多种肿瘤，如乳腺癌，宫颈癌，食道癌和肺癌当中都有过量 的表达【3 4 ，3 引。e i f 3 b ( p l l 6 ) 的m r n a 表达水平也在乳腺癌中发现有显著上调【3 4 1 。e i f 3 c ( p l l o ) 在精原细胞瘤中也是被转录激活的【j 。n u p p o n e n 等在一次乳腺癌与前列腺癌表达上 调的基因的筛查中发现e i f 3 h ( p 4 0 ) m r n a 水平分别增高了2 0 和3 0 【3 7 】。推测虽然不能被 排除e i f 3 这些亚基具有独立的生物学功能，但是这些亚基的表达上调能够导致e i f 3 的上调。 e i f 4 e 与帽结构结合是翻译起始的限速步骤， 经典的猪瘟病毒( c 】a s s j c a ls w j n e f e v e r v i r u s ， 但是在丙肝病毒( h e p a t i t i scv i r u s ，h c v ) 和 c s f v ) e i f 3 能直接结合l r e s 【38 1 。因此e i f 3 对于胞质中一些非帽结构起始依赖性m r n a 有翻译起始的功能，对这些m r n a 提供一种翻 译优势。有意思的是最近发现e i f 3 e ( p 4 8 ) m r n a 表达水平在乳腺癌以及非小细胞肺癌中分 别有4 0 和3 0 的表达下调。小鼠e i f 3 e 是由i n t 一6 编码的，而f n t 6 是鼠科乳腺肿瘤病毒 ( m o u s em a m m a r yt u m o u rv i r u s ，m m t v ) 的整合位点，因而这个基因的破坏导致了肿瘤的 发生【”j 。也有假设认为e i f 3 们n t 6 是e i f 3 的一个负调节因子，这个弧基可以与干扰素可诱 导的蛋白，p 5 6 相互作用来阻止蛋白质的合成【4 0 j 。因此e i f 3 e 表达水平的降低能够增加e i f 3 的活性对肿瘤的发生或者恶变有潜在的危险。 4 3e i f 4 g e i f 4 g 是一个大的支架蛋白，可以与e i f 3 ，e i f 4 e ，e i f 4 a ，p a b p ，m n k l ，4 0 s 小亚基和 m r n a 相可- 作用。在哺乳动物细胞中存在两种e i f 4 g 蛋白( e i f 4 gi 和e i f 4 g1 1 1 ，它们在翻 译起始过程中都参与e i f 4 f 复合体的形成。过量表达e i f 4 gi 会引起n i h 3 t 3 细胞的恶性转化 并且在f m 3 a 细胞中发生蛋白质过量翻译【4 “。过量的e i f 4 g 也可以结合到m r n ai r e s 位点 上增强一些生长因子以及抗调亡因子的翻译。此外，e i f 4 gm r n a 本身还有i r e s 位点，能 够引起其自身持续的过量表达。d a p 5 m a t l p 9 7 是e i f 4 g 类似蛋白与e i f 4 g 靠近c 端的2 3 相似性极高，但靠近n 端的l 3 完全缺失。因此它能够与e i f 3 和e i f 4 a 相结合，但与e i f 4 e 不 能相互作用。d a p 5 是一个死亡相关蛋白最早是作为细胞调亡的介导因子被分离出来的【2 2 】。 然而，在最近的研究中发现在成神经细胞瘤中过量表达d a p 5 能使肿瘤细胞逃避调亡1 4 “。 4 4e i f 4 e e i f 4 e 参与从“m r n a s 库”中选择某一m r n a 参与起始合体的形成。9 0 m r n a s 的5 u t r s 少于2 0 0 个核苷酸序列并缺乏上游的a u g s ，这类m r n a s 称为“s t r o n gm r n a s ”( 编码管 家蛋白质) 。与之对应的是“w e a k m r n a s ”，它包含长的富含g c 的5 u t r s ，具有起稳定作 用的二级结构和或上游的a u g s ，这类m r n a s 编码癌蛋白、细胞周期调节因子、生长因子和 生长因子受体【4 3 】。在e i f 4 e 低表达时，“s t r o n gm r n a s ”的翻译将很快达到最高值，但“w e a k m r n a s ”不能与有限的e i f 4 e 结合，导致低表达。当e i f 4 e 在较高表达时，“w e a km r n a s ”的 表达也增高，从而使细胞进入周期并分化增殖。进一步增加e i f 4 e ，并不能进一步增加 “s t r o n gm r n a s ”的翻译，但可使“w e a km r n a s ”表达进步增加，使细胞生长加速，并产生 形态上的改变。e i f 4 e 再进一步增加，使控制细胞周期的关键因子不成比例地增加，细胞可能 经历畸形有丝分裂和或凋亡，导致基因不稳定，并导致细胞癌变【4 。e f f 4 e 在正常情况下是 东南人学碘士学位论文 低表达的，过度表达的e i f 4 e 导致具有长57 非编码区的“、v e a km r n a s ”基因产物上调。在 实体肿瘤发展中，恶性组织的增殖需要大量蛋白的合成，e i f 4 e 的表达增高是一个必然的事 件。虽然e i f 4 e 的过度表达，并不能很严密的反映细胞的增殖，但可反映细胞的恶性特征。k e v i l 等相继证实，e i f 4 e 的过度表达引起纤维母细胞生长因子和血管穿透因子翻译增加、在细胞增 殖分化和肿瘤血管形成发展中起重要作用i 4 ”。n a f h a n 在m d a 一4 3 5 细胞株中引入e i f 4 e 反义 r n a 引起肿瘤血管生成的抑制的同时，纤维母细胞生长因子合成也减少【4 。包括全长 e i f 4 e c d n a 的p m v 7 4 e 转染n i h 3 t 3 细胞，在n i h 3