（生物化学与分子生物学专业论文）运用差异显示及基因芯片研究shewanella+spwp3在胁迫条件下的基因表达.pdf

运用差异显示及基因芯片研究深海细菌 s h e w a n e l l a 印w p 3 在不同胁迫条件下的基因转录表达 ， 摘要 深海是一个特殊的生态环境，这里永久低温、高压、黑暗。生活在这些环境 下的极端微生物必然有特殊的生理代谢途径来适应极端环境。对深海微生物的研 究不仅有助于了解生命的起源，而且可以了解各种极端微生物的生活特性，有助 于对深海微生物资源的开发利用。极端条件下的生命和生态现象研究将可能揭示 生命适应逆境、演化自身的能力，为人类健康开辟新的途径。本文所研究的深海 细菌分离自西太平洋1 9 1 4 米的深海沉积物中。菌种鉴定为s h e w a n e l l as p w p 3 ， 它既是耐压菌，又是低温菌，是研究极端微生物适应极端环境的理想材料。本文 用w p 3 作为实验材料，通过模拟不同的外界胁迫条件，期望找到该细菌在这些胁 迫条件下的基因表达变化，从而探索极端微生物适应胁迫条件的一般特征，进而 ! ， 为研究极端微生物的极端环境适应性机理研究奠定基础。 盐度实验表明，w p 3 能在1 一7 n a c i 浓度的2 2 1 6 e 海水培养基中生长， 生长的最适盐度为3 4 。而且菌体在这两种盐度中能达到的菌体浓度相近， 其生长速度大体相当，但这两项指标都小于最适盐度下的w p 3 。我们用1 和7 盐度环境下生长的细菌的r n a 作对照，寻找盐调节的基因的表达情况。检测到 的4 3 个差异基因片段通过克隆、测序。随后的r t p c r 验证有6 个基因存在差异 表达，且四个基因( y 6 ，y 1 5 ，y 2 1 ，y 2 5 ) 在高盐下表达量上升，而y 9 ，y 2 9 则在1 盐浓度下转录增强。这些结果表明，w p 3 的盐度调节可能涉及蛋白质的合成 ( y 6 ：5 0 sr i b o s o m a lp r o t e i nl 2 4 ) ，蛋白质的折叠和运输( y 2 1 ：p e p t i d y l p r o l y l c i s t r a n si s o m e r a s e ，y 2 9 ：c h a p e r o n ep r o t e i nh s c a ) ，谷氨酸盐的生物合成( y 2 5 ： g l u t a m i n es y n t h e t a s e ) ，脂肪酸代谢( yi5 ：p r o b a b l ei s o c i t r a t el y a s e ) ，底物运输( y 9 ： a b c t r a n s p o r t e r ，a t p - b i n d i n gp r o t e i n ) 。另外，分别检测了这6 个基因在盐激( 3 到1 2 n a c i ) 、冷激( 1 5 。c 到0 。c ) 、压力刺激( 0 i m p 到5 0 m p ) 条件下的表 达谱。发现y 2 9 编码的h s a a 基因在我们检测的每个胁迫条件下都有差异表达。 运用同样的差异显示方法扫描w p 3 在热激和冷激条件下特异表达的基因。 在热激3 0 m i n 条件下，共有8 个基因存在差异表达。其中4 个下调，4 个上调。 在冷激3 0 m i n 条件下检测到有6 个基因表达变化( 2 个下调，4 个上调) 。 对已经全基因组测序的w p 3 构建全基因组c d n a 芯片，用g l i m m e r 预测的 编码序列( c d s ) 有4 9 4 5 个，其中c d s 的平均长度为9 2 6 b p ，最长的编码序列 v c b sr e p e a tp r o t e i n 长1 4 ，6 4 3 b p 。j 最短的编码序列为9 0 b p 。编码序列占整个基 因组长度的8 4 4 。在预测的4 9 4 5 个c d s 中，设计出的4 7 4 4 个基因的引物有 4 6 5 0 个基因( 超过9 8 ) 的引物对都能得到预期的特异条带。剩下的扩增效果 不好或者扩增不出条带的基因设计了3 9 条长的o l i g o 探针，每条探针长约7 0 b p ， 保证能特异地跟基因结合。基因芯片上的o r f 的数目一共是4 6 8 9 个，覆盖了整 个基因组编码序列的9 5 以上，达到了构建全基因组c d n a 芯片的要求。 我们利用构建好的w p 3 全基因组c d n a 芯片进行芯片杂交实验。在热激条 件( 菌体在2 0 0 c 生长，4 2 一热刺激) 下，3 0 m i n 有4 5 9 个基因( 2 5 2 个上调，2 0 7 个下调) ，6 0 m i n 有6 0 2 个基因( 3 2 8 个上调，2 7 4 个下调) ，9 0 m i n 有6 5 9 个基 因( 有3 7 0 个是表达上调，2 8 9 个为表达下调) ( 基因的变化 2 倍) 存在差异表 达。基因差异表达的变化幅度为最高3 1 5 倍，最低0 0 5 倍。差异表达的基因中 上调基因更多的涉及能量代谢，调控因子，活性分子的转运。而下调基因较多跟 细胞壁的合成和组装，大分子的合成和修饰有关。 冷激条件下，3 0 m i n 时，差异表达基因共有2 2 个基因，其中上调基因1 1 个， j 下调基因1 1 个；6 0 m i n 差异表达基因共6 6 个，其中上调基因3 4 个，下调基因 3 2 个；9 0 m i n 差异表达基因共1 0 8 个，其中上调基因4 6 个，下调基因6 2 个。对 不同生长温度( 4 0 c 和2 5 0 c ) 下基因的差异表达情况也进行了检测，相比于2 5 0 c ， ： 4 0 c 下差异表达基因共3 8 8 个，其中上调基因1 7 4 个，下调基因2 1 4 个。低温刺 ： ： 激下上调的基因跟转录起始、d n a 的复制相关，下调基因更多涉及鞭毛相关蛋 白、电子呼吸链等；低温下生长时，上调基因还有细胞膜相关蛋白，下调基因还 有热激蛋白分子伴侣等等，表明低温刺激和低温生长时菌体的基因调控表达的途 径存在一定程度的差异。 ：1 5 0 m p 静水压刺激下，w p 3 的基因表达变化不大，3 0 m i n 时差异表达基因共 5 个，其中上调基因4 个，下调基因1 个；6 0 m i n 差异表达基因共1 0 个，其中上 调基因5 个，下调基因5 个。i 分析表明，跟r n a 转录有关的s i g m a 因子可能参 与了压力调节，而亚硝酸盐还原酶和延胡索酸盐还原酶电子呼吸链受到抑制。 i i 盐度的刺激也是我们检测的重点。在盐激条件下，3 0 m i n 时，差异表达基因共有 3 9 个基因，其中上调基因2 9 个，下调基因1 0 个；6 0 m i n 差异表达基因共1 4 个，其 j 中上调基因5 个，下调基因9 个；9 0 m i n 差异表达基因共1 9 个，其中上调基因4 个， 下调基因1 5 个。盐激条件下差异表达的基因没有出现与相容性分子调节有关的基因， 下调基因主要为t r n a 合成酶，鞭毛蛋白，分子伴侣等；上调的基因更多跟多糖合成， 水解酶，转座酶的生物合成相关。整个时间表达的趋势为瞬时表达，即盐激的初期表 达上调，随着时间的延长这些基因的转录又回复到初始水平。 i 关键词：s h e w a n e l l as p w p 3 全基因组c d n a 芯片 差异显示基因表达 胁迫反应 i i i t h e g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e so f t h ed e e p - s e ab a c t e r i a s h e w a n e l l as p w p 3u n d e rd i f f e r e n t 。s t r e s sc o n d i t i o n sb y d i f f e r e n t i a ld i s p l a ya n dc d n a r n i c r o a r r a y a b s t r a c t d e e p s e ai sas p e c i a le c o s y s t e mf o ri t sp e r m a n e n tc o l d n e s s ，h i g hp r e s s u r ea n d d a r k n e s s t h es t u d yt o w a r d st h e d e e p s e am i c r o b e s w i l lb e h e l p f u l t ot h e u n d e r s t a n d i n go ft h eo r i g i no fl i f e ，t h ec h a r a c t e ro fb i o d i v e r s i t ya n dt ot h ee x p l o i t a t i o n o fm i c r o b i a lr e s o u r c e si nd e e ps e a t h em e t a b o l i ca n de c o l o g i c a ls t u d yo f1 i f eo n e x t r e m ec o n d i t i o n sw i l lg i v es o m ei n s i g h t so ne v o l u t i o na n d a d a p t a t i o nm e c h a n i s mo f e x t r e m o p h i l e si nr e s p o n s et o s t r e s sc o n d i t i o n sa n d w i l lp a v ean e ww a yf o rt h e d e v e l o p m e n to fa n t i s t r e s sa g r i c u l t u r a la n da n i m a lh u s b a n d r yp r o d u c t sa n df o rh e a l t h o fh u m a n b e i n g s t h ed e e ps e ab a c t e r i at i s e di nt h i ss t u d yw a si s o l a t e df r o md e e p s e as e d i m e n t s o f1 9 1 4 md e p t hi nw e s tp a c i f i c ；t h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i sa n dm o l e c u l a rs t u d ys h o w s t h a t 。、t h eb a c t e r i u mi sap s y c h r o p h i l i ca n dp i e z o t o l e r a n tm i c r o b ew i t ht h et e r ma s i s h e w a n e l l as p w p 3 ，w h i c hw i l lb ea ni d e a lm a t e r i a lt o s t u d yt h ea d a p t a t i o n m e c h a n i s mo fe x t r e m o p h i l e st ot h ee x t r e m ee n v i r o n m e n t s t h ea i mo ft h i ss t u d yi st o f i n dt h ev a r i a t i o no fg e n ee x p r e s s i o no fw p 3u n d e rt h es t r e s sc o n d i t i o n sb ys i m u l a t i n g t h e s ec o n d i t i o n ss oa st oe x p l o r et h eg e n e r a lf e a t u r eo fe x t r e m o p h i l e si nr e s p o n s et o t h e s es t r e s s c o n d i t i o n s ，a n dt of u r t h e rs t u d yt h ea d a p t a t i o nm e c h a n i s m so f e x t r e m o p h i l e st oe x t r e m ee n v i r o n m e n t s w p 3c a ng r o wi n2 2 1 6 em a r i n em e d i u mc o n t a i n i n g1 t o7 s a l i n i t y , w i t h a no p t i m a ls a l i n i t yo f3 - 4 s i m i l a rc e l ld e n s i t ya n dg r o w t hr a t ew e r eo b t a i n e di n1 a n d7 s a l i n i t yb u tt h e ya r eb o t hl o w e rt h a nt h o s ea to p t i m a lc o n d i t i o n t h er n a s j f r o mt h eb a c t e r i ag r o w ni n1 a n d7 s a l i n i t yw e r eu t i l i z e dt o i n v e s t i g a t et h e e x p r e s s i o no fs a l i n i t y 。r e g u l a t e dg e n e sb yd i f f e r e n t i a ld i s p l a y ：n i n e t yp r i m e rs e t s j w e r eu s e dt os c a nt w od i f f e r e n tr n a p o o l sd e r i v e df r o mb a c t e r i ag r o w ni n1 a n d 7 n a c l f o r t y t h r e ep u t a t i v ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s e df r a g m e n t sw e r ei d e n t i f i e d ， c l o n e da n ds e q u e n c e da n ds i xo ft h ef o r t y t h r e e f r a g m e n t sw e r ec o n f i r m e dt ob e 一一一 1 v ； d i f f e r e n t i a l l yt r a n s c r i b e dd u et ot h ec h a n g eo fs a l i n i t y t o u rg e n e s ( y 6 ，y 1 5 ，y 2 1 ， y 2 5 ) w e r eu p - r e g u l a t e di n1 n a c i ，w h i l et h eo t h e rt w o ( y 9 ，y 2 9 ) c o n t a i n e dm o r e a b u n d a n tt r a n s c r i p t si n7 n a c l n ed a t as u g g e s t e dt h a t s t r a t e g i e si n v o l v e di n c o n t r o l l i n gp r o t e i ns y n t h e s i s ，p r o t e i nf o l d i n ga n d o rt r a f f i c k i n g ，g l u t a m a t e c o n c e n t r a t i o n ，f a t t ya c i dm e t a b o l i s m ，a n ds u b s t a n c et r a n s p o r t i n gw e r eu s e df o rs a l t a d a p t a t i o ni ns h e w a n e l l as p w p 3 t h ee x p r e s s i o np a t t e r n so ft h e s i xg e n e si n r e s p o n s et ot r a n s i e n ts t r e s ss h o c k si n c l u d i n gs a l ts h o c k ( 3 n a c is h i f tt o1 2 ) ，c o l d oo s h o c k ( 1 5c s h i f tt o0c ) a n dh i 曲h y d r o s t a t i cp r e s s u r es h o c k ( 0 1m p as h i f tt o5 0 m p a ) w e r ef u r t h e re x a m i n e d y 2 9e n c o d i n gt h ep u t a t i v eh s c ac h a p e r o np r o t e i nw a s i n d i c a t e dt ob ei n v o l v e di na d a p t a t i o no fa l lt h es t r e s s e st e s t e d d i f f e r e n t i a ld i s p l a ym e t h o dw a sa l s ou s e dt os c a nt h eg e n ee x p r e s s i o no fw p 3 u n d e rh e a ts h o c ka n dc o l ds h o c k c o n d i t i o n s a f t e r3 0 m i no fh e a ts h o c k ，8g e n e s w e r ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d ，o fw h i c h4g e n e sw e r eu p r e g u l a t e da n d4g e n e s d o w n r e g u l a t e d u n d e rc o l ds h o c kc o n d i t i o n ，f o r3 0 m i n ，2g e n e sw e r ed o w n g r a d e d a n d4u p g r a d e d t h ec d n am i c r o a r r a yw a sc o n s t r u c t e db a s e do nt h ew p 3g e n o m es e q u e n c e t h e4 9 4 5p r o t e i n e n c o d i n go p e nr e a d i n gf r a m e s ( c d s ) w e r ep r e d i c t e db yg l i m m e r s o f t w a r ew i t ha na v e r a g el e n g t ho f9 2 6 b p t h ec d sa c c o u n t sf o r8 4 4 o ft h ew h o l e g e n o m es e q u e n c e 4 6 5 0c d sp r o d u c es h a r pa n ds ! n g l ep c rb a n d so u to f4 7 4 4p a i ro f p c rp r i m e r sd e s i g n e db yp r i m e rv 5 0 3 9o l i g op r o b e sw i t ha7 0 b pl e n g t hw e r e s u p p l e m e n t e dt a k i n ga c c o u n ti n t ot h er e s to fc d s t h a tc o u l dn o to b t a i n e db yp c r m e t h o d t h en u m b e ro fo r fo nm i c r o a r r a ym a k eu pt o4 6 8 9w h i c ha c c o u n t sf o rm o r e t h a n9 5p e r c e n to ft h a ti nw p 3 ，t h u sm e e tt h en e e d sf o rw h o l eg e n o m em i c r o a r r a y ，n l em i c r o a r r a yh y b r i d i z a t i o ne x p e r i m e n t sw e r ep r o c e e d e db yw p 3c d n a c h i p st oo b s e r v ed i f f e r e n t i a lg e n ee x p r e s s i o ni nr e s p o n s e1 0h e a ts h o c ka n dc o l ds h o c k c o n d i t i o n s a th e a ts h o c kc o n d i t i o n ，t h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s e dg e n e sw e r e4 5 9 ，a m o n g t h e m2 5 2u p g r a d e da n d2 0 7d o w n g r a d e da t3 0m i n ，6 0 2g e n e s ( 3 2 8u p g r a d e da n d 2 7 4d o w n - g r a d e d ) a t6 0m i n ，a n d6 5 9g e n e s ( 3 7 0u p g r a d e da n d 2 8 9d o w n g r a d e d ) a t 9 0m i ne x h i b i t e dd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o na ta 2 一f o l dl e v e l d nr e s p o n s et oa t e m p e r a t u r e u p - s h i f tf r o m2 0 。ct o4 2 。c 1 1 1 ee x t e n to fc h a n g ef o l dh a dar a n g ef r o m0 0 5t o3 1 5 n e g e n e st h a tw e r eu p r e g u l a t e di nr e s p o n s et oh e a ts h o c kh a da n n o t a t e df u n c t i o n sj n e n e r g ym e t a b o l i s m ，r e g u l a t o r yf u n c t i o n s ，a n ds u b s t a n c e st r a n s p o r t i n g ，w h e r e a st h o s e e n c o d i n gp r o t e i n si n v o l v e di n c e l lw a l ls y n t h e s i s ，m a c r o m o e l c l a rs y n t h e s i sa n d v i m o d i f i c a t i o nw e r ea m o n gt h em o s tu p r e g u l a t e dg e n e s i nr e s p o n s et oh e a ts h o c k jod e f j 鹏t h e g l o b a tg e n ee x p r e s s i o nt o d e c r e a s e dg r o w t h t e r n p e r a l u r e ， e m p o r a lg e n e e x p r e s s i o np r o f i l e sw e r ee x a m i n e di nc e l l ss u b j e c t e dt oc o l d s f r e s sb v u s l n gm l c r o a 玎a yf o rw p 3 d i f f e r e n t i a lg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e si nc e l l s s u b j e c t e di o c o l d _ s t r e s sw e r ea l s oe x a m i n e db yc d n a m i c r o a r r a y t h er e s u i t ss h o w e dt h a f2 2 g e n e s ( 1 1u p - g r a d e da n d1 1d o w n g r a d e d ) a t3 0 r a i n ，6 6g e n e s0 4 u p 一目a d e da n d3 2 w n 一目a d e d ) a 6 0 r a i n ，1 0 8g e n e s ( 4 6u p g r a d e da n d6 2 d o w n g r a d e d ) a t9 0 m i n s h o w e dd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ni n r e s p o n s e t oat e m p e r a t u r ed o w n s h i f lf r o m2 5 。ct o jn eg l o b a lt r a n s c r i p t o m ei n r e s p o n s et og r o w t ht e m p e r a t u r ea l t e r a t i o nj nw p 3 w e r ea l s oe x 锄i n e d c d n a m i c r o a r r a ya n a l y s i sw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ej n n u e n c e o t e m p e r a u r eo ng l o b a lg e n ee x p r e s s i o ni nw p 3 g r o w nt oe x p o n e n t i a lp h a s ea l2 5 。c a n d4 。c 3 8 8g e n e s ( 1 7 4g e n e su p r e g u l a t e da n d 2 1 4g e n e sd o w n - r 6 9 u l a t e d ) w e r e d l f i e r e n 1 a 1 1 ye x p r e s s e da t ：4 。cr e l a t i v et o2 5 。c o u rr e s u l t ss h o w e dt h a t t h e r ea r e s o m ed l f f e r e n c e sa b o u tt h eg e n er e g u l a t i o na n d p a t h w a ym e t a b 0 1 i s mb e c w e e nc o l d v i 缩写词表( a b b r e v i a t i o n s ) 缩写词表 p m e a a 姆 心 b p b s a c d n a c y 3 一d c t p c y 5 一d c t p d d h 2 0 d e p c d m s o d m s o d n a d n t p d t t e c o l i e d t a g + c g t c i p t g k b l b m m l n m l m m m o p s ( a b b r e v i a t i o n s ) 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l6 巯基乙醇 a m i n oa c i d 氨基酸 a l k a l i n ep h o s i j h a t a s e 碱性磷酸酶 a m m o n i u mp e r s u l f a t e 过硫酸胺 b a s ep a i r 碱基对 b o v i n es e r u ma l b u m i n 小牛血清白蛋白 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a c y 3 标记的胞嘧啶脱氧核苷三磷酸 c y 5 标记的胞嘧啶脱氧核苷三磷酸 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e 双蒸水 d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙脂 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲亚砜 d i m e t h y ls u l f o x i d e = 甲亚砜 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核苷三磷 酸 ： d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a ? a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g u a n i n e + c ) ，t o s i n e 鸟瞟呤+ 胞嘧啶 g u a n i d i n et h i o c y a n a t e 异硫氰酸胍 i s o p r o p y l t h i o dg a l a c t o s i d e 异丙基d 一半乳糖 苷 k i l o b a s e 千碱基对r + l u r i a b o r t hm e d i u m 肉汤培养基 m a r k e r 分子量标记； m i n u t e 分钟 m i l i l i t r e 毫升 m i l m o l a r 毫摩尔 3 一( n - m o r p h o l i n o ) p r o p a n e - s u l f o n i ca c i d3 一( n - 吗 啉代) 丙磺酸 i x m p m r n a o d o r f p a g e p c r r a p 。p c r r n a r n a s e r n a s i n r p m r t p c r s d s s e c t a e t a q t e t e m e d 1 1 r i s u l u p l ，u p 2 | n x g a l r f i a g e p a 兆帕 m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 信使核糖核酸 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放读码框 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝 胶电泳 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r n a a r b i t r a r i l yp r i m e dp c rr n a 随机引物p c r r i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 r i b o n u c l e a s er n a 酶 r n a s ei n h i b t o rr n a 酶抑制剂 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转分钟 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r 反转录聚合酶链式反 应 s o d i 2 u m d o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 s e c o n d 秒 t r i s a c e t a t ee l e c t r o p h o r e s i sb u f f e rt r i s 醋酸电泳 缓冲液 t h 6 r m o sa q u a t i c u s 热聚合酶 t r i s e d l at h s e d l l a 缓冲盐溶液 n ，n ，n ，n t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en ，n ，n ，n 一 四甲基乙二胺 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o r n e t h a n e 三羟甲基氨基 甲烷 m i c r o l i t r e 微升 u n i v e r s a lp r i m e r l ，2 通用引物1 ，2 w e i g h t v o l u m e 重量体积 5 - b r o m o 4 一c h o r o 3 一i n d o l y l - 1 3 - l h a l a c t o p y r a n o s i 5 - 溴一4 一氯一3 一吲哚1 3 d 半乳糖吡喃 m i c r o g r a m 微克 x 运用差异显示及基因芯片研究s h e w a n e l l as p w e 3 在胁迫条件下的基因表达 第1 章前言 生活在极端环境中的微生物是生命的奇迹。它们蕴涵着生命进化历程的丰 富信息，代表着生命对于环境的极限适应能力，是生物遗传和功能多样性最为丰 富的宝藏。近年来极端微生物研究在生命科学、特别是微生物学中的地位日益突 出，极端微生物已经成为发达国家竞相占有和发掘的重要战略资源。 海洋覆盖了地球7 1 的区域，而占海洋总面积6 5 的深海是人类财富的巨大 宝库，蕴藏着丰富的资源特别是生物资源。海洋幅员辽阔、遍布理化性质独特的 极端自然环境，如高温，低温，强酸，高盐，高压等环境，j 因此，极端微生物资源极 为丰富。在不同极端环境中存在各种各样的微生物。在微生物的进化过程中自然 选择使一些微生物对极端环境有较强的适应性，这些微生物称为极端微生物。海 水，尤其是深海，营养相对贫乏，微生物活动不是十分剧烈，但从海水表面到 1 0 8 6 0 m 深的海底沉积物中都存在着微生物【1 1 。近年来，j 海洋微生物的研究日益被 重视，对海洋微生物的生态调查、生理和遗传特征以及开发利用都有许多研究。 深海是一个特殊的生态环境，这里永久低温( 火山口除外) 、高压、黑暗。对深海 微生物的研究不仅有助于了解生命的起源，而且可以了解各种极端微生物的生活 特性，有助于对深海微生物资源的开发利用。 j 极端微生物为我们界定了生物圈的范围，它们或许提示着生命的起源，同时 ! 还丰富了自然界的生物多样性。极端微生物生命策略的多样性是生命科学发展的 ! 全新突破口，开展极端环境下的生命现象研究对于揭示生物圈起源的奥秘和生物 进化规律，阐明生物多样性的形成和演变机制，认识生命与环境的相互作用，尤 其是与地球化学变化的关系都具有极为重要的意义。这方面研究的成果还能有 力地促进极端微生物资源在环境保护和修复、人类健康、生物技术等方面的利用， 乃至地外空间的开发和利用。因此近年来，极端环境下的生命现象研究已成为在 生命科学研究的一个重要部分，极端微生物已经成为发达国家竞相占有和发掘的 重要资源。 李升康中山大学博士学位论文 1 1 深海微生物研究的概况 1 9 9 7 年起，美国国家科学基金会启动了关于极端微生物的研究的专项 j l i f e i ne x t r e m ee n v i r o n m e n t s ( l e x e n ) 在极端微生物的基础研究方面开展了系 的工作，基本围绕三个问题：1 物种多样性一生命极限条件是什么? 2 功能多 样性一生命的行为规律是否存在? 3 生命进化一生命如何从前生条件进化而 来? 在极端微生物的生物技术利用方面，美国已经开始享受极端酶带来的利益。 p c r 酶、e n t 酶、碱性酶及极端高温酶已在产业上产生了重要影响。极端微生物 的开发利用，有望在新材料、，1 新药等方面开辟新的途径。 日本1 9 9 1 年开始实施了著名的深海之星( d e e p s t a r ) 计划，耗资5 0 亿日元 ： 进行为期5 年深海极端微生物的研究，现在每年仍维持3 0 0 万美元的资助。从深 海中获得了1 0 0 0 多株嗜压j 嗜冷、嗜热、嗜碱及耐有机溶剂的多类型的极端微 生物，最引人注目的则是有机溶剂菌，其极端因子为苯、甲苯、环已胺、煤油等， 溶剂浓度可达5 0 。这些极端微生物在新酶、新药开发及环境整治等方面的应 用潜力极大。 欧盟于9 6 年结束的一个资助期为三年的极端微生物的预研项目一 b i o t e c h n o l o g yo fe x t r e m o p h i l e s ，又于9 7 年启动一个耗资7 0 0 万欧元的计划一一 “极端细胞工厂 ( e x t r e m o p h i l e sa s c e l lf a c t o r y ) ，开发极端微生物及其产物 的利用价值。作为欧盟的整体策略，极端微生物项目的目的是“利用生物技术改 造现在的化学工业过程”，项目协调人a n t r i n i k a n 教授认为，极端微生物工业的 时代已经到来。 我国特殊的地理环境，赋予了得天独厚的极端微生物资源，加强极端微生物 这一重要遗传资源的认识、保护、开发和持续利用，是我国生物技术实现跨越式 开发的一次难得的机会。对于提高我国科技的国际地位、迎接2 1 世纪的挑战具 有深远的意义。 圭ls i e b u r t h 【2 1 发表了一系列关于海洋微生物，包括细菌、古菌、原生生物、 ： 真菌及病毒的研究方法后，海洋微生物的研究日益蓬勃发展。随后，荧光显微镜 2 运用差异显示及基因芯片研究s h e w a n e l l as p w p 3 在胁迫条件下的基因表达 计数法及同位素示踪法的应用【3 】，促进了人们对海洋浮游微生物的生物量和生长 状态的研究，对海洋微生物的群体代谢、群体生长动力学和群体碳流有了一个总 体的了解，使人们意识到了海洋微生物在海洋生态系统中的重要地位【4 1 。分子生 物学和系统发育学方法的发展，使直接对环境样品中微生物的蛋白和核苷酸序列 ： 进行研究和比较成为可能，进一步促进了微生物生态学的研究和发展，使人们对 环境中自然状态下的微生物的群体有了更深刻的了解，发现了很多在传统分离培 l ： 养方法中无法监测到的微生物群落【5 j 。现在，海洋微生物多样性及其生态研究已 一 经有了相当的进展。 科学家们针对不同海域中的海洋浮游微生物，以独立于菌株培养的分子系统 发育生物学方法进行了海洋中细菌多样性的研究1 6 】，在这些研究过程中，获得了 丰富的海洋浮游细菌的多样性信，亩j 7 , s , 9 , 1 0 i1 1 】。对这些不同海域中的海洋细菌进行 j 了分析比较，发现除了丰富的细菌多样性之外，这些不同的自然环境中都存在着 共同的细菌群落。海洋微生物是海洋生态系统中最重要的组成部分，是海洋生物 研究中的一个重要领域。深海微生物的研究是现代海洋微生物的一个重要组成部 分。极端环境下的微生物是系统进化研究中研究生命起源演化的重要材料。深海 微生物和地球的有机物碳、氮、硫循环关系密切是地球物质循环不可分割的重 要参与者。因此，深海微生物有哪些种类、特点、极端环境的适应性机理、特殊 代谢产物及其利用价值等，都引起了人们广泛的兴趣。深海微生物的研究区域分 布广泛，目前国际上进行深海微生物研究的国家主要分布在欧洲，美洲及亚洲， 其中美国、日本、德国、英国和法国都是深海微生物研究的主力军。目前，在深 海微生物的分离培养、多样性调查、功能基因研究和适应性机制研究( 如深海嗜 压菌的嗜压机制) 等方面取得了一定的进展；各类极端微生物在工业用酶、工具 酶、环境修复以及生物活性物质等方面的开发应用，也有了突破，使人们看到了 深海微生物开发的巨大潜力和广阔的应用前景【1 2 j 。2 0 0 3 年1 0 月份开始的整合大 约 洋钻探计划( i o d p ) 将深部生物圈和洋底下的海洋列为该计划中三大科学课题之 首，深海生物资源尤其是微生物资源越来越得到人类的重视。随着科学的发展进 步，水下工程技术和探测技术的改进和完善，人类对深海微生物的研究和开发有 了更大的空间和可能性。 李升康中山大学博士学位论文 l ：1 1 深海生态环境的一般特征 海洋是生命的诞生和孕育之地，生物的进化历程表明，地球上的生物起源于 海洋。海洋不但占据了地球7