（光学专业论文）激光照射诱导活细胞中生物效应的分子机制研究.pdf

华南师范大学硕士学位论文答辩合格证明 学位申请人至垄向本学位论文答辩委员会提交 题为照盘堡，筮透受施壁幽堑渔蠲缎燃的硕士论文， 经答辩委员会审议，本论文答辩合格，特此证明。 学位论亳篱颦霉员今委员 抓骚 再对 压犀髦 论文指导老师( 签名) ： ( 签名) 2 p 够年苦月d 日 摘要 摘要 激光照射可以调节很多生物过程，比如它可以诱导细胞的增殖、分化、凋亡 等等。但是激光生物效应的机制至今仍不清楚。本论文主要利用c e l lc o u n t i n g k i t 8 测定细胞存活率的方法研究了不同剂量激光照射对人类肺腺癌细胞 ( a s t c a 1 1 生长的影响；利用激光共聚焦扫描显微镜结合各种荧光染料探针和荧 光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 技术研究了激光 照射生物效应的分子机制。这对于更好地阐明激光生物效应及其机制，指导激光 更好地应用于临床具有重要的意义。 论文绪论部分介绍了激光生物效应及其机制研究的现状，同时说明了本课题 的研究目的与意义；接着本文对激光共聚焦扫描显微镜及f r e t 技术的原理和应 用进行了概况性的介绍。 在第一部分的实验工作中，我们利用c e l lc o u n t i n gk i t 一8 测定细胞存活率的 方法对不同剂量激光照射对a s t c a 1 细胞生长的影响进行了研究。结果发现小 剂量的h e n e 激光照射( 0 4 8 j c m 2 - 0 8 j c m 2 ) 能促进a s t c - a - 1 细胞增殖；大剂量的 h e n e 激光照射( 6 0 j c m 2 1 2 0 j c m 2 ) 能诱导a s t c a 1 细胞凋亡。 在第二部分的实验工作中，我们利用基于探针r a i c h u r a s 的f r e t 技术在活 细胞内实时观测了o 8 j c m 2 激光照射诱导细胞增殖过程中r a s 和r a f 相互作用的 动态过程。结果表明：小剂量激光照射诱导a s t c a 1 细胞增殖过程中r a s r a f 被激活。我们的研究表明r a s r a f 信号通路蛋白的激活在小剂量激光照射诱导细 胞增殖过程中确实扮演了重要的角色，是小剂量激光照射诱导细胞增殖的机制之 在第三部分的实验工作中，我们利用激光共聚焦扫描显微镜结合荧光染料探 针和f r e t 技术，对大剂量激光照射诱导细胞凋亡的分子机制进行了研究。在 1 2 0 j c m 2 的h e n e 激光照射诱导a s t c a 一1 细胞凋亡的过程中，我们用h 2 d c f d a 来检测细胞内活性氧( r o s ) 的产生；用r h o d a m i n e l 2 3 来监测细胞内线粒体膜电位 ( 攀m ) 的变化；用m i t o t r a c kd e e p r e d6 3 3 来定位线粒体；用基于s c a t - 3 和 摘要 r a i c h u r a s 荧光基因探针的f r e t 技术来检测胞内c a s p a s e ，3 和r a s r a f 的活性； 用b i d c f p 荧光基因探针来检测胞内c a s p a s e 8 的活性。荧光成像技术的使用实现 了细胞内生命事件的在体实时定位的动态观测。实验结果表明大剂量激光照射诱 导细胞凋亡过程中发生了一系列级联事件：在激光照射过程中r o s 开始产生： 大约在激光照射后1 0 m i n ，a w m 开始降低；大约在激光照射后3 0 m i n ，胞内 c a s p a s e 3 开始被激活。另外，实验中发现在大剂量激光照射诱导的细胞凋亡过 程中r a s r a f 的活性被下调，c a s p a s e 一8 并没有被激活。我们的研究表明大剂量激 光照射诱导细胞凋亡是直接起始于线粒体上r o s 的产生和甲m 及其通透性的改 变，而不依赖于c a s p a s e 8 介导的细胞凋亡途径。 最后，论文展望了激光照射对疾病临床治疗应用及其作用机理研究的前景。 关键词：激光照射；荧光共振能量转移技术( f r e t ) ；活性氧( r 0 s ) ；线粒体膜电 位( a q j m ) ；c a s p a s e ；r a s r a f 翌! 三坠塑 a b s t r a c t l o w p o w e rl a s e ri r r a d i a t i o n ( l p l i ) c a nm o d u l a t ev a r i o u sb i o l o g i c a lp r o c e s s e s f o ri n s t a n c e ，l p l ic a ni n d u c ec e l l p r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o na n da p o p t o s i s y e t ， t h em e c h a n i s mo fl p l ib i o l o g i c a le f f e c t sr e m a i n su n c l e a r i nt h i sd i s s e r t a t i o n t h e e f f e c to fd i f f e r e n tf l u e n c el p l io nh u m a nl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l l s ( a s t c a 1 1 g r o w t hw a sa n a l y z e du s i n gc e l lc o u n t i n gk i t - 8 ：t h em e c h a n i s mo f t h ee f f e c tw a s i n v e s t i g a t e du s i n gs p e c i f i cf l u o r e s c e n tp r o b e ss t a i n i n g a n df l u o r e s c e n c er e s o n a n c e e n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) t e c h n i q u e s o u r s t u d i e sh e l pt oc l a r i f yt h em e c h a n i s mo fl p l i b i o l o g i c a le f f e c t sa n dg u i d et h ec l i n i ct h e r a p y ， f i r s ti n p r o l e g o m e n o n ，t h ep a p e r i n t r o d u c e dt h er e s e a r c hs t a t u s q u o o ft h e b i o l o g i c a l e f f e c t sa n dt h em e c h a n i s m so fl p l i a tt h es a m e t i m e ，t h ep a p e r g e n e r a l i z e dt h es t u d yw o r ki nt h i sd i s s e r t a t i o na n de x p l a i n e dt h ea i ma n dm e a n i n go f t h es t u d y a n dt h e n ，t h i sp a p e rr e c a p i t u l a t i v ei n t r o d u c e dt h ep r i n c i p l ea n da p p l i c a t i o n o fl a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p e ( l c s m ) a n df r e t i nt h ef i r s te x p e r i m e n t a ls t u d y t h ee f f e c to fd i f f e r e n tf l u e n c el p l io na s t c - a 一1 c e l l s g r o w t hw a sa n a l y z e du s i n g c e l l c o u n t i n gk i t 一8 t h e r e s u l t ss h o wt h a tl o w f l u e n c el p l i ( 0 4 8 j c m z - o 8 j c m 2 ) i n d u c e sa s t c a1c e l l sp r o l i f e r a t i o n ，w h i l eh i g h f l u e n c el p l i ( 6 0 j c m 2 - 1 2 0 j c m 2 ) i n d u c e sa p o p t o s i s i nt h es e c o n d e x p e r i m e n t a ls t u d y ，t h es p a t i o - t e m p o r a ld y n a m i c s o fr a s r a f a c t i v i t yd u r i n go 8 j c m 2l o wf l u e n c el p l i i n d u c e da s t c - a - 1c e l l sp r o l i f e r a t i o nw a s m o n i t o r e di n s i n g l el i v i n gc e l lu s i n gf r e ti m a g i n gb a s e do nr a i c h u r a sg e n e t i c r e p o r t e r t h er e s u l t ss h o w t h a tl o wf l u e n c el p l ii n d u c e sa c t i v a t i o no fr a s r a f t h e s e r e s u l t s s u g g e s ta c t i v a t i o n o fr a s r a fp l a y sa ni m p o r t a n tr o l e d u r i n g l o wf l u e n c e l p l i i n d u c e d p r o l i f e r a t i o n i nt h et h i r d e x p e r i m e n t a ls t u d y ，t h em e c h a n i s mo fh i g hf l u e n c el p l i i n d u c e d a s t c - - a - 1c e l l sa p o p t o s i sw a si n v e s t i g a t e du s i n gs p e c i f i cf l u o r e s c e n tp r o b e ss t a i n i n g 3 a b s t r a c r a n df r e t t e c h n i q u e s w eh a v em e a s u r e da n da n a l y z e dt h ed y n a m i c so fg e n e r a t i o no f r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ，a l t e r a t i o no fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e n t i a l ( 甲m ) u s i n gh 2 d c f d a a n dr h o d a m i n e l 2 3f l u o r e s c e n c ep r o b e sr e s p e c t i v e l y ，t h ed y n a m i c s o fa c t i v i t yo f c a s p a s e 一3 a n dr a s r a fu s i n gf r e ti m a g i n gb a s e do ns c a t 一3a n d r a i c h u r a s g e n e t i cr e p o r t e r s ，a n d t h e a c t i v i t y o f c a s p a s e 一8d u r i n g 1 2 0 j c m 2 h i g h f l u e n c el p l i i n d u c e da p o p t o s i s ，r e s p e c t i v e l y t h es p a t i o t e m p o r a ld y n a m i c so fc e l l s e v e n t sc a nb em o n i t o r e di nr e a l t i m ei ns i n g l el i v i n gc e l lb yt h eu s eo fl c s m i m a g i n g t h er e s u l t ss h o wat e m p o r a ls e q u e n c eo fe v e n t sd u r i n ga p o p t o s i si n d u c e db yh i g h f l u e n c el p l i ：i n t r a c e l l u l a rr o sg e n e r a t i o ni n i t i a t e s d u r i n gl a s e ri r r a d i a t i o n ，a t e m b e g i n s t od e c r e a s ea b o u tl o m i na f t e rl a s e rt r e a t m e n t ，a n d c a s p a s e 一3 a c t i v a t i o n i n i t i a t e sa b o u t3 0 m i na f t e rl a s e rt r e a t m e n t o u rr e s u l t sa l s os h o wh i g hf l u e n c el p l i d e r e g u l a t e st h er a s r a fa c t i v i t ya n dh a sn oe f f e c to nc a s p a s e - 8a c t i v i t y t h e s er e s u l t s s u g g e s th i g h f l u e n c el p l i - i n d u c e dc e l l s a p o p t o s i s i si n i t i a t e d d i r e c t l y f r o m i n t r a c e l l u l a rr o sg e n e r a t i o na n da q j md e c r e a s e ，a n di s i n d e p e n d e n t o fc a s p a s e - 8 a c t i v a t i o n l a s t t h ep a p e rp r o s p e c t e dt h ef o r e g r o u n do ft h ea p p l i c a t i o no fl p ut r e a t i n g i l l n e s si nt h ef i e l d so fb i o l o g ya n dp h y s i c s k e y w o r d ：l o wp o w e rl a s e ri r r a d i a t i o n ( l p l i ) ；f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r ( f r e t ) ；r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ；m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l ( 掣m ) ；c a s p a s e ；r a s r a f 4 第一章绪论 1 1 激光照射生物效应研究 第一章绪论 激光照射能够产生多种生物效应，比如它可以诱导细胞的增殖、分化和凋亡 等等【l 一3 l 。激光照射诱导细胞增殖的效应已经在多种细胞中得到证实，比如它 可以促进表皮细胞【4 】、骨细胞【5 】、神经细胞【6 】、成纤维细胞【7 】、淋巴细胞【8 】、 造血细胞【9 】等等的增殖，从而可用于促进伤口的愈合，骨的修复，神经的再 生，增强免疫，治疗一些再生障碍性疾病等；激光照射也被报道可以促进一些细 胞的凋亡，比如造血细胞 1 0 1 、肾表皮细胞【1 1 】、鼠骨髓瘤细胞 1 2 】、瘢痕成纤 维细胞【1 3 】等等，从而有利于瘢痕组织的消除，白血病的治疗等等。激光照射结 合光敏荆即光动力学作用可以诱导细胞凋亡【1 4 ，1 5 】，可用于一些肿瘤的治疗。当 激光剂量相对较低时，对细胞生长有促进效应；当剂量较高时，则抑制细胞生长 【1 6 ，1 7 1 。另外，激光照射也能引起机体免疫活性的改变、机体新陈代谢的变化、 血液流变学性质的改变、蛋白结构的变异、酶活性的激活或抑制等等【1 8 】。事实 上低能量激光的效应主要依赖于激光波长、能量密度、照射过程及细胞类型，其 中细胞类型可能是最重要的决定因素 1 9 ，2 0 1 。激光照射产生的这些生物效应是激 光治疗与预防疾病的基础。 1 2 激光照射生物效应的机制研究 对于激光照射生物效应的机制，目前还没有一个公认的理论，一些学者提出 了许多假说和模型 2 1 1 ：比如较早期的有1 9 7 2 年前苏联i n y u s h i n 提出的生物电场 设想 2 2 】，1 9 7 7 年匈牙利m s e t e r 提出的偏振刺激设想【2 3 ，2 4 ，1 9 8 0 年前苏联 j i p o x o h h y k o b 提出的色素调节设想【2 3 ，2 4 1 ，1 9 9 3 年周凌云提出的孤子态一混沌态 假说 2 5 1 ，1 9 9 7 年刘承宣等提出的生物信息模型和生物信息转换模型 2 6 2 9 ， 第一章绪论 1 9 9 8 年w i l d e n 等提出的7 1 入电子辐射现象的线粒体能量传递理论模型【3 0 】， 1 9 9 9 年c h i c h u k 等提出的自由基机制假说【3 1 ，3 2 】等等。简要叙述分析如下： 1 2 1 生物电场设想 该设想建立在g u r v i c h 的生物场理论和s z e n t g y o r g y i 的观点，印非定域电子 在生物过程中的作用以及生物分子具有半导体性质之上。大意是：生物组织，特 别是生物膜，具有半导体的性能，因而整个机体可以看作是一个大的晶体，其中 有生物组织的电导区。该电导区由于代谢过程而存在一定密度的自由电荷，叫生 物等离子体。在各种不利的内、外因素作用下，生物等离子体的内稳定受到干 扰，从而引起病理过程的发展。h e ，n e 激光能量参数( 光子能量1 9 e v ) 与代谢过 程的能量特征相当接近，可以通过共振作用( 不同于理疗用的普通光1 刺激代谢过 程，使生物等离子体恢复稳定。该设想在当时是为解释h e n e 激光的治疗作用而 提出来的，但大量研究表明，可见及近红外范围内的各种激光都可以产生某些生 物效应，不同波长激光的的生物效应虽有所不同，但也有许多相似的表现。由此 不难看出生物电场设想的局限性。 1 2 2 偏振刺激设想 细胞膜是类脂双分子层结构，而类脂分子是电偶极子。当细胞被偏振光照射 时，类脂分子的极化方向被迫按偏振光的电场方向重新排列( 有序分布代替随机 分布1 ，从而影响与细胞膜有关的每一个过程，如细胞代谢、免疫应答、酶反应 等。理论上讲，光的电场强度是高频交变的，所以类黯分子的极化取向也不会固 定不变。 1 2 3 色素调节设想和细胞膜受体设想 色素调节设想的依据是光生物学揭示的光能调节动植物的生命过程这一基本 规律也适用于激光，认为高等动物中也存在和植物、微生物类似的光色素系统。 有实验证明过氧化氢酶( c a t ) 可能就是动物组织中吸收h e - n e 激光的色素，当然 也可能是某种尚未被发现的新色素，这种色素作用光谱窄，光敏性高，吸收 h e n e 激光后能调节和控制r n a 和蛋白质的合成，触发多种生理过程。细胞膜 6 第一章绪论 受体设想的大意是：h e n e 激光的刺激作用很可能是通过细胞膜受体( 光致敏化 作用) 实现的。激光辐照通过受体的参与产生光活化效应，表现为核仁活化( 解除 抑制) 、d n a r n a 一蛋白质系统活性提高以及核糖体上蛋白质合成的活化，这些 活化过程构成细胞机能活化的基础。表现为生物合成过程( 包括基本的酶过程) 水 平的提高，特别是环三羧酸酶和细胞色素氧化酶活性提高，细胞利用氧能力加 强，以及氧化过程活化。从而提高a t p 的合成，增强细胞有丝分裂能力，活化 细胞增殖过程，刺激细胞内外生理过程和修复再生过程。这两种设想的立足点是 一致的，即都认为机体中存在某种生物大分子。这种分子可以吸收光子并被活 化，进而引起随后的生物效应。这种生物大分子可能是某种色素分子( 生色团) ， 也可能是某种细胞膜受体；被吸收的光子可以来自于激光，也可来自于普通的非 相干光。这里的困难是：哪些生物大分子是光受体分子，如何寻找和验证? 早期 o l s o n 猜想光首先被线粒体酶吸收，k a t o 和k a r u 等指出这种光受体可能是黄和 细胞色素c 氧化酶。t i p h l o v a 和k a r u 首先研究了低强度h e n e 激光对噬菌体t 4 与大肠杆菌相互作用的影响，发现光照可以加速细菌的分化，但不影响噬菌体的 活性f 感染宿主的能力) ，证实细菌含有的呼吸链组分是初始光受体 ( p r i m a r y p h o t o a c c e p t o r ) ( 9 4 a 菌体中没有) 。k a r u 等又对其它多种细胞，如吞噬细 胞、酵母细胞、h e l a 细胞、人淋巴细胞等进行了h e n e 激光照射实验，进一步证 实激光可作用于呼吸链，引起呼吸爆发。后来k a r u 等进一步指出：对可见和红外 激光来说，细胞色素c 氧化酶是细胞的初始光受体。但d u b e 等认为最初的光反 应是细胞色素一d 吸收h e n e 激光，然后被氧化。而r o c h k i n d 等认为，低强度激 光可诱导产生单线态氧，其能量传递是靠卟啉，而不是靠细胞色素完成的； c h i c h u k 等进一步指出，内源性卟吩是红光波段( 波长6 3 2 8 n m ) 的一种生色团。可 见目前对初始光受体已经有了比较多的研究和认识。不过应指出，初始光受体可 能有多种，并因细胞类型的不同而不同。如，低强度激光对没有线粒体的红细胞 也有刺激作用。 7 第一章绪论 1 2 4 孤子态混沌态假说 将激光引入d n a 分子动力学方程( s i n e g o r d o n 方程) ，获知d n a 分子即使 在“弱”激光作用下，也有可能由原来的孤子运动状态进入混沌态，从而导致其 空问构象随时涮“无规则”地演化，产生遗传变异。孤子是否存在于d n a ，尚 存在争议；低强度激光是否直接作用于d n a ，也还缺乏实验支持。k a r u 认为低 强度激光不会直接作用于d n a ，杨在富等的实验所揭示的激光生物效应的时问 延迟性符合k a r u 的观点。 1 2 5 生物信息模型( b i m l ) 和生物信息转换模e , - 刨( b i t m l ) 生物体接收或传出信息的部分成为生物表层信息元；以生物表层信息元作为 信源或信宿的体内系统称为生物里层信息元。低强度激光的生物效应是通过生物 表层信息元相干态的物理放大，和相继的细胞膜受体介导的第二信使( 生物里层 信息元1 的生物放大两次级联放大实现的。所谓物理放大，即生物表层信息元会 形成相干态，健康生物体的生物信息元为亚辐射态( 辐射强度为零) ，对低强度激 光的刺激没有响应；病理条件下则形成超辐射态( 可以产生辐射) ，可对低强度激 光的刺激产生物理放大作用。所谓生物放大，即低强度激光不仅作用于细胞色素 f 细胞色素吸收光子可促进线粒体合成a t p ，调节细胞功能，此为低强度激光作 用机制之一) ，还可与细胞生色团相互作用。b i m l 假设，细胞生色团对弱激光的 吸收允许弱激光象激素一样成为生物信息的载体。对细胞膜上的生色团，b i m l 进一步假设，绿、蓝、紫等冷光通过g s 蛋白活化腺苷酸环化酶使细胞内环腺苷 酸( c a m p ) 水平升高；红、橙、黄等暖光通过g i 蛋白活化c a m p 的磷酸二脂酶， 通过g q 蛋白活化磷脂酶c 或活化蛋白激酶关联受体，使细胞内c a m p 水平降 低。b i t m l 在不引起损伤的前提下，随着照射量的提高，一种激光对信使浓度 的改变超过相应的阈值时，生物系统内部的平衡机制将使它所启动的信使系统转 换成与现有信使系统相拮抗的信使系统。该理论模型中色素、膜受体等概念是对 前人观点的继承与发展。但根据杨在富的实验结果，相同照射条件的5 3 2 n m 激 光( 冷光) 与6 3 3 n m 激光( 暖光) 的生物效应相似，随时间变化规律一致，只是 5 3 2 n m 激光的效应略明显一些，这与上述理论并不一致。 第一章绪论 1 2 6 引入电子辐射现象的线粒体能量传递理论模型 考虑到电子的辐射现象和低水平激光的医疗应用，w i l d e n 等提出了关于细 胞能量传递( 呼吸链) 的自洽的理论模型。作者认为：现有的关于细胞能量传递的 生物化学模型把电子作为能量载体，只考虑了其经典的粒子性，因而忽视了电子 的波一粒二象性和该过程中辐射能的引入。根据呼吸链中有关能量的数值，作者 认为在细胞能量传递过程中应该引入特定波长范围的电磁辐射，相应波长的光可 以刺激生物大分子，引起蛋白质分子的构象改变，或将能量传递给电子。红色和 红外波段的低水平激光与呼吸链中有关组份的特征能量和吸收水平吻合的很好。 这种激光刺激可以激活细胞，提高其线粒体a t p 的产量f 这是许多细胞学实验的 共同结果1 。该理论从电子的波粒二象性出发解释激光与生物大分子的原初相互 作用，其关于红光和红外光与呼吸链组分相互作用的观点与k a r u 等人一致，但 同样缺乏对波长较短的可见光与生物大分子相互作用的阐述。 1 2 7 激光生物效应的自由基机制 为解释低强度激光辐射在治疗一系列炎症疾病中的作用，c h i c h u k 等提出了 自由基机制假说。该假说的主要观点是：对低强度激光辐射来说，内源性卟吩 ( p o r p h i n s ) 匙l 光波段( 波氏6 3 2 8 n m ) 的一种生色团；光被吸收后诱导产生的自由 基随后参与自由基反应，特别是脂质过氧化过程；细胞膜脂质过氧化水平的改变 导致包括c a 2 + 在内的离子通透性的提高；w b c 胞质内高水平的c a 2 + 引起c a “依 赖性的细胞激活，表现为细胞功能电位( f u n c t i o n - a l p o t e n t i a l ) 的升高，以及细胞受 激产生更多的氧化物前体和其它生物活性物质，包括n o 及一系列参与微循环调 节的细胞活性因子。有多方面的实验证实低强度激光可以诱导产生自由基。 o l b a n 等用6 7 0 n m 激光照射猪有核p l t ，发现有l p o 和超氧阴离子产生； g r o s s m a n 等也发现，7 8 0 n m 激光促进体外培养的人正常角化细胞( n h k ) 增殖与 r o s 的产生有关，加入抗氧化剂后促增殖作用被抑制。但与此相矛盾的是，许 多实验表明低强度激光可以清除自由基，提高机体抗氧化能力，从而减轻缺血一 再灌注伤及其它氧化性损伤。1 w a s e 等认为，低强度激光诱导产生的自由基不可 能对机体有益处，低强度激光的抗氧化损伤作用一定是源于某种目前尚未知的机 9 第一章绪论 制。我们的实验表明，低强度5 3 2 n m 激光既可以提高抗氧化酶的活性，又可以 诱导产生自由基，这取决于照射剂量。因而，自由基有可能只是激光生物效应的 伴随产物( 如伴随激光诱导的呼吸链爆发而产生) 。 1 2 8 激光生物效应的信号通路机制 现代细胞生物学研究认为，任何外界刺激信号都要通过某种特定受体或离子 通道等将信号由细胞外传到细胞内，再经过特定的胞内信号转导路径，诱导基因 表达和细胞的各种生物效应 3 3 1 。激光作为一种生物刺激信号，很有可能通过激 活胞内信号通路，从而诱导细胞的生物效应。对于低能量激光促细胞增殖与信号 通路的关系，国内外已有不少学者对此进行了研究，比如近期有许川山等提出低 能量激光促增殖效应与丝裂原激活的蛋白激酶信号传导途径有关 3 4 1 ，s h e f e r 等 人的一系列实验表明低能量激光照射促细胞增殖过程中涉及到多种信号通路蛋白 活性或表达量的变化f 2 ，3 5 3 7 等等，表明了低能量激光的生物效应和多种信号通 路有关。 小剂量激光照射促进细胞增殖的信号通路机制，已经有很多报道。比如，有 研究者通过免疫沉淀和w e s t e r nb l o t t i n g 的方法检测到小剂量的激光照射后肝细 胞生长凼子受体( h g f r ) 磷酸化的增加，和有丝分裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 磷酸 化的增加，m a p k 的激活促进了早g 1 相调节蛋白的表达，从而促进细胞周期的 进展【3 5 】。同时他们也证实了激光照射可以使磷脂酰肌醇3 激酶( p i - 3 k ) 下游的 a k t 磷酸化激活，激活的a k t 可以直接磷酸化m t o r ，后者又可以促进真核起始 因子4 e ( e i f 4 e ) 结合抑制蛋白p h a s i 的磷酸化，从而释放e l f 4 e ，促进了基因转 录和细胞周期进展 3 6 j 。有研究暗示了蛋白酪氨酸激i 晦( p t k ) 在激光照射引起中 性粒细胞呼吸爆发过程中扮演重要角色，暗示了p t k p l c - p k c n a d ( p ) h o x i d a s e 通路可能参与这一过程【3 8 】。还有报道表明激光照射可以促进细胞 i l 1 仅、i l 8 的表达从而促进角质化细胞转移与再生 3 9 1 。有人设想激光照射的 能量可能被细胞内的发色团吸收，从而转变成代谢能，比如呼吸能【4 0 】。事实上 激光照射后线粒体内a t p 的合成明显增加了【4 0 】，线粒体膜电位也发生了改变 【4 0 】。另外，激光照射也增加了细胞内c a 2 + 的水平【4 1 】，增加了活性氧( r o s ) 的生 1 0 第一章绪论 成【4 2 】。但是，大剂量激光照射诱导细胞凋亡的机制，报道甚少。有报道表明大 剂量激光照射可以损伤d n a 4 3 1 。在光动力作用诱导的细胞凋亡过程中，细胞内 产生大量的r o s 4 4 】，随后线粒体的膜电位降低 4 4 ，线粒体通透性发生变化， 线粒体结构被破坏，线粒体内的一些促凋亡因子比如细胞色素c 等等被释放 【4 4 】，从而激活c a s p a s e 一9 ，相继激活c a s p a s e 一3 4 5 ，激活的c a s p a s e - 3 切割胞内的 些底物分子而导致细胞凋亡 4 6 4 8 1 。 1 3 本研究的目的意义 尽管激光照射可以诱导很多生物效应，对其机制也进行了大量的研究，并提 出了许多解释，但是，在作用机制方面尚未形成一个完善的理论体系。 激光是如何影响信号通路的，已有文献报道激光照射过程中细胞内产生了 r o s l 4 2 】。而r o s 又可以和信号通路发生相互作用【4 9 ，5 0 】。细胞的生长与胞内各 种信号通路的协调作用是紧密相连的。r a s r a f 信号通路是调控细胞增殖的重要 通路【5 1 ，c a s p a s e 家族蛋白的激活与细胞凋亡的发生密切相关 4 7 ，4 8 】；线粒体是 提供细胞能量的重要细胞器，其内含有很多内生的光敏性分子，线粒体的膜电位 影响了线粒体的结构完整和通透性1 5 2 1 。所以研究激光照射后细胞内这些信号分 子的变化，有助于激光照射生物效应机制的进一步阐明，有助于指导激光这种相 对非损伤的手段更好地应用于临床治疗。 同时由于细胞内的生命事件是一个连续变化的过程，而大部分研究者都采用 的免疫沉淀和w e s t e r nb l o t t i n g 的方法，来研究激光照射生物效应的机制，这些 传统的生物学方法，需要破碎细胞，只能反映细胞群体的静态事件，无法做到在 活细胞生理条件下实时的对细胞内事件进行动态研究。我们利用激光共聚焦扫描 显微镜结合荧光染料探针和荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r f r e t ) 技术，克服了传统方法的缺陷，实现了单个活细胞内生命事件的 在体实时定位的动态连续观测。我们用f r e t 技术成功再现了激光照射诱导细胞 增殖、凋亡过程中细胞内一些信号蛋白活性的动态变化。激光共聚焦扫描显微镜 第一章绪论 结合荧光染料探针和f r e t 技术的使用，对于激光照射诱导细胞增殖、凋亡过程 中时间序列的级联事件的动态观测分析，具有重要的意义。 1 2 第二章激光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移技术的原理及应用 第二章激光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移技术的 原理及应用 对于普通光学显微镜，由于光的衍射，其分辨率受到了极大的限制；在高分 辨率时显微镜的聚焦深度很浅，而且对研究的样品都有很大的损伤。随着激光扫 描测量图像技术、光电技术和计算机技术的发展，将其应用于显微领域，形成了 一种新的显微镜一激光共聚焦扫描显微镜( l a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p e ， 简称l c s m ) ，它的特点在于采用共焦扫描成像技术，使激光光源、被照物和探 测器处在彼此共轭的位嚣，图像的分辨率得到了很大的提高；并通过改变聚焦深 度，获得不同深度的扫描切片，通过计算机对不同层面的图像进行重组，获得三 维立体图像，并且能够在不损伤样品的同时，对样品内部结构进行观察研究，即 所谓的活体观察。l c s m 集荧光显微镜、激光扫描和计算机图像处理功能于一 体，并使用紫外或可见光激发荧光探针，从而可以得到细胞或组织内部微细结构 的荧光图像，并能在亚细胞水平上观察诸如r o s ，甲m 等生理信号及细胞形态 的变化，成为组织形态学、分子细胞生物学、神经科学、生理学、病理学等生 物、医学领域中新一代强有力的研究工具 1 8 ，5 3 ，5 4 1 。 f r e t 技术是近年来生命科学领域出现的一种崭新的技术：利用这种技术能 够定时、定量、定位、无损伤检测活细胞内蛋白质蛋白质问相互作用。而其中 以g f p ( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 及其突变体的应用最为广泛。g f p 是从维多利亚 水母中分离出来的，受紫外线激发而发出绿色荧光，由此得名。g f p 的发光基团 是环状三肽，发光时无需辅助因子，无需作用底物。又据报道与g f p 融合表达 的蛋白质在细胞内仍能行使正常的功能，所以综合以上优点，g f p 就成了一个极 好的体内的原位的可检测蛋白质一蛋白质间相互作用的报告分子。g f p 近年来发 展出了多种突变体，通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱和发射光谱均发 生变化而发出不同颜色的荧光，有b f p ( b l u ef l u o r e s c e n tp r o t e i n ) ，c f p ( c y a n 第二章激光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移技术的原理及应用 f l u o r e s c e n tp r o t e i n ) ，y f p ( y e l l o wf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) ，d s r e d 等( 图2 - 1 ) 。这些突 变体使f r e t 方法用来研究活细胞内蛋白质一蛋白质间相互作用成为可能【5 5 】。 e x c i t a t i o n w a v e l e m 蜘 1 1 1 1 1 i e m i s s i o n w a v e l e n g t hl n m 图2 - 1 各种g f p 突变体的荧光激发和发射光谱 2 1l c s m 的原理及其功能应用 2 1 1l c s m 的原理 l c s m 系统由激光光源、扫描头、显微镜和图像处理系统四个基本组成部分 组成。图2 - 2 是本实验室所使用的德国z e i s s 公司新开发的l s m 5 1 0 - c o n f o c o r 2 型 双光予激光共聚焦扫描显微镜系统的结构示意图。如图所示，首先光束通过一个 1 4 l g口皇端_国 霉_嚣一蒜m 第二章激光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移技术的原理及应用 入射针孔的光阑作用入射到样品的细微点上，避免了非照射区域产生光散射，而 在发射光检测光路上放置了一个检测针孔，发射光通过此针孔作用到达检测器。 入射光源针孔和检测针孑l 的位置相对于物镜焦平面是共轭的，这样，来自焦平面 上、下的光被阻挡在针孔的边上，不在焦点处的光在进入针孔前已经发散，不能 够被探测器接收，排除了非焦点处散杂光的干扰，这大大提高了成像的清晰度和 分辨率。而且，照射激光束经透镜聚焦后照射到样品形成直径达微米量级的光 斑，同时物镜的焦点也位于光斑处，二者共焦于一点，从而使得到的图像与我们 在显微镜中用肉眼所见到的完全一致。另外，我们的系统具有多个激光光源和多 条激发谱线，可以同时对多荧光标记的样品同时进行多通道成像。激光功率连续 可调，通过降低激光功率，可以有效地减少了染料的漂白和光毒性。通过象素采 集的延迟和平均，可以获得高分辨率的荧光图像。， 图2 - 2l s m 5 1 0 c o n f o c o r 2 系统结构示意图 2 1 2l c s m 的功能应用 2 1 2 1 提高图像分辨率 l c s m 系统的光照和探测都限制在样品的一个点，通过对视野内所有的点逐 个扫描获得样品的整个图像。而在普通的光学显微镜中是把物体作为平面图像进 行观察的，容易产生不必要的散射光和闪烁引起的对比度降低。而且，由于 l c s m 的共焦性，只有在物方焦点处的光才能够被探测器接收，而不在焦点处的 第二章激光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移技术的原理及应用 光在进入针孔前已经成为发散光，不能够被探测器接收，排除了非焦点处杂散光 的干挠，提高了图像的分辨率 1 8 ，5 3 ，5 4 1 。 2 1 2 2 层析技术 l c s m 的激光光束聚焦到样品的某个层面，对该层面进行扫描便可获得该层 面的二维信息，由于l c s m 的共焦特性，该层面前后的光信息不能进入探测器而 被滤掉。通过改变聚焦的深度，获得样品不同层面的光学切片图像，即层析技 术。层析技术在激光扫描术中的早期应用是研究半导体的局部特性，现在则主要 应用于激光共焦扫描显微技术对生物体、组织或细胞结构进行分析。它与电子显 微镜相比，无需进行超薄切片就可对活体进行层析观察，这正是生物学、医学研 究所十分希望实现的新技术，因而在生物学、医学领域有着相当广泛的应用 1 8 ，5 3 ，5 4 】。 2 1 2 3 三维立体成像 激光共焦扫描显微镜通过改变x 轴和y 轴反射镜的偏转角来实现对x y 平 面的二维扫描，利用步进马达改变载物台在z 轴方向的位置从而获得不同层面的 二维图像信息，然后将所获得的信息输入计算机，借助于计算机对不同层面的光 信息进行三维重组，即可在不损伤样品的情况下获得该样品的三维立体图像 【1 8 ，5 3 ，5 4 。 2 1 2 4 获得实时图像 利用h 2 d c f d a 、m i t o t r a c k 、r h o d a m i n e l 2 3 等多种荧光染料探针以及各种 基因编码的荧光探针，l c s m 可对单个细胞内r o s 的动态变化作毫秒级的实时定 量分析；对线粒体、内质网、溶酶体、细胞骨架、细胞核、结构性蛋白质、 d n a 、r n a 、酶和受体分子等细胞特异结构的含量、组份及分布进行定时、定 量、定性、定位测定；同时还可测定分子扩散、膜电位、氧化一还原状态和配体 结合等生化反应变化过程。另外，l c s m 可以对细胞的面积、平均荧光强度、积 分荧光强度、细胞周长、形状因子及细胞内颗粒数等参数进行自动测定：对细胞 1 6 第二章激光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移技术的原理及应用 内各种酶活性以及蛋白质的相互作用作实时定位定量的分析。因此，l c s m 能完 成活细胞生理信号的动态监钡l j 1 8 ，5 3 ，5 4 。 2 2f r e t 基本原理及其应用 2 2 1f r e t 原理 f r e t 是指两个荧光发色基团在足够靠近时