（分析化学专业论文）新型荧光探针的合成及其与生物大分子作用的研究.pdf

摘要 摘要 近年来，荧光光谱法因其具有操作简便、灵敏度高等优点，逐渐发展成为 一种十分重要且有效的光谱分析手段，相应地，设计合成不同类型的荧光试剂 也成为这一领域工作者的重要任务之一。针对所要识别的客体，将具有选择性 识别功能的基团修饰在荧光基团上，合成具有选择性识别功能的荧光分子，根 据荧光分子与客体作用后荧光信号的变化，即可实现对客体的识别及传感。本 文设计合成了三种有机小分子化合物，利用光谱法研究了其自身或金属配合物 与生物大分子d n a 或b s a 的作用，共分四个章节进行阐述。 第一章为文献综述，对2 0 0 5 年以来国内外报道的有关荧光光谱法研究某些 小分子荧光探针与d n a 和蛋白质相互作用的研究作了简要概述。 第二章合成了新的席夫碱类化合物n ( 2 羟基萘亚甲基) 4 ( 2 羟基萘亚甲基 氨基) 苯甲酰肼( h h b h ，1 ) ，产物经1 h n m r 、质谱和取光谱鉴定。采用荧光 光谱法和u v 二s 吸收光谱法研究了1 的锌配合物l - z n 与b s a 的相互作用。在 p h7 4 啊s h c i 缓冲溶液中，以3 7 0n m 激发，该配合物1 z 1 1 在4 7 5n n l 处有弱 荧光发射，加入b s a 后荧光显著增强。同时1 z n 配合物能猝灭b s a 的内源荧 光，考察了不同温度下s t e m v o l m e r 猝灭方程以及b s a 对主体吸收光谱的影响， 结果表明此过程为形成基态配合物的静态猝灭过程，并计算出不同温度下的结 合常数k b 和结合位点数n ，结果显示几乎不随温度的变化而变化，1 1 值接近 1 。同步荧光和三维荧光光谱表明1 - z n 配合物与b s a 作用时引起了b s a 构象的 变化。依据f s r t e r 非辐射能量转移理论，确定了1 - z n 配合物与b s a 间的结合距 离和能量转移效率。 第三章合成了新的席夫碱类化合物对氨基苯乙酮对二甲氨基苯甲酰腙 ( a a d b h ，2 ) ，产物经1 hn m r 鉴定。采用荧光光谱法和u v - v i s 吸收光谱法 研究了2 与d n a 的相互作用。在p h7 4 强s h c i 缓冲溶液中，以3 4 5n m 激发， 该化合物荧光很弱，加入d n a 后4 5 0n l n 处荧光逐渐增强。离子强度对2 - d n a 荧光强度几乎没有影响，这说明2 和d n a 间不存在静电作用。d n a 对2 吸收 光谱的影响呈现减色效应，2 与热变性d n a 的研究和2 对e b - d n a 体系的猝灭 作用研究结果均表明2 主要以插入作用方式与d n a 作用。 第四章采用荧光光谱法和u v 二s 吸收光谱法研究了新化合物2 【2 ( 3 ，5 二( 2 摘要 吡啶基甲基) 氨甲基- 4 羟基苯基) 乙烯基】5 甲基吡嗪( b i p a h e m p ，3 ) 的锌配合 物3 z n 与d n a 的作用，在p h7 4 孙s h c l 缓冲溶液中，d n a 可使该配合物的 荧光增强，表明3 z n 与d n a 间发生了相互作用。d n a 对3 z n 配合物吸收光谱 的影响未呈现减色效应和红移现象，3 z n 配合物的偏振强度在加入d n a 后也未 见增强，这都表明3 z n 配合物与d n a 之间不存在插入作用。离子强度的研究、 s c a t c h a r d 曲线法以及3 z n 与热变性d n a 作用的研究结果均表明3 z n 配合物与 d n a 以静电结合方式发生相互作用，结合常数为7 9 6 x10 4l m o l 。 关键词：荧光光谱；2 - 2 一( 3 ，5 一- - ( 2 - 吡啶基甲基) 氨甲基4 羟基苯基) 乙烯基】5 甲 基吡嗪；n - ( 2 一羟基萘亚甲基) - 4 - ( 2 - 羟基萘亚甲基氨基) 苯甲酰肼；对氨 基苯乙酮对二甲氨基苯甲酰腙；d n a ；b s a f l u o r e s c e n c e p r o p e r t i e so ft h er e c e p t o r w i l l u n d e r g oc h a n g e s t h ec h a n g e o f f l u o r e s c e n c es p e c t r u mc a nb eu s e dt or e c o g n i z ea n ds e n s et h eg u e s t w ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e dt h r e ek i n do fc o m p o u n d s ，s t u d i e dt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h e mo rt h e i r m e t a lc o m p l e xa n dd n ao rb s a t h i st h e s i sc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r s i nc h a p t e r1 ，t h ed e v e l o p m e n to fs t u d i n gt h ei n t e r a c t i o n so fs m a l lm o l e c u l e sa n d b i o m o l e c u l e sh a sb e e ne l a b o r a t e ds i n c e2 0 0 5 i n c h a p t e r2 ，an e ws c h i f f - b a s ec o m p o u n d , n ( 2 一h y d r o x y n a p h t h a l e n e m e t h y l e n e ) 一4 - ( 2 一h y d r o x y l n a p h t h a l e n e m e t h y l e n a m i n e )b e n z o y l h y d r a z i n e ( 1 ) w a s s y n t h e s i z e da n dt h ep r o d u c tw a sc h a r a c t e r i s e db y1 hn m rs p e c t r u m ，m a s sd a t aa n d i rs p e c t r u m t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nz i n cc o m p l e x ( 1 z n ) a n db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w a si n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c ea n da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p i e s am a r k e d i n c r e a s ei nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f1 z nw a so b s e r v e da t4 7 5n mu p o na d d i t i o n o fb s aw h e ne x c i t a t i o nw a v e l e n g t hw a ss e ta t3 7 0n n li np h7 4 ir i s h c lb u f f e r s o l u t i o n r e v e r s e l y , t h ei n t r i n s i cf l u o r e s c e n c eo fb s a c o u l db eq u e n c h e db y1 一z n c o m p l e x t h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mw a ss u g g e s t e da ss t a t i cq u e n c h i n ga c c o r d i n g t o t h es t e r n - v o l m e re q u a t i o na n dt h eu v - v i sa b s o r p t i o ns p e c t r a lc h a n g e so fl - z nu p o n a d d i t i o no fb s a t h eb i n d i n gc o n s t a n t sk a n dt h en u m b e ro fb i n d i n gs i t e snw e r e c a l c u l a t e d t h ee f f e c to fl - z no nt h ec o n f o r r n a t i o no fb s aw a ss t u d i e du s i n g s y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y a n d t h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y 。i na d d i t i o n ，t h eb i n d i n ga v e r a g ed i s t a n c erb e t w e e nt h ed o n o r ( b s a ) a n da c c e p t o r ( 1 z n ) w a se s t i m a t e db a s e do nt h ef s r s t e r sn o n - r a d i a t i o ne n e r g y t r a n s f e rt h e o r y i n c h a p t e r3 ，a n o t h e r s c h i f f - b a s ec o m p o u n d ，p - a m i n oa c e t o p h e n o n e - p - i i i a b s t r a c t d i m e t h y l a m i n ob e n z o y lh y d r a z o n e ( 2 ) w a ss y n t h e s i z e da n da n dt h ep r o d u c tw a s c h a r a c t e r i s e db y1 hn m r s p e c t n n n t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n2a n dc a l ft h y m u s d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( c t d n a ) w a si n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c ea n da b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p i e s as i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f2w a so b s e r v e d u p o na d d i t i o no fc t - d n ai np n7 4t r i s h c lb u f f e rs o l u t i o nw h e ne x i t e da t3 4 5i l i n t h ei o n i cs t r e n g t he x p e r i m e n tr e v e a l e dt h a tt h e r ew a sn oe l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n b e t w e e n2a n dc t d n a t h ea b s o r p t i o nt i t r a t i o no f2 、析t hc t - d n as h o w e d h y p o c h r o m i ce f f e c t s t u d yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e n2a n dd e n a t u r e dc t - d n aa n d2 q u e n c h i n gt h ef l u o r e s c e n c eo fe b - d n ab o t hr e v e a l e dt h a tt h ei n t e r a c t i o nm o d e b e t w e e n2a n dc t d n aw a si n t e r c a l a t i o ni n t e r a c t i o n i n c h a p t e r4 ，t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e n z i n c c o m p l e x o f2 一 2 ( 3 ，5 - b i s ( 2 一 p y r i d y l m e t h y l ) a m i n o m e t h y l - 4 - h y d r o x y - p h e n y l ) e t h y l e n e 5 一m e t h y l p y r a z i n e ( 3 ) a n d c t - d n aw a ss t u d i e db yf l u o r e s c e n c ea n da b s o r p t i o ns p e c t r a la s s a y an o t a b l ei n c r e a s e i nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f3 - - z nw a so b s e r v e du p o na d d i t i o no fc t - - d n ai np h7 4 ir i s h c lb u f f e rs o l u t i o n t h ea b s o r p t i o nt i t r a t i o no f3 - z nw i t l lc t d n as h o w e dn o b a t h o c h r o m i cs h i f ta n dh y p o c h r o m i ce f f e c t n oa n i s o t r o p yi n c r e a s ew a so b s e r v e d w h e nc t - d n aw a sa d d e dt o3 - z ns o l u t i o n t h e yb o t hp r o v e dt h el a c ko fi n t e r c a l a t i o n i n t e r a c t i o nb e t w e e n3 一z na n dc t - d n a t h ei o n i cs t r e n g t he x p e r i m e n t ，s c a t c h a r dp l o t , s t u d yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e n3 - z na n dd e n a t u r e dc t d n aa l lr e v e a l e dt h a tt h e i n t e r a c t i o nm o d eb e t w e e n3 一z na n dc t - d n aw a se l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n b i n d i n g c o n s t a n tw a sc a l c u l a t e dt ob e7 9 6 xl0l m o l k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ；n 一( 2 - h y d r o x y n a p h t h a l e n e m e t h y l e n e ) - 4 - ( 2 - h y d r o x y l n a p h t h a l e n e m e t h y l e n a m i n e ) b e n z o y l h y d r a z i n e ；p a m i n oa c e t o p h e n o n e - p - d i m e t h y l a m i n ob e n z o y lh y d r a z o n e ；2 - 【2 ( 3 ，5 - b i s ( 2 - p y r i d y l m e t h y l ) a m i n o m e t h y l - 4 - h y d r o x y - p h e n y l ) e t h y l e n e - - 5 - m e t h y lp y r a z i n e ；d n a ；b s a i v 1 2 4 硫脲类荧光探针6 1 2 5 苯乙烯花菁染料类荧光探针7 1 2 6 黄酮类荧光探针8 1 2 7 其它类荧光探针9 1 3 金属络合物探针l0 1 3 1 席夫类碱金属配合物。1o 1 3 2 卟啉类金属配合物15 1 4 其它类型荧光探针1 6 1 5 论文设想1 6 第2 章荧光光谱法研究一种新的席夫碱金属配合物与b s a 的相互作用1 8 2 1 前言1 8 2 2 实验部分18 2 2 1 主要仪器18 2 2 2 主体化合物的合成1 9 2 2 3 实验中所用试剂2 0 2 2 4 实验方法2 0 2 3 结果与讨论2 1 2 3 1z n 2 + 对主体l 吸收光谱的影响及其配位比的测定2 1 2 3 2b s a 对配合物1 - z n 荧光光谱的影响2 2 2 3 3 配合物1 - z n 对b s a 荧光光谱的猝灭作用2 3 v 目录 2 3 4 结合常数k b 与结合位点数n 2 6 2 3 5 配合物l - z n 与b s a 之间的能量转移2 7 2 3 6 配合物1 - z n 对b s a 构象的影响2 9 2 4 结论3 2 第3 章荧光光谱法研究新型席夫碱化合物与d n a 的作用3 3 3 1 前言3 3 3 2 实验部分3 3 3 2 1 主要仪器3 3 3 2 2 主体化合物的合成3 4 3 2 3 实验中所用试剂3 5 3 2 4 实验方法3 5 3 3 结果与讨论3 6 3 3 1d n a 对主体2 荧光光谱的影响3 6 3 3 2d n a 对主体2 吸收光谱的影响3 7 3 3 3 离子强度对2 - d n a 体系荧光光谱的影响3 8 3 3 4 热变性d n a 与2 的作用3 9 3 3 5 主体2 对e b d n a 体系荧光光谱的影响3 9 3 4 结论4 1 第4 章新型荧光探针与d n a 分子的相互作用4 2 4 1 前言4 2 4 2 实验部分_ 4 2 4 2 1 仪器与试剂。4 2 4 2 2 实验方法4 3 4 3 结果与讨论4 4 4 3 1d n a 对3 - z n 荧光强度的影响4 4 4 3 2d n a 对3 - z n 配合物吸收光谱的影响4 5 4 3 3 离子强度对3 - z n 与d n a 作用荧光强度的影响4 6 4 3 4 荧光偏振4 6 4 3 5 配合物3 - z n 对e b d n a 体系荧光光谱的影响。4 6 v l 一 ! ! ! 一二一 _ 一 4 3 6 配合物3 - z n 与热变性d n a 的作用4 8 4 3 7 结合常数4 9 4 4 结论吖”5 0 全文总结与展望，z 致谢一5 4 参考文献5 5 附录o z 攻读学位期间的研究成果6 4 v i l 符号说明 一 符号说明 ，7 i 、 ，_ 。、 r i 、? _ 、，_ 弋o 、二7 n 一、h o o h 。7 h n n p - - 、 、 、心7 中文名称：n ，( 2 羟基萘次甲基m ( 2 羟基萘次甲基氨基) 苯甲酰肼 英文名称：n - ( 2 - h y d r o x y n a p h t h a l e n e m e t h i n e ) - 4 - ( 2 - h y d r o x y l n a p h t h a l e n e m e t h i na m i n o ) b e n z o y l h y d r a z i n e 代称：h h b h ( 1 ) h 3 c 厂、q。 n 、： h 3 c 、= _ h n n ，一 t 、 ，一n h 2 h3c。7 中文名称：对氨基苯乙酮对二甲氨基苯甲酰腙 英文名称：4 - a m i n oa c e t o p h e n o n e - ( 4 - d i m e t h y l a m i n o ) b e n z o y lh y d r a z o n e 代称：a a d b h ( 2 ) r = 二= 、 、。、n 、 7 、弋、 、一nn j ，- = 一 、 n 一、，_ 一 ，j o h h 3 c 一一，7 二n 厂nn = ，- = = = 。 ， 0n 中文名称：2 - 2 ( 3 ，5 二( 2 吡啶基甲基) 氨甲基- 4 一羟基苯基) 乙烯基】- 5 甲基吡嗪 英文名称：2 2 - ( 3 ，5 b i s ( 2 p y r i d y i m e t h y l ) a m i n o m e t h y l - 4 一h y d r o x y - p h e n y l ) e t h y l e n e 。5 - m e t h y l p y r a z i n e 代称：b i p a h e m p ( 3 ) 1 1 概述 脱氧核糖 生命活动过程 胞的主要成分 因表达的物质 研究小分子与 质，并为一些抗肿瘤和抗病毒药物的设计合成提供理论支持。由于荧光光谱法 具有用样量小、测定过程快速简便及灵敏度高等优点，使其得到了广泛的应用【2 j 。 吖啶、菲啶类染料是应用最早的核酸探针，以吖啶橙1 3 】和溴化乙锭1 4 为代表， 它们通过嵌入或静电吸引与d n a 结合，使d n a 的荧光大大增强，是非序列特 异的小分子探针。吖啶橙和溴化乙锭类染料虽然与d n a 结合稳定，但未结合的 染料自身的荧光会造成高的荧光背景，干扰检测，同时溴化乙锭具有强毒性， 因此，g l a z e r 5 ，q 研究组开发了一类对d s d n a 具有高度亲和力的不对称菁类染 料t o t o 和y o y o ，染料在溶液中荧光极弱，降低了检测过程中的荧光背景干 扰，当与d s d n a 结合后发生强烈的荧光，荧光增强约1 0 0 0 倍。1 8 7 1 年，v o nb a y e r 合成了荧光素1 7 ，其在水中的最大吸收和发射波长分别为4 9 2 和5 7 1n l t l ，荧光 量子产率在p h 8 时达到o 9 2 ，因此，大量的荧光素类衍生物被合成并用作d n a 【8 】 和蛋白质【9 】的荧光探针。罗丹明染料分子呈刚性平面，亦有较高的荧光量子产率， 故此也广泛应用于d n a 和蛋白质的荧光探针。此后许多研究人员致力于合成各 种d n a 和蛋白质生物分子的荧光探针，取得了许多研究成果，也有相应的综述 发表【l o 1 2 】。本文仅就2 0 0 5 年以来国内外报道的有关荧光光谱法研究某些小分子 与d n a 或蛋白质相互作用的研究进展作一简要概述。 1 2 各种有机分子荧光探针 1 2 1 吖啶类荧光探针 吖啶染料通常被用作细胞、膜、脂蛋白、蛋白质和核酸等生物物质的荧光 第1 章引言 探针。因为它在可见光区有很大的吸光系数、很强的荧光，而且和d n a 结合时 有很大的结合常数。s a b o l o v ad 等1 1 3 】研究了一系列n ( 9 丫啶基氨基硫羰基) 氨基 酸( a t a ) 与质粒d n a 的作用。这些氨基酸包括氨基乙酸( g l y c i n e ) 、脯氨酸 ( p r o l i n e ) 、亮氨酸( l e u c i n e ) 、组氨酸( h i s t i d i n e ) 、苯基丙氨酸( p h e n y l a n i n e ) 及色氨酸( t r y p t o p h a n ) 等。结果表明插入试剂( 探针) d n a 络合物的稳定性、 形成的动力学参数和几何结构等不仅仅依赖于平面的插入模版，还依赖于大的 侧链基团的成分和结构。各种吖啶衍生物与d n a 的结合大小顺序为9 a a ( 7 ) a t g i y ( 1 ) a t p r o ( 2 ) a t l e u ( 3 ) 舢i s ( 4 ) a t p h e ( 5 ) a t t r p ( 6 ) ， 9 a a 为盐酸9 氨基吖啶。含有大的取代基的化合物1 - 6 通过1 2 种方式与d n a 结合，比7 更加有效。这可能是因为吖啶9 位上大的取代基导致吖啶衍生物1 - 6 的疏水性增强所致。荧光猝灭实验表明它们与d n a 的作用为插入模式。根据 a m l 计算，在御除的互变异构体中，a 型结构更易插入d n a 的双螺旋结构中。 fhh 2fh 厂 fhh 2fh h n nc 。c o o hh n “n 一。 f 1 7 _ ：、f ，。i j7 ， ，if l7 ，i ：，l 7 ：1 、1 、| 占c ，c ，h 、 n 一7 n a t g l y ，1 a t p r o 2 爷hc 乜h 3帚hc o 刚n h n ncc hh n 止一ncc 、 ，、，hc h 3 ，、一j ，气h 屯- - n h | | ，! j 、，jj f 1 jf ，l 旷，) 羔嚣阮旷， ：! ! ：! # 于l n ：h 2 i ili h c x i ezh 掣1 钔研究了一种吖啶衍生物( n ( a c r - 4 c a ) 0 t a l a ) ( 8 ) ，该物质 在吖啶上引进一个阳离子侧链n n 二甲基氨乙基，并在c 一9 位上引入一个a 丙 氨酸。因为吖啶族探针常通过范德华力和离子键与d n a 骨架上的磷酸阴离子作 用，引进阳离子侧链n ，n 二甲基氨乙基可以有效加强吖啶衍生物的插入能力， 2 第l 章引言 而且能够通过和鸟嘌呤形成氢键而与d n a 发生沟槽结合。在c 9 位上引入一个 q 丙氨酸可以和腺嘌呤、鸟嘌呤形成氢键从而加强了与d n a 的结合力，并可提 高化合物的水溶性。实验结果表明n ( a c r - 4 c a ) - a a l a 与d n a 的作用模式为 插入作用。 h 2h 2 h n cc c o o h ljl ，j 、7 n 1 hh 2h 2c h 3 o l n c ：c = n 8 c h 3 吖啶是一个传统的插入试剂，它的一些衍生物已经用做抗肿瘤药物，如9 苯胺吖啶和m 安吖啶及其衍生物已经作为临床上的抗白血病药物，然而目前的 抗肿瘤药物对健康细胞也有很大的杀伤力，对肿瘤细胞缺乏高选择性，因此， 设计具有选择性识别作用的药物成为研究的热点。相关研究结果表明：一个抗 癌试剂的抗癌活性可以通过在芳香环上加入一个特别的侧链而进行改进，这些 改变可以调整d n a 的亲和力和选择性。r a m i r e zfj 等f 1 5 】研究了精胺结合的吖啶 ( 9 ) 与寡聚核苷酸的作用。精胺是生物体内产生的聚胺物质，聚胺是细胞繁殖 的重要聚阳离子，而且能和核酸作用。这些使精胺成为一个很好的侧链。当精 胺结合到吖啶上时降低了其对健康细胞的损害。 n h 2 + ( c h 2 ) 3 n h 2 + ( c h 2 ) 3 n h 2 + ( c h 2 ) 4 n h 2 * ( c h 2 ) 3 n h 3 * ， ，、 0 ， ! ： ：1 。7 n 、7 9 1 2 2 卟啉类荧光探针 z h o ux 等【1 6 】合成了季铵卟啉( 1 0 ) 和一系列多b 取代的阳离子卟啉， 2 ，3 ，1 2 ，1 3 四苯基5 叫三甲基- 4 铵苯基) 1 0 ，1 5 ，2 0 三苯基卟啉( 1 1 ) ，2 ，3 ，1 2 ，1 3 - 四苯基5 m 三甲基- 4 铵苯基) 1 0 ，1 5 ，2 0 三苯基卟啉( 1 2 ) ，2 , 3 ，7 ，8 ，1 2 ，1 3 ，1 7 ，1 8 一 八苯基5 叫三甲基_ 4 铵苯基) 1 0 ，1 5 ，2 0 三苯基卟啉( 1 3 ) ，2 , 3 ，7 ，8 ，1 2 ，1 3 ，1 7 ，1 8 - 八苯基5 ，1 0 - - ( n 三甲基4 铵苯基) 1 5 ，2 0 三苯基卟啉( 1 4 ) ，研究了它们的光氧 化能力以及与d n a 的相互作用。u v - v i s 吸收光谱、荧光光谱、c d 谱和d n a 光裂解实验等研究结果均表明卟啉d 位的取代对卟啉与d n a 的作用和结合模式 有很大的影响，卟啉正电荷的增加增强了它们与d n a 的作用，同时也增强了 3 第1 章引言 d n a 光裂解能力。 l j r 、 、j n h n - = = 、 ，一、+ 2 ：nw 一产：j 一赫i 曲s 厂nh n 一一 一 ，+ j 、 f 、 【j j i ij 1 ，r 7i 。厂r ? 一一n hn = ， 7 一i卜j ，一n ( c h 3 ) 3 。 n h n 一、一i r 一一 u， 、 二， f j 1 1 ：r = p h 1 2 ：r = m e f l! i p i。、， p h p h 、r 、1s p h 争二o 却i s ，s 、 、 ? 、，、，1 1 、_ o l o 一n h n 一、 7 1 、 p h ，j 赢 fl i t r 1 3 ：r ；h 1 4 ：r = n ( c h 3 ) 3 p a r = jh 等l l7 j 研究了5 嘧啶1 0 ，1 5 ，2 0 三( p 氯苯基) 卟啉( t y t p p ，1 5 ) 与环 糊精( c d ) 和d n a 的作用。t y t p p 可以和三甲基b 环糊精( t m p c d ) 形成 1 ：1 的包合配合物，而和b c d 却很难形成包合配合物，这表明包合过程中疏水 效应起了很重要的作用。t y t p p 也可以沿着d n a 的螺旋通过外侧堆积作用和 d n a 结合而非插入作用，这是因为卟啉中心具有很高的电子密度。然而当加入 t i m p c d 后，t y t p p 与d n a 的作用减弱，这是因为t y t p p 进入到t m p c d 的 空穴增加了t y t p p 周围环境的疏水性从而影响了t y t p p 与d n a 的作用。 第1 章引言 h u a n gjw 等【1 8 】研究了在n a h 2 p 0 4 缓冲溶液中两种卟啉阳离子h 2 t m p y p ( 1 6 ) 和c t m p v p ( 1 7 ) 与d n a 的相互作用。结果表明c t m p y p 与d n a 的结 合方式为外部静电结合，h 2 t m p y p 与d n a 的结合方式为插入模式。这是因为 羧基苯起了很重要的作用，它不仅使整个分子的正电荷降低，而且比甲基吡啶 的空间位阻大，另外它也大大改变了某些前线轨道的性质和能级，特别是最低 空轨道( l u m o ) 及其附近的非占据分子轨道。 c h a 铲i 1 、漆二。毋 即n 一二 h s c - n 夕弋、 ；，一ro i 型产心h n r 2 = 弋，c lo h 、2 一 一vv i 7 厂、 一 f 。l l i “n h 2 t m p y p ，1 6 c t m p y p ，1 7 1 2 3 蒽类荧光探针 c h c n l h 等【1 9 】研究了在十二烷基磺酸钠( s d s ) 胶束中，d n a 对杰纳斯绿 b ( j g b ，1 8 ) 荧光强度的影响。实验结果表明在s d s 胶束中，j g b 的弱荧光增 强，最大发射峰从4 2 5n l t l 紫移到4 1 0n n l ；在d n a 的存在下，j g b 的荧光发生 猝灭，荧光的猝灭程度( f o f ) 与d n a 的浓度在一定范围内成线性关系。在高 浓度d n a 存在时，由于静态猝灭和动态猝灭的同时存在，它偏离了s t e m v o l m e r 方程。离子强度和p 0 4 3 。浓度效应表明j g b 是通过静电与d n a 表面的p 0 4 3 作用 的。 二。zh二：|?i二：jl|：i、：j7荸?，jj+c r ofj j l i ujs 等1 2 们以9 葸甲酸( a c a ，1 9 ) 甲基溴化铵( c t a b ) 体系作荧光探 针提出了一种测定d n a 的高灵敏荧光方法。随着c t a b 的加入，a c a 和c t a b 形成了不发荧光的离子缔合络合物，使a c a 的荧光逐渐减弱，而当c t a b 的浓 5 第1 章引言 度进一步增加时，a c a 进入到c t a b 胶束的中心而不能形成离子缔合络合物， 此时a c a 的荧光又被增强且发射峰红移。随着d n a 的加入，a c a c t a b 体系 的荧光强度显著增强( a c a 的荧光强度没有变化) ，在最佳测定条件下，荧光强 度的变化与c t d n a 或f s d n a 的浓度成线性关系，线性范围为o 0 8 1 0g g m l ， 检测限分别为0 0 1 9 嵋m l d 和0 0 2l x g m l 。与其它荧光方法相比，此方法具有 灵敏度高、操作简单及干扰小等优点。 c i o o h 7j 1 9 1 2 4 硫脲类荧光探针 硫脲类化合物因其含有强配位能力的n 、s 等配位原子及n h 基团，能与生 物分子作用，具有显著的生物活性。具有分子内电荷转移( i c t ) 荧光特性的化 合物对外部微环境极其敏感，当微环境疏水性增强时，其荧光强度增大。在极 性溶剂中常出现长波长的c t 态发射，可以消除生物体系自身的荧光干扰【2 l 】。因 此，吴芳英等【捌合成了基于i c t 的荧光分子对二甲氨基苯甲酰胺基硫脲( 2 0 ) 和对n 二甲氨基苯甲酰胺基- n 苯基硫脲( 2 1 ) 。在p h7 4 的 i r i s h c l 缓冲溶液 中，2 0 的荧光峰在4 3 6n n l ，因荧光共振能量转移作用( f l 迮t ) 和h a s 或b s a 的疏水环境，2 0 的荧光强度随着人血清白蛋白h s a 或牛血清白蛋白b s a 的加 入而线性增强，并且荧光峰蓝移至4 3 0n m 。据此定量测定蛋白质含量，方法检 测限分别为8 3 9 x 1 0 母m 0 1 l - 1 ( h s a ) 和7 5 4 1 0 一m 0 1 l - 1 ( b s a ) 。2 0 与h s a 和 b s a 的结合常数分别为1 4 1 x 1 0 5m o l l 。2 0 猝灭蛋白质的荧光为形成基态配合 物的静态猝灭过程，同步荧光显示2 0 与蛋白质结合后改变了蛋白质的二级结构。 而n 位上被苯环取代的化合物2 l 与蛋白质没有作用，推测为苯环的空间位阻所 致。 ：= = o 旷j 厂一nr 然0r = 衲h h n n h 一 ；d o h sh 崔凤灵等【2 3 。2 9 】合成了饱和烃类硫脲类衍生物2 2 ，它可以强烈地猝灭b s a 和 h s a 的内源荧光，根据猝灭常数饬的计算得出2 2 对b s a 和h a s 的猝灭属于 形成新的化合物的静态猝灭。并且根据a l l ，a g 和s 的计算结果可知，2 2 与 6 第1 章引言 b s a 或h a s 主要是通过疏水力作用，依据f 6 r t e r 非辐射能量转移理论，确定了 2 2 与b s a 或h s a 发生了非辐射能量转移，进一步证实了2 2 与b s a 或h s a 间 属于静态猝灭。此后该研究小组又合成了一系列饱和烃和二芳基硫脲衍生物 2 3 - 2 8 。它们与蛋白质的作用情况类似，其中2 4 和2 7 与蛋白质结合的常数低于 其它几种。同时根据2 4 或2 8 的同步荧光光谱变化同b s a 或h s a 浓度呈线性关 系建立了测定b s a 或h s a 的方法。并理论计算模拟了蛋白质晶体结构与2 8 的 作用情况，结果显示2 8 与蛋白质结合区域主要位于i i a 和i i i a 域的疏水空穴， 同时与h s a 的精氨酸和天冬氨酸残基之间还存在氢键作用。 r 钭8 、l 2 2r = c 6 h 1 3 2 5r = c 1 1 h 2 3 筘r = o c 2 h 5 r 、r ? l0f 。f l h nh nfi 拍r = c i 2 8 r = o c 2 h 5 。旷，j f f口 严，j 夕。钭飞一7 一一少 万 1 2 5 苯乙烯花菁染料类荧光探针 k u r t a l i e ven 等 3 0 l 合成了一系列基于f 染料( e ) - 4 ( 4 ( - - 甲基氨基) 苯乙烯 基1 1 一甲基碘化吡啶盐( 2 9 ) 的单体和二聚体苯乙烯花菁染料3 0 - 3 5 ，在水溶液 中研究了其加入b s a 和d n a 后的光谱性质。结果显示，随着b s a 和d n a 浓 度的增加，染料的吸收光谱出现红移，荧光强度明显增强，然而吸收光谱和荧 光光谱的形状并没有变化。计算了结合常数和结合位点数，结果表明含有戊基 或更长连接基团的二聚苯乙烯花