（应用化学专业论文）数字图像处理技术在平面色谱和点阵检测中的应用研究.pdf

四川大学硕士学位论文y6 5 4 2 5 6数字化图像处理技术在平面色谱及点阵检测中的应用研究应用化学专业研究生：敬小丽指导老师：梁冰平面凝胶电泳是d n a 、核酸、蛋白质日常分离分析不可缺少的工具：薄层扫描色谱是有机物、药物尤其是天然药物分离分析的主要手段，也是构建中药指纹图谱的主要技术之一：生物芯片是基因测序与表达、基因诊断、蛋白功能研究、药物高通量筛选的现代先进技术。它们的信息获取均是以平面图像检测为原理。因此，能够将计算机数字化图像处理技术运用于这类复杂的图形图像处理，使这类分析检测技术容易实现自动化、信息化、定量准确化以及仪器小型经济化。因此，本论文根据数字化图像处理技术的原理，运用v i s u a lc + + 语言和d e l p h i 语言，研究开发出了个数字化图像处理的软件，旨在：1 ) 硬件上使用价格便宜的办公用扫描仪数码相机紫外检测仪，替代价格昂贵的专业薄层扫描色谱仪、专业凝胶电泳成像及处理系统、生物芯片检测仪。2 ) 能够进行薄层色谱、平面凝胶电泳等平面色谱的定性定量分析。3 ) 能够进行中药指纹图谱相似度的计算与比较。4 ) 能够进行点阵图像的检测，为生物芯片的检测打下基础。经过多方面的应用研究，结果表明：以办公用扫描仪数码相机紫外检测仪为硬件的本数字化图像处理系统一、能够进行薄层色谱、平面凝胶电泳的定性定量分析：1 ) 给出薄层色谱的定性指标r ，值。i索轻存誊擘踊露愆舞蠹一o ，。j数字化图像处理技术在平面色谱及点阵检测中应用的研究2 ) 能够将薄层扫描色谱、平面凝胶电泳图像斑点( 包括可视图像，紫外荧光图像) 的颜色深浅和大小准确定量地转化为数值，相关系数在o 9 9 以上。二、能够进行中药薄层扫描色谱指纹图谱、平面凝胶电泳指纹图谱等相似度的计算与比较。1 ) 指纹图谱的文件格式可以是b m p 、j p o 、g i f 等众多的w i n d o w s 通用格式。2 ) 记录纸上打印的分析图谱也能应用。三、在点阵图像检测方面1 ) 能够清晰分辨密度高达约6 4 0 0 个点c m 2 的可见光点阵，每个点的面积小于0 0 1 5 m m 2 ，相当于生物芯片中的高密度点阵范畴。随着办公扫描仪的分辨率提高，本数字图像处理系统处理密集点阵的能力还能进一步完善。2 ) 可清晰分辨以浓度为l p p m 的核黄素溶液点构成的6 4 个点c m 2 的荧光点阵。每个点相当于溶液体积约l 乩、绝对量为l n g 的核黄素。本系统在生物芯片检测上的应用己具备了基础，有待进一步研究。四、程序整体优化设计水平高，人机交换界面友好。软件中引入了数据库，数据自动列表，能进行编辑，且可以e x c e l 的格式保存，为文档处理和工作曲线的绘制提供了极大的方便。本数字化图像处理系统与专业仪器相比，设备简单、价格低廉、操作便捷、易于普及。为我国众多大专院校和中小企业的普通实验室广泛开展平面色谱研究与应用以及中药质量评价和控制提供了一条行之有效而又经济的途径。关键词：数字图像处理平面色谱点阵指纹图谱相似度l 四j t l 大学硕士学位论文t h er e s e a r c ho ft h ea p p l i c a t i o no fd i g i t a li m a g ep r o c e s s i n gt e c h n i q u et ot h ep l a n a rc h r o m a t o g r a p h ya n da r r a yd e t e c t i o nm a j o r ：a p p l i e dc h e m i s t r yp o s t g r a d u a t e ：j i n gx i a o l is u p e r v i s o r ：l i a n gb i n gp l a n a rg e le l e c t r o p h o r e s i si sa ni n d i s p e n s a b l et o o lf o rt h es e p a r a t i o na n da n a l y s i so f d n a ，r n aa n dp r o t e i n ；t h i nl a y e rs c a n n i n gc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) i sam a i nm e t h o df o rt h es e p a r a t i o na n da n a l y s i so fo r g a n i c s ，m e d i c i n e ，e s p e c i a l l yt h en a t u r a lm e d i c i n e ，t l ci sa l s oo n eo ft h em a i nt e c h n i q u e sf o rt h ef i n g e r p r i n to fc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e b i o c h i pi sa na d v a n c e dt e c h n o l o g yf o rg e n es e q u e n c ed e t e r m i n a t i o n ，g e n ee x p r e s s i o n ，g e n ed i a g n o s i s ，p r o t e i nf u n c t i o nr e s e a r c h ，h i 【g ht h r o u g h - p u tf o rc a n d i d a t em e d i c i n e t h es i g n a l e x t r a c t i o np r i n c i p l eo ft h i se n t i r ea n a l y t i c a lt e c h n i q u ei s2 - d i m e n s i o n a li m a g ed e t e c t i o n s oc o m p u t e r a s s o c i a t e dd i g i t a li m a g ep r o c e s s i n gc a nb eu t i l i z e d t h e r e f o r ei nt h i st h e s i s ，an e ws o f t w a r ef o rc o m p u t e r - a s s o c i a t e dd i g i t a li m a g ep r o c e s s i n gw a sd e v e l o p e db yu s i n gv c + + d e l p h il a n g u a g e i tw a se x p e c t e dt oh a ss u c hf o l l o w i n gf u n c t i o n s ：1 ) u s ec h e a pc o m m o ns c a n n e ro rd i g i t a lc a l i l e r a u l t r a v i o l e ta n a l y z e rt or e p l a c ee x p e n s i v ep r o f o s s i o n a lt h i nl a y e rs c a n n i n gc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) a n dt h ep l a n a rg e le l e c t r o p h o r e s i si m a g i n gs y s t e m 2 ) b ea b l et od oq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so ft l ca n dp l a n a rg e le l e c t r o p h o r e s i s 3 ) b ea b l et oc a l c u l a t ea n dc o m p a r et h es i m i l a r i t yo fc h r o m a t o g r a p h yo fc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e sf i n g e r p r i n t 4 1b ea b l et od e t e c t2 - d i m e n s i o na r r a yi m a g i n g ，l a y i n gaf o u n d a t i o nf o rb i o c h i pd e t e c t i o n an u m b e ro fa p p l i c a t i o n sh a v es h o w nt h a tt h i sd i g i t a li m a g ep r o c e s s i n gs y s t e mm数字化匿像处理技术在平面色谱及点阵检测中应用的研究w h i c hc o m b i n e st h es o f t w a r ew i t hac o n m l o ns c a n n e ro rad i g i t a lc a m e r a u l t r a v i o l e ta n a l y z e rh a ss u c hf o l l o w i n gf u n c t i o n s ：1 b ea b l et od ot h eq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so ft l ca n dp l a n a rg e le l e c t r o p h o r e s i s ：1 ) g i v et h ev a l u eo f r f , aq u a l i t a t i v ep a r a m e t e ri nt l c 2 ) b ea b l et ot r a n s f o r mq u a n t i t a t i v e l yas p o to rab a n d ( v i s i b l eo rf l u o r e s c e n t ) o nap l a n a ro f t l co rp l a n a rg e le l e c t r o p h o r e s i si n t od i 瘿t 司v a l u e 2 b ea b l et oc a l c u l a t ea n dc o m p a r et h es i m i l a r i t yo fc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e sf i n g e r p r i n t ：1 、t h ef i l ef o r m a to ff i n g e r p r i n tc a nb ew i n d o w sg e n e r a lf o r m a t ss u c ha sb m p ,j p ga n dg i et h ei n t e r n e tf i l ef o r m a tc a na l s ob en t i l i z e d 2 ) f i n g e r p r i n to nr e c o r dp a p e rc a na l s ob eu t i l i z e d 3 i nt h ea s p e c to f a r r a yd e t e c t i o n1 1av i s i b l ea r r a yo f 6 4 0 0 d o t s c m = ，w i t ha na r e ao f e a c hd o tl e s st h a n0 0 1 5 m m zc a nb ec l e a r l yd i s c r i m i n a t e d 2 1af l u o r e s c e n ta r r a yo f6 4 d o t s c m 2 ，d r a w nw i t hal a c t o f a l v i ns o l u t i o no fl p p m ，e a c hd o tc o n t a i n i n gl n gl a c t o f a l v i n , c a nb ec l e a r l yd i s c r i m i n a t e d 4 h a v i n gf r i e n d l yh u m a n e c o m p u t e ri n t e r f a c ei nt h es o f t w a r e ，d a t a b a s et e c h n i q u en 粥a p p l i e d s oi tp e r m i t sd a t aa u t ol i s t ，a u t oe d i t i o n ，a n ds a v i n gaf i l ea se x c e lf o r m a t c o m p a r e dw i t hp r o f e s s i o n a li n s t r u m e n t s ，t h ep r o p o s e dd i g i t a li m a g ep r o c e s s i n gs y s t e mh a st h ea d v a n t a g eo fs i m p l ee q u i p m e n t ，l o w e rp r i c ea n dc o n v e n i e n to p e r a t i o n ，s oi ti se a s yt os p r e a d t h i ss y s t e mp m v i d e sa l le f f e c t i v ea n de c o n o m i cw a yf o rp l a n a rc h r o m a t o g r a p h yr e s e a r c ha n da p p l i c a t i o n ，a n df o rq u a l i t ye v a l u a t i o na n dc o n t r o lo fc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n ei nm a n yc o m n l o nl a b o r a t o r i e so f c o l l e g e sa n ds m a l l - m i d d l ee n t e r p r i s e si no u rc o u n t r y k e y w o r d s ：d i g i t a li m a g ep r o c e s s i n g ；p l a n a rc h r o m a t o g r a p h y ；a r r a y ；f i n g e r p r i n ts i m i l a r i t y堕型查兰堡圭堂垡堡壅1 前言色谱技术是当代最重要的物质分离分析技术。色谱方法及其原理各种各样，就其固定相的形式而言，可以分为柱色谱和平面色谱。其中，以平面图像为检测原理的平面色谱技术如薄层扫描色谱、平面凝胶电泳具有设备简单、操作方便、样品用量少、预处理简单、可平行分离多个样品、分析时间短、分离效能高、灵敏、结果准确等诸多优点，在化学、生物、医药领域有着广泛而重要的应用。平面凝胶电泳是d n a 、核酸、蛋白质日常分离分析不可缺少的工具。而薄层扫描色谱法则是有机物、药物分离分析的主要手段，也是构建中药指纹图谱的主要技术之一。中药指纹图谱已成为当今国内外认同的中药以及植物药的质量评价和控制的有效方法，有利于中药及其产品进入国际市场。近年来迅速发展的生物芯片是二十世纪的重大科学技术发明之一，在基因测序、基因表达、基因诊断、药物高通量筛选方面有着重要意义。芯片的检测可以看作是对由光波长和强度不同的密集点阵构成的平面图像的检测。可见，平面色谱、芯片点阵的检测归根结底是平面图像的检测与处理。数字化是图像处理的潮流，计算机技术极大地推动了数字化图像处理技术的发展。以计算机为基础的数字化图像处理技术使复杂的图形图像处理变得简便快捷。数字图像处理技术在化学、生物、药学领域中的最重要的应用之一就是平面色谱图像处理的数字信息化，结果计算分析的自动化，定量准确化，仪器简便化。国外对此的研究较早，而国内这方面的工作最近才开始。1 1 薄层色谱法简介薄层色谱法最早是由俄国科学家i z m a i l o v 和s c h r a i b e r 于1 9 3 8 年发明建立的。经过近七十年的发展，已经成为有机物分析，中药或植物药分离鉴定、分析的一种重要的技术。它是在平滑光洁的玻璃、金属、塑料板上( 或聚酯薄膜上) ，把硅胶或氧化铝等吸附剂用淀粉、石膏或醋酸纤维素等固定剂铺成薄层作为色谱固定相，用溶剂( 流动相) 把试样展开，利用显色剂使分离了的组分显色( 有紫外吸收的组分可用紫外光照射显示出荧光斑点或在荧光板上显示荧光猝灭斑点) ，根据组分展开的距离与展开剂前沿所移动的距离之比值r r 进行定性分析，根据色谱斑点的大小和颜色深浅进行定量分析的方法。薄层色谱法具有众多的优点“：设备简单、操作方便、样品用量少，分离数字化图像处理技寒在平面色谱及点阵检测中应用的研究速度快、灵敏度及分辨率高，结果准确，固定相使用一次后即可弃去。所以只要样品中的杂质不影响测定的进行，就不必考虑杂质的污染问题，样品预处理比较简单：对被分离物质的性质没有限制；具有多路柱效应，可同时进行多个样品的分离，所以样品分析时间短；优化展开剂的组成非常方便，不受检测器的限制，在同一色谱上可根据被分离化合物的性质选择多种检测方法进行定性或定量，并且可以重复测定。因此，薄层色谱法的应用范围很广，使用频率很高。涉及的领域包括生化，医药，临床、环境化学，食品农业等o 。”。各国的药典收录的薄层色谱法占不小的比例。中国药典( 2 0 0 0 版) 收录薄层色谱作鉴别的品种已达7 3 0 种，作含量测定的品种4 5 0 种“。图1 1 为高良姜的薄层扫描图。经典的薄层色谱或是靠目视来进行半定量分析，或是将斑点刮下，用溶剂溶出分离后的组分，再进行定量测定，操作繁琐，误差大“”。薄层扫描色谱法解决了薄层色谱的定量问题。即将试样在薄层板上经层析分离、显色后，用薄层扫描色谱仪在选定波长处扫描，得薄层斑点的灰度积分值，据此进行含量测定“。随着高效吸附剂的使用、点样仪器的自动化，薄层扫描色谱的分辨率的提高、重现性及定量的精密度也大大提高了。图1 1 高良姜的薄屡扫描图2四川大学硕士学位论文1 2 平面凝胶电泳简介电泳是指带电粒子或分子在电场作用下的定向迁移。平面凝胶电泳是在玻璃板支撑的各种薄层( 如琼脂，琼脂糖，淀粉，聚丙烯酰胺等) 介质上进行分离的一种快速电泳技术。一种质点，如果能解离或吸附其它带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。粒子在外加电场e 的作用之下的定向移动速度v ，遵循k o h l a u s “”的规律：v = m e其中m 是粒子的有效迁移率。不同性质的质点，由于带电性质、电量及质量不同，有效迁移率就不同，在一定电场强度下移动的方向和速度就不一样。它们在相同的时间，移动不同的距离，从而达到相互分离。然后，以显色荆使分开来了的组分显色。就得到反映组分所在位置和浓度深浅的二维平面图像。若组分有紫外吸收，则可以在紫外光照射下，拍照出紫外色谱图像。根据组分移动的距离进行定性分析，根据色谱带的大小和颜色深浅进行定量分析。阻凝胶为载体的电泳分离分析技术适合于生成高质量的电泳胶片，为数码相机或c c d 摄像头对图像的自动采集提供便利，保证了图像的质量，为以后的图像分析处理创造了条件，并且易于长期保存。平面凝胶电泳是d n a 、核酸、蛋白质日常分离分析不可缺少的工具“5 。舯3 。圈1 2 某蛋白的平面凝胶电泳圈3塾兰垡堕堡丝堡茎查垄兰耍鱼堂墨皇堕丝型! 壁旦塑受塞1 3 中药指纹图谱1 3 1中药指纹图谱的意义中药的化学成分众多，复杂。即使单昧中药，所含化学成分少则几十种，多则成百上千，中药复方就更不言而喻。中药用药讲究君臣佐使o “，药效不是来自单一的活性化学成分，而是来自多种活性成分之间的协同作用，甚至是与某些“非活性成分”的协同效应或“生克作用”2 2 - 2 4 o 因此，任何单一的活性化学成分或指标成分都难以评价中药的真伪和优劣。对于这样一个复杂的体系，不用说把其活性成分准确定性定量分析出来，就是仅对于其化学组成，要准确定性定量分析出来通常也是不可能的。故历来有“丸散膏丹，神仙难辨”之说。因此，长期以来，对中药材，多靠外观及显微形态鉴别，对于中成药，基木上是借鉴西药的质量评价与控制模式，即仅对其中的某种或少数某几种所谓的活性成分或指标成分进行分析，即使在质量标准中建立多项鉴别试验，但也不能做到逐一药味，逐一成分进行鉴定。因此，长期以来，中药从原材料到产品缺乏被国际认可和接受的客观、明确、严格的质量标准和规范，中药制剂的有效性和安全性缺乏可靠的、系统的科学数据加以证实。这是制约中药产业化，国际化的一个瓶颈。我国大部分中成药因达不到国际医药市场的标准和要求，虽出口到1 3 0 多个国家及地区，但在国际份额中只占5 ，且多为原料中药材。其余份额为日、韩、印度、泰“四分天下”。日本一个制剂品种的出口额等于我国全部中药出口的总和。不仅如此，“洋中药”凭借提取加工技术、包装、营销手段等优势，正加快占领我国市场。所以中药的质量评价与控制工作己成为追不及待的研究任务。如何使药物检出尽可能多的覆盖中药化学组成的全貌，达到正确地科学地评价中药的质量的目的呢? 经过多年来的研究，人们越来越认识到中药指纹图是当前解决这一问题的有效可行的方法”。指纹图谱技术用于植物药质量控制可以追溯到上个世纪7 0 年代。随着薄层色谱技术的发展，薄层色谱被大量地用于植物药中化学成分的定性分析。根据薄层板上斑点的位置( r r ) 进行定性鉴别；根据斑点大小和斑点颜色斑点数量进行定量鉴别。这样的薄层鉴别方法已经初步具备了指纹图谱的雏形。但是，针对中药质量评价和控制的中药指纹图谱的涵义最近才被明确提了出来：运用当代分析技术对中药的化学信息以图形图像的方式进行表征并加以4四川大学硕士学位论文描述。中药指纹图谱是一种综合的、整体的、可量化的鉴定手段，借以鉴别药物的真伪，评价原料药材、半成品和成品质量均性和稳定性。中药指纹图谱建立的目的是全面反应中药所含化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量。因此，中药指纹图谱的建立，应该以系统的化学成分研究为依托，充分体现系统性、特征性、稳定性三个基本原则。系统性系指指纹图谱所反映的化学成分，其中包括中药有效部位所含主要成分的种类，或指标成分的全部。特征性系指指纹图谱中反映的化学成分信息( 具体表现为保留时间或位移值) 应具有高度选择性。这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。稳定性系指指纹图谱在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱。如此建立在中药化学成分系统研究结果之上的指纹图谱是能够较全面反映中药内在质量的一个有效手段。尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。中药指纹图谱已成为中药质量评价的国际展趋势，有利于中药及其产品进入国际市场。美国f d a 及欧共体药审委对进口植物药产品均要求采用指纹图谱技术以保证其产品质量的一致。轷h o 在1 9 9 6 年草药评价指导原则中已有规定，如在植物药的镪l 备及成品的章节中均提到如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致。图1 3 蜂王浆亲水性供试品溶液的典型指纹图谱5数字化图像处理技术在平面色谱及点阵检测中应用的研究1 3 2 构建中药指纹图谱的技术目前用于构建中药指纹图谱所采用的方法除色谱法外，还有光谱法，分子生物学方法及其他方法f 2 7 捌。相对来说，色谱指纹图谱较成熟。色谱法包括薄层色谱法，高效液相色谱法和气相色谱法也有用毛细管电泳法。1 ) 薄层色谱法为传统的中药的定性鉴定方法。给出的信息量大。尽管重现性及精密度不及h p l c ，但其操作简单，分析速度快，一次分析样品数量多，分析成本低的优点使得它在中药质量控制中应用极为广泛，尤其适于研究及生产过程的质量控制。现代新型的薄层扫描色谱仪可将薄层板色谱结果转变为类似于液相色谱的谱图，使得薄层色谱技术成为中药指纹图谱研究的主要方法之一。在企业对产品进行日常监测中，应选用仪器设备易得，且便于操作的方法，而薄层扫描色谱法适应了这样的要求。2 ) 高效液相色谱法具有分离教能高，选择性高，检测灵敏度高，分析速度快，应用范围广等特点。是最常用的指纹图谱研究方法。但h p l c 对样品的预处理要求高，要求除去大分子和颗粒，否则会对色谱系统造成损害。同时，h p l c柱的洗涤和预平衡时间长，运行成本高。3 ) 气相色谱法气相色谱法多用在含挥发性物质的药物中。对挥发性物质，需先将其衍生化。4 ) 紫外光谱法和红外光谱法能够给出药中化学物质的结构信息，红外光谱信息量大，而紫外光谱特征信息远不如红外。复方的紫外光谱和红外光谱是其混合化学物质吸收峰的叠加1 ，其专属性难以定夺，不具备指纹特征。可以作为中药指纹谱图研究的辅助方法。5 ) x 光衍射分析能够给出药中化学物质的结构信息，部分信息也可能与特定的化学成分直接关联。但也是混合化学物质的信息叠加，对低含量组分不灵敏。且所用仪器昂贵，在国内尚未普及。可以作为中药指纹谱图研究的辅助方法。6 ) 分予生物学方法例如d n a 指纹图谱和蛋白指纹图谱。后者多采用平面凝胶电泳技术来实现。对于中药指纹图谱，目前尚不要求均能签定出为何种化学成分，只要求批批药品指纹图谱一致，意味着药品质量稳定或与标准一致。但从长远发展而言，仅能对指纹图谱中的少数指标成分峰做出定性定量分析，从药理学的角度考虑，6四川大学硕士学位论文是不充分的。因此，今后中药指纹图谱的发展，当以基于分离原理的色谱法或其联用技术为主流。1 3 3 中药指纹图谱的比较中药指纹图谱，目前还有采用直观对比，即靠且视比较待测样品与标准图谱的特征差异，这样不但费时，没有量化指标，还易引入人的主观误差。但发展趋势是引入相对指数、重叠率、n 强峰等量化数据，由计算机软件进行相似度计算，从而进行客观、科学、准确的相似程度比较。国内最近已经由浙江大学开发出了中药指纹图谱相似度计算软件，但该软件仅适用于柱色谱法或类似的方法。但该软件存在以下缺点。“：1 ) 如果图谱的s i g n a l 文件较大时，使用该系统处理就无法进行，如气相色谱文件无法进行数据的处理与分析；2 ) 系统只能处理9 8 个峰，超过9 8 个峰自动设定为0 0 0 ，不利于整体相似度比较；3 ) 谱峰自动匹配时，峰未积分时则以0 0 0 对应，对设定标准模板影响较大；4 ) 无法导出共有模式数据；5 ) 一次最多只能导入处理l o 个数据文件。薄层色谱法等平面色谱技术的检测原理完全不同于柱色谱，未见有能适用于薄层扫描色谱技术的中药指纹图谱相似度计算软件的研究的报道，也未见浙大类型的相似度软件应用于薄层色谱。事实上，目前所见到的中药薄层扫描色谱指纹图谱均系直观比对，没有相似度定量指标。考虑到薄层扫描色谱，平面凝胶电泳在中药质量评价与控制的重要性和广泛性，有必要对中药薄层扫描色谱指纹谱图相似度计算软件进行研究开发。这就是本论文的主要研究目的之一a1 4 生物芯片点阵简介生物芯片是融化学、分子生物学、微电子学、精密制造、仪器分析、计算机信息处理、管理、多学科为一体的高度交叉的新技术。生物芯片是在面积不大的基片( 如硅片、玻片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等) 表面上以点阵方式固定成千上万种可寻址的、具有生物识别功能的分子，然后与经标记的检体分子同时反应或杂交。通过放射自显影、荧光扫描、化学发光或酶标显示，能够在短时间内分析大量生物分子，获得大量有用的生物信息。其效率是传统检测手段的成百上千倍。从而解决了传统核酸印迹杂交( s o u t h e r nb l o t t i n g 和7数字化匿像处理技术在平面色谱及点阵检测中应用的研究n o r t h e r nb l o t t i n g 等) 技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量( 1 0 wt h r o u g h - p u t ) 等的不足。另一方面，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使芯片具多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n 。s b h )等。由于生物芯片技术具有高通量( 或超高通量) 、并行性、低消耗、微型化、自动化的特点，己被广泛应用于药物研发的许多领域o 。所以生物芯片技术是9 0 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。既具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景，2 0 0 1 年全世界生物芯片市场达1 7 0 亿美元。图1 4 分子印章法制造的生物芯片点阵制成并经杂交反应后的生物芯片，一般采用激光共聚焦显微扫描仪进行扫读，获得一幅由荧光强度不同的密集的点阵构成的平面图像。每个点的荧光强弱就代表了样品中能与该阵点所键合的功能活性分子( 如寡核核苷) 发生杂交的d n a 片段的浓度高低。与前面平面色谱图像的检测一样，生物芯片的检测也是平面图像检测。不同的是生物芯片的阵点非常小，达几百点一上万点c m 2 ，对扫描仪的分辨率要求很高，所以生物芯片扫描仪的价格非常昂贵。1 5 数字图像处理系统简介1 5 1 数字图像处理技术简介图像处理是对图像信息进行加工以满足人的视觉心理或应用需求的行为，8四川大学硕士学位论文其处理的手段有光学方法和电子学法( 数字法) 。前者已经日趋完善，但其处理图像的精度不够高，稳定性差，操作不方便从2 0 世纪6 0 年代起，随着电子技术和计算机技术不断提高和普及，数字图像处理进入高速发展时期。数字图像处理技术在近几年越来越广泛的引起国内外的关注。所谓数字图像处理技术0 7 删就是利用计算机和有关软件对数码相机、扫描仪等硬件转换图像信息而得到的电信号进行某些数学运算，以满足不同领域对图像的要求。数字图像处理技术处理精度比较高，而且可以通过改进软件来优化图像的效果。图像处理的数字量非常庞大，计算机的高速运算大大促进了数字图像处理技术的发展。在其自然形式下，图像并不能直接由计算机分析。因为计算机只能处理数字而不能处理图片，所以一幅图像在用计算机进行处理前必须转化成数字形式。在图像的每个像素的位置，图像的亮度被采样，从而得到图像对应点上表示其亮度的明暗程度的整数值。对所有的像素都完成转化后，图像就被表示成一个整数矩阵。即用一个数字矩阵来表示一幅物理的图像。这个转化过程称为数字化。每个像素具有两个属性，位置和灰度。位置由扫描线内的采样点两个坐标决定。它们又称为行和列。表示该像素位置上明暗程度的整数称之为灰度。此数字矩阵就可作为计算机进一步处理的对象。f ( o ，o )f ( o ，1 )f ( o ，n 一1 )f ( 1 ，0 )f ( 1 ，1 )f ( 1 ，h 一1 )f ( m - 1 ，0 ) f ( m 一1 , 1 ) f ( m - 1 ，n 一1 )其中f ( i ，j ) 表示位置为( j ，i ) 的图像数字化值，对于1 6 位灰度图像f ( i ，j )在0 到2 5 5 的整数之间变化( o 表示全黑，2 5 5 表示全白) 。对于1 6 位彩色图像则是将图像分为红、绿、蓝、三个分量，把这三个分量分别化为0 到2 5 5 共2 5 6个等级，根据红、绿、蓝各种不同的组合表示出2 5 6 x 2 5 6 x 2 5 6 种颜色3 。图像经过数字化后在计算机中以各种不同的格式存在，主要有位图与矢量图。图像文件可以使用其中任何一种或者两种表示方法。位图是最常用的表示方法，因为在一定的范围内它易于实现，而且可以用于任何图像。数字图像处理的优点是处理精度高，处理内容丰富，可进行复杂的非线性处理，有灵活的变通能力，一般来说只要改变软件就可以改变处理内容。数字9塾兰垡里堡竺望茎查垄兰堡垒童墨塞矍堡塑主窒星塑堡墨图像处理概括地说主要包括如下几项内容：几何处理、算术处理、图像增强、图像复原、图像重建、图像编码、图像识别、图像理解。图像处理技术的发展涉及越来越多的基础理论知识，雄厚的数理基础及相关的边缘学科知识对图像处理科学的发展有越来越大的影响。总之，图像处理科学是一项涉及多学科的综合性科学。数字图像处理是图像工程的个重要的研究领域，有几个因素表明，数字图像处理领域将继续增长。一个重要的因素是图像处理所需要的计算机设备的不断降价。处理器和大容量存储器都一年比一年便宜。第二个因素是图像数字化和图像显示设备越来越普及。第三个原因是由于视觉是人类感知外部世界最重要的手段，据统计，在人类获取的信息中，视觉信息占6 0 0 0 ，而图像正是人类获取信息的主要途径，因此，和视觉紧密相关的数字图像处理技术的潜在应用范围自然十分广阔。商业、医学、工业、军工、民用到处都闪烁着它的身影。在化学领域中主要用于谱分析1 和结构分析“”。表1 。1 数字图像处理的应用领域物理、化学生物、医学环境保护地质农业、林业渔业气象法律通信军事结晶分析、谱分析等细胞分析、染色体分类、x 射线、c t 等水质及大气污染调查等资源勘测、地图绘制、g i s 等农产物估产、植被调查等鱼群分布调查等卫星云图分析等指纹识别等仿真、电视、多媒体通讯等导弹导航、军事侦察等1 0四川大学硕士学位论文1 5 2 数字图像处理技术的硬件设备计算机图像处理软件结合图像的输入输出设备就构成了数字图像处理系统。除了数码相机和扫描仪以外，该数字图像处理系统还需要一些必要的硬件设备：打印机、电脑。其整个结构示意图如图1 5 。其中成像系统指扫描仪和数码相机。成像系统打印机图1 5 数字图像处理系统图1 5 2 i 办公用扫描仪办公用扫描仪通常由滤光镜( 或反光镜) 、光源( 或三色光源) 、聚焦透镜、扫描模块、扫描头、扫描灯管组成。办公用扫描仪最重要的性能指标是分辨率。其单位为d p i ，又分为光学分辨率和实际分辨率。实际分辨率是指扫描仪在扫描图像时每英寸产生的实际像素数“。1 5 2 2 数码相机数码相机是集光、电、机于一体的电子产品，其集成了图像信息的采集、存储和传输等部件，能与计算机进行数字信息的交互处理。它的核心部件是c c d或c m o s 图像传感器“。近年来，数码相机以其高分辨率、方便、快捷处理软件丰富和高的性能价格比等特点受到人们的广泛关注。数码相机的主要性能指标有：分辨率：这是数码相机最重要的性能指标，取决于图像传感器上像素的多少，在像面面积一定条件下，像素越多，分辨率越高：彩色深度：它用二进制位来表示，决定了色调的范围。彩色深度的值越高就能更好的还原亮部和阴影部的细节。一般数码相机采用三原色中每种原色8位或者1 2 位彩色深度，即彩色深度2 4 位或3 6 位：连拍速度：数码相机是以低帧速率工作的，对于拍摄活动景物及连续拍摄，要求相机能提供较短的曝光数字化图像处理技术在平面色谱及点阵捡测中应用的研究时间和较高的连拍速度目前数码相机己具有较高的连拍速度；存储器及存储能力：数码相机拍摄的图像文件通过驱动器记录在各种存储器上，目前使用的存储器既有内置闪速存储器，又有可移动式存储器、可移动式硬盘等；信号的输出形式：通过r s 一2 3 2 串行臼、存储器读出器、u s b 接口等进行传输。有些数码相机还有视频输出端口。1 6 本课题的研究意义、内容综上所述，以平面图像为检测原理的平面色谱技术如薄层扫描色谱、平面电泳在化学、生物、医药领域发挥着重要的作用。具有设备简单、操作方便、样品用量少、预处理简单、可平行分离多个样品、分析时间短、分离效能高、灵敏、结果准确、运行费用低等诸多优点，特别适合研究过程，生产过程和企业内控的分析测定。生物芯片扫描仪是芯片检测必需的检测仪器。但专业薄层扫描色谱仪、平面凝胶电泳成像系统、生物芯片扫描仪价格都很昂贵，国内不少大专院校、研究所、企业的实验室还未能普及，影响了相关的研究和应用。而性能良好稳定价格低廉的家用扫描仪和数码相机，结合数字化图像处理技术，就有可能将这些问题迎刃而解。国外对平面色谱分析的图像处理软件的研究开发己普遍进入了商业化。国外也有报道用a d o b ep h o t o s h o p 软件对扫描获得的薄层色谱图进行定性定量分析。但该软件不是薄层色谱专用软件，使用起来非常麻烦。而国内这方面的工作做得不多。网络上可以获得一些免费下载的图像处理软件，但多数不是平面色谱的专用软件，功能不足，界面不够友好，操作较繁琐，费时。所以我们希望能开发出一种能将家用扫描仪和数码相机应用在平面色谱定性定量分析中的软件。何曾基于数字图像处理技术原理、开发了能利用办公用扫描仪进行平面色谱定性、定量分析的软件“。但该程序结构欠优化，功能不强大，运行需要较大的计算机内存容量，限制了高扫描分辨率的应用，对密集点阵图像不能准确处理，也没有指纹图谱相似度的研究，且人机交互界面不够友好和方便。因此，本课题旨在研究开发出这样一个功能强大的软件：使用价格便宜、普及程度高、性能优良的办公用扫描仪和数码相机，结合数字化图像处理技术，旨在：四川大学硕士学位论文( 1 ) 能够进行薄层扫描色谱的定性定量分析。( 2 ) 能够进行平面凝胶电泳的定性定量分析。( 3 ) 能够进行中药平面色谱( 薄层色谱，凝胶电泳，纸色谱) 指纹图谱相似度的计算与评价。( 4 ) 能够用于高密度点阵图像的测定，为应用于生物芯片检测打下基础。( 5 ) 操作便捷省时，人机界面友好，而且根据用户的不同需求有不同的参数选择。墼兰些堕堡竺里垫查垄兰耍鱼堕墨皇堕望型主查旦塑堡塞2 数字化图像处理系统的软件的开发2 1 系统的结构及其模块划分当决定要开发一个数字化图像处理系统时，首先要对该系统的需求进行分析。根据上面的讨论，本数字化图像处理系统应达到三个主要的目的：( 1 ) 平面色谱的定性定量分析。对此要求有二个：能将色谱谱带或色斑转化为与引起这些谱带或色斑的物质的量成比例的数值，这是定量的依据。能给出谱带或色斑比移值r f ，它是相对于点样位置及溶剂前沿的相对值，是色谱定性分析的依据。( 2 ) 能评价两个谱图之间的相似度。( 3 ) 点阵图像的处理分析。其原理可以看作与相同，只是分辨率要求要高的多。为了定量灵敏和准确，( 1 ) 不能以某一像素点或某一部分像素点的色彩值或灰度值来定量。应该是谱带或色斑所含像素点的色彩值或灰度值的总和。并以峰形图形象表示。( 2 ) 尽可能消除实验因素带来的背景和噪音。另一方面也只有消除了噪音的影响，定性的依据r ，才能计算准确。根据以上分析，系统的流程图如图2 1 。该数字图像处理系统的核心是数据的处理，所以需要有一个专门的信息系统来处理数据，故设计系统功能模块结构如图2 2 。分析信息系统需要实现的功能主要有三大块：信息的输入、处理、输出。2 2 分析信息系统的具体实现2 2 1 开发及运行环境：操作系统：w i n d o w s 系统。最好是f f i n d o w s 2 0 0 0 ，因为它稳定易用，功能强大。数据库服务器：m i c r o s o f ta c c e s s2 0 0 0 。便于理解，操作简便。数据库访问系统：o d b c 数据库接口。m i c r o s o f t0 d b c 标准实际上把用户接口同具体的数据库管理过程分离开来，且为w i n 2 k 自带的接口3 - 具，使用方便。开发工具：v i s u a lc + + 语言和d e l p h i 语言。功能强大，运行计算速度快，适合发展更大的系统。1 4四川大学硕士学位论文图2 1 系统实现的流程图r困困园+团数字化图像处理技术在平面色谱及点阵检测中应用的研究图2 2 系统的功能模块图1 6巴型查兰堡主兰垡丝奎2 2 2 规划编辑人机交换界面入机交换是否友好易用在很大方面决定了软件的受欢迎的程度。本软件按照图2 2 的功能模块基本上划分成了不同的界面图。图2 3 是打开程序后的主菜单界面图。图2 3 主菜单界面囤2 2 3 编写各功能模块函数由前面的分析可以看出，程序是由多个功能模块组成，而每个模块又由多个函数组成。功能是否模块化决定了程序的优劣，也决定了程序扩展维护起来是否方便。因此，模块函数的编写是本课题里最重要的部分。2 2 3 i 图像读入显示模块当副图像读入该分析软件时，其完整图像灰度值便读入了内存，等待处理。从图像的读入开始，该软件构造了专用处理图像的类c d i b j 来进行图像输入输出操作。用户将从扫描仪或相机获得的图片交给该系统打开后，系统获取了必要的信息，这些信息包括：图片的格式类型，文件大小；图片以像素1 7数字化图像处理技术在平面色谱及点阵检测中应用的研究为单位的高度和宽度；图片的颜色位数，是否使用调色板；图像数据占用内存大小。下面的语句实现了图像的读入：v o i dc d e m o l d o c ：s e r i a l i z e ( c a r c h i v e & a r )i f ( m _ p d i b i n i t ) m _ ! o d i b i n i t 一 s e r i a l i z e ( a r ) ：i f ( a r i s s t o r i n g ( ) )i n tn b o u n d 卫l i n e a r r a y g e t u p p e r b o u n d ( )a r n b o u n d ；写入列表项数f o r ( i n ti = o ：i n b o u n d ；读入新的列表项f o r ( i = o ：i i n v a l i d a t e ( ) ：2 2 3 2 斑点的识别一多行图像分割如图1 4 所示，平面色谱图和生物芯片点阵往往是平行多行谱图或点的集合。图像信息输入系统后，数字图像处理技术中一个最重要的问题就是对包含有大量各式各样景物信息的图像进行分解。本研究分解的最终结果就是要将谱1 8四川大学硕士学位论文图分解成各个样品的斑点。虽然目前已经能用模糊逻辑数学和其它技术自动识别点样点，但这些方法比较复杂且斑点识别不准确。本软件使用的方法就是在图像中选取需识别的区域，进行多行分割。计算机根据分行信息自动在该区域内寻找斑点，并