（园林植物与观赏园艺专业论文）偃麦草非质体蛋白抗冻活性的研究.pdf

摘要 摘要 低温是影响植物生长的一种逆境因素，也是限制植物分布的关键因子。为适应生态环境， 植物会发生一系列生理变化来适应低温胁迫，产生对低温的抗性。随着人们对植物抵御低温 胁迫的研究越来越深入，发现低温蛋白中的一种抗冻蛋白，对植物适应低温逆境具有重要作 用。它的发现揭示了植物抵御低温的又一途径，为我们了解植物的抗冻作用原理提供了新的 思路，同时也为生产实践提供了理论依据。 本研究以我省极抗冻野生草坪草偃麦草为试验材料，对偃麦草不同季节非质体蛋白种类 及基本性质、抗冻活性的差异进行了比较分析，寻找并鉴定偃麦草体内对抗冻起决定作用的 蛋白质，以更深入的了解偃麦草优良抗性的根源，对为开发禾本科植物抗冻育种资源提供基 础数据。 本研究获得的主要研究结果如下： l 、冬季偃麦草根茎、根颈的非质体蛋白比夏季存在差别，冬季的蛋白条带的浓度都有 所增加，并在分子量3 9 k d a 位置出现一条新谱带；冬季偃麦草的叶片与夏季有较大差异，冬 季偃麦草与夏季相比在分子量2 5 、2 0 、1 5k d a 位置各少一条谱带。 2 、冬季偃麦草的根茎非质体蛋白与根颈蛋白条带相似，但与叶片的菲质体蛋白有较大 差异；冬季偃麦草非质体蛋白条带丰富，条带分布表现出高度的一致性，主要条带均分布于 2 0 - 6 0 k d a 的中、低分子量区。 3 、冬季偃麦草非质体蛋白有多种高抗冻活性的抗冻蛋白，随着蛋白浓度的增加，抗冻 能力越强；夏季中以无抗冻活性的蛋白为主，只是随着蛋白浓度的增加，会出现少量的有抗 冻活性的冰晶，可能与抗旱和病虫害有关。 4 、偃麦草非质体s d s p a g e 回收的蛋白抗冻活性鉴定表明了，夏季非质体蛋白中在分 子量约为6 6 、4 3 、3 7 、3 3 、2 5 、2 0 、1 5k d a 的附近均有少量的可修饰冰晶自由生长的蛋白 质存在；冬季偃麦草非质体蛋白6 8 、4 6 、3 4 、2 8 、2 3 k d a 分子量附近均有可修饰冰品形态抗 冻蛋白存在，其中6 8 、4 6 、2 8 、2 3 k d a 分子量的蛋白具有较高的抗冻活性，3 4 k d a 分子量的 蛋白具有较弱的抗冻活性， 3 9k d a 蛋白基本不具抗冻活性。 5 、高抗冻活性蛋白抑制冰晶生长强度大于弱抗冻活性蛋白；观察表明圆形冰晶生长速 度显著高于柱形；六角形冰晶 柱形 双锥形 针状；在有生长空间的情况下，冰晶形态可 在一定低温范围内维持原形状生长，超过低温限定范围冰晶生长成枝状扩散。边缘若有其他 冰晶颗粒相互影响时，冰晶向基面的扩展可减慢或停止。 关键词：偃麦草：非质体蛋白；冰晶修饰；s d s p a g e 分析 东北农业大学农学硕i ：学位论文 r e s e a c hf o rt h ea n t ie e z ea c t i v i t yo f a p o p l a s t i cp r o t e i n i ne l y t r i g i ar e p e n sl a b s t r a c t l o wt e m p e r a t u r ei st h ea d v e r s i t yf a c t o rw h i c he f r e c t st h eg r o w t ho fp l a n t s ，a n di sa l s o i m p o r t a n tf a c t o ro nl i m i tt h ed i s t r i b u t i n g t oa d a p to n e s e l ft oc i r c u m s t a n c e ，p l a n t sc o u l dh a v ea s e r i e so fp h y s i o l o g i c a lc h a n g et oa c c o m m o d a t et h ec o l ds t r e s sa n dp r o d u c et h er e s i s t a n c et ol o w t e m p e r a t u r e m o r ea n dm o r er e s e a r c ho nr e s i s t a n c eo nl o wt e m p e r a t u r e ，p e o p l ef o u n dt h ea n t i f r e e z e p r o t e i n ，b e l o n d e dt ot h ec o l d i n d u c e dp r o t e i n s ，p l a yt h er o l ei nt h ec o l ds t r e s s tt h ed i s c o v e r ya n d r e s e a r c ho fa f p sp r o v i d ean e wr e s e a r c hw a yt os t u d yt h ec o l ds t r e s so fp l a n t ，t h i sa l s op r o v i d et h e t h e o r yg i s tf o rp r o d u c t i o n t h i ss t u d yt o o ke l y t r i g i ar e p e n sl a sm a t e r i a l ，w h i c hh a ss t r o n gr e s i s t a n c ei nh e i l o n g j i a n g p r o v i n c e t o c o m p a r ea n da n a l y s ep r o t e i nv a r i e t y , b a s i c c h a r a c t e ra n dt h ed i f f e r e n c eo f f r e e z i n g r e s i s t e n c ea c t i v eu n d e rd i f f e r e n ts e a s o n s t ou n d e r s t a n dt h er o o to ft h eg r e a s tr e s i s t a n c eo f e l y t r i g i ar e p e n 8l ，w es e a r c h a n di d e n t i f yt h ep r o t e i nw h i c hp l a y st h ed e c i s i v er o l ei nf r e e z e r e s i s t a n c ei ne l y t r i g i ar e p e n sl ，t h i sw i l lp r o v i d et h eb a s i cd a t af o re m p o l d e r i n gt h er e s o u r c eo f a n t i f r e e z eb r e e d i n gi ng r a m i n e ap l a n t s t h em a i nr e s u l t sa sf o i l o w s ： 1 、t h e r ea r eb i gd i f f e r e n e sr h i z o m ea n dr o o tc o l l a ra p o p l a s t i cp r o t e i n so fe l y t r i g i ar e p e n sl b e t w e e nw i n t e ra n ds u m m e r t h ea p o p l a s t i cp r o t e i n so fw i n t e ra r er i c h e ra n dm o r eo n eb a n dt h a n s u m m e r , t h eb a n do fm o l e c u l a rw e i g h ti s3 9k d a ；d i f f e r e n c e sb e t w e e nl e a v e sa p o p l a s t i cp r o t e i n si n w i n t e ra n ds u m m e r ，t h eb a n d so fm o l e c u l a rw e i g h t2 5 、2 0 、15k d ad i s a p p e a r e d 2 、t h eb a n d so fr h i z o m ea p o p l a s t i cp r o t e i n so fe l y t r i g i ar e p e n sla r es i m i l a rt ot h a to fr o o t c o l l a ri nw i n t e r ，b u tt h e r ea r el a r g ed i f f e r e n e sb e t w e e nr h i z o m ea n dl e a v e sa p o p l a s t i cp r o t e i n s i nw i n t e r a p o p l a s t i cp r o t e i n so fe t y t r i g i ar e p e n sla r er i c h ，a n dt h ed i s t r i b u t i n go fe a c hl a n ei s a l m o s tu n i f o r mw h i c hp r e s e n ti nm o l e c u l a rm a s s e so f2 0 6 0 k d a 3 、t h e r ea r es o m eh i g h e ra n t i f r e e z ea c t i v i t yp r o t e i n si na p o p l a s t i cp r o t e i n so fe l y t r i g i ar e p e n s li nw i n t e r ，a n dt h eh i g h e rc o n c e n t r a t i o n ，t h eh i g h e ra n t i f r e e z ea b i l i t y t h e r ea r ef e wa n t i f r e e z e a c t i v i t yp r o t e i n si na p o p l a s t i cp r o t e i n so fe l y t r i g i ar e p e n sli ns u m m e r ，i ft h ec o n c e n t r a t i o ni s h i g h e r , t h e r e w i l lb es o m eh i g h e ra n t i f r e e z ea c t i v i t yp r o t e i ni ns u m m e rw h i c hm i g h th a v e a s s o c i a t i o nw i t hd r o u g h tr e s i s t a n c ea n dd i s e a s er e s i s t a n c e 4 ，m o l e c u l a rw e i g h t6 6 ，4 3 ，3 7 ，3 3 ，2 5 ，2 0 ，1 5k d ao fs o l u b l ep r o t e i ni nt h es u m m e r a p o p l a s t i cp r o t e i n so fe l y t r i g i ar e p e n sls e p a r a t e db ys d s - p a g e ，n e a rt h e s ep r o t e i ne x i s t e ds o m e i i a b s t r a c t p r o t e i nt h a tc a nm o d i f yi c ec r y s t a lg r o w t h n e a rm o l e c u l a rw e i g h t6 8 、4 6 、3 4 、2 8 、2 3 k d ao fp r o t e i n i nt h ew i n t e ra p o p l a s t i cp r o t e i n so fe l y t r i g i ar e p e n sl ，t h e r ee x i s t e da n t i f r e e z ep r o t e i nt h a tc a l l m o d i f yi c ec r y s t a lm o r p h o l o g y ，a n dm o l e c u l a rw e i g h t6 8 、4 6 、2 8 、2 3 k d ah a dh i g ha n t i f r e e z e a c t i v i t y ，p r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h t3 4 k d a h a dw e a ka n t i f r e e z ea c t i v i t y ，p r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h t3 9 h a dn oa n t i f r e e z ea c t i v i t y 5 、t h ep r o t e i n sc a nl i m i t e dt h ei c ec r y s t a lg r o w i n gs p e e da sh i g ha st h ea n t i f r e e z ea c t i v i t y r o t u n d i t yi c ec r y s t a lg r o w e df a s t e rt h a nc o l u m n a ri c ec r y s t a l ；h e x a g o ni c ec r y s t a l c o l u m n a ri c e c r y s t a l s p i n d l es h a p ei c ec r y s t a l a c i c u l a ri c ec r y s t a l ；i nt h e c a s et h a th a de n o u g hg r o w t hs p a c e ， i c ec r y s t a lm o r p h o l o g yc a ng r o wi nt h e i ro r i g i n a ls h a p ei nt h el o wt e m p e r a t u r e ，i fe x c e e d e dt h el o w t e m p e r a t u r ei c ec r y s t a ld i f f u s ea sb r a n c h i ft h e r ew e r eo t h e ri c ec r y s t a l se f f e c t e de a c ho t h e r ，i c e c r y s t a lg r o w e ds l o w e ro rs t o p k e yw o r d s ：e l y t r i g i ar e p e n sl ；a n t i f r e e z e - p r o t e i n ；i c ec r y s t a lm o d i f y i n g ；s d s p a g e c a n d i d a t e ：l i f a n s p e c i a l i t y ：g a r d e np l a n ta n do r n a m e n t a lh o r t i c u l t u r e s u p e r v i s o r ：p r o f c h ed a i d i 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谓 的地方外，论文中不包含其 他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 洼；如递直基丝重要挂型主明的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位语文作者签名：鸯岩 日期：喈年月f 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密庙遁川奉授权书) 学位论文作者签名：套岩只期：) 刃莎年多月j f 同 导师签名： 日期：) 矽多年多月日 引言 1 引言 1 1 研究目的和意义 低温和寒冷是地球上经常出现的一种气候现象，许多生物会经常性地或周期性地经历低 温逆境。它对植物的生长发育有着重要的影响，也是限制植物分布和生产的关键因子，许多 生物会经常性地或周期性地经历低温逆境。极端温度会对植物产生冷害和冻害，使植物的生 长受到抑制甚至死亡，这也限制了植物的广泛应用。 在低温时，植物可以利用体内的一些已有蛋白质或新合成一些蛋白质，来维持常温下才 能进行的一些新陈代谢。由于这些蛋白质或多肽在低温环境下表现活跃，对植物度过低温逆 境具有重要作用，因此将这些蛋白质通称为植物低温蛋i 兰l ( c o l d i n d u c e dp r o t e i n s ) 。植物抗冰冻 存在着多种机制，抗冻蛋白的发现和研究揭示了植物抵御低温的又一途径，为我们了解植物 的抗冻作用原理提供了新的思路，同时也为生产实践提供了理论依据。 偃麦草是禾本科偃麦草属( e l y t r z g i ad e s v ) 多年生根茎一疏丛型草本植物，是黑龙江省的 野生乡土草种。偃麦草具有突出的抗寒性，在北方高寒地区可安全越冬，春季解冻不久即可 返青，能耐受4 0 。c 的低温，越冬率达1 0 0 。春秋生长旺，刚返青的幼苗遇一8 c 一1 0 ( 2 的低温 也冻不死，秋季修剪后的再生株，随着气温下降而繁茂生长。 本研究以我省抗冻野生草种偃麦草为实验材料，2 0 0 6 年，本实验室曾对偃麦草可溶性全 蛋白进行了研究，得到了可溶性全蛋白中存在一定的抗冻蛋白。为了进一步研究偃麦草的抗 冻能力，本试验通过多种方法，对偃麦草不同季节非质体蛋白及基本性质、抗冻活性的差异 进行了比较分析，并鉴定偃麦草体内对抗冻起决定作用的蛋白质，以更深入的了解偃麦草优 良抗性的根源，对为开发禾本科植物抗冻育种资源提供基础数据。 对禾本科植物育种中重要野生材料偃麦草的这些研究，在国内外鲜见报道，本研究的 成果将对进一步认识禾本科植物在寒冻胁迫下表达抗冻功能的蛋白质种类、性质功能与调节 作用机制，以及抗冻蛋白结构的了解，丰富禾本科植物蛋白质组学的基础数据具有重要意义。 为偃麦草抗寒机理及蛋白质组学的研究奠定了基础。 1 2 抗冻蛋白研究进展 低温及寒冷是影响植物生产的一种逆境冈素，许多生物会经常性地或周期性地经历低温 逆境。在温度达到冰点时，植物体的胞间隙及木质部的导管和管胞中结冰，细胞内水分进入 细胞间隙，并不断结冰，导致细胞脱水，进而使植物发生冻害。若低温条件持续，植物体内 的冰晶为使其表面积最小化，会自动发生再结晶，从而造成冻害加重。为了适应低温环境， 越冬植物和生长在低温环境下的植物经长期进化，在生长习性、形态结构和生理生化等方面 东北农业大学农学硕l ：学位论文 形成了对低温胁迫的各种反应机制，随着分子生物学、基因组学、蛋白质组学及生物技术的 发展，人们对植物抵御低温胁迫机制的研究越来越深入，近年来研究发现，在低温时，植物 可以利用体内的一些已有蛋白质或新合成一些蚩白质，来维持常温下才能进行的一些新陈代 谢( 李跃强，2 0 0 4 ：文李，刘盖，2 0 0 7 ) 。 鱼类抗冻蛋白的研究开展较早，比较深入和系统。目前认为鱼类抗冻蛋白从结构上可以 分成四种类型：即抗冻糖蛋i 刍( a f g p s ，除非特别注明，a f g p 也包括在a f p s 中) 、i 型抗冻蛋 白( a f pi ) 、i i 型抗冻蛋i t ( a f pi i 两1 i 型抗冻蛋i 兰i ( a f p i i i ) 。a f g p 主要由三肽糖单位串联 重复而成，a f g p s 的分子量一般在2 5 3 3 7 k d a 之间，糖基是抗冻活性形成的主要基团，因为 化学修饰( 乙酰化和过氧化) 糖基后会导致抗冻活性的丧失。( 钟其旺，2 0 0 2 ) 植物抗冻蛋白研究起步较晚，1 9 9 2 年g r i f f i t h 及其同事筛选到一个用来阐明冷诱导蛋白 的鉴定、功能和定位的技术途径。他们从经低温锻炼的能够忍受细胞外结冰的冬黑麦( s e c a l e c e r e a l e ) 叶片的质外体削细胞问冲洗技术提取得到了内源产生的具有抗冻功能的蛋白质。从质 外体分离的蛋白具有抗冻蛋白独有的两个特征，即能修改冰品正常长的模式和压低水的结冰 温度( p u d n e yp d a ，2 0 0 3 ) ，因而，他们认为该蛋白就是植物中类似鱼类a f p 的抗冻蛋白， 质外体蛋白被命名为抗冻蛋白( a f p s ) ，又因抗冻蛋白质( a f p s ) 是一类高效生物活性蛋白质， 能以非依数l 生( n o n c o l l i g a t i v e ) 形式降低溶液冰点而不影响溶液熔点，由此产生冰点与熔点的 差异，即抗冻蛋白质的热滞活性( t h a ) ，有时也将抗冻蛋白质称之为热滞蛋白质( t h e r m a l h y s t e r e s i s p r o t e i n s ，t h p s ) ，其抗冻活性的大小用t h a 来表示。t h p s 通过吸附作用抑制冰晶 生长速度，保护细胞膜免受冷冻损伤。 与g r i f f i t h 首次发现并从冬黑麦叶片的质外体中提取并部分纯化了该蛋白的同年，美国 圣母人学的d u m a n 实验窒在多种植物中发现了具有热滞效应的蛋白质。两年后我国的费云标 等从常绿植物沙冬青( a m m o p i p t a n t h u sm o n g o l i c u s ) n r 片中分离得剑了a f p s ；卢存福等在高山 植物庸古特红景天叶片及悬浮培养细胞中获得a f p s ，并采用组织培养方法低温诱导其愈伤组 织产生a f p ，也获得成功。直剑1 9 9 8 年，英国y o r k 大学的w o r r a l l 等发表了胡萝卜( d a u c u s c a r o t a ) a f p 及其基因的论文，才标j 占着第一个植物a f p s 基冈被发现。2 0 0 1 年，我国的尹明 安等成功克隆了中国占月萝卜和英国占月萝卜的a f p s 基因。同年，祭美菊等在冰缘植物珠芽蓼 叶片的质外体中提取到了a f p s ，分子量从1 5 2 - 7 2 3 k d a 人小不等，且均为抗冻糖蛋白 ( a f g p ) ，其中分子量为7 2 3 k d a 的a f g p 是迄今为j ：在动植物中得到的分子量最大的a f p ， 热滞活性为o 1 3 ( 7 1 8 m g m 1 ) ，a f g p s 是维持珠芽蓼抗冻性的重要物质基础。2 0 0 2 年，n e l l y 等从b o r e o g a d u s s a i d a 中分离纯化得到一种n 端被甲基化的a f g p ，通过对其动力学构象进行 研究表明：a f g p 无论在什么条件下基本上都保持着一种相似的三维折叠结构，该a f g p 的水 化作用和相对稳定的土链构象在抑制冰晶生长中发挥着重要的作用。目前已有4 0 多种植物被 作为研究对象，至少在2 0 种高等植物中检测到热滞活性的蛋白。 随着对植物抗寒性研究的不断深入，人们发现抗冻蛋白是耐冻植物对冬季低温较为普遍 的适应机制，它广布于除地衣和黏菌外的所有植物( d o u c e t ，2 0 0 0 ：d u m a nj g ，1 9 9 3 ；z a m a n i ， 2 0 0 3 ) 。现已经确定许多植物中含有参与冰冻胁迫反应的蛋白质( l i ns z ，2 0 0 1 ，u r r u t i am e ， 1 9 9 2 ，w o r r a l l ，1 9 9 8 ) 。 2 引言 i ii ii - - 1 2 1 植物抗冻蛋白结构特征与表达调控 1 2 。1 。1 植物抗冻蛋白结构特征 据报道，目前已有4 0 多种植物被作为研究对象，至少在2 6 种高等植物中检测到热滞活 性的蛋白。但目前为止，关丁植物a f p s 的结构模型还鲜为报道，k u i p e r ( 2 0 0 1 ) 等，在多年 生黑麦草中发现其冰晶抑制活性高，热滞活性低，其一级结构中禽有重复性序列。基于这个 特点他们从理论上提出一个三维结构模型：在这个1 1 8 个氨基酸的多肽中每1 4 、1 5 个氨基酸 组成一个环，8 个这样的环组成一个p 一筒状结构，1 3 一筒状结构的一端是保守的撷氨酸疏 水核，另一端是由内部天冬酰氨酸组成的梯状结构。撷氨酸是疏水性氨基酸，天冬酰氨酸是 亲水性氨基酸，d 一筒状结构的亲水端与冰晶表面吻合互补，疏水端则有效地防止了水与冰 的结合，阻止了冰晶继续生长。 s i d e b o t t o m ( 2 0 0 0 ) 从冬黑麦草中分离的一种沸点可溶蛋白l p l 2 富含氨基酸残基a s p ， v a l ，t h r 和a l a 等，一级结构共1 1 8 个氨基酸，由s e r 和t h r 间隔的7 个氨基酸残基重复序 列构成p u d n e y ( 2 0 0 3 ) 等认为，l p l 2 在高级结构上与昆虫a f p s 的相似。v a l 残基是l p l 2 的疏水核心。l p l 2 可能通过相对的两个冰晶结合面与冰晶结合，这种独特的冰晶结合特性使 之具有有效的重结品抑制功能。 王维香( 2 0 0 7 ) 从沙冬青叶片提取液中分离了一种富含氨基酸残基a s p ，v a l ，g l y 和 a l a 等的蛋白，从分子量、氨基酸组成、糖基含量及冰晶生长形态来看与冬黑麦抗冻多肽非 常相似，并且高度同源性。 在所有研究的植物a f p s 中，只有艄萝卜d c 3 6 的基因结构被研究得较为清楚。氨基酸序 列测定表明，胡萝卜d c 3 6 富含亮氨酸重复序列( 1 e u c i n e r i c h r e p e a t ，l r r ) ，包括约十个不完 整串联重复序列，每一个重复序列有2 4 个氨基酸，与多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋i 冬i ( p g i p ) 高度 同源( 5 0 6 5 ) 。a f p s 可能是植物p g i p 在长期抵御外界寒冻胁迫中，逐步进化形成的( w o r a l l d ，1 9 9 8 ；m e y e rk ，1 9 9 9 ；s m a l l w o o dm ，1 9 9 9 ) 。 表1 1 为目前已经报道的从植物中分离出抗冻蛋白。其中5 种获得了编码抗冻蛋白基因 的核苷酸全序列。序列分析结果表明，大多数抗冻蛋白与致病相关蛋白具有序列同源性。 表1 1 从低温驯化植物中分离到的抗冻蛋白 t a b 1 一la n t i - f r e e z i n gp r o t e i n si s o l a t e df r o mc o l d a c c l i m a t e dp l a n t s 3 东北农业大学农学硕十学位论文 续上表： 抗冻蛋白分子量 植物m o l e c u l a rm a s s p l a n ts p e c i e s o f a n t i f r e e z i n g p r o t e i n s ( k d ) 基冈库 同源蛋白登录号码 h o m o l o g y g e n b a n k a c c e s s i o nn o 文献 r e f e r e n c e 胡萝卜 d a u c u sc a f o t a 多年生黑麦草 l o l i u mp e r e n n e 冬黑麦 s e c a l ec e r e a l e 沙冬青 a m m o p i p t a n t h u sm o n g o l i c u s 3 6 2 9 3 5 3 2 3 5 2 5 1 6 2 8 5 0 2 8 4 0 多聚半乳糖醛酸酶 抑制子蛋白 无同源蛋白 p 1 ，3 内切葡聚 糖酶 i 型内切几丁质 酶 类奇甜蛋白 型内切几丁质 酶 无同源蛋白 无同源蛋白 植物凝集素 a f 0 5 5 4 8 0 m e y e rk ( 1 9 9 9 ) a j 2 7 7 3 9 9s i d e b o t t o mc ( 2 0 0 0 ) a f 2 8 0 4 3 7 h u a n gt ( 2 0 0 2 ) a f 2 8 0 4 38y e hs ( 2 0 0 0 ) f e iy b ( 2 0 0 1 ) w a n gw x ( 2 0 0 3 ) 魏令波1 9 9 9 。 桃树 6 0 脱水素 w i s ，n 囊燃m 注：本表人部分参考j ，王瑞云( 2 0 0 6 ) 义献( 抗冻生白与植物低温胁迫反应) 此外，在雪莲( 费云标，1 9 9 3 ) 和高山植物庸古特红景天( 卢存福，2 0 0 0 ) ，珠芽蓼( 祭 美菊，2 0 0 1 ) 等4 0 余种植物中都发现有内源a f p s 的产生。但是，通过研究也发现，单种蛋 白对于提高植物抗冻性的作用是微小的，植物抗冻性的大幅度提高需要由这些蛋白和其他冈 子的共同参与( s t e p o n k u sp ，1 9 9 8 1j a g l ok r ，1 9 9 8 ) 。 植物a f p 的机制的模璎认为一般晶体的生长垂直于晶体表面，假如杂质分子吸附于冰生 跃通途的表面，那么需要再外加推动力( 冰点下降) ，促使冰在杂质间生长。由于曲率增大使 边缘的表面积也增加。冈表面张力的影响，增加表面积将但体系的平衡状态发生改变，从而 冰点下降、假设a f p s 吸附丁整个冰品表面，由表面效应造成溶液冰点降低值可以通过下式 计算：a t = 2 8 m t 0 l p 2r a c n 1 0 0 0 m w 1 2 a t ：冰点降低值( 抗冻活性) ；6 ：表面张力；t o ：正常冰点值( 2 7 3k ) ：m ：水的摩尔质量：l ： 摩尔分子溶化潜热；p ：冰之密度；2 r ：抗冻蛋白分子之直径：吸附到冰上的a f p s 和总 数之比值；c ：a f p s 之浓度：n ：阿佛加得罗常数；m w ：a f p s 之摩尔质麓。 从现有资料来看，植物a f p s 分子量在11 - 7 0 k d a 之间，在低温锻炼冬黑麦的叶片质外体 中发现有7 种肽( a n t i k a i n e nm ，1 9 9 6 ) ，其中6 种多肽从s d s 聚丙烯酰胺凝胶中洗出后表 现出高的抗冻活性。用氨基末端序列比较、免疫交叉反应、酶活性分后发现，这些多肽与3 类病原相关蛋白相似，即内几丁质酶、内p 1 ，3 一葡聚糖酶和t h a u m a f i n 1 i k e 蛋白( h o nw c ， 19 9 5 ) 。两种a f p s ( 3 5 和3 2 k d a ) 像葡聚糖酶( g l u c a n a s e l i k ep r o t e i n s ，g l p s ) ，两种( 3 5 和2 8 k d a ) 像儿丁质酶( c l p s ) ，两种( 2 5 和1 6 k d a ) 像t h a u m a t i n ( t l p s ) 。这些多肽的氨基酸构成很相似， 即它们相对富含a s p a s n ，g l u g l n ，s e r ，t h r ，g l y 和a i m 它们都缺乏h i s ( 除一个多肽外) 且 4 引言 一 、- 含多至5 的c y s 残基。分子量为1 3 k d a 的质外体小多肽只有很小的抗冻活性。该多肽可能 除控制冰形成外在低温锻炼过程中可能有其他作用。 1 2 1 2 抗冻蛋白的表达与调控 植物抗寒性研究发现，所有参与植物低温胁迫反应的基囚及其蛋白产物都要经过低温诱 导才能表达、合成和积累( h u a n g ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ；y e hs2 0 0 0 ：g u y1 9 9 0 ：t h o m a s h o w1 9 9 8 ) 。 a f p s 在生物体内积累和消除有季节性变化。一般在春夏季消失，秋季出现，经过冷驯化后冬 季达到最高峰。常温下，植物体内不存在抗冻蛋白，但低温会诱导抗冻基因表达，导致抗冻 蛋白的产生。b r i g g s 和s i m i n o v i t c h ( 1 9 4 9 ) 最早发现植物低温诱导蛋白，在越冬期间的黑槐 皮中发现2 3 条新蚩白带。拟南芥属植物经过低温驯化后，增加了1 5 0 ，8 0 ，6 9 ，5 8 ，5 7 ， 4 5 ，3 3 ，3 2 ，3 0 和2 0 k d 的蛋白质，减少了1 6 k d 的蛋白质：雀麦属植物经低温锻炼后增加 了l1 5 ，5 4 ，4 8 ，4 7 ，3 8 ，3 1 k d a 和减少了7 2 ，2 7 ，2 3 ，2 2 k d 蛋白质，其它如水稻、小麦等 几十种材料上的实验都揭示了类似的结果( g u y ，1 9 9 0 ) 。在北印第安那州的2 3 种被研究的被 子植物及常绿植物中，秋、冬季均可检测到a f p s ，但夏季这种抗冻蛋白就消失( h u a n g t ， 2 0 0 2 ) 。抗冻蛋白仅在植物体遭遇低温胁迫时表现其活性，也只有可以忍耐冰晶在其组织中 形成的植物才具有抗冻性。w e i s e r ( 1 9 7 0 ) 提出了“植物抗冷性诱导过程是基冈表达改变”的 观点，g u y ( 1 9 8 5 ) 等，发现菠菜在5 c 诱导下有新m r n a 出现，证实在低温诱导抗性增强 过程中基因表达会变化。此后，在菠菜、拟南芥和苜蓿幼苗等的研究中也证明，低温锻炼的 过程中也诱导了新的蛋白质的合成。m a h a p a t r a 等对苜蓿幼苗的低温诱导特异蛋白的基因表 达进行了研究，结果表明抗寒基因可能在转录水平上调控，并与品种的抗冻力成正相关。 a f p s 的表达也受到一些环境因子的调节包括温度，光周期等。低温条件下生长的冬黑麦 在日照长度为8 h 时所积累的抗冻蛋白多于日照长度为1 6 h 时的积累量( m a r e n t e s1 9 9 3 ) 。可 见，低温和短日照是诱导抗冻蛋白积累的2 个重要环境因素。这也是人们通过模拟秋季日照 时数减短和气候渐冷的条件对植物进行冷驯化，使其抗寒性提高的理论基础。 对胡萝卜和黑麦抗冻蛋白的表达调控过程的研究表明，抗冻蛋白的有效表达，不仅需要 低温诱导，而且需要有组织特异性和发育特异性。同一种抗冻蛋白在不同的植物中，表达的 部位不一定相同；同一种植物内不同类型的抗冻蛋白表达的部位、时期也不一定相同。胡萝 卜幼苗经4 c 的低温处理3 0 m i n ，抗冻蛋白基因( d c a f p ) 便开始表达，并在2 4 h 内趋于恒定 ( m e y e r ，1 9 9 9 ) 。低温和短日照可使胡萝卜的根、茎及叶片中抗冻蛋白保持稳定( s m a l lw o o d m 1 9 9 9 ) 。将正常生长的黑麦转移到5 c 及短日照的环境中，在2 4 h 内就可采用免疫学检测 技术检测到3 - l ，3 葡聚糖酶抗冻蛋白。然而，几丁质酶抗冻蛋白需要经过3 7 周的冷诱导 方可累积，但将植株转移到2 0 及长日照环境并解除冷锻炼1 2 h 后便消失( h u a n g ，2 0 0 0 ， y e hs2 0 0 0 ) 。黑麦几丁质酶抗冻蛋白的c h t 9 及c h t 4 6 转录在根中未发现，但在叶鞘的 薄壁组织、叶肉、表皮细胞及韧皮部细胞中均可检测到。与胡萝卜抗冻蛋白不同，黑麦中的 几丁质酶抗冻蛋白在低温及短日照下不会直接积累，而是在冷驯化过程中作为生长和发育的 一部分间接地累积( y e h2 0 0 0 ) 。在4 c 条件下，悬浮培养的黑麦细胞仅将6 种抗冻蛋白中 的3 种分泌到培养基中( p i h a k a s k i m a u n s b a c h2 0 0 3 ) 。这些都表明，发育因素也影响着植物 抗冻蛋白的表达及其调控。 5 122 抗冻蛋白作用机理 1221 抗冻蛋白对冰晶的修饰效应 抗冻蛋( ：l ( a n t i f f e e z ep r o t e i n s ，a f p s ) 是从功能上定义的一类蛋白质虽然不同抗冻蛋自 在大小车结柑r 彳丁报人的羊芹，但对抵抗冰球陆能t 都十分相似。抗球蛋白( a f p s ) 具有冰 品形态效应、热滞效应午重结品抑制艘麻( p a r o d y m o r r e a l ea ，1 9 9 8r u b i n s k yb ，1 9 8 9 ： z a c h a r i 拈s e nk e ，1 9 8 2 ；o i s e nt m ，1 9 9 7 ：m c l a n i em ，2 0 0 2 ) 等。a f p s 通过抑制冰品的重 品化防止小的冰品结成更太的冰品使形成的冰品小且均匀。阅此，它可以减轻冰晶在抹 融的动态变化中对生物体的伤害。a f p s 的热滞皴应和重结晶抑制效应都是通过a f p s 与冰品 的表面相互”川( 冰品的形态敞，奇) 而实现的。 目1 1 1a f p 修饰的冰品形态 f i gi 1i c ec r y s t a lm o r p h o l o g y p r o d u c e db ya f p 酗l2 a f p 与“角形的冰品 吸附 f i g i 一2a f pb i n g i n g t o t h e h e x a g o n a li c ec r y s t a l 幽i 3 在高浓度a f p 溶液 中的冰品形状 f i gi 一3m o r p h o l o g yo f a l l i c e c r y s t a lg r o w n i na f p a f p s 对冰品形态具柏明显的修饰效果。当a f p s 与冰品结台之后，水分于将诎限制进 结台柏a f p s 的冰品表可，导致冰品的平直丧而发生弯曲从而引起冰品的总表而积增_ 九f 圈 1 - i 中插入的放_ 人剀) 。这种总表面积增人j 血过一种开尔文效应抑制了水分子与冰品的平直表 面结台的趋势晶终导致溶液冰点的非依数性降低自it h 活性的产生( w i l s o np w ，1 9 9 3 ) 。 a f p s 可以吸附到冰品的不同面，形成形状再异大小不同的冰品( a n t s o na a ，2 0 0 i ) ，但基 本l 可分为两大粪穴棱坝金字塔( h e x a g o n a lb l p y r a m i d ) l l a 棱盘( h e x a g o n a lp l a t e ) 缄 棱柱 ( h a g o n a lc o l u m n ) ( w i l s o np w ，2 0 0 2 ) 。 一个特定的冰品表而住与a f p s 结台之后，生眭速度将明显变慢，而且会导致许多小刻 面的形成和增人。当4 , 女r l 面变得越米越多后这个特定的冰品表面将完全停j r 生长。最终冰 品在所有方向的表面都被完全蚀划，导致眯品生臣的被彻底停r 。 通过冰蚀刻( i c ee t c h i n g ) 技术呵让窑a f p s 与冰品表面的结台，而且可用r 投现能与a f p s 结合的特定的淋品表面( k n i g h tc a ，1 9 9 i ) 。冰蚀刻技术的原理是将己生蚝至半球形状的冰 品置1 二稀秆后的a f p s 溶液中，a f p s 虽然能与冰品结台，但由于自身浓度过低，故不能抑制 冰品的生长，田而a f p s 被整台到继续生k 的冰品的内部，将诛晶从溶液中移出，然后让其 引言 缓慢升华，而被整合到冰晶内部的a f p s 则被逐渐暴露出来，在冰晶表面上呈现出白色的蚀 刻点，通过冰晶蚀刻技术，已经刻画了多个与不同a f p s 相结合的冰晶表面。 a f p s 改变冰晶生长的方式和速度与a f p s 浓度有关。a f p s 吸附冰品的方式如图1 2 。在 d d h 2 0 中，冰沿平行于冰晶基面的a 轴生长，在垂直于基面的c - - 轴上几乎不生长，因而显 微镜下看到的冰晶是扁平和圆的；在低浓度a f p s 溶液中，由于a f p s 与冰晶有微弱结合，冰 品沿a - 轴生长受到微弱抑制，主要沿c 轴由生长，而冰晶基面未受干扰，冰可以由此生长， 成为六棱双金字塔( h e x a g o n a lb i p y r a m i d s ) 或六角梯状体( h e x a g o n a lt r a p e z o h e d r a ) ；例如鱼类和 植物a f p s 与一个特定的锥面结合时，由于冰晶六角形的对称关系，导致冰品被修饰成六棱 双金字塔形状( k n i g h tc a ，1 9 9 1 ；k u i p e rm j ，2 0 0 1 ) ，而昆虫a f p s 可以同时与冰晶的基面 和棱面相结合，导致冰晶被修饰成六棱盘形状( g r a e t h e rsp ，2 0 0 0 ) 。在高浓度a f p s