（物理化学专业论文）以fbpase和sbpase为靶标的抑制剂设计和理论研究.pdf

硕士学位论文 【a s t e r st h e s i s 摘要 光合作用是绿色植物特有的生理生化过程，也一直是除草剂研究中的热点。近 年来，随着计算机辅助药物分子设计、高通量虚拟筛选、酶学测试等相关技术的发 展，大大降低了新农药研究开发的成本并缩短了开发的周期，在目前的新农药研发 过程中得到广泛应用。果糖1 ，6 二磷酸酶( f b p a s e ) 和景天庚酮糖一l ，7 二磷酸酶 ( s b p a s e ) 是绿色植物光合作用暗反应中两个非常重要的同源蛋白酶。在暗反应过 程中，f b p a s e 和s b p a s e 含量与其它酶相比要少很多，但是少量降低转基因植物中 两者的活性却能够削弱暗反应循环，并导致植物光合作用能力的降低。另外，s b p a s e 是高等绿色植物所特有的一种酶，因此s b p a s e 是一个良好的潜在的抑制剂靶标。 本文综合运用许多现代分子模拟方法对绿色植物光合作用暗反应系统中这两个重 要的同源的催化水解酶( 果糖1 ，6 二磷酸酶( f b p a s e ) 和景天庚酮糖1 ，7 二磷酸 酶( s b p a s e ) ) 进行了理论研究和抑制剂的合理设计。 蓝藻结构相对简单，其基因序列也已全部已知，而且在蓝藻中不含有s b p a s e 。 虽然蓝藻中只含有f b p a s e ，但是f b p a s e 是一个双功能酶，能同时催化f b p a s e 和 s b p a s e 的底物。因此可以单独针对f b p a s e 活性空腔的研究，从而了解f b p a s e 与 s b p a s e 的活性空腔的结构。我们首先采用同源模建的方法构建了蓝藻的f b p a s e 的 三维晶体结构，运用分子力场进行结构优化。基于优化后的构型进行虚拟筛选，通 过抑制剂与活性空腔的分子对接，选择了3 0 个打分高的化合物进行酶水平的活性 测试。4 个高活性的先导化合物将会进行下一步的结构优化和设计。 s b p a s e 是高等植物所特有的一种酶，在植物体内含量很低，但是单一调控该酶 却对暗反应有着很强的影响。因此，s b p a s e 是一个良好的潜在除草剂靶酶。s b p a s e 与f b p a s e 活性空腔比较保守，但目前还没有针对s b p a s e 晶体结构的报道。基于对 f b p a s e 的活性空腔的了解，同源模建了拟南芥的s b p a s e 的结构，并采用同样方法 进行虚拟筛选，同样选择了2 5 个打分高的化合物进行酶水平的活性测试。目前活 性测试还在进行中。 关键词：绿色农药；果糖1 ，6 二磷酸酶；景天庚酮糖1 ，7 二磷酸酶；抑制剂 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t p h o t o s y n t h e s i si s a l li m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lp r o c e s so fg r e e n p l a n t s ，a n dh e r b i c i d e so fi n h i b i t i n gp h o t o s y n t h e s i sa r ew i d e l ys t u d i e si nh e r b i c i d e r e s e a r c h t h ed e v e l o p m e n to fc o m p u t e r - a i d e dd r u gd e s i g n , h i g h - t h r o u g h p u tv i r t u a l s c r e e n i n ga n de n z y m ea s s a yt e c h n o l o g y , c a l lg r e a t l ya c c e l e r a t et h ep e r i o do fn o v e l p e s t i c i d e sr e s e a r c h a n dr e d u c et h ec o s to fr e s e a r c h i nt h i st h e s i s ，w eu s et h e s e t e c h n o l o g i e st os t u d yt w ov e r ys i g n i f i c a n tc a t a l y t i ch y d r o l y s i se n z y m e sf o rc a l v i nc y c l e o f g r e e np l a n t s ，f i u c t o s e - 1 ，6 - b i p h o s p h a t a s e ( f b p a s e ) a n ds e d o h e p t u l o s e - 1 ，7 - b i s p h o s p h a t a s e ( s b p a s e ) t h el e v e l so ff r u c t o s e 一1 ，6 - b i s p h o s p h a t a s e ( f b p a s e ) a n d s e d o h e p t u l o s e - l ，7 一b i s p h o s p h a t a s e ( s b p a s e ) a r ee x t r e m e l yl o wc o m p a r e d 诵t l lt h o s eo f o t h e re n z y m e si nt h ec a l v i nc y c l eo fp l a n t s t r a n s g e n i cp l a n t sw i t has m a l ld e c r e a s ei n t h ea c t i v i t i e so ff b p a s eo rs b p a s ee x h i b i t sar e d u c t i o ni np h o t o s y n t h e t i cc a p a c i t y , i n d i c a t i n g t h a tt h er e d u c t i o ni n p h o t o s y n t h e s i s r e s u l t sf r o mar e d u c t i o ni nt h e r e g e n e r a t i v ec a p a c i t yo ft h ec a l v i nc y c l e s b p a s ei sap o t e n t i a lt a r g e tf o rh e r b i c i d e r e s e a r c hb e c a u s eo fi t se n o r m o u ss i g n i f i c a n c ef o rp h o t o s y n t h e s i sa n do n l ye x i s t i n gi n l l i g hp l a n t s w el o o ki n t ot h em e c h a n i s mf o rt h eh y d r o l y s i so f f b p a s ea n ds b p a s ei n d e t a i la n dr a t i o n a l l yd e s i g ni n h i b r o r sb yc o m p u t e r - a i d e dd r u gd e s i g n ( c a d d ) m e t h o d s c y a n o b a c t e r i a l c e l l sc o n t a i na u n i q u ee n z y m e ，f r u c t o s e - l ，6 一b i s p h o s p h a t a s e s e d o h e p m l o s e - 1 ，7 一b i s p h o s p h a t a s e ( f b p a s e s b p a s e ) ，w h i c hc a nh y d r o l y z eb o t hf b pa n d s b p 、以ma l m o s te q u a ls p e c i f i ca c t i v i t i e s w ep r e d i c tt h e3 ds t r u c t u r eo fc y a nb a c t e r i ab y h o m o l o g ym o d e l i n gf o rv i r t u a ls c r e e n i n gi ns p e c sd a t a b a s e ar e p r e s e n t a t i v es e to f3 0 c a n d i d a t e sb a s e do ns c o r i n gf u n c t i o n sa r es o r t e do u tf o ri nv i t r ot e s t s f o u ro u to f 3 0 c a n d i d a t e sw i t hb e t t e ri n h i b f f o r ya c t i v i t ya l es e l e c t e df o rf u r t h e rs t r u c t u r a lo p t i m i z a t i o n b a s e do nt h eh o m o l o g yb e t w e e ns b p a s ea n df b p a s e ，p r e d i c t i v em o d e lo f a r a b i d o p s i st h a l i a n as b p a s ei se s t a b l i s h e db yh o m o l o g ym o d e l i n g 2 5c a n d i d a t e sa r e s e l e c t e df o rt h ee n z y m ea s s a ya f t e rm o l e c u l a rd o c k i n gi ns p e c sd a t a b a s e r i g h tn o w t h ee n z y m ea s s a yi si np r o g r e s s k e yw o r d s ：g r e e np e s t i c i d e ；f r u c t o s e - 1 ，6 一b i s p h o s p h a t a s e ；s c d o h e p t u l o s e - i ，7 - b i s p h o s p h a t a s e ；i n h i b i t o r s 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：鲴锚 日期：矽年莎月乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的规 定享受相关权益。回意途塞逞窒蜃溢卮! 旦坐生；旦= 生；旦三生筮鱼! 作者签名：多) 膨皆作者签名：多j 锣肾 帆中6 月6 日 导师签名：爹 喊吵钥6 日 厂9 专月 静6 ) 午 ：辞 名 m 始7 师期 宁日 p 话月臼形 出踩 湛务 名 沁 签 ： 者期 作日 1 1 绿色植物与碳同化 第一章绪论 光合作用是生物界获得能量、食物以及氧气的根本途径，所以光合作用被称为 “地球上最重要的化学反应”。光合作用分为光反应和碳同化反应”。碳同化是指植 物利用光反应中形成的n a d p h 和a t p 将c 0 2 转化成稳定的碳水化合物的过程。( 如 图1 1 ) 曾- q 、o t o ? 斗。： t m一 4 t p 一 。i * 鬟7 i 艘)岍 0 。 f fi “归0 c o , c h p 圈i - 1 ：光合作用中光反应与碳同化反应 根据碳同化过程中最韧产物所古碳原子的数目以及碳代谢的特点，将碳同化途 径分为三类：岛途径( c 3p a t h w a y ) 、c 4 途径( c 4p a t h w a y ) 和c a m ( ， c r a s s u l a c e a na c i dm e t a b o l i s m ) 途径。 1 1 1c 3 过程以厦其物质代谢 c 3 途径是光台碳代谢中最基本的循环，是所有放氧光合生物所共有的同化c 0 2 的途径。经过1 0 多年周密的研究， 尔文等人终于探明了光合作用中从c 0 2 到蔗 糖的一系列反应步骤，推导出一个光合碳同化的循环途径，这条途径被称为卡尔文 循环或卡尔文本森循环。 由于这条途径中c 0 2 固定后形成的最初产物3 一磷酸甘油酸( p g a ) 为三碳化合 物，所以也叫做c 3 途径或c 3 光合碳还原循环( c 3p h o t o s y n t h e f i cc a r b o nr e d u c t i o n c y c l e ， c 3 p c r 循环) ，并把只具有c ，途径的植物称为c 3 植物( c 3p l a n t ) 。 c 3 途径的反应构成由核酮糖一1 ，5 二磷酸( r u b p ) 开始至r u b p 再生结束，共 有1 4 步反应，均在叶绿体的基质中进行。全过程分为羧化、还原、再生3 个阶段。 ( 如图i - 2 所示) 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s s u g a 异s p a t t ya c r ) m 肄噜oa c i d s 图1 - 2 ：c 3 循环示意图 第一步三碳的固定，即游离的c 0 2 经酶促反应转变为有机物分子中的羧基， 也称作c 0 2 的羧化( e a r b o x y l a t i o n ) 。c 0 2 的受体是核酮糖1 ，5 二磷酸 ( r i b u l o s e 。l ，5 一b i s p h o s p h a t e ，r u b p ) ，催化此反应的酶是核酮糖。1 ，5 二磷酸羧化酶 加氧酶( r i b u l o s e 一1 ，5 - b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ，r u b i s c o ) 。 第二步3 磷酸甘油酸经一系列酶促反应转化成6 磷酸果糖，催化这一系列反 应的酶与糖的异生途径相似，不过3 磷酸甘油醛脱氢酶在叶绿体中是以n a d p h 为 辅基，而不是n a d h 。 第三步 1 ，5 。二磷酸核酮糖的再生，由一系列转酮酶和转醛酶催化这些反应， 催化酶及反应式与戊糖途径类似。最后是5 磷酸核酮糖在磷酸核酮糖激酶 ( p h o s p h o r i b u l o k i n a s e ) 的催化下再生为1 ，5 一二磷酸核酮糖。 所以c 3 途径的总反应式可写成： 3 c 0 2 + 5 h 2 0 + 9 a t p + 6 n a d p h _ g a p + 9 a d p + 8 p i + 6 n a d p + + 3 r 。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 附：c 3 循环的物质的转换与过程 g 卵。 图1 3 ：开尔文循环的物质转化 参与反应的酶：( 1 ) 核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶力氧酶( r u b i s c o ) ：( 2 ) 磷酸甘油 酸激酶( p g a k ) ；( 3 ) 磷酸甘油醛脱氢酶( g a d p h ) ；( 4 ) 磷酸丙糖异构酶 ( t r i o s e p h o s p h a t ei s o m e r a s s e ) ；( 5 ) 醛缩酶( a l d o l a s e ) ；( 6 ) 果糖一1 ，6 一二磷酸酶 ( f b p a l s e ) ；( 7 ) 磷酸葡糖异构酶；( 8 ) 磷酸葡糖酶；( 9 ) 转羟乙醛酶；醛缩酶： o d 景天庚酮糖1 ，7 一二磷酸酶( s b p a s e ) ；转羟乙醛酶；磷酸核酮糖差向异 3 构酶：凹磷酸核糖异构酶；彻磷酸核酮糖激酶 1 1 2c 3 过程中重要的酶 1 12 1 核酮糖一l ，5 - 二磷酸羧化酶加氧酶( r u b is c o ) 核酮糖一1 ，5 - 二磷酸羧化酶伽氧酶( r u b i s c o ) ( e c ：4i 13 9 ) 是c a l v i n 循环中一 个非常重要的取功能酶，既可以催化其底物核酮糖一i ，5 - 二磷酸( r u b p ) 9 - - - 氰化 碳结合，开始进行碳三循环，又可以与氧气结合，进行光呼吸。生成二氧化碳o 。5 j 。 r u b i s e o 的晶体结构已经被解出，但是在不同的植物中的结构有所不同，图1 4 是菠 菜中的r u b i s c o 与二氧化碳以及2 一羧基阿拉伯糖醇一1 ，5 - 二磷酸复合物的晶体结构 ( 1 i r l ) t 6 1 。 图1 - 4 ：r u b i s e o 与二氧化碳以及2 羧基阿拉伯糖酵一1 ，5 - 二磷酸的晶体结构 根据r u b i s c o 大亚基氨基酸序列同源性及空间结构的相似性，可以将其分为4 类，即i 、i i 、i i i 、i v 型( 表1 ) 。i 型主要存在于能够进行光合作用的有机体内，如 高等植物、真核藻类、蓝藻、光能及化能自养细菌及其它一些原核生物，在高等植 物中r u b i s c o 基本组成一般是由8 个大亚基( l s 分子量约5 1 5 8 k d a ) 和8 个小亚基 ( s s ，分子量约1 2 1 5 k d a ) 。j i 型r u b i s c o 缺失小亚基仅由2 - 8 个大亚基组成。呈 ( l 2 ) 。的结构，其分子量为1 1 0 j , 5 0 k d a ，主要存在于一些光能及化能合成细菌、 海产甲藻( s y m b i o d i n i u m s p p ) 、膝钩藻( g o n y a u l a x p o l y e 卉口) 等中。虽然这两种类型 的同源性很低，只有2 8 【7 圳，但是活性位点上的氨基酸却是高度保守的。i i i 型也 仪由大亚基组成呈l x 结构，存在于某些嗜热古生菌如豫菌、詹氏甲烷球菌等中 1 7 , 9 1 0 1 i v 型又称为r u b i m o 类似蛋白( n 小i s c 0 1 i k e p r o t e i n ，r l p ) 。存在于非光含细菌、 部分不依赖卡尔文循环的光合细菌和古生菌如绿色硫细菌、好热性硫磺细菌柏吐一，、 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 泥生绿菌、枯草芽孢杆菌等中，并不催化碳的羧化反应，但是参与了细菌的硫代谢。 根据对t k - r u b i s e o 的研究结果表明，它是由大亚基组成的( l 2 ) 5 的十聚体，与 菠菜中的i 型r u b i s e o 有3 6 的同源性，与深红红螺菌中的型r u b i s c o 有3 0 的 同源性【7 】；分析詹氏甲烷球菌r u b i s e o 的序列表明，它与蓝藻中的聚球藻i 型r u b i s c o 有4 l 的同源性，与深红红螺菌中的i i 型r u b i s e o 有3 3 的同源性。尽管以上三 类r u b i s e o 相互之间的同源性较低，但已知的r u b i s c o 参与羧化或氧化核酮糖1 ，5 二磷酸( r i b u l o s e 1 ，5 b i s p h o s p h a t e ，r u b p ) 过程的所有保守氨基酸残基在i 、和m 型 中都存在，除了型中p h e l 9 9 被其它氨基酸所取代。型与i 、i i i 相比， 许多活性位点保守氨基酸残基缺失，同源性甚低。 表1 1 ：不同来源的r u b i s c o 及其羧化氧化值、结构和功甜1 1 l 表1 2 ：r u b i s c o 的大亚基的活性位点的部分氨基酸比较( f o r m sia n di da n d ( f o r m s a n di v ) 1 1 2 1 t 慢e o r v a r a s m 6 51 2 3 ”51 7 7 2 9 4 2 9 5 3 7 93 8 14 0 44 0 5 f o r mis o t r a t _ aetnk k h rsg o g m 招晌etnkk hrsg go 型幽型童里至i 蔓基k 鹜塞鱼垒垒 硒r mi i 矗r a b r u ,e tnk k hr sg g g 五c a m u l a t 珥etnk k hrsg g g fd a n # r i f i c a me tnkkt trs0 og f o r m 豇，月啪 e tnk k hrso g g 只h a r i l ：g h i ietnk kh 爱sg g g l m d 赫a r a e m i a etnkk hr sgg g n o t e ；e ，t ，n ，k ，h ，r ，s ，o ，q ，d ，f m , a dp 嬲址a u 。f a r ，a 姐l y s ，h i s ， a r g ，钳；q y ，q a 警，f a e ，抽地乎酣i 徊y 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s r u b i s e o 有活化和钝化两种形态，钝化型酶可被c 0 2 和m 9 2 + 激活，这种激活依 赖于与酶活性中心有关的赖氨酸的氨基( - n h 2 ) 有关。首先钝化型酶的- n h 2 与 c 0 2 作用，形成氨基甲酰化合物( e - n h c 0 0 。) ，它与镁离子作用形成活化型的酶 ( e - n h c o o 。m 9 2 + ，也称三元复合体e c m ) ，然后底物r u b p 和c 0 2 再依次结合 到活化型酶上进行羧化反应【1 3 1 。 r u b i s e o 只有先于c 0 2 、m 9 2 + 作用才能成为活化型的e c m ，如果先与r u b p 结 合，就会成为非活化型的e r u b p 。关于此酶的作用由图1 5 所示：在暗中钝化型 r u b i s e o 与r u b p 结合形成e r u b p 后不再发生反应，在光下，活化酶由a t p 活化， 让r u b p 与r u b i s e o 解离，使r u b i s e o 发生氨基甲酰化，然后与c 0 2 和m 矿结合形 成e c m ，促进r u b p 的羧化。 r u b i s c o 对c 0 2 的固定有很高的特异性，因此希望能够找到一种高效的r u b i s c o 或者突变体。但要表达出包含大小亚基且具有活性的全酶，目前来说还具有很大困 难l l 引。另外，改造r u b i s c o 是一个复杂的过程，必须和叶绿体的整个生理联系起来。 抑制 厂 a t p r u b i s c o a d p + p i o d 2 誓9 2 图1 5 ：r u b i s c o 活化酶活化r u b i s e o 的假说图【1 3 】 1 1 2 2 果糖一l ，6 一二磷酸酶( f b p a s e ) 果糖1 ，6 二磷酸酶( f b p a s e ) ( e c ：3 1 3 1 1 ) 主要作用是催化果糖1 ，6 二磷酸 脱去c l 位上的磷酸，水解形成果糖一6 磷酸，并释放一个磷酸根。在叶绿体中，果 糖一1 ，6 一二磷酸酶( f b p a s e ) 主要参与卡尔文循环，固定二氧化碳【1 5 。1 7 】；在哺乳动 物和异养细菌中果糖1 ，6 二磷酸酶( f b p a s e ) 是糖质新生中很重要的一个酶【l8 】。 根据序列的同源性，f b p a s e 可分成5 种类型，i 型分布最为广泛，存在于大多数细 菌中，少量古细菌中和所有真核生物中【1 9 。2 0 】。也有许多细菌表达i i 型f b p a s e ，在 大肠杆菌( e c o i l ) 中由g l p x 编码，但是其生理学上的作用目前还不清楚【2 l 】。在p h y l a f i r m i c u t e s ，f u s o b a c t e r i a , 以及部分b a c t e r o i d e s 表达i 型f b p a s e ，i v 型f b p a s e 主 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 要存在于古细菌中，耐热细菌中还存在着v 型f b p 觞e 田讲l 。目前f b p a s e 的晶体结 构也已有许多报道瞄- 2 7 1 ，现已知道f b p 笛e 在动植物中都是一个由四个相同的亚基 组成的四聚体，并且还原型和氧化型之间结构也会发生约1 7 0 的扭转团圆l 。目前， 在动物中以f b p a s e 为靶标合理设计型糖尿病抑制剂已有高活性先导化合物报道 3 0 - 3 3 j 。在植物中，通过调控单个f b p a s e ，从而调控整个卡尔文循环的效率。j k o b m a n n 等人通过减少转基因马铃薯叶绿体中f b p a s e 含量发现：当f b p a s e 的活性只有野生 型的1 5 时，导致的生长速率减慢，并且茎长得小；当活性为野生型的3 6 时，茎 的发育正常，但是光合能力比较低，同时可溶性碳水化合物的含量增加刚。另外， h a z e mo b i a d a u 驯u i 等抑制西红柿中f b p a s e 的活性，导致西红柿体积减小，但是对 于碳水化合物代谢的影响却较d , t 3 5 j 。 1 1 2 3 景天庚酮糖一1 ，7 一二磷酸酶( s b p a s e ) 景天庚酮糖1 ，7 二磷酸酶( s b p a s e ) ( e c ：3 1 3 3 7 ) 和f b p a s e 在植物叶绿体 内是同功酶p 6 j ，s b p 嬲e 也是光调控酶。1 9 世纪6 0 年代前一直把两者当作是同一个 酶，事实上在一些藻类中也只存在一种同时具有s b p 嬲e 和f b p a s e 的双功能酶【3 7 1 ， 这也意味着两种酶之间有很强的同源性【3 8 】。1 9 7 8 年，b r e a z e a l e 等人发现一种对景 天庚酮糖1 7 二磷酸有特异性的酶f 3 9 】；接着n l s h i z a w a 和c a d e t 等人分别从玉米和 菠菜中纯化出s b p a s e 4 0 - 4 。虽然s b p a s e 与f b p a s e 两者序列上同源性只有2 9 3 2 ， 但是二者活性空腔却比较保守心j ，这正好说明两者在功能上相类似。s b p a s e 由于 受到光调控，因此在黑暗中处于无活性的氧化态，在硫氧铁氧还原蛋白的作用下还 原成具有活性的还原态【4 3 舶】。而且s b p a s e 是植物所特有的一种光调控酶，在动物 体内，则不存在s b p 弱e 。 2 0 0 1 年y o s h i k om i y a g a w a 等人【4 5 j 报道了将蓝藻的f b p a s e s b p a s e 双功能酶转 录到烟草中，并第一次发现通过过量表达c a l v i n 循环中的单个酶，使得烟草的二氧 化碳的固定以及光合合成效率增加。但是蓝藻的s b p a s e f b p a s e 是一个双功能酶， 因此无法确定到底是两个酶协同作用还是单个酶起作用。为了更进一步的了解 s b p a s e 与f b p a s e 在对植物的生长、光合作用以及c a l v i n 循环的影响，2 0 0 5 年 s t e p h a n el e f e b w e 等人 4 6 】将拟南芥的s b p a s e 的在烟草中过量表达，发现在烟草生 长的早期能够促进植物的生长，同时叶片的生物量也有所增加，并且是过量表达 c a l v i n 循环单一的一个酶一s b p a s e ，从而促进植物在生长初期的快速生长。另一 方面，e l i z a b e t hp h a r r i s o n 等人在1 9 9 8 年发现降低转基因烟草中s b p a s e 的活性导 致植物光合作用能力减少并改变碳水化合物的积累 4 7 1 。2 0 0 1 年时发现s b p a s e 的少 量减少使得r u b p 的再生速率线性降低，但是对r u b i s c o 同化二氧化碳的能力却没 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 有影响 4 8 1 。2 0 0 6 年m a s a h i r ot a m o i 等人为了了解f b p a s e 与s b p a s e 分别对c a l v i n 循环的影响，在转烟草的叶绿体中分别表达了蓝细菌的f b p a s e 和衣藻的s b p a s e ， 并且发现s b p a s e 对r u b p 的再生起着至关重要的作用，而f b p a s e 主要调控r u b p 再生过程中c 0 2 的固定和淀粉的合成 4 9 1 。因此s b p a s e 对于植物的生长有着至关重 要的作用。 1 2 本文立题思想 我国是一个农业大国，农业是国民经济的基础，农药在农业的现代化的进程中 具有十分重要的作用。据有关统计，若不使用农药，玉米将减产3 0 ，大豆减产5 7 ， 棉花减产3 9 ，水稻减产5 7 ，各发达国家目前因病虫草鼠害所造成的损失竟达 3 0 之多，各发达国家目前仍依赖农药来保证农作物的产量和质量。 随着科学技术的迅速发展，不少相关研究目前已经深入到细胞或分子水平 上，并创制出超高效、高选择性、低毒、低残留对环境友好的新农药品种。但农药 如果长时间使用单一品种，往往会带来生态的变化和抗性的产生等问题。目前对于 药物的研发常常有两种方法：一种就是不断对先导结构进行修饰，这种需要对靶标 的结构以及突变体结构有充分的了解；另一种就是寻找新的靶标，这种方法优势在 于研制出的产品不易产生抗药性，但是新的靶标的寻找是十分困难的。 光合作用只在植物和细菌中存在，以光合作用系统为靶标的化合物对于人 畜的影响也会很小，因此光合作用是生物合理设计低毒高效除草剂的理想靶标。在 暗反应碳同化的过程中，f b p a s e 与s b p a s e 对于植物的卡尔文循环以及植物的生长 都有着重要的意义。并且s b p a s e 对同化c 0 2 的核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶力日氧酶 ( r u b i s c o ) 的底物核酮糖1 ，5 二磷酸( r u b p ) 再生以及合成淀粉都有非常重要的 调控作用。实验报道，少量改变烟草中的景天庚酮糖1 ，7 二磷酸酶( s b p a s e ) 的含 量，会导致植物光合作用效率发生明显的变化，因此如果能够降低植物体内的 s b p a s e 的活性，降低植物的光合作用效率，进而可以达到抑制植物的正常生长的目 的。2 0 0 2 年a n j a 等人就尝试高通量筛选s b p a s e 的抑制剂，并且得到有些化合物能 够抑制酶的8 0 的活性【5 0 】，因此如果以s b p a s c 为靶标生物合理设计小分子化合物 来抑制s b p a s e 的活性，可以达到除草目的，另一方面，以s b p a s e 作为新靶标也可 以尽量避免植物的抗性，所以s b p a s e 是一个良好的潜在除草剂靶标。 由于目前s b p a s e 的研究相对于f b p a s e 来说非常有限，因此以f b p a s e 作为 研究s b p a s e 的基础是非常必要的。本文首先是以蓝藻f b p a s e s b p 嬲e 双功能酶为 研究起点，开展针对蓝藻双功能酶的抑制剂的生物合理设计，在结合酶水平上的， 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 生物活性测试，充分了解f b p a s e 的活性空腔的结构，以及催化水解机理。 基于上一章的研究基础，以拟南芥的s b p a s e 为靶标，基于f b p a s e 研究的结果， 设计并筛选针对s b p a s e 的潜在抑制剂。结合酶水平的生物活性测试，希望能够对 于s b p a s e 的活性空腔有进一步的了解，并对s b p a s e 的催化水解机理能够有新的认 识，以期能够找到高活性的苗头化合物。 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 第二章理论基础和计算方法 本文主要通过同源模建的方法，以不同模板构建已知一级结构但三级结构未知 的f b p a s e 和s b p a s e 的三维结构，通过分子力学对蛋白结构进行优化。经过优化后 得到的最佳构型再与小分子库进行分子对接，寻找能够与蛋白活性空腔有良好作用 的小分子化合物。研究主要的理论方法是同源模建、分子力学、分子对接。下面对 这几种计算方法进行一下简单的介绍。 2 1 同源模建( h o m o l o g ym o d e l i n g ) 假设所要研究的靶酶( t a r g e t ) 的3 d 结构还未通过x - r a y 或者n m r 解析，只 有其一级序列。如果与之同源的蛋白( 同源性 3 0 ) 3 d 结构已解析( 这个蛋白结 构称为模板) ，那么可以通过软件计算，并模拟出靶酶的3 d 结构，这个过程就叫做 同源模建。( 注：在模建未知3 d 结构的蛋白时，也有从头算等其它方法1 5 卜5 2 j 。) 同一家族的蛋白的3 d 结构一般要比起一级氨基酸序列要更加保守【5 3 1 。如果两 个蛋白在氨基酸序列上有比较好的同源性，那么其结构的相似性则可以预测，但是 有些蛋白的氨基酸序列同源性不高，但是在结构上也是有可能相似的【5 3 1 。目前同源 模板一般都分为四个步骤瞰。5 6 】：蛋白序列折叠分析与模板的选择，靶酶与模板序列 比对，模型的建立和模型的评估与改进。( 图2 1 1 ) 如果模型不符合要求，则可以 重复以上的步骤，重新选择直到达到满意的模型。 1 0 幽2 - 1 ：同掠模建的一般步骤胛i 2 1 1 序列折叠分析与模板选择 同源模建的第一步就是分析与靶酶相关的蛋白的晶体结构，从而选择合适的模 板。一般来说，与靶酶相关的蛋白的晶体结构可以通过靶酶的氨基酸序列利用一些 咧站或者数据库来搜索。比如院：p r o t e i n d a t a b a i l k 【期，s c o p l 5 8 。9 1 ，d a l i i 。i ，c a t h 6 1 - 6 2 1 。 在序列分析中最常用的蛋白分析方法主要包括数据库中单个序列与靶酶序列的比 对方法：f a s t a ”，b l a s t “啪j ，以及多个同源蛋白序列与靶酶序列的比对方法： p s i b l a s t l 州“。另外一种方法就是基于靶酶蛋白结构与已知晶体结构之间的比对， 结合结构打分函数，单独考虑每个序列结构片段”8 - 7 9 。这种方法主要是应用在 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 无法找到与靶酶序列有明确同源性的已经晶体结构。 序列折叠分析就是利用上述的比对方法与软件，选择一个或者多个合适的模板 进行模建。在选择一个或者多个模板时，总的原则是氨基酸序列的整体同源性越高， 这时所得到的模板就越好。选择适当模版可参考以下的方式： 乱经由多重序列排列或演化树的分析找出与未知结构蛋白质序列最接近的蛋白质 结构，亦即一致性比较高的蛋白质结构。 b 这些被解的结构中，考虑它们的r e s o l u t i o n 3 0 ) ， 利用s w i s s - m o d e l 的f i r s ta p p r o a c hm o d e l 方法模建，模建的结构是从4 号竟氨 酸( l e u l ) 到3 3 3 号的甘氨酸( g l y ，g ) ，共3 3 0 个氢基酸。 凹3 - 2 ：蓝藻f b p a s e1 i 模扳i n l 9a 的叠台目。红色是模扳，绿色是模型，。1 悯为底物。 模建的结果利用s y b y l 软件包进行分子力学的结构优化，优化时采用的是 p o w e l l 方法和t r i p o s 力场。将优化后的结果与模板的结构进行叠合( 如图3 2 ) ，模 型与模板的c 的r r n s d 值为2 0 2 。同时利用p r o c h e c k 程序对模型进行检验( 如 图3 - 3 ) 。 一 r a l l l a c h a l l d r a np l o t r e s i d u e si nm o s tf a v o u r e dr e g i o n s 【a ，b ，l 1 2 3 58 94 r e s i d u e si na d d i t i o n a la l l o w e dr e g i o n s a ，b ，l ，p 】 2 387 r e s i d u e si ng e n e r o u s l ya l l o w e dr e g i o n si a ，曲，一i ，一p 】4l5 r e s i d u e si nd i s a l l o w e dr e g i o n s10 4 图3 3 ；蓝藻f b p a s e 的r r m a e h a n d m n 圈 对于p r o c h e c k 检测的r a m a c h a n d r a n 图来分析各种氨基酸在空间位置上是否 具有统计学上的概率分布。目前r a m a c h a n d r a n 图已被广泛用于鉴定实验测定的或 者计算模拟出的各种蛋白质结构的合理性。图3 。3 是对于模建的蓝藻f b p a s e 的检测 结果。其中红色区域显示的是最适允许区为8 94 ，黄色的是最大允许区为8 7 ， 颜色再浅一点的区域是一般允许区这个区域中有四个氨基酸a r g 7 6 、l y s l 7 9 、 c l u 2 4 8 、a l a 2 9 4 ，说明在分布上是允许的，但是在结构卜是不稳定的。不允许区 为o4 ，a s p 6 0 落在此区域中，表示其不满足统计学上的分布。总的来说，蓝藻 f b p a s c 的模型是满足r a m a c h a n d r a n 图分布规定的，因而优化后的f b p a s e 模攫用于 其后的结构研究是可行的。 3 2 3f b p a s e 的活性空胜的建立与筛选策略 根据模建的蓝藻f b p a s c 的3 d 结构，对蓝藻f b p a s e 的活性空腔进行研究。由 于模板的晶体结构i n l 9 中没有底物因此采用s y b y l 软件的s u l f l e x - - d o c k 进行 对接底物f b p 。其中活性空腔的位置通过s u l f l c xd e c k 的p r o t o c o lg e n e r a t i o n 中的 自动生成，其位置与f b p a 她家族中的底物f b p 的位置一致口叫”。蓝藻f b p a s c 的 活性空腔的如图3 _ 4 所示。 逖 矿占、 ，如洲、掣二 1c - t 】， 、 “ 、， t “， ： 7 图3 - 4 ：蓝藻f b p a s e 的活性空腔，底物为对接的f b p 2 3 错浆 y i p i n g z h a n g 小组【1 8 1 和j u n - y o n g c h o e i “9 组均对f b p 嚣e 催化水解f b p 机理 进行了研究，在f b p a s e 的活性空腔中，主要是g l u 9 8 、a s p 7 4 、a s p 6 8 、a s p l l 8 、 a s p 2 1 等负电氨基酸形成一个大范围的负电荷区域，在m 9 2 + 的介导下，夺取水中 的氢质子，剩下的o h - 进攻p 原子。另外r u l i nz h a n g 等人1 1 2 0 1 对猪肾脏中的f b p n s e 的结构也进行突变研究，将活性空腔中的a r g 2 7 6 突变成甲硫氪酸( m e t ，m ) ， 研究发现, a r g 2 7 6 对于催化水解底物f b p 有着重要的作用虞变后的蛋白的催化活 性明显下降，k c a t 只有野生型的o6 7 。更为重要的是a r g 2 7 6 的突