（环境工程专业论文）基因工程菌对偶氮染料脱色研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本文综述了处理偶氮染料废水的多种方法，详细介绍了基因工程技术和生物强化方 法的特点及其在废水处理中的应用。在此基础上，研究了四方面内容：基因工程菌 j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 的培养发酵条件；基因工程菌j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 的脱色能力研究； 受体菌ec o l ij m l 0 9 的脱色能力研究；以上二株菌的生物强化效果比较。 基因工程菌j m l 0 9 ( v g f x - a z r ) 最佳培养发酵条件为：n a 2 i - p 0 4 ( 4 2 6 9 l ) ， k h 2 p 0 4 ( 2 6 5 9 l ) ，m n s 0 4 7 h 2 0 ( 0 0 0 2 9 l ) ,f e s 0 4 7 e 【2 0 ( o 0 1 9 l ) , m g s 0 4 7 1 4 2 0 ( 0 2 9 i n ) ， c a c h ( o 0 2 9 ，l ) ，n h 4 c i ( 0 5 9 l ) ，a m p ( 5 0 m g l ) ，葡萄糖( 5 鲫l ) 、氯化铵( 3 9 l ) ，p h 为 7 5 ，温度为3 5 ；接种量1 0 m l l 。 基因工程菌j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) ( g e m ) 缺氧条件下脱色效果强于好氧条件 下；缺氧条件下对酸性红b 、酸性橙i i 、酸性红6 b 、酸性黑1 0 b 、酸性红g 、酸性红 g r 均有较好的脱色效果，其适用范围广；对不同浓度的染料( 5 0 5 0 0 0 m g , l ) 均有脱 色效果；在p h 缸8 之间，2 5 - - 4 0 ，盐度1 5 ，均有较好的脱色效果；在考察范围的 盐度和p h 范围内符合一级动力学方程；基因工程菌ec o l ij m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 脱色 过程是- n = n 断裂生成小分子芳香胺的过程。 受体菌ec o l ij m l 0 9 缺氧条件下对偶氮染料的脱色效果强于好氧条件下：能耐受 5 0 0 0 m g l 的染料浓度，脱色率达到8 0 ；对酸性红b 、酸陡橙、酸性红6 b 、酸性黑 1 0 b 、酸性红g 、酸性红g r 均有较好的脱色效果，其适用范围较广；在p h 6 - - 8 之间， 2 5 , - - 4 0 ，盐度1 5 之间对偶氮染料均有较好的脱色效果；对偶氮染料的脱色过程是 n = n 断裂生成小分子芳香胺的过程。 生物强化试验中，基因工程菌j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 和ec o l ij m l 0 9 相对于活性 污泥系统均有强化效果；基因工程菌的强化能力优于j m l 0 9 ，进水葡萄糖最佳浓度为 1 0 0 0 m g 甩，对酸性红b 、活性红k - 2 b p 、酸性品红6 b 有较好的强化作用。 关键词：偶氮染料；基因工程菌j m l 0 9 e x - a z r ) ；生物强化 基因工程菌对偶氮染料脱色研究 a b s t r a c t s o m e t e c h n o l o g i e st ot r e a ta z od y e w a s t e w a t e ra r ei n 口o d u c e di nt h i sp a p e r ，e s p e c i a l l yt h e c h a r a c t e r sa n d a p p l i c m i o no f g e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g ya n db i o a u g m e n t a t i o n f o u ra s p e c t s a r ei n c l u d e di nt h ep a p e r ，t h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o no f j m l 0 9 g e x - a z r ) f e r m a n t a t i o n ，t h e t h es t u d yo i ld e c o l i r i z a t i o no f j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) ，t h e s t u d yo n d e c o l o r i z a t i o no f j m l 0 9 ，t h e b i o a n g r n e n t a t i o no f t w o b a c t e r i a t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fj m l 0 9 ( i k 3 e x - a z r ) ：n a 2 h p 0 4 ( 4 2 6 9 l ) ， k t t 2 p 0 4 ( 2 6 5 9 l ) ，m n s 0 4 7 1 4 2 0 ( 0 0 0 2 9 l ) ，f e s 0 4 7 i - 1 2 0 ( 0 o l g l ) ，m g s 0 4 + 7 h z o ( 0 2 9 l ) ， c a c l 2 ( o 0 2 9 l ) ，n h 4 c i ( 0 5 9 l ) ，a m p ( 5 0 r a g l ) ，g l u c o s e ( 5 e e l ) ，n h 4 c 1 ( 3 9 l ) ，p h7 5 ， t e m p e r a t u r e 3 5 * c ，i n o c u l a t i o nq u a l i t y l o m l l u n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n j m l 0 9 ( p g f x - a z r ) c a l ld e c o l o r i z em o r ee f f i c i e n t l yt h a n a e r o b i c i tc a nd e c o l o r i z en u m e r o u sa z od y e s ，s u c ha sa c i dr e dr e db ，a c i d o r a n g ei i ，a c i db l a c k 1 0 b ，a c i dr e dg ，a c i dr e dg r t h ed e c o l o r i z a t i o nc o n c e n t r a t i o ns c a l ei s5 0 5 0 0 0 m g l t h e o p t i m a l d e c o l o r i z a f i o nc o n d i t i o ni sp h 6 8 ，2 5 4 0 。c ，s a l i n i t yl 5 t h ed e c o l o r i z a f i o na c c o r d s w i t ht h ef i r s tc l a s sk i n e t i c se q u a t i o n u n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n , ec o l ij m l 0 9c a nd e c o l o r i z em o r e e f f i c i e n t l yt h a na e r o b i c i t c a r ld e c o l o r i z en u m e r o u sa z o d y e s ，s u c h a sa c i dr e db ，a c i do r a n g e i i ，a c i db l a c k1 0 b ，a c i dr e d g ，a c i dr e dg 1 lt h ed e c o l o r i z a f i o nr a t ei s8 0 a tt h ec o n c e n t r a t i o no f s 0 0 0 m g 几t h eo p t i m a l d e c o l o f i z a t i o n c o n d i t i o n i s p h 6 - g ，2 5 - - 4 0 c ，s a l i n i t y1 - - 5 c o m p a r e dw i t ht h ea c t i v a t e ds l u d g e , t h et w os y s t e m sb i o a u g m e n t e db yj m l 0 9 ( p ( 3 e x - a z r ) a n d e c o l ij m l 0 9i e a ta z od y ew a s t e w a t e rm o r ee f f i c i e n t l y , e s p e c i a l l yj m l 0 9 ( p g e x - a z r ) t h eo p t i m a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no f i n f l u xi s 1 0 0 0 m g l j m l 0 9 3 e a z r ) c a n b i o a u g m e n t t h ei r e a to f a c i dr e d b ，a c t i v e r e dk 一2 b pa n da c i df u c h s i n6 b k e yw o r d s ：a z od y e ；g e n e f i c a le n g i n e e r i n gm i c r o o r g a n i s mj m l 0 9 ( p g e x - a z r ) ； b i o a u g m e n t a t i o n i i 独创性说明 作者郑道声明：本硕士学位论文是我个人在导师指镣下进行的研究 工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其德入已经发表藏撰写的研究成采，也不包含为获得 大连理工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 豹霜恚对本研究所骰麴贡献均叠l 在论文中散了明确酶说明并表示了谢 意。 作者签名：鱼f 查日期：兰竺：! ：立 大连理工大学硕士学位论文 引言 全世界使用的合成染料达3 万多种，8 0 以上的染料为含偶氮键、多聚芳香环的复 杂有机化合物。染料工业是化学工业中环境污染极其严重的产业之一。 生物法以其运行成本低，无二次污染的优点逐渐成为染料废水处理技术的主体。生 物强化处理技术是为了提高生物系统的处理能力，而向该系统中投加的从自然界中筛选 的优势菌种或通过基因工程产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害物质的方法。 目前，生物强化技术的实现途径为投加有效降解的微生物；优化现有处理系统的营 养供给、添加基质( 底物) 类似物来刺激微生物生长或提高其活力；投加基因工程菌。 最为普遍的方式是直接投加对目标污染物具有特效降解能力的微生物，这种特效微生物 经过筛选、培养、驯化之后，投入到该废水中，进行处理。该方法可有效提高有毒有害 物的去除效果，改善污泥性能，加快系统启动，增强系统稳定性、耐负荷冲击能力等， 操作简便，易于管理。 投加的微生物应满足三个基本条件：投加后，菌体活性高；菌体可陕速降解目标污 染物；在系统中不仅能竞争生存，而且可维持相当数量。生物强化制剂的优点：它能缩 短微生物培养驯化的时间，迅速提高生物处理系统中微生物的浓度，从而提高工作效 率；使用安全，操作简单方便，可以实时地处理污染，从而节省能源。基因工程菌生物 强化技术存在的主要问题：基因工程菌对环境要求苛刻，而且释放到环境中存在一定的 潜在生态风险；由于对生物强化体系这一复杂的微生物生态系统调控不当，导致工程菌 难以与土著微生物竞争而形成优势菌，以及投加菌种流失或死亡，从而生物强化效果不 明显，甚至失败。 本文选用一株由本实验室构建的基因工程菌进行强化偶氮染料脱色试验，分别考察 其生长能力、脱色能力、在反应器中的强化能力。 基因工程黼对偶氮染料脱色研究 1 绪论 随着染燃与印染工业的发展，其生产废承已成为强前最主要黪东体污染源之一。印 染废水的水艨复杂，萁特点为：水量大、有机污染物含量高、色度深、碱往和p h 值 变化大、水质变化剧烈，增加了处理难度。废水中的p h 值、c o d 。、b o d s 、颜色各 不相同，可生他性差。q p v a 浆料和毅型助剂鲍使髑，使难生他降嬲的有极物在废水 中含量大大增加。通常赴璎方法分为翰联法、纯学法、生物法。秘祷常用的物理纯学法 见表1 1 ， 表1 1 嚣蓑鬻翔豹物理瞧学懿瓣豢瑟凌求搜零 t a b l e1 1t h e p h y s i c a l c h e m i c a l t e c t m o l p 西e 3 t o t r e a t d y e w a s t e w a t e r 由于物理化学法存在运行成本高，二次污染严重等问题，因此生物法仍然为浆用的 主要方法。以下痔主要介绍染料废水处理的生物法。 l 。l 染料建墩妻奄生物照理方法 1 1 1 好氧法 磐氧处遐法因其原理褥攀、效果良静两褥到广泛疲鼹。相对于勰氡处理法焉富，该 法不产生臭昧。但是，好擎e 处理法虽然对b o d 的去豫率较高，对穗度的去除率帮不太 理想，而且好飘处理法因为鼹通气而耗能较多，污泥产量也较大，给后处理造成麻烦。 藏驽氧处理法露言，除了强污涯控毒l 方颡俸进一步研究之乡 ，还应考虑与粳理法、佬学 法等方法的联用，以期在遮标排放的前提下，使处理效率更高、效果趸好、费用烫低。 2 大连理工大学硕士学位论文 1 1 + 2 获氢法 厌氧法处理废水经常伴随着腐臭味，假此法仍有其独到的长处：不必通气搅拌， 可降低能耗；产生的气体主要是甲烷，可提供新的能源；污泥生成量小，因而它是 一孛缀毒发震蕊途涎工监疲承处理方法。毽楚，疑惑髂上滋，羹蔻攀猿运震获氧憝璞法 处理染料废水效果不理想，难以达标排放。现在有许多研究人员采用不同措施改善工 艺，取得了一定成绩。李亚新等”l 】设计的厌氧生物滤池试验，得到了较好效果，可健 c o d 率去除这7 游s 6 。6 ，毪度去豫6 0 8 4 ，窭永承震稳定。 1 1 3 厌氧好氧联合法 一般说来，厌氧处理法对染料废水的色度去除率贡献较大，好锇处理对c o d 、 b o d 懿去豫率黉簸较大。逐年来，夔着染瓣蠢藐努解、貔生物簿簿方蠢懿发震，傻缮 染料废水的处理更加困难，单稚某种单一的处理方法很濉取得令人满意的效果。现在的 处理工艺已经逐渐转向以厌袋好氧联合处理为轴心的、与物理或化学方法结合的混合 多缀处理工艺，激麓这至l 最辕处瑾效栗。瓣本静辛嚣元臻等人溺藤注射器俸容器，弼疆 胶密封造成厌氯环境，分别处理活性染料的模型废水和蜜排废水，结果发现：不论撼对 c o d 还是对色腱，厌氧法的处理效果都不好。丽采用厌氧。好氧连续处理，则效果技 好，c o d 去除枣霹达酯稳度去除搴迭7 0 8 0 。 1 2 微生物对染料的脱色 微生物处璎染料瘥水较之物理化学方法有强大优势，戈其是微生物处理偶氮絷 辉。荮氧条侔下，菌体不能缀好的代谢偶氮染料；厌氧条件下，很多菌体能断裂亲漱性 的偶氮键，由偶氮还原酶将偶氮染料降解成2 种无色芳番胺。这些芳香胺厌氧条件下不 缝避一步降解，鼠对动物蒋蠢壤，致癌。霉运豹是芳香妓为好氧生物降鼷豹有效底物。 如槊好氧一厌氧系统用于废水箍逢，芳香胺w 通过好氧条件下羟基忧途径开环机理被彻 底矿化。 1 2 。1 混合菌体系瓣染料豹聪色 大量的研究发现，微生物群体内的菌体共代谢可以磊相弥补，形成更为有效的降解 和矿化。k n a c k m u s s p 曾研究用2 种菌同时降解磺酸萘：s p h i n g o m o n a sb n 6 能降解2 ，磺 3 熬因工程菌对偶氮染利脱色研究 酸蒙为东扬酸褰子等份凌，东枥羧离子髭逡一步簿解，蠹孬量楚建s p h i n g o m o n a sb n 6 褥 性。因而，只有能降解水杨酸离子菌体存在的情况下2 - 磺酸萘才被彻底降解。很多纯菌 都怒从菌落中筛选出的。表1 2 中列举了部分关于混合菌体系处理染料废水研究情况。 袭1 2 褒莹应舔予絷糕艟垂静情嚣 t a b l e l 2 b i o d e g r a d a t i o n o f # e s i nc o l o t l r e d w a s t e w a t e r u s i n g m i x e d b a c t e r i a c u l t u r e s 4 大连理工大学硕士学位论文 表1 2 ( 续表) 1 2 2 单一菌体系对染料的脱色 混合菌的优势是显而易见的，它们能完成很多纯菌不能完成的降解，更适用于实际 应用。然而，混合菌仅仅能提供给我们宏观现象，重复性差。而纯菌对研究降解机理很 有帮助。表1 3 列举了人工筛选的单一菌体系对染料的脱色情况。 1 3 影响偶氮染料脱色的因素 研究显示，生物脱色过程受操作参数( 溶解氧，温度，p h ) 及溶液的氧化还原能 力影响很大。体系中电子受体和电子供体的体积必须与反应体系中的中的生物量及染料 质量一致。 1 3 1 氧气对染料脱色的影响 氧气对菌体生长及染料脱色有重要影响。在生物体生长过程中，氧气对物理状态影 响很大，如果外界环境是富氧的，高氧化还原能力的电子受体氧气可能阻碍染料的脱 色。这是因为电子供体氧化释放出的电子更易于还原氧气而不是偶氮染料。 研究显示，在脱色过程中，避免接触氧气。然而，好氧条件下，偶氮染料脱色的抑 制是暂时的，可逆过程。如果用氮气取代空气中的氧气，还原过程就重新开始，并与持 续厌氧速率一样。氧气对偶氮染料还原的抑制可以解释为其对厌氧菌的毒性，也就是偶 氮还原酶与氧气反应而不是偶氮染料。 厌氧条件下，偶氮键断裂后，染料分子没发生进一步裂解。若想完全矿化必须有氧 5 基因工程菌对偶氨染料脱色研究 表1 3 缝薤盎鼹予絮校魏色翳壤凝 t a b l e1 3b i o d e g r a d a t i o no f d y e si ne o l o u r e dw a s l e w a i e r u s i n gs i n g l eb a c t e r i as t r a i n 存在。这是因为好飘条件下芳香胺才可羟基化汗环降解。因此，对有效的废水处理，需 要聚用厌隼c _ 好氧工艺。好氧与厌氧的平衡必须严格控制，因为有氧会造成脱色产物颜 色交深。芳香胺产镌梵厌氧条襻产耱，爵氧条件下不稳定，傻羟基和氨鏊鬣纯藏奎宁翻 6 大连理工大学硕士学位论文 亚胺奎宁，脱色副产物产生新的色度。在精确的操作条件下，很多菌能在厌氧好氧序批 反应中有很好的脱色效果。 1 3 。2 瀑麓瓣染秘聪色& 影稳 在一定范围下，溢度增高会提高脱色率。脱色效果与菌体的生长温度一致，大致为 3 5 - - 4 5 c 。高温度下，脱色活性的降低是由于偶氮还原酶的失活。若条件合遣，偶氮还 燕i 酶毒缀照懿热稳定憋，国短蘩芬窍较褰靛琶效率。 1 3 3 p h 德对染料脱色的影响 脱色最佳的p u 为中性或偏弱碱陛，强酸性或强碱性使脱色速率下降。偶氮染料的 生兹还覆中，芳香黢黪健滋产戆会经p h 爵裹，葚黧篦嚣戆靛镐氮染麓穰篷逶强。p 壬| 在 7 0 到9 5 范围内，对偶氮染料的还原影响很小。p h 从5 0 到7 0 ，还原速率增长2 5 倍，p h 7 o 9 5 范围内逋率变化不明鼹。 1 3 a 染鞲浓度簿染耩裁急瓣影响 染料浓度会影响脱色效率是由染料的毒性引起的。酶一般程低浓度染料下有很好的 脱色效率。m i e h a e l i s - m e n t e n 方程可以用来描述酶储化过程： 晶 其中：v 一i s l 浓度下反应速率；v m 。某底物浓度下最大速度；挺。一 m i c h a e l i s 鬻数。 w u h r m a n n 口n n n 察发现，初始快速的脱色后，脱色速率会降低。这是由予染料脱 色过程中代谢中间产物的毒性造成的。染料浓度越麓，脱色需要的时间就越长。s a n i 2 4 j 等发瑗，1 - 1 0 u m 静袋精容易遥色。缳当梁籽浓发量爵凳3 0 u r n 辩，麓色减弱。然两有 些染料浓魔对脱色率无影响。这符合p 酶还原机理，此脱色过程内与染料浓度溉关的因 素控制。 1 3 5 染料缩擒对染辩簸色的影穗 结构简单的，分子缀低的更容易被降解：相反结构复杂，分子量大的难以降解。根 据末端非酶脱色枧理，还原速率受偶氮基团附近电子密度影响。供电子取代基( s 0 3 h 7 鏊困工程蕴对髑熬染鹈聪色研究 一s 0 2 n h 2 ) 在偶氮键的对位，会增强脱色速率。 n i g a m n 等证实有羟罄和氦基的偶氮染料眈甲纂，甲氯基，磺酸基，或硝蕊的染料 更容易降孵。染糕残色瞧与偶氛键缒数量有关。单弱氮染鹋 l 双蠛三弱氮染辩聪鲁淡。 很多研究人员认为染料的种类与脱色有关而不是分子结构特征。酸性染料由于若干磺酸 基豳的存被脱色速率比较慢。赢接染料就比较快。活性染料脱色逋率较慢。磺酸基团对 黢惫戆影晦与驳魏爨瓠溪有关。如票染褥黢馘生在缨您内部，磷酸基溺会疆礴粢器分 子在细胞膜的转移，因此磺酸基团数擞越大，脱色速率越慢。然而，如粜染料脱色发生 在细胞外，磺酸基团对染料脱甑影响比较小。 产瘸氮还暴酶蕊体对特定绻捣熬染糕存专一萑。橙 稻氮还滚酶特舞犍蠡栽髓琶橙 i 及其对位羟基的衍生物。另一种酶掇i i 偶氮还原酶对橙i 及其邻位羟熬衍生物有特辨 性脱色效果。也发现磺酸基染料比羧酸染料容易脱瓴。磺酸基的商电负性使偶氮基团容 易褥至l 毫蕊。 氢键对偶氮基团的溆子密发影响缀大，对还原速度影噫也很大。取代基的位置和性 质影响羟基偶氮化合物的偶氮- 腙互交现象。偶氮染料衍生物中的羟基质子不稳定，会 与稳氮键审豹氮骚子结合，形成偶氮* 藤互交平衡。这个平衡受分子结祷帮分予周密环 境的影响。z i m m e r m o n 2 8 l 发现，腙存在下，偶氮还暇酶活拨下降，这表明分子鲍偶氮结 果的稳定对酶反_ 暾很重要。目前甲基的影响还没有明确的碜f 究结聚。 1 3 。6 毫子供体对染瓣聪惫的影瀚 有机媳予供体和氢对脱色过程缺一不可。b r a s e l q 等研究表明添加萄毽糖，醚酸根离 子等电子供体助予偶氮键的断裂。不同电子供体热稳定性是不同的。因此，脱骰速率受 电予供体酶影响穰大。考察每个生物黼色过稷的电予供体垒物特设是禳羹要的，电子供 体不仅毖域强脱色率，还能为磁究酶佟甩途径提拱线索。例如，如果甲酸盐 乍为厌氧下 转移入染料分子的最佳电子供体，可得出结论，过程中有甲酸盐脱氢酶的参与。 辅助底妨( 秘始电子供体) 的浓废能控掰还原平衡产物的形成速度( 中间电子供 体) 。y 。o 圆发现，缨憨滚慕的产物可以搀为茨氧偶氮还暇豹电予供体。通常避程孛， 还原型辅酶被有机底物氧化发生电子转移。在偶氮染料还原过程中，辅酶作为电子的供 8 大连理工大学硕士学位论文 体。一些化学物质，如邻乙汞硫基苯酸钠，阻遏产n a d h 体系的乙醇脱氢酶反应， n a d h 是染料还原过程中产生还原中间产物做必需的。因此，n a d h 是偶氮还原速度 的决定者。 1 3 7 氧化还原电位对染料脱色的影响 色度的脱除依靠电子受体和供体的氧化还原电位，因为还原的控制阶段是个氧化还 原平衡( 染料与胞外还原基团) 。氧化还原电位能体现分子接受电子被还原的能力。因 而，还原能力越强，分子越容易被还原。b r a g g e r l 2 1 】等研究显示，在脱色率的对数值与 底物斑驳能力间存在线性关系。这种脱色率与染料底物的电化学性质关系表明菌体还原 染料脱色的决定速度与一些结构特异性现象无关，如选择性膜渗透。 厌氧条件下，低氧化还原电位( 蔗 糖 乳糖 葡萄糖 淀粉 果糖。相比较下，工程菌j m l 0 9 ( v g e x - a z r ) 在以甘油作为 碳源的培养集中长势最好，但甘油价格较贵；蔗糖为碳源，菌体生长启动期长；乳糖还 可用作诱导剂阳。因此，本试验培养基考察以葡萄糖为碳源。 2 2 2 3 氮源的影响 氮源的作用是提供微生物合成蛋白质的原料，是不可缺少的生长元素。分别加入 5 9 几的n h 4 c 1 、( n h 4 ) 2 s 0 4 、尿素( 脲) 、草酸铵及蛋白胨于3 0 * ( 2 ，1 5 0 r m i n 摇床中培 养，进行氮源选择。结果如图2 6 所示。 蛋白胨作为氮源时，菌体生长状况最好，但由于蛋白胨是一种复合营养物质，其中 的成分比较复杂，且价格昂贵，所以实际发酵中不予采用。其余四种氮源之中加入 n i - g c l 的j m l 0 9 ( r ) g e x - a z r ) 的长势好且价格便宜，所以采用n h 4 c 1 作为氮源。 2 2 2 4 碳源用量的影晌 选取葡萄糖用量为5 9 l 、6 9 l 、7 9 l 考察碳源用量对菌体生长的影响，结果如图 2 7 大连理工大学硕士学位论文 0 5 0 4 吉0 3 至 璺9 0 2 b 勺 0 1 0 0 01 52 02 53 0 t h 图2 5 碳源对菌体生长的影响 f i g 2 5i n f l u e n c eo f c a r b o n s o u r c e st og r o w t h 02 02 5 图2 6 氮源对菌体生长的影响 f i g 2 6t h e i n f l u e n c e o f n i t r o g e ns o u r c e s o n g r o w t h 从图2 7 中看出，菌体长势为葡萄糖5 9 i _ 7 9 l 6 9 l 。菌体在葡萄糖用量为5 9 ，i j 6 5 4 3 2 l o o 0 0 0 o 0 0 ，j、靠一喜 基因工程甑对偶氮染料脱色研究 时生长状态最健。由此得出结论，葡萄糖的用量不是越大越好，这可熊是由于葡萄糖发 醵的产物是乙酸h ”，而乙酸鼹菌体代谢的产物，而且会使培养基层酸性，从而抑制筒的 奎鲶。因此，壤定蔻葵培养中羰潺月量为5 9 咒蕙莓糖。 051 91 52 02 5 t h 圈2 7 萤萄糖爝羹对燕俸生长鲍影噍 f i g , 2 7 t h ei n f l u e n c e o f g l u c o s e q 砌i t y o n g r o w t h l 黝il隰l| 234567 n h 。c 逸l 4 图2 8 氯化铵对荫体生长的影响 f i g , 2 8 t h e i n f l u e n c e o f n i - h c l o i l g r o w t h 5 o 5 0 5 o 5 o 们 蚴 0警蛩。_享口 箝瓣药：2持：宝 o 0 o 0 o o o o -1警4搴p喜 大连理工大学硕士学位论文 2 2 2 5 氮溅粥量的影响 对氮源用量进行考察，选择n h n c l 用量为2 9 i 。、3 e 2 l 、4 9 l 、5 9 l 、6 9 m 、7 9 l ， 实验结果如图2 8 。 从图2 8 可知，n h 4 c 1 对菌体生长无瞻显影响，实黼发酵中采瘸3 9 疋。 2 2 2 6 p h 的选择 微生物的生命活动、物质代谢与斌密切秘关。p h 值对基因工程菌j m l 0 9 ( r “3 e x - a z r ) 的影响翔豳2 9 所示。 。，4 乙0 3 警 蚤0 2 耋 害o 1 0 0 1 01 52 02 5 t l h 图2 9 p h 对菌体生长的影响 f i g , 2 9t h e i n t l u e n e e o f p h 簌图2 9 器墨在鹾壤势7 或7 5 辩蘧傣魏于重黎鞍嵩，毽生长麓麓蓍莽在必 熬 培养基生长的情况较好，而后期在p h = 7 5 的培养蘩生长占优。分析原因为基因工程菌 j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 嫩长的过程中产生的代谢产物乙酸及c c h 降低了培养潦的p h 毽，颞殴器麓掇较裹戆壤券基孛生长馕凝较磐，实辩发赘中采曩p # 7 ，5 。 2 2 2 7 接种爨的影响 改变接种量5 m i j l 、1 0 m l l 、2 1 h n i j l 、3 0 m l j l ，考察接种量对菌体生长的影响， 缝象蘩銎2 。1 8 。 从图2 1 0 可以看出接种量大，初始菌密度比较大，但最后趋于致，接种量大启动 期短，接种燃小启动期长，对茵体生长最终值无影响，实际发酵使用接种量1 0 m i j l 。 基匿i 】：程菌对偶氮染料脱色研究 - 警 蚤 茧 o 6 o 5 o 4 0 3 b o 2 w 0 1 o o 01 0 1 52 02 5 t h 圈2 1 0 接种量对菌体囊长的影响 f i g 2 1 0 t h ei n f l u e n c eo f i n o c u l a t i o no dg r o w t h 2 2 。2 8 瀛寝翡影璃 温度是微生物的熏要生存因予，温度对体内酶的活性影响很大，因此温度的变化通 常对菌体生长有明显影响。改变温度3 0 。c 、3 5 c 、4 0 。c ，结暴如图2 。l l ： 冀 。5 器 官冀 0 o 051 0l52 02 5 t h 图2 11 湓度对菌体生长的影响 f i g 2 11t h e i n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r et og r o w f l l 大连理工大学硕士学位论文 从图2 1 l 中可以看出，温度3 5 时，菌体的生长状况最好。在适宜的溆度范围 内，温度每升高1 0 。c ，酶促反应速度将提高1 - 2 倍，微生物的代谢速率和生长速率均可 糖疲提蔫。滤塞熬壤莽瀑霾可使微生貔疆最浚静生长逮枣生长。潦凄过毒或过低均会降 低代谢速率及生长速率。 本章小结 基因工程菌j l v l l 0 9 ( p g e x - a z r ) 的最佳培养条件为： 1 、b 为最佳无机靛培养基，成份：n a 2 h p 0 4 4 2 6 9 l ，k i q 2 p 0 42 6 5 9 l ， m n s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 2 9 l ，f e s 0 4 7 h 2 0 0 m g l ，m g s 0 4 7 1 - 1 2 00 2 9 l ，c a c l 2 o 0 2 9 l ，n h 4 c 1o 5 9 l ，a m p 5 0 m g l 2 、最佳碳氮源分别魑龌萄糖( 5 9 l ) 、氯化铵( 3 9 l ) 3 、p h = 7 5 ，溢疫菇3 5 9 c 生长最始 4 、接种照对菌体生长影响不大 基因工程菌对偶氦染料脱色研究 3 基因工程菌的脱色性能研究 由于基因工程菌j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 经诱导后产生的偶氮还原酶能破坏偶氮染料 的- n = n ，使其脱色。本节重点考察其脱色的条件( 温度，p h ，盐度，供氧量) 及其适 用范围。 3 1 材料与方法 3 1 1 材料 3 1 1 1 菌种与染料：同章2 3 1 1 2 染料 所用染料：酸性红b ，酸眭橙i i ，酸性黑1 0 b ，酸性红6 b ，酸性红g ，酸性红 g r ，结构如表3 1 所示。 3 1 1 3 仪器：同章2 3 1 1 4 培养基 1 、l b 培养基 n a c l1 0 9 l ，酵母膏5 9 l ，蛋白胨1 0 9 l ，p h = 7 2 2 、无机盐培养基 g l u c o s e5 9 l ，n h 4 c i3 9 l ，n a 2 h p 0 4 4 2 6 9 l ，k h 2 p 0 42 6 5 9 l ，m n s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 2 9 l ，f e s 0 4 7 1 - 1 2 0o 0 1 9 l ，m g s 0 4 7 1 - 1 2 0o 2 9 l ，c a c l 20 0 2 9 l ，微量元素 1 m l 甩( f e c l 2 - 4 h 2 01 5 ，n i c l 6 h 2 00 0 2 4 ，c u c l 2 2 h 2 00 0 0 2 ，m n s 0 4 7 i - 1 2 0 0 1 ，c o c l 2 6 i - 1 2 0o 1 9 ，n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0o 0 2 4 ，z n c l 20 0 7 ，h 3 8 0 3 0 0 0 6 ) 。 3 1 2 实验方法： 3 1 2 1 脱色实验： l 、好氧脱色实验 将培养得到的菌体投入2 5 0 m l 灭菌摇瓶，并投加染料及无机盐培养基，浓度达到 实验要求，菌体干重0 3 3 6 9 l ，3 0 。c ，1 5 0 r p m 观察染料脱色情况。 人连理工大学硕士学位论文 表3 1 染料结构与最大吸收波长 t a b l e 3 1t h es t r u c t u r ea n d t h e k m o f t h e d y e 2 、缺氧脱饿实验 将蛰券褥瑟瑟蘩髂投久：筏孛，著热入染籽及茏蕊薤培养蓦，滚勰，密封；浓度运到 实验要求，3 0 c ，菌体煎鼹达到干重0 3 3 6 9 l ，观察脱色情况。 3 1 2 2 脱色熊力的测定 蘩薅瓣藏色l 力躅魄雹法溪l 定。蓉先，在染糕豢大吸收波长滚l 裙始殴迸发籼；聪色 后，取样8 , 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，上清液最大吸收波长处测定吸光殿a ，则脱色率为： q ：牮。1 0 0 a 0 其中：a o _ 初始时刻的吸光度； a t _ 城色一定时间后的吸光度 基匿l 工程菌对偶氮搬料脱色研究 3 1 。2 3 鹣经鳋b 鑫漆魏线 5 0 4 0 3 0 2 0 l o 0 0 奄0 20 40 60 8l 。01 21 a1 6 a b s 图3 1 染料酸性红b 浓度与吸光度曲线 f i g 3 1t h e a b sa r i dc o n c e u m a i o no f a c i dr e db 3 2 结果与讨论 3 2 。1 供簸条件对染料的脱色影响 酸性红b 浓度s o m g a _ ，分别在3 0 好氧和缺氧条件下考察基因工耩菌j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 脱色能力。实验结果如图3 2 。 蠢鞠3 2 胃酝，镞氧条释对染瓣豹获煎毒穰大豹影豌。奁皱氧条舞下，簇爨q - 程蓥 j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 在2 0 小时脱色率就达到8 0 ，而在好飘条件下2 0 小时只能达到 1 5 友右，达到8 0 港簧3 5 ，3 、对。说骋缺氧条传旨稠予酸性级b 豹脱色。磅究表骥， 偶氮染牵尊的脱色是由细菌产生的偶氮还原酶破环染料分子的偶氮键引起的，该酶促反应 需要辅酶n a d h 参与，氧气的存在阻止了n a d h 向偶氮键转移h 8 4 9 ，从丽抑制偶氮还 原酶瓣溪力，降稳蘩瓣藐色疑力。嚣筵，基嚣王穰萤j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 砖德氮梁辩 的脱色威应应在厌氧祭件下进行。下述脱色实验均在缺氧条件下进行。 。v1咖蜀心。一|苷t一萎甜oou 大连理大学硕士学位论文 051 01 52 0 2 53 03 54 0 4 5 5 0 t h 黼3 2 锋c 条襻对基颡工疆萤脱色麓力的影璃 f i g 3 2 t h e i n f l 渊o f o x y g e n o n d e c o l o r i z a t i o n 3 2 。2 缺氧祭馋下基因王程蘸j m l 0 9 ( p o e x - a z r ) 瓣染￥萼戆袋色馕璇 3 2 2 。1 对举同染料的脱毽 在缺飘条件下，考察了j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 对酸性橙i i 、酸性黑1 0 b 、酸性红 6 嚣、酸性缝g 、羧性绞g r 纛耱不阉馁氮聚辩戆黢色戆力，染拳萼浓度缝必5 0 m g 兄，实 验数据如灏3 3 历示。 由图3 3 可见基因工程茵j m l 0 9 ( p g e x - a z r ) 对多种偶氮染料有较好的脱佼效 袋。除酸。黢橙l l 外，怼羧瞧爨1 0 1 3 、酸蠖缎国、敬蠖绞g 、酸性继g r 戆栽色郄在 8 0 以上，蕊鼠对红色絷料普遍有较强鼹黢色能力。分攒募嚣可建楚浚健橙i l 结稳滋铰 简单，稳定，偶氮键不搦在微生物的作用下断裂。 3 2 ，2 ，2 基鞫王穰蘩薅苓翔染糕滚痉酸性鲮转戆袋惫效暴 考察蒸爨工程菌瓣不阉浓度酸牲黢b 豹戏色效果。选取浓度茭5 0 m g l ， 1 0 0 r n g l ，2 0 0 m g n ，7 5 0 m e d l ，2 0 0 0 m g l ，5 0 0 0 m g 几，寅验结果如图3 4 瓣 褥 嬲 0 蒉，3荟uo嚣ioio。o 基因工程菌对偶氮染料脱色研究 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 一ac l d0r a n g e 儿 - - o - - a c l db i a e k1 0 b 一_ a c l df u c h i 6 b 01 02 03 04 05 06 07 08 0 f f h 图3 3 基因工程菌对不同染料的脱色 f i g 3 3t h ed e g r a d a t i o no f d i f f e r e n td y e s - - i i - - 5 0 r a g l 1 051 01 52 02 53 03 54 04 55 0 t h 图3 4 染料浓度对脱色率的影响 f i g 3 4 t h ei n f l u e n c eo f d y e c o n c e n t r a t i o no nd e c o l o r i z a t i o n r o t e 晏寸h芒co一_霜一-o一8等 寮藿g108q 大连理工大学硕士学位论文 由图3 4 可知，菌体对5 0 m g l 、1 0 0 m g l 、2 0 0 m g l 、7 5 0 m g l 、2 0 0 0 m g , ( l 的酸性 红b 在4 0 - - 5 0 h 内脱色率均能达到8 肚9 0 。5 0 0 0 m g , o l 下脱色能力昵显下降达到4 0 ， 这是出染辩纛往雩| 起。说鞠戴萤蔻耐受离浓凄染辩袋东。 3 2 2 3 口h 对基因工程菌j m l 0 9 ( p g e x a z r ) 脱瓴的影响 缺氧条传下，实验染料酸性红b ，浓度5 0 0 m g l ，用氢氧化钠翻盐酸调节视始p h 为4 ，6 ，7 ，8 ，1 0 ，比较不同西 对萤体脱色能力静影响，实验结祭如图3 ，5 瑟示。 o5l o1 5 图3 5p 珏对基嬲工程菌脱色8 力的髟嚷 f i g 3 5 t h e i r t f l u c e o f p h 硼如猡瞄越l 锄 由图3 5 知，p h = 7 或8 时脱色效果最好，2 0 小时能达到9 0 0 , 4 。p h = 6 、4 、1 0 条件 下，捞小疆鹣色率只l 这戮5 8 0 - - , 2 0 0 , 4 。阕对发褒，毯弱疆洼( 基鲻) 蕊条终下2 0 ，l 、薅 脱色率为2 0 ，高于酸性。说明脱色最俄条件为中性戚偏弱碱性，强酸或强碱性会使脱 色效果下降。 耱惫避簇孛整襄l 墓俸浓度交豫渣戮，缝象翔蚕3 6 。 由图3 6 可知，脱包怼程中，菌体浓度均无明显变化，在碱性条件下，菌体千重降 低。 3 l 褥 诣 孙 e o争，a_叠叠。一莲季一口 基园工程菌对偶飘染料脱色研究 0 3 0 o 2 5 0 ，0 5 0 0 0 051 0 1 5 t t h 圈3 6 脱色过程德俸密度变他 2 0 f i g 3 6t h em i c r o o r g a n i s md e n s i t yd u r i n g t h ed e c o l o r i z a t i o n 3 2 2 4 涅凄对酸熄缝b 袋皂熬影演 p h = 4 p h = 6 p h = 7 p h = 8 p h = 1 0 缺氧条件下，实验染料浓度为5 0 0 m g 几，调节温度为2 5 4 c 、3 0 c 、3 5 c 、4 0 ， 考察不同温度对脱色率的影响，实验结果如图3 7 。 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 o 1 52 02 53 0 溉 圈3 7 温度对基因工襁蓥脱色能力的影响 f i g 3 7 t h ei n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r eo i ld e g r a d a t i o n 瓣 烛 o o o 警矗一g言 蕊惫w蛙搿。蛊碍glo廿特粹 大连理工大学硕士学位论文 由图3 7 可知，1 5 小时之前，4 0 。c 脱色效率最好，2 5 小时后，脱色效率均在8 0 左 右，无明擞菱别。说明该酶促脱色反应对温度不敏感。 聪色遭程中益蒺l 萤钵浓度交纯| 骞凝，结栗羹鹜3 8 。 从图3 8 可知，菌体在