（分析化学专业论文）新型压电微生物传感仪及其在临床分析中的应用研究.pdf

博f j 学位论文 摘要 由微生物感染引发的疾病已经严重威胁到人类的健康。结核病是由结核分枝 杆菌病原体感染引发的重大传染性疾病，曾经是人类的第一大杀手，随着抗菌素 的广泛应用，上世纪六七十年代，结核病的危害直线下降，人类颇有“大获全胜” 的感觉。在上世纪末，结核病却又卷土重来，疫情直线回升，大有重新找回“第一 杀手”位置之势，而最令人担心的，莫过于耐药性结核病病例的大量出现。要控制 耐药菌株的发展，最直接而有效的方法是进行结核分枝杆菌早期快速检测。结核 分枝杆菌由于其增代时间长，生长缓慢，比其它微生物更难实现快速检测。快速 全自动微生物培养系统对于临床病原菌感染的早期诊断、抗生素的合理运用、延 缓病原菌的耐药性都起到了十分重要的作用。而目前临床使用得较多的几款全自 动微生物培养系统包括b a c t e c4 6 0t b 和b a c t e cm g i t9 6 0 。b a c t e c4 6 0t b 存在放射性污染、仪器操作和维护困难。b a c t e cm g i t9 6 0 系统所使用的荧光 物质易分解造成假阴性。此外，以上仪器本身造价就高，其配套试剂需依赖进口， 因此其推广受到经济条件的限制，对于结核病发生率高的贫穷国家或发展中国家 是可望而不可及的。 串联式压电传感器的主体部分是由压电石英晶体和一对插入溶液中的平行板 金属对电极串联组成，该传感器对电极问的电参数变化有灵敏的响应。由于其操 作简便、准确、灵敏以及价格便宜而深受广大分析化学者的欢迎。本论文在本室 前期工作的基础上，致力于快速、灵敏、准确而造价便宜的新型串联式压电微生 物传感器的研制。通过改进、优化或引入新的探头，解决了传感器受背景电参数 及电极材料影响的问题，拓宽了该类传感器在生命科学中的应用，使信息的提取 更加准确容易，测定更加快速方便。鉴于此开展了以下研究工作： ( 1 ) 新型多通道串联式压电传感器( m s p q c ) 的构建及其在结核分枝杆菌减毒 菌株h 3 7 r a 检测中的应用。该方法是将结核分枝杆菌产生的挥发性代谢产物导致 接收液电导变化和串联式压电传感器对电导的灵敏响应结合起来进行检测。首先， 设计了双管检测装置，外部是检测管，底部固定有一对电导电极，管内盛有2m l k o h 接收溶液；检测池内部是培养管，内盛有y o u m a n s 改良p r o s k a u e r b e c k 培养 基，结核分枝杆菌能代谢培养基中甘油和天门冬酰胺产生挥发性的n h 3 和c 0 2 ， 代谢产物能被接收液吸收，导致接收液的电导发生变化，从而检测出结核分枝杆 菌。由于双管结构的引入，解决了检测受仪器灵敏区间限制问题。我们用m s p q c 成功地检测了h 3 7 r a ，在1 0 2 1 0 7 c f u m l d 之间，菌液初始浓度的对数与检测时间 ( f d t ) 之间存在线性关系。检测限为10c f u m l 。同时检测结果与全自动化的 i i 新型k i u 微生物传感仪发】e n i 临f 未分析中的心用研究 b a c t e cm g i t9 6 0 进行了对比，二者的结果均通过z i e h l n e e l s e n ( z n ) 染色法镜 检证实了h 3 7 r a 的存在。该仪器与同类产品相比还有一个最重要的优点，价格便 宜( 仪器约为：10 2 0 万，试剂约为：2 0 元；而同类产品b a c t e cm g i t9 6 0 仪 器：9 0 万，试剂约为：8 0 元) 。m s p q c 有望开发成为一种准确、快速而廉价的 结核分枝杆菌检测仪器。 ( 2 ) m s p q c 用于结核分枝杆菌标准菌株h 3 7 r v 和临床菌株的检测。通过对未 减毒标准菌株h 3 7 r v 与减毒菌株h 3 7 r a 在y o u m a n s 改良p r o s k a u e r b e c k 培养基 中的m s p q c 典型曲线的对比，分析了未减毒菌株可能的代谢途径，并通过对代 谢途径的推测，优化了培养基，获得了h 3 7 r v 的增强检出信号，初步证实了推测。 同时筛查了最佳抑菌剂成分并成功用于临床菌株的检测，其检测结果与l j 斜面 和b a c t e cm g i t9 6 0 进行对比，结果表明，该仪器准确、快速、简便，有望应 用于临床实验室结核分枝杆菌的检出。 ( 3 ) 提出m s p q c 进行一线抗结核药物药敏试验的新方法。通过设定参比管， 并将参比管加入的菌液浓度调节为药物管浓度的1 1 0 0 ，巧妙地解决了m s p q c 的 不完全定量问题。根据临床实验室标准机构( c l s i ) 的规定成功定义了菌株对于药 物敏感性的快速划分标准，并在此基础上将临床结核分枝杆菌对异烟肼、链霉素、 乙胺丁醇和利福平四种一线药物的敏感性进行了实际划分，其结果与琼脂比例法 ( a p m ) 和b a c t e cm g i t9 6 0 方法进行了比较，该法快速、操作简便，还可以实 时监测，从而为结核分枝杆菌药敏研究及药物治疗提供有效手段。 ( 4 ) 叉指阵列电极串联式压电传感器( i d e s p q c ) 的构建及其在微生物培养检 测中的应用。i d e s p q c 是直接将又指阵列电极( i d e ) 代替平行板不锈钢对电极与 压电石英晶体串联构成。本章通过理论和实验对比探讨了i d e s p q c 与串联式压 电传感器( s p q c ) 对溶液电导和电容变化的响应以及i d e 电极参数对i d e s p q c 响 应灵敏度的影响。结果表明，在一定条件下，i d e s p q c 较s p q c 对溶液电参数 的变化有更灵敏的响应。当使用i d e s p q c 对微生物进行检测时，其线性范围为 1 0 1 0 6c f u m l 一，检测下限为1 0c f u m l 。其结果与s p q c 和平板计数法( p p c ) 进行 了对比，该方法与s p q c 和p p c 有相同的准确度，但较后两者更快速。 ( 5 ) 聚苯胺多通道串联式压电传感器( p a n m s p q c ) 的研制。将i d e 修饰碱型聚 苯胺聚乙烯醇复合物制备成p a n 探头与压电石英晶体串联，构建了p a n m s p q c 。 其用于微生物测定的原理为：细菌在新陈代谢过程中均会产生c 0 2 ，而在一定湿度 下c 0 2 能与聚苯胺掺杂，能引起p a n 探头电导的变化，实现对微生物的检出。相对 于s p q c ，由于探头不直接与培养基溶液接触，该传感器不受培养基电参数的影响， 不需要特别合成的培养基。利用该传感器可定量地检测样本中的初始微生物浓度， 其线性范围为1 0 1 0 6c f u m l ，其检测限为10c f u m l 。 ( 6 ) 聚吡咯多通道串联式压电传感器的制备( p p y - m s p q c ) 。常规的s p q c 除 博j ：学位论文 了受仪器灵敏区间限制外，还有一点就是其电极材料难于选择。导电聚合物经掺 杂导电率可提高十几个数量级，由绝缘体变为导体，有金属性，可作为电极，再 加之其对于一些物质具有选择性电响应，可将其代替余属电极作为敏感探头，与 压电石英晶体串联，构建新型串联式传感器。本章以聚吡咯为例，将聚吡咯化学 沉积于绝缘基底上制成导电聚合物膜作为m s p q c 的探头，研究其在高湿度和室 温下对于n h 3 的响应特性。当n h 3 量在o 11 t m o l 到6t u m o l 之间时，氨量与频移 之间存在线性关系，该方法的最低检测限为0 1l a m o l 。该传感器有望用于需在高 湿度、室温下进行n h 3 测量的体系。 ( 7 ) p p y - m s p q c 用于l 天门冬酰胺酶活性的测定。基于l 天门冬酰胺酶催化 l 天门冬酰胺底物水解产生n h 3 ，通过使用p p y - m s p q c 测定n h 3 ，从而实现酶 活性的测定。使用p p y - m s p q c 筛选了l 天门冬酰胺酶活性测定的最佳条件；测 定了酶动力学参数；研究了该酶对不同底物l 天门冬酰胺、d 一天门冬酰胺以及 l 谷氨酰胺的不同催化活性；测定了不同酶浓度，该方法的线性范围是0 0 l 。0 1 u m l ，其检测下限为o 0 lu m l 。其结果与奈氏试剂法进行了对比，该方法准 确、无需使用有毒的试剂且能实现实时在线检测。该方法有望用于产l 一天门冬酰 胺酶微生物的筛选及产氨酶活性的测定。 关键词：串联式压电传感器；叉指阵列电极；导电聚合物；结核分枝杆菌；微生 物；l 天门冬酰胺酶； i v a b s t r a c t t h ei n f e c t i o nc a u s e d b ym i c r o o r g a n i s m s h a st h r e a t e n e dh u m a n s h e a l t h t u b e r c u l o s i s ( t b ) i s t h em o s t i m p o r t a n t i n f e c t i o nd i s e a s ew h i c hc a u s e d b y m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s i th a sb e e nt h el a r g e s tk i l l e rf o rh u m a n i nt h e19 6 0 s ，i t s h a r m f u l n e s sd e c r e a s e dw i t ha n t i b i o t i c s w i d ea p p l i c a t i o n s h o w e v e r , t h er e e m e r g e n c e o ft b ，e s p e c i a l l yr e s i s t a n ts t r a i n s ，r e s u l t si nam a j o rh e a l t hc a r e p r o b l e m t h e d e v e l o p m e n to far a p i da n de f f i c i e n ta u t o m a t e dm i c r o o r g a n i s mc u l t u r es y s t e mf o rt h e i d e n t i f i c a t i o no ft bi so fe x t r e m ei m p o r t a n tf o rp a t i e n tt r e a t m e n ta n dp r o t e c t i o no f h e a l t h c a r ep r o f e s s i o n a l s r a p i dc u l t u r ed e t e c t i o nt e c h n i q u e sh a v eb e e nu s e di nc l i n i c ， s u c ha sb a c t e c4 6 0t ba n db a c t e cm g i t9 6 0 h o w e v e r , t h ef o r m e rh a st h e r a d i o a c t i v ed a m a g ea n dt h el a t t e rn e e dt ou s ef l u o r e s c e n tr e a g e n tw h i c hi s e a s i l y d e c o m p o s e d i na d d i t i o n ，a l la b o v es y s t e m sa r er a t h e re x p e n s i v ef o rb o t hi n s t r u m e n t s a n dr e a g e n t s s o ，t h e i rw i d eu s ew a sl i m i t e d m i l l i o n so fp e o p l ei n d e v e l o p i n g c o u n t r i e sd i ee a c hy e a rf r o mt bb e c a u s eo fe x p e n s i v ed i a g n o s t i cc o s t m o r ea c c u r a t e ， m o r er a p i da n dc h e a p e rd e t e c t i o ns y s t e mi su r g e n t l yn e e d e di nd e v e l o p i n gc o u n t r i e s t h ek e ys e c t i o no fs e r i e sp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ( s p q c ) i sc o m p o s e do fa n a tc u t ，9m h zp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a la n dap a i ro f p a r a l l e l - p l a t em e t a le l e c t r o d e s i n s e r t e di n t ol i q u i ds o l u t i o ni ns e r i e s i th a ss e n s i t i v er e s p o n s et ot h ee l e c t r i c p a r a m e t e rc h a n g e s ( s u c ha sc o n d u c t a n c ea n dc a p a c i t a n c e ) b e t w e e nt h ee l e c t r o d e s s p q ch a sa t t r a c t e dm a n ya n a l y s t sb e c a u s eo fi t ss e n s i t i v er e s p o n s e ，a c c u r a t e ，l o wc o s t a n de a s yo p e r a t i o n t h i sd i s s e r t a t i o ni sd e v o t e dt ot h es t u d yo fn o v e lm i c r o o r g a n is m p i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a ls e n s o r s ，e s p e c i a l l yt bs e n s o r t h em a i nw o r ko ft h i s t h e s i sc o u l db es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) an e wm u l t i c h a n n e ls e r i e sp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a ls e n s o rs y s t e m ( m s p q c ) w a sd e v e l o p e df o rr a p i dg r o w t ha n dd e t e c t i o no fm y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i sh 37 r a t h es y s t e mw a su s e dt od e t e c th 37 r ab a s e do nc o m b i n a t i o nt h e v o l a t i l em e t a b o l i cp r o d u c t sd u r i n gt h eg r o w t ho fm t u b e r c u l o s i sw i t hs p q cs e n t i v e r e s p o n s e t os o l u t i o nc o n d u c t a n c e f i r s t l y ，t h ed o u b l et u b e s c o n f i g u r a t i o nw a s p r o p o s e d t h em e t a b o l i cp r o d u c t s ，d i f f u s i n gf r o mt h em e d i u mi n t ot h ek o h a b s o r b i n gs o l u t i o n ，r e s u l t e di nt h ec o n d u c t a n c ec h a n g eo ft h ea b s o r b i n gs o l u t i o n d e t e c t e db yt h em s p q cs e n s i t i v e l y t h ef r e q u e n c ys h if tv e r s u st i m er e s p o n s ec u r v e s w e r er e c o r d e d b ys e l f - d e v e l o p e ds o f t w a r e f r e q u e n c yd e t e c t i o nt i m e ( f d t ) v 博卜学f t 论文 c o r r e s p o n d i n gt o 1 0 0 h zi nf r e q u e n c ys h i f tv a l u ew a su s e da sap a r a m e t e rt o q u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n em t u b e r c u l o s i sh 3 7 r a ( a na v i r u l e n ts t r a i n ) a sf o rh 3 7 r a ， t h ef d th a dal i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h el o g a r i t h mo fi t si n i t i a lc o n c e n t r a t i o ni nt h e r a n g eo f10 2 10 7c o l o n yf o r m i n gu n i t s ( c f u ) - m l 1 ( r 一0 9 9 8 ) a n dt h ed e t e c t i o nl i m i t w a sl o wt o10c f u m l 4 n a o hs o l u t i o nt h a tc a nk i l lc o n t a m i n a t i n gm i c r o o r g a n i s m s a n dm a k em t u b e r c u l o s i sa l i v ew a su s e da sp r e t r e a t m e n tr e a g e n tt op r o v i d et h e s e l e c t i v i t yt ot h i sm e t h o d c o m p a r i n g t e s t sw e r ea l s oc a r r i e do u tb yu s i n gb a c t e c t m m g i t t m9 6 0a n dc o n v e n t i o n a ll o w e n s t e i n j e n s e n ( l - 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