（水生生物学专业论文）hgmcsf在鱼腥藻7120中的表达及其表达系统的改进.pdf

金锐：h g m c s f 基因在鱼腥藻7 1 2 0 中的表达及其表达系统的改进 摘要 人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子( h g m c s f ) 是第一个被克隆和利用重组 d n a 技术生产的造血刺激因子，是一个具有多项潜能的造血生长因子，具有十分重 要的临床应用价值，在国际生物技术制药市场上占有重要的位置。目前市场上销售的 h g m c s f 多是由大肠杆菌作为宿主生产的，由于其过表达及含内毒素的缺点，人们 曾尝试在酵母、哺乳细胞、昆虫细胞、植物细胞中表达h g m c s f ，但或多或少都有 一些缺陷。两蓝藻作为新兴的制备基因工程药物的宿主具有遗传背景简单，便于外源 基因转化、蛋白酶活性低、培养基低廉、不含内毒素等优点，是制备基因工程药物的 很有潜力的宿主。 本文在利用鱼腥藻7 1 2 0 作为宿主成功表达h g m 。c s f 基因的基础上，对克隆到 的h g m c s f 进行修饰，在基因的5 端添加了可以在蓝藻中高效表达的s d 序列，并 将s d 序列与起始密码子a t g 之间的距离调整为相差6 个碱基，然后将h g m - c s f 基 因插入到中间载体p r l 4 3 9 强启动子p p s b a 的下游，得到中间表达载体p r l g m s ，进 一步插入到穿梭载体p d c - 0 8 的相应位点，构建成穿梭表达载体p d c g m s 。利用三 亲接舍转移法转化鱼腥藻7 1 2 0 ，通过相应抗生素筛选并经继代培养后得到含有目的 基因的转基因藻g m s 藻株。并对转基因藻的最遁生长条件进行了优化筛选。同时本 文还针对我们前期所构建的穿梭表达载体系统存在稳定性欠佳，质粒易丢失的特点， 所以又克隆了鱼腥藻7 1 2 0 中编码谷氨酰胺合成酶( g s ) 的g l n a 基因，将其作为整 合平台，插入到p r l 一7 2 1 中的h o m - c s f 基因和强启动子p p s b a 的上游，构建成了整 合载体p r g g m 。为提高h g m c s f 基因在鱼腥藻7 1 2 0 中的表达效率和提高外源基 因在鱼腥藻7 1 2 0 中的稳定性提供了资料。 本论文的主要内容及结果如下： 1 克隆h g m c s f 基因，在5 端添加s d 序列，并调整s d 序列与a t g 间距离， 然后将其插入强启动子p p s b a 的下游，克隆到穿梭载体p d c 0 8 的相应位点，构建成 穿梭表达载体p 9 c g m s ，然后利用三亲按合转移转化鱼腥藻7 1 2 0 ，通过相应抗生素 筛选并经继代培养后得到含有目的基因的转基因藻g m s 藻株；转基因藻d n a 水平 检测，表明h g m c s f 已经转入g m s 藻株中；w e s t e r n b l o t 分析表明，在转基因藻中 表达了具有免疫活性的h g m c s f 。 2 通过对转基因藻的最适生长条件测定发现，转基因藻株的最适生长温度为 3 0 ，最适p h 值为9 。5 1 0 。5 ，在调整了环境因子的基本培养基中，g m s 藻株与野生 上海师范大学硕士学位论文 摘要 藻的细胞密度和叶绿素含量并无显著差异，建议使用b o i i ( 一n ) 培养基。 3 光合放氧测定结果显示，在添加1 0 m m o l l 的n a h c 0 3 后，相对于野生藻， g m s 藻株的净光合速率提高了3 2 3 ，而真实光合速率上调了3 0 2 ，光补偿点下降 了7 个光强单位，光饱和点上调了约5 1 个光强单位。 4 在研究添加外源碳源对转基因藻生长的影响后发现，转基因藻与野生藻相比 具有更强的利用无机碳源( n a h c 0 3 ) 和有机碳源( 葡萄糖) 的能力，最适添加n a h c 0 3 浓度为1 5m m o l l ，最适添加葡萄糖浓度为1 5 。与添加n a h c o s 相比，葡萄糖对藻 细胞的促进作用更加明显。这有利于实现微藻的高密度培养，也有利于以后的产业化 大规模培养。 5 克隆了鱼腥藻7 1 2 0 中编码谷氨酰胺合成酶( g s ) 的g l n a 基因作为整合平台， 将其插入到p r l - 7 2 1 中的h g m - c s f 基因和强启动子p p s b a 的上游，构建成了整合载 体p r g g m 。 以上结果说明，我们选取鱼腥藻7 1 2 0 作为宿主系统，成功表达了具有免疫活性 的外源h g m - c s f 。并且外源基因的转入没有影响宿主的生长，反而提高了对光能的 利用率，有利于我们后期的大规模培养。 关键词： 蓝藻基因工程；人粒一巨噬细胞集落刺激因子；鱼腥藻7 1 2 0 ；三亲接合移 s d 序列；转基因藻；同源重组 金锐：h g m c s f 基因在鱼腥藻7 1 2 0 中的表达及其表达系统的改进 a b s t r a c t h u m a ng r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o ro a g m c s f ) i st h ef i r s t h a e m a t o p o i e t i cc y t o k i n e st h a th a sb e e nc l o n e da n db e e nu t i l i z e db yr e c o m b i n a n td n a t e c h n o l o g y nh a sp o t e n te f f e c t si ns t i m u l a t i n gp r o l i f e r a t i o n , m a t u r a t i o na n df u n c t i o no f h a e m a t o p o i e t i cc e l l i to c c u p i e dl a r g ep e r c e n to fr e c o m b i n a n t i o nm e d i c i n em a r k e t i nt h e m e a n t i m e c o m m e r c i a lp r o d u c e dh g m c s fu s u a l l yu s eec o l it ob et h eh o s t f o ri t s d i s a d v a n t a g e so fo v e r e x p r e s s i o na n de n d o t o x i n ，p e o p l et r yt oe x p r e s sh g m c s fi nm a n y o t h e rh o s t sj u s ta sy e a s t ，m a m m a l ，h e x a p o d ，e t c b u tt h er e s u l t sh a v en o tb e e no p t i m i z e d c y a n o b a c t r e r i aa st h ep o t e n t i a lc a n d i d a t eh o s tt op r o d u c eg e n e t i ce n g i n e e r i n gm e d i c i n e h a v es i m p l es t r u c t u r ea n dm a k e st h e mb eap o t e n t i a l l yp o w e r f u lm o d e l s y s t e mo fm o d e m b i o t e c h n o l o g y , a n dt h e yp r o v i d ea d v a n t a g e o u sh o s t st op r o d u c eo r g a n i cs u b s t a n c e s b a s e d o nt h e s ea d v a n t a g e s ，w ea t t e m p tt oe x p r e s sh g m - c s f g o n ei nc y a n o b a c t e r i a lc e l l i nt h i sa r t i c l e ，b a s eo ns u c c e s s f i f l l ye x p r e s s e dh g m - c s fi na n a b a e n a s p p c c7 1 2 0 w em o d i f i e dh g m c s fg o n eb ya d ds h i n e d a l g a m o ( s d ) s e q u e n c ei nn t e r m i n a la n d a d j u s t e dt h ed i s t a n c eb e t w e e ni ta n da t gw h i c ha f f e c t st h ee f f i c i e n c yo ft r a n s l a t i o n t h e n i n s e r t e di ti n t o d o w n s 打e a mo ft h ep r o m o t e rp p s b a ，l i g a t e di tw i t hp d c 0 8t oc o n t r u c tt h e s h u t t l ee x p r e s s i o nv e c t o r , p d c g m s t h e nt r a n s f o r m e di ti n t oa n a b a e n as p p c c7 1 2 0 b y t h et r i p a r e n t a lc o n j u g a t i o nt r a n s f e rm e t h o d g a i n e dt r a n s g e n i cs p p c c7 1 2 0h a r b o r i n g p d c g m sb ys c r e e n i n gw i t l ln e o m y c i n e t h e no p t i m i z e dt h ec u l t u r ec o n d i t i o n st of o u n d t h er e s t r i c tc u r v e rf a c t o r s a n df o rt h er e a s o no ft h ep r o p h a s es h u t t l ev e c t o r sw h i c hw e c o n s t r u c t e dh a v et h eu n s t a b l e d i s a d v a n t a g e ，w ec l o n e dg l n ag o n ew h i c he n c o d i n g g l u t a m i n es y n t h e t a s eb yt dp c ri na n a b e a b a 印p c c7 1 2 0a sai n t e g r a t i v ep l a t f o r m t h e n ，a ni n t e g r a t i v ee x p r e s s i o nv e c t o rp r g - g mw h i c hc o n t m n e dh g m c s fg e n ea n d e n d o g e n o u sp r o m o t e rp p s b aw a sc o n s t r u c t e d np r o v i d e sr e f e r e n c et oi m p r o v et h e e x p r e s s i o nl e v e la n dt h es t a b i l i t yo f f o r e i g nh g m - c s fg e n ei n a n a b e a b as d p c c7 1 2 0 t h ec o n t e n t sa n dr e s u l t so f t h i se x p e r i m e n tw e r ea sf o l l o w s ： 1 w ea d d g g a g a g s ds e q u e n c ei n h g m c s fn - t e r m i n a la n da d j u s t e dt h e s e q u e n c eb e t w e e ns da n da t gi n t o6 b pb yp c r t h e ni n s e r t e di ti n t od o w n s t r e a mo f t h e s t r o n gp r o m o t e r , p p s b ao fs h u t t l ev e c t o rp i l l 一4 3 9 ，t h e nl i g a t e di tw i t hp d c 0 8t oc o n t r u c t t h es h u t t l ee x p r e s s i o nv e c t o r , p d c g m s t h e nt r a n s f o r m e di ti n t oa n a b a e n a s p p c c7 1 2 0 ， b yt h et r i p a r e n t a lc o n j u g a t i o nt r a n s f e r m e t h o d s c r e e n i n go fp o s i t i v ec l o n e sw e r e p e r f o r m e do nb g - 1i ( - n ) a g a rp l a t e ss u p p l e m e n t e dw i t hn e o m y c i n e p c ra m p l i f i c a t i o no f j h 上海师范大学硕士学位论文 摘要 w i l dt y p ea n dt r a n s g e n i ca n a b a e n ac e l l s 、啦t hs p e c i f i cp r i m e r sr e v e a l e dn ob a n di nw i l d t y p ea n dp l a s m i df r e ec e l l s ，w h e r e a st r a n s g c n i cc e l l sy i e l d e da a b o u t3 9 0 b pb a n d s w e s t e r n b l o ta n a l y s i sf u r t h e rc o n f i r m e dt h a th g m - c s fw a se x p r e s s e di nt h et r a n s g e n i ca n a b a e n a s p p c c7 1 2 0h a r b o r i n gp d c o m s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a th g m c s fw a sr i o to n l y s u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e di n t oa n a b a e n as p p c c7 1 2 0 ，b u ta l s oe x p r e s s e di ng m ss t r a i n s 2 r e s u l t so ft h eg r o w t hc u r v eo fc e i l so v e rt i m ew e r es h o w e da sf o l l o w s t h e o p t i m a lg r o w t ht e m p e r a t u r ea n dp ho f t r a n s g e n i ca n a b a e n aa r e3 0 a n dp h 9 5 - p i l l 0 5 r e s p e c t i v e l y t h er e c o m m e n dm e d i u mi sb g 1 1 ( - n ) a f t e ra d j u s t e dt h ee n v i r o n m e n t a l f a c t o r s ，t h ed i f f e r e n c eo fc e l lg r o w t ha n dc h l o r o p h y l lad e t e r m i n a t i o nb e t w e e nt r a n s g e n i ca n dw i l d r y p e a n a b a e n as p p c c7 1 2 0i s n o t o b v i o u s 3 p h o t o s y n t h e s i sa c t i v i t yo ft r a n s g e n i cs p p c c7 1 2 0h a r b o r i n gp d c g m sw a s h i g h e rt h a nt h a to fw i l dt y p eu n d e rs u p p l e m e n t e d 谢吐ll o m m o l ln a h c 0 3i nf l e s h m e d i u m ，t h en e tp h o t o s y n t h e t i ca c t i v i t ya n dt r u ep h o t o s y n t h e t i ca c t i v i t yo fg m ss t r a i n s w e r e3 2 _ 3 a n d3 0 2 h i g h e rt h a nt h a to f w i l dt y p er e s p e c t i v e l y 4 a f t e rs t u d i e dt h ee f f e c t so fi n o r g a n i cc a r b o n sa n do r g a n i cc a r b o n so nc e l lg r o w t h ， t h e 订a n s g a n i ea n a b a e n ah a sm o r ea b i l i t yt ou t i l i z et h ec a r b o n sc o m p a r e dw i t hw i l dt y p e ， t h eo p t i m a lc o n s i s t e n c ei st h e n a h c 0 3 = 1 5 m m o l l ， g l u c o s e = 1 5 t h e s em e s s a g e s w i l lh e l pu st oo p t i m i z et h eg r o w t ho f t h et r a n s g e n l cc y a n o b a c t e r i af o r f u r t h e re x p r e s sm o r e h g m - c s fi nt h el r a n s g e n l cc e l l s 5 i nt h i sw o r k ，1 4 b pf r a g m e n to fg h 溘g e n ee n c o d i n gg l u t a m i n es y n t h e m s ew e r e o b t a i n e db yt dp c rf r o mg e n o r n l cd n ao fa sai n t e g r a t i v ep l a t f o r m a f t e rt h a t ， i n t e g r a t i v ee x p r e s s i o nv e c t o rp r g - g mw h i c hc o n t a i n e dh g m c s fg e n ea n de n d o g e n o u s p r o m o t e rp p s b aw a sc o n s t r u c t e d a l lt h er e s u l t sp r o v e dt h a tw es u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e dh g m c s f g e n e i n t o a n a b e a b as p p c c7 1 2 0a n dt h ee x p r e s s e dp r o t e i nh a si m m u n i t ya c t i v i t y t h eg r o w t ho f t r a n s g e n i ca n a b e a b as p ，p c c7 1 2 0w a sn o ti n f e c t e db u ti m p r o v e d ，a n dt h ep h o t o s y n t h e t i c a c t i v i t yw a sa l s oe n h a n c e da f t e rt h ef o r e i g nh g m c s fw a st r a n s f o r m e d k e yw o r d s ：h u m a n g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r ；a n a b e a b a s p p c c7 1 2 0 ；t r i p a r e t a lc o n j u g a t i v et r a n s f e r ；t r a n s g e n l cc y a n o b a c t e r i a ； s h i n e - d a l g a m o ( s d ) s e q u e n c e ；h o m o l o g yr e c o m b i n a t i o nm e t h o d 金锐：h g m - c s f 基因在鱼腥藻7 1 2 0 中的表达及其系统的改进 l 文献综述 1 1 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( h g m - c s f ) 1 1 。1h g m c s f 的结构特点及生物学活性 1 9 7 7 年，b u r g e s s 等从小鼠肺条件培养液中发现一种能刺激粒细胞和巨噬细胞形 成集落的因子，命名为粒一巨噬细胞集落刺激因子( g r a n u l o c y t e - m a e r o p h a g ec o l o n y s i t u m u l a t i n gf a c t o g g m - c s f ) ( b u r g e s s e ta l , 1 9 7 7 ) 。属于造血生长因子，主要由t 细胞 和巨噬细胞产生，可作用于造血干细胞并促进其、增值、分化，所形成的细胞不限于 中性粒细胞、巨噬细胞( m 口) 群，即诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体呈集落性生长， 在造血调控和免疫调节中发挥着重要的作用。( 陈建魁等，2 0 0 4 ) 。h g m c s f 还能诱 导早期红细胞、巨核细胞、嗜酸性粒细胞前体细胞的增殖，增强中性粒细胞的细胞毒 作用，主要用于治疗骨髓发育不全综合征、再生障碍性贫血、艾滋病、肿瘤放疗和化 疗引起的粒细胞减少、辅助骨髓及外周血液细胞移植等，在促进粒细胞恢复方面疗效 显著，具有重要的临床价值( 孙卫民，1 9 9 9 ；肖振宇等，2 0 0 0 ) 。该因子是从人白血病 细胞系m 西或人t 淋巴细胞系t 7 细胞中克隆的，是第一个被克隆的造血刺激因子， 也是第一个利用重组d n a 技术生产的造血因子( g a s s o n ，1 9 9 1 ) 。 1 1 1 1h g m - c s f 的结构和理化性质 h g m c s f 基因长度约为2 5 k b ，为单基因编码，定位于第5 号染色体长臂的i l 3 基因的下游，和鼠g m c s f 基因在编码区和非编码区均高度同源。g m - c s f 基因含 有4 个外显子( 分别编码5 3 、1 4 、4 2 和3 5 个氨基酸) 和3 个内含子，m r n a 长0 7 k b 编码含1 4 4 个氨基酸的前体蛋白( 1 6 3 k d ) ，其中含1 7 个氨基酸的信号肽。h g m - c s f 的m r n a 的3 端非编码区有8 个串联的a u u u a 结构，这一结构与加速m r n a 的降 解。h g m c s f 最保守的核苷酸序列在5 端的翻译区域，可能控制着m r n a 的降解有 关( 肖振字等，2 0 0 0 ) 。 g m - c s f 的分子一级结构对其活性有较大影响。k a u s h a n - s k y 等用一系列人和 鼠的杂交分子证实；3 8 4 8 ，9 5 - 1 1 1 残基片段对造血功能非常重要；用合成法证明： g m - c s f n 末端前1 3 个氨基酸和c 末端后6 个氨基酸的缺失对其造血活性无影响。 分子缺失实验证实：2 0 一2 l ，5 5 - 6 0 ，7 7 - 8 2 ，8 9 1 2 0 残基片段为生物活性必需：9 7 1 2 1 位氨基酸之间的结构对于维持g m - c s f 的造血的完整活性是必要的，7 7 9 4 ，4 0 9 4 和1 1 0 1 2 7 残基片段对于受体结合和或完整活性非常重要。而1 6 1 8 位氨基酸残基 对保持生物学活性是至关重要的。以下是h g m c s f 的基因编码序列( w o n g 盯 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 甜1 9 8 5 ) 。 a t gg c ac c cg c cc g ct c g c c ca g cc c c a g ca c g c a gc c c t g gg a g c a tg t ga a tg c ca t cc a g g a gg c cc g gc g tc t cc t ga a cc t g a g t a g a g a ca c t g c tg c tg a ga t ga a tg a aa c ag - i ag a ag t ca t ct c a g a aa t gt t tg a c c t c c a gg a g c c g a c ct g cc t ac a g a c c c g c c t g g a gc t gt a ca a gc a gg g cc t gc g g g g c a g cc t ca c ca a gc t c a a gg g cc c ct t ga c ca t ga t gg c c a g cc a ct a ca a gc a gc a c t g c c c tc c a a c c c c gg a aa c t t c c t g tg c aa c cc a ga t t a t ca c ct t t g a a a g tt t ca a ag a ga a c c t g a a gg a ct t tc t gc t tg t ca t cc c c t t t g a c t g c t g g c a g c c a g t c c a g g a g t g a 图1 - 1h g m - c s f 的蛋白结构 f i g 1 - 1 p r o t e i ns t r u c t u r eo f h g m - c s f h g m c s f 基因是由1 2 7 个氨基酸残基组成的蛋白分子，含两个二硫键f e 5 4 c 9 6 c 8 8 - c 1 2 1 ) ，只有第一对二硫键与活性相关；有2 个n 糖基化部位即4 4 4 6 ( a s n - l e u - s e r ) 和5 4 - 5 6 ( a s n g l u - t h r ) ( a s n 2 7 是糖基化位点，而a s h 3 7 不一定1 以 及3 个o - 糖基化部位，含4 个半胱氨酸可组成2 个二硫键。g m c s f 的等电点为 3 5 4 5 。天然g m c s f 约有3 4 的糖基化，糖基化与g m - c s f 的抗原性有关。不同 来源的g m - c s f 的相对分子质量范围为1 4 ，5 0 0 3 5 ，0 0 0 d a ，相对分子质量差异是由于 2 金锐：k g m - c s f 基因在鱼腥藻7 1 2 0 中的表达及其系统的改进 糖基化程度不同，真核细胞表达时相对分子量一般为2 2 0 0 0 d a ，天然的h g m c s f 的 相对分子量为1 4 5 0 0 3 2 0 0 0 d a ( 肖振宇等，2 0 0 0 ) ，但糖基化程度不同的g m c s f 生物 学活性却无明显不同，甚至有报道证明大肠杆菌表达的非糖基化g m c s f 有比真核 表达g m c s f 更高的生物活性。另外，未糖基化的重组g m c s f 有更长的半衰期， 接合受体的亲和力也更高。( m o o n e n ，1 9 8 7 ；c e b o ne t a l ，1 9 9 0 ；d a n i e l e t a l ，2 0 0 4 ) 。 h g m - c s f 分子由2 个反向平行的b 折叠和4 个反向平行的a 螺旋组成。分子整 体呈非球型，另由两个二硫键分别与螺旋b 和p 折叠的第二条链、螺旋c 和羧基末 端连接，4 3 - 5 4 位的残基形成的环穿过羧基束端二硫键形成的环，形成罕见的“穿线” 拓扑学。图1 1 是h g m c s f 的蛋白空间结构( 肖振宇，2 0 0 0 ) 。 1 1 1 2h g m c s f 的生物学活胜 g m - c s f 的主要作用是对粒细胞系和单核细胞系细胞的维持存活、促进生长、诱 导分化和增强功能等，有种属特异性( 王绮如等，1 9 9 8 ；肖振宇等，2 0 0 0 ) 。 1 ) 体外生物学活性 延长造血组细胞及成熟血细胞( 中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞) 的生存期； 促进造血祖细胞、粒巨嗜细胞、噬酸粒细胞、红系细胞( 与e p o 合用) 、t 细 胞( 与i l - 2 合用) 、巨核细胞、原发性白血病性细胞( 急性、慢性髓性白血病) 等的 生长： 促进白血病细胞系( m ，6 0 ) 分化； 激活成熟血细胞如中性粒细胞、巨嗜细胞、噬酸粒细胞功能。 2 ) 体内生物学活- 眭 增加中性粒细胞、嗜酸粒细胞、单核巨噬细胞的活性，以及抗体依赖性细胞介 导的细胞毒作用( a d c c ) ，可抗细菌、真菌、原虫感染，抵制具有抗体被覆的肿瘤 细胞； 增强中性粒细胞、吞噬细胞的活性： 上调中性粒细胞、细胞黏附分子的表达； 通过甲酰肽、补体等激活初级中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞，使之产 生超氧物质，有利于杀灭细菌，同时刺激单核细胞以提高免疫水平： 直接发挥中性粒细胞和单核细胞的协同作用。 3 ) h g m - c s f 的受体 h g m - c s f 受体分布于造血细胞( 单核细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞及其祖细 胞等) 、非造血细胞( 成纤维细胞、成骨肉瘤细胞系、乳房癌细胞系、子细胞肺癌系、 内皮细胞成骨样细胞、胎盘、s v - 4 0 转化的c o s 细胞) 中，在中性粒细胞上只有高 上海师范大学硕士学位论文文献综述 亲和力位点，而在单核细胞上则有高和低2 种位点( g o r m a ne ta 1 ，1 9 9 0 ；p a r ke ta 1 ， 1 9 9 2 ) 。 h g m c s f 受体分布于属于造血因子受体家庭，该家庭包括i l 2 受体( b 链) 、( i l 4 受体、i l 6 受体、i l 7 受体和e p o 受体，受体受佛波酯和f m l p 下调表达的调节。 1 1 2h q 以c s f 的临床应用 自1 9 8 5 年s i e f f 等发表第一篇有关重组人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子的文 章以来( s i e f f e t a l ，1 9 8 5 ) ，h g m - c s f 的临床用途逐渐引起了各位学者的兴趣，这些年 来有关h g m - c s f 研究报道的文献每年均在于簏左右。作为一个多潜能的造血生长因 子，它的主要临床应用是促进骨髓造血，目前在临床上h g m c s f 已成功地用于治疗 恶性肿瘤放、化疗后所致的白细胞减少症，以及用于骨髓移植、再生障碍性贫血和某 些存在白细胞低下的免疫缺陷性疾病的治疗等。近些年的研究发现，g m c s f 不仅能 够作用于造血于、祖细胞促进骨髓造血，而且还作用于目前已知体内功能最强的抗原 提呈细胞一树突状细胞，以促进免疫应答，调节免疫反应( t a r t , 1 9 9 6 ；朱学军，1 9 9 7 ) 。 另外，g m - c s f 还作用于角质细胞、成纤维细胞、粘膜细胞等。近些年来有许多文献 报道，r h g m - c s f 不但能够用于防治白细胞减少症，而且在创伤愈合、抗病毒、抗真 菌等治疗中也有着很好的疗效。g m - c s f 的临床应用主要表现在以下几方面： 肿瘤化疗所致造血障碍：能迅速改善化疗后的中性粒细胞减少症状，从而保证 化疗、放疗的剂量和频率，使其效率大大提高。 艾滋瘸：g m c s f 不但能增加病人外周血中性粒细胞的数量，同时能提高中性 粒细胞的功能，并对h r v 有一定的对抗作用，若与a z t 药物联合应用能提高疗效。 显著延长a i d s 病人的生存时间。 骨髓异常增生综合症( m d s ) 和再生障碍性贫血：g m c s f 可有效地修复m d s 的粒系再生能力，单核细胞及嗜酸粒细胞也明显增多，全血细胞数量增加，感染机会 减少，增加病人对化疗药物的耐受性；还应用于白血病化疗、再生障碍性贫血、急性 放射病、粒细胞缺乏症等。 骨髓移植：g m - c s f 能加快骨髓造血功能的重建，并促进周围血白细胞恢复， 减少并发症，提高骨髓移植的成功率，提高病人生活质量，减少住院天数、减少抗生 素的用量及住院费用。 增强免疫功能：g m - c s f 可以促进单核巨噬细胞的生成，并激活单核巨噬细胞 合成和释放抗肿瘤因子，从而发挥杀菌作用。 1 1 3 h g m c s f 的研究进展 正是由于h g l 讧c s f 具有广阔的应用前景，市场的需求也很大。m m c s f 是第- - 个被克隆的造血生长因子，也是第一个利用重组d n a 技术生产的造血因子( g a s s o n 4 金锐：h g m c s f 基因在鱼腥藻7 1 2 0 中的表达及其系统的改进 1 9 9 1 ) 。但是天然h g m c s f 的制备量少，且不易分离纯化，因此为满足临床前和临床 研究需要，近十几年来，在其基因重组表达、融合蛋白表达和复性纯化等方面的研究 取得很大的进展。并已成功地在大肠杆菌、酵母、植物细胞和哺乳动物等宿主中表达 ( 姚军等。1 9 9 6 ；荫俊等，1 9 9 9 ；j a m e s2 0 0 0 ；陈皓等，2 0 0 1 ；s a r d a n ae ta 1 ，2 0 0 2 ；k w o n 甜a 1 。2 0 0 3 ) ，并广泛应用于临床，是一种治疗造血系统功能异常的有效药物。 1 1 3 1h g m c s f 的表达体系 目前重组h g m c s f 已在大肠杆菌( b u r g e s se ta 1 ，1 9 8 7 ) 、酵母( m i y a j i m ae ta 1 ，1 9 8 6 ) 、 檀物细胞如烟草( s a r d a n ac ta t ，2 0 0 2 ) 、昆虫细胞如家蚕细胞( s t a ，甜a 1 ，1 9 9 6 ) 和哺乳动 物如猴c o s 细胞( w o n gg e ta 1 ，1 9 8 5 ) 、小鼠( r y o oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 和大鼠( k o d a i r ae ta 1 ， 1 9 9 7 ) 等中得到表达。 1 ) 在大肠杆菌中的表达 h g m c s f 基因在大肠杆菌中的表达方式主要为两种：( 1 ) 包涵体形式。h g m - c s f 在大肠杆菌中最常见的是形成不溶性的包涵体，经提取包涵体、变性裂解、复性、纯 化等步骤得到h g m - c s f 。( 2 ) 分泌型表达。将h g m c s f 基因克隆到o m p a 基因( 外 膜蛋白信号肽) 后面，用定位突变的方法去除二者之间的连接序列，得到成熟的 h o m c s f ，但表达量不高，每升发酵液仅2 0 m g 左右( 王锡峰等，1 9 9 9 ；施定基，2 0 0 0 ) 。 大肠杆菌表达系统缺乏蛋白质的翻译后加工能力，可能潜在地影响表达蛋白质的 稳定性、抗原性及生物学活性，用大肠杆菌表达h g m c s f 的生产和加工步骤较为繁 琐。但大肠杆菌表达系统具有成本低、产量高等优点，是其他表达系统无法比拟的。 另外，大肠杆菌表达的h g m c s fn 一位点和o - 位点均未被糖基化，分子量为1 4 。6 d a ， 这可能会对提高h o m - c s f 的活性产生影响( m o o n e n ，1 9 8 7 ；d a n i e l ，2 0 0 4 ；o u i l l e r m i n a , 2 0 0 4 ) 。大肠杆菌表达系统仍是目前最常用的外源基因表达系统( 荫俊等1 9 9 9 ) 。 2 ) 在哺乳动物中的表达 1 9 9 7 年，c o s e a r e l a a 等构建了h g m - c s f e p o 重组基因，并在中国仓鼠( c l i o ) 细 胞中获得表达，并证明该蛋自在介导红细胞分化方面l e h g m c s f 和e p o 更为有效 ( c o s e a r e l ae ta 1 ，1 9 9 7 ) ，随后还在猴c o s - 1 细胞中进行了表达。h g m c s f 在哺乳动 物体系中的表达主要分两步完成：( 1 ) 建立转基因老鼠；( 2 ) 在鼠的骨髓中插入逆转 录病毒载体，用来表达h g m c s f 。 在哺乳动物体系中h g m c s f 表达量甚微，难以大规模生产。并且过表达 h g m - c s f 导致转基因老鼠出现了失明现象，其巨噬细胞渗透进入横纹肌中。这就表 明用老鼠胚胎过表达h g m c s f 可能会导致某些疾病的产生( m e t e a l f , 1 9 8 8 ；g a s s o r l 1 9 9 1 ) 。另外，用携带鼠的h g m c s fe d n a 的逆转录病毒载体去感染鼠的骨髓，并试 图在其中过表达则导致产生致命的骨髓增生综合症。用哺乳动物细胞细胞表达的 h g m - c s f ( c h o g m ) ，n 位点均糖基化，分子量为1 8 2 4 k d a 。这也会对h g m c s f 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 的活性产生影响。因此，在哺乳动物中过表达h g m - c s f ，生产基因工程药物的工作 上尚需要进一步的研究( o a s s o n ，1 9 9 1 ) 。 3 1 在昆虫细胞中的表达 蚕蛋白产量大大高于其他表达系统。在1 0 0 0 只幼蚕虫的表达量可达1 5 0 r a g ( 一 只幼虫得到l m l 血液淋巴) ，而且幼虫表达的糖基化蛋白的稳定性大大高于大肠杆菌 表达的非糖基化蛋白( s h ie t a l ，1 9 9 6 ；肖振宇等，2 0 0 0 ) 。 舢在酵母中的表达 在酵母细胞中表达h g m - c s f ( g i l l i s ，1 9 9 8 ；t a v e m i e r , 1 9 8 9 ) 是将h g m - c s f 基 因克隆到a 因子下游，用定位突变的方法除去h g m - c s f 与因子信号肽间的连接肽， 在a d h z 、p g k 等启动子调控下，在酵母中表达并分泌到胞外，表达量可高达 5 0 - 6 0 m g l 。 目前，h g m - c s f 主要是在酿酒酵母中表达，随着基因工程技术的发展，其局限 性逐步显露出来。在常规的通气发酵条件下，酿酒酵母所能达到的生长速度和密度不 高，因此表达外源基因难以达到很高水平。外源基因在酵母中可通过多拷贝质粒形势 存在或整合到染色体上，其随机过度的糖基化以及多拷贝质粒的不稳定性会对外源 h g m c s f 的表达产生影响。因为相对糖基化的h g m - c s f 来说，未糖基化的h g m c s f 的生物学活性要高1 0 倍( m o o n e n ，1 9 8 7 ；d a n i e l ，2 0 0 4 ；g u i l l e r m i n a , 2 0 0 4 ) ，所以这将 可能导致酵母中表达的h g m c s f 活性下降。 鄢在植物细胞中的表达 h g m c s f 基因已经在许多植物中表达成功( r a v i n d e re ta l ，2 0 0 2 ) 。利用植