（遗传学专业论文）蕈菌的出菇培养及α鹅膏毒肽的分离纯化.pdf

四川大学硕士学位论文 覃菌的出菇培养及a 一 鹅膏毒肤的分离纯化 遗传学 专业 硕士研究生王建东指导老师杨志荣教授 本文分两部分， 分别对星抱寄生菇出菇培养和a 一 鹅膏毒肢分离纯化作了相 关研究。在第一部分实验中，首次将分离的星抱寄生菇菌丝经过驯化培养，实 现人工出菇，并观察到该菌生长过程中有节抱子和串生的厚垣抱子生成。基础 培养基筛选显示h s v a为最优培养基。以h s v a 为基础培养基，分别做了碳源、 氮源、 温度和p h 单因子实验， 结果显示其单因子最适培养条件分别是: 碳源为 葡萄糖， 氮源为n h 4 c 1 . ( n h 4 ) z h p 0 4 . n h 4 n 0 3 , 温度在2 0 - 2 5 0c , p h 为6 - 9 0 以h s v a 为基础培养基通过正交实验筛选到的优化培养条件， 其变动因素分别是 葡萄糖 3 . 0 g / l , n h ,c 1 0 . 2 g / l , p h 5 . 0 ，培养温度 2 0 0c 。试验结果显示该菌不 是文献描述的专性寄生，它可以在半合成培养基上自然生长。而且该菌的培养 条件相对简单，在实验室条件下易于控制，可以作为研究荤菌出菇培养条件的 材料。另外，星抱寄生菇水提液具有很好的抑芽效果，对绿豆和油菜种子的抑 制率分别为 7 1 . 2 7 %和 5 6 . 3 0 ，有望将此性质应用于开发新型生物生长调节 剂。 第二部分实验，我们在毒蘑菇中毒事件的事发地采集到一株鳞柄白毒鹅膏 菌，对其进行了形态学和分类学的研究。小鼠毒性实验进一步证明其含有致死 毒素， 后经反相高效液相色谱法从中分离到了a 一 鹅膏毒肤， 此即为一种主要致 死毒素。 我们分别制备了a 一 鹅膏毒肚标品和加入了鳞柄白毒鹅膏菌子实体提取 液的a 一 鹅膏毒肤标品两条标准曲线， 对上述两条标准曲线的回归方程进行显著 性检验，得到两者的合并方程 y=5 1 5 9 x十1 0 9 7 . 4 。并对鳞柄白毒鹅膏菌子实 体中的。 一 鹅膏毒肤进行了 测定， 通过上述方程计算其含量为2 8 3 3 . 8 u g / g 干子 实体。 我们还对雪白 毒鹅膏菌、 块鳞鹅膏菌、 星抱寄生菇进行了r p - h p l c 测定， 结果显示雪白毒鹅膏菌与星泡寄生菇均不含有 a 一 鹅膏毒肤， 而块鳞鹅膏菌子实 四川大学硕士学位论文 体中a 一 鹅膏毒肤含量为7 4 . o u g / g 干子实体。 关键词: 星抱寄生菇; 培养条件; 反相高效液相色谱法:a 一 鹅膏毒肤: 鳞 柄白毒鹅膏菌 四川大学硕十学位论文 p r e l i m i n a r y s t u d y o n s p o r o c a r p f o r m a t i o n o f a s t e r o p h o r a ly c o p e r d o i d e s a n d p u r i f i c a t i o n a n d i s o l a t i o n o f a - a ma n i t i n ma j o r : g e n e t i c s g r a d u a t e s t u d e n t : w a n g j i a n - d o n g i n s t r u c t o r : y a n g z h i - r o n g t h e s p o r o c a r p f o r m a t io n o f a s te r o p h o r a ly c o p e r d o i d e s a n d p u r if i c a t i o n a n d i s o la t i o n o f a - a m a n i t i n w e r e s t u d i e d i n t h i s r e s e a r c h . i n t h e f i r s t p a rt , i t w a s f i r s t o b s e r v e d t h a t t h e s p o r o c a r p s c o u l d b e f o r m e d fr o m c u l t i v a t e d h y p h a e o f a . 加o p e r d o id e s i n o u r l a b o r a t o ry , w i t h d i s p e r s i v e a r th r o s p o r e s a n d c a t e n u l a r c h l a m y d o s p o r e s . t h e h s v a w as i d e n t i f i e d t o b e t h e o p ti m i z e d c u l t u r e m e d i u m b y t h e e x p e r i m e n t o f f i l t r a ti n g b asic c u l t u r e m e d i u m . a n d t h e o p t i m i z e d c u lt i v a t in g c o n d iti o n s w e re g l u c o s e f o r c a r b o n , n 践c l , ( n h 4 ) z h p 认， n h 4 n 0 3 f o r n i t r o g e n , t e m p e r a t u r e in 2 0 - 2 5 c , a n d p h i n 6 - 9 , b y t h e s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t o f t h e h s v a a c c o r d i n g t o o u r o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t , t h e o p t i m i z e d c u l t u r e m e d i u m w as d e v e l o p e d fr o m h s v a , a n d t h e v a r i a b l e f a c t o r s w e re 3 . 0 g / l g l u c o s e , 0 .2 g / l n i-i 4 c 1 , p h 5 . 0 , a n d t h e g r o w i n g t e m p e r a t u r e a t 2 0 0c . t h e r e s u l t s h o w e d t h a t a ly c o p e r d o i d e s w as n o t o b l i g a t o ry p a r a s i t i s m as r e p o rt e d b e f o r e . i n s t e a d , i t c o u l d g r o w n a t u r a l l y i n s e m i - s y n t h e t i c m e d i u m . t h u s , i t c o u l d b e u s e d a s t h e m a t e r i a l o f t h e r e s e a r c h o f s p o r o c a r p f o r m a t i o n o f m u s h r o o m s , b e c a u s e o f i t s s i m p l e c u l t i v a t i n g c o n d i t i o n s a n d e asi l y b e i n g c o n t r o l l e d i n l a b o r a t o ry . f u r t h e r m o r e , it s w a t e r e x t r a c t s h o w e d a n i n h i b it o ry e ff e c t o n t h e b u d d i n g o f b r a s s i c a n a p u s a n d p h a s e o l u s a u r e u s , w i t h t h e e ff i c i e n c y o f 7 1 .2 7% a n d 5 6 . 3 3%，r e s p e c t i v e l y . t h i s e ff e c t m a y p o t e n t i a l l y b e a p p l i e d o n t h e d e v e l o p m e n t o f n e w b i o l o g i c a l g r o w t h re g u l a t o r . i n t h e s e c o n d p a rt , t h e a m a n i t a v i r o s a w as g a t h e r e d i n t h e p l a c e w h e r e p o i s o n i n g o f t h e p e o p l e w e r e f o u n d , a n d t h e re s e a r c h o f m o r p h o l o g y a n d t a x o l o g y o f 四川大学硕士学位论文 i t w e r e s t u d ie d . f u rt h e r m o r e , t h e t o x i c i t y e x p e r i m e n t o f r a t s s h o w e d t h e l e t h i f e r o u s t o x i n w a s c o n t a i n e d i n i t , a n d l a t e r t h e a - a ma n i t i n w a s i d e n t i f i e d f r o m i t . t h e u n i t e d e q u a t i o n t h a t y=5 1 5 9 x+1 0 9 7 . 4 w a s b u i l t , b y t h e e s t a b l i s h m e n t o f t w o s t a n d a r d c u r v e s o f t h e gr a d i e n t m a r k o f t h e a - a m a n i t i n a n d t h e gra d i e n t m a r k o f t h e a - a m a n i t i n a d d e d w i t h l i q u i d fr o m a . v i r o s a , a n d f o l l o w e d m a k i n g t h e s i g n i fi c a n c e t e s t s o f t h e m t o id e n t i 斤t h e m w e r e f r o m o n e gr o u p . t h e c o n t e n t o f a - a m a n i t i n o f t h e a . v i r o s a i s 2 8 3 3 .8 u g / g ( d r i e d s p o r o c a r p ) b y m e n s u r a t i n g i t . t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t n o a - a m a n i t i n h a d b e e n d e t e c t e d fr o m t h e s p o r o c a r p o f a . ly c o p e r d o id e s a n d a . n i v a l is 勿r p - h p l c . b u t i n t h e s p o r o c a r p o f a m a n i ta e x c e l s a , a - a m a n i t i n c o u ld b e f o u n d , a n d it s c o n t e n t w a s 7 4 .o u g / g ( d r i e d s p o r o c a r p ) k e y w a - a ma n i t i n o r d s : a s t e r o p h o r a ly c o p e r d o id e s , c u l t i v a t i n g c o n d i t i o n s , r p - h p l c , a ma n i t a v i r o s a 四川大学硕十学位论文 引言 毒蘑菇的开发利用研究是一项具有广阔前景的领域，世界上有记 述的毒蘑 菇有 1 0 0 0 余种，中国目 前已知的近 5 0 0 种， 其中极毒致死的约百种。目前已分 离鉴定的毒蘑菇毒素包括鹅膏毒肤( a m a t o x i n s ) 、 鬼笔毒肤( p h a l l o t o x i n s ) . 毒伞素 ( v i r o t o x i n s ) 、 毒 蝇碱( m u s c a r i n e ) 、 异恶r t ( i s o x a z o l e ) 衍生 物、 鹅膏氨酸( i b o t e n i c a c i d ) 以 及蝇 覃醇 ( m u s c im o l ) 等 p 1 。 在 鹅膏 菌 毒素的 研 究 过 程中 ， 人们发 现了。 一 鹅膏 毒肤对真核生物r n a聚合酶 的 专一性抑制作用和p h a l l o i d i n 对肌动蛋白的 专 一性束缚作用，从而推动了分子生物学、细胞生物学、发育生物学、医学生物 学等学科的发展。而且，对鹅膏菌毒素的毒理阐述所带给科学家的启示而赋予 生命科学研究所产生的成果是令人鼓舞的。这也促使人们源源不断地去研究和 应用鹅膏多肤毒素2 1 由于人工合成鹅膏多肤毒素的技术还不成熟，还不能实际应用，其来源都 是从鹅膏多肤毒素的生产菌中分离提取。而鹅膏多肤毒素的主要生产菌都属于 鹅膏科，鹅膏科菌类是菌根菌，人工栽培存在困难，所以目前利用的几乎都是 野生鹅膏菌， 其资 源非常有限，限制了 人们对鹅膏多肤毒素的 研究和应用13 1 这也使鹅膏科菌类的分离纯化和出菇培养成为一个研究热点。现在，人们己能 分离培养出纯化的鹅膏菌菌丝体，但是还不能出菇培养，而且对鹅膏菌菌丝体 的分析表明其几乎不含有鹅膏多肤毒素，所以纯化培养的鹅膏菌菌丝体能否出 菇是关键所在。本实验室分离到的星抱寄生菇能在半合成培养基上较好的生长 并出菇，是一种研究覃菌出菇机理的良好材料，我们在此对其出菇培养条件进 行了初步探索和研究。 在毒蘑菇毒素中， 导致人和动物死亡的主要是鹅膏毒肤， 对鹅膏毒肤准确、 快速的检测不仅有助于对野生毒菌的鉴定，对毒菌中毒病人的及时诊断和治疗 也很关键。并且，鹅膏多肤毒素分离纯化技术的发展也有利于提高其产量和降 低成本，促进其研究和应用。目 前，检测鹅膏菌毒素的方法有点迹法、纸层层 析法、薄层层析法、液相色谱法( l c ) 、高效液相色谱法( h p l c)、放射性免疫测 定法( m a ) ， 毛细管区带电泳法( c z e ) 等4 -6 1 。每一种方法都有其优点和不足。 其 中， h p l c法分析分离生物样品具有速度快、灵敏度高、分辨率好、用量少等 四川大学硕 七学位论文 优点7 1 。我们使用r p - h p l c法对。 一 鹅膏毒肤的分离纯化作了 初步研究，并测 定了鳞柄白毒鹅膏菌子实体中a 一 鹅膏毒肤的含量。 为从野生毒菌中分离纯化获 得高纯度的鹅膏毒肤以及筛选治疗毒蘑菇中毒的药物奠定了坚实的基础。 四川大学硕十学位论文 第一章 星袍寄生菇出菇培养 星饱寄生菇 ( a s t e r o p h o r a l y c o p e r d o i d e s ) 中文别名为草寄生， 隶属于担 子菌亚门，层菌纲，伞菌目，白蘑科，寄生菇属。野外常见寄生于稀褶黑菇 ( r u s s u l a n i g r i c a n s ) ,黑菇( r . a d u s t a ) 及密褶黑菇( r . d e n s i f o l i a ) 菌盖中央、 菌 褶 和 菌 柄 部 18 1 目前可以人工栽培的食、药用真菌的种类有很多，但是对产生子实体的过 程研究的相对深入的伞菌仅有灰盖鬼伞 ( c o p r i n u s c i n e r e u s ) 、棕色蘑菇 ( a g a r i c u s b r u n n e s c e n s ) 、 毛柄小火菇 ( f l a m m u l i n a v e l u t i p e s ) 等少数种19 1 而国内外学者对星抱寄生菇做的研究工作则更少，到目前为止除了对野生星抱 寄生菇做了形态学观察和分类学的研究之外，没有任何驯化培养和其他相关工 作的记录。为了充分认知此种资源，还有许多工作值得深入开展。星抱寄生菇 具有寄生于其他草菌的独特生理性状，而人们对此机理却不清楚;星抱寄生菇 野生菌丝体生长及出菇迅速，有望从中分离到新型生物生长调节剂，用于难以 培养的名贵食、药用真菌的人工出菇研究;由于该菌能在实验室培养条件下出 菇，易于操控，还可用于荤菌出菇机理和遗传学研究。本论文拟对其进行人工 驯化、出菇栽培、条件优化筛选，做相关生物学活性研究。 1 .材料与方法 1 . 1材料、仪器. 1 . 1 . 1材料 供试菌:星饱寄生菇 ( a s t e r o p h o r a l y c o p e r d o i d e s ( b u l l . ) d i t m a r e x s . f . g r . n y c t a l i s a s t e r o p h o r a f r . ) ， 采自 四 川 省阿 坝州 三 江自 然 保 护区。 香 菇 ( l e n t i n u e d o d e s ) 、金针菇( f l a m m u l i n a v e l u t i p e s ) 、双抱蘑菇 ( a g a r i c u s b i s p o r u s )、 平 菇 ( p l e u r o t u s o s t r e a t u s )、 金 顶 侧 耳 ( p l e u r o t u s c i t r i n o p i l e a t u s ) 为市售。 供试材料:油菜( b r a s s i c a n a p u s ) ，绿豆( p h a s e o l u s a u r e u s ) 。实验所用 昆明小鼠，由华西实验动物中心提供。 四川大学硕+ 学位论文 1 . 1 . 2仪器 光学显微镜: o l y m p u s , b x 4 0 。 扫描电子显微镜:日本日立公司， s - 4 5 0 型。 1 . 2实验方法 1 . 2 . 1培养基配方 分离培养基: 葡萄糖2 0 g ， 牛肉膏2 g ， 蛋白 陈0 . 2 g , m g s 0 , 0 . 5 g , v b , 1 0 m g , 琼脂1 6 g ，加蒸馏水至1 0 0 0 m l , p h 5 . 5 o h s v a 培养基: 葡萄糖2 . o g ， 酵母粉1 . 0 g , n h , c 1 0 . 1 g , c a s o , 1 / 2 h , o 0 . l g , k c 1 0 . 1 g , v b , 1 . o m g , v h 0 . 1 m g ，琼脂1 6 g ，加蒸馏水至1 0 0 0 m l ，调p h 到5 . 5 . p d a 培养基: 葡萄糖2 0 g ，蛋白 陈 l o g ， 琼脂1 6 g ，马铃薯2 0 0 g ， 加蒸馏水 至1 0 0 0 m l , p h自 然。 p d m培养基:葡萄糖 2 0 g , c a c l , 1 g , m g s o , 1 g , k h , p o , 1 g ，麦芽汁 1 2 0 m l ( 1 0 - 1 5 波美度) ，马铃薯2 0 0 g , v b , 0 . l m g ,琼脂 1 6 g ，加蒸馏水至 1 0 0 0 m l , p h 5 . 2 . m m n培养基:葡萄糖 2 0 g , c a c l , 0 . 0 5 g , m g s o , 0 . 1 5 g , k h i p 0 , 0 . 5 9 , n a c i 0 . 0 2 5 8 , ( n h , ) ,h p o , 0 . 2 5 g , f e c 1 , ( 1 9 6 ) 1 . 2 m l ， 麦芽汁1 2 0 m l( 1 0 - 1 5 波美度) ， v b , 0 . l m g ，琼脂1 6 g ， 加蒸馏水至1 0 0 0 m l , p h 5 . 4 e b m 培养基:葡萄糖2 0 g ，蛋白 陈0 . 2 g ，酵母膏2 g , m g s o , 0 . 5 g , v b , 1 0 m g , 琼脂1 6 g ， 加蒸馏水至1 0 0 0 m l , p h 5 - 6 o 滨田氏 培养基: 葡萄搪2 0 0 g ， 酵母膏5 g , 1 n h c l 1 . 6 m l， v b , 1 o m g ， 琼 脂1 6 g ，加蒸馏水至1 0 0 0 m l , p h 5 - 6 e 麦芽汁培养基: 麦芽 汁1 0 0 0 m l ( 1 0 - 1 5 波 美 度) ， 酵母膏2 g ， 琼脂1 6 g , p h 自然。 玉米粉葡萄糖 培养基: 葡萄糖2 0 g ， 玉米粉2 0 g , k h , p o , l g ， 蛋白 陈0 . 5 g , 琼脂1 6 g ， 加蒸馏水至1 0 0 0 m l , p h 5 - 6 o 玉米粉综合培养基: 葡萄糖2 0 g ，玉米粉2 鲍，k , h p o , 1 g , m g s o , 0 . 5 g ， 蛋 白 陈 1 g ， 琼脂1 6 g ，加蒸馏水至1 0 0 0 m l , p h 5 - 6 a 菌根菌标准培养基: 葡萄糖 1 0 g , k h , p o , 0 . 5 g ，麦芽汁2 5 m l( 1 0 - 1 5 波美 度) ， c a c l , 0 . 0 5 g ， 酵母膏1 . 5 g ，柠檬酸铁溶液0 . 5 m l ( 1 . o g 柠檬酸铁+ 0 . 6 4 g 柠檬酸， 溶于1 0 0 0 m l 水中) ， 蛋白 陈2 . 5 g ， 酒石酸钾1 g , n h 3 0 的高温下培养会对星 抱寄生菇造成不可逆的损伤。 0 . 6 6 8 息宜哲曰习淤吸 子实体鲜重 原基出现时间 1 2 1 0 86420 se-一1- 0 . 0 7 1 0 .0 4。 n, 万叫姗脚。 口侧兹堆体韦 1 0 0 c 1 5 c 2 0 0 c3 0 c 3 5 c 口04ezl洲卫25c 图 6 温度梯度实验结果 2 . 6 p h 梯度实验结果 图7 显示星抱寄生菇的生长p h范围 从p h 5 . 0 到1 2 ， 最适于在接近中 性p h 生 长 ( p h 6 .0 - 9 .0 ) ， 有较强的 耐 碱能力， 能 够在p h 1 2 的 培 养基上生长。 其 原基 出 现时la l 为: p h 5 , 6 , 7 最早， p h 8 , 9 , 1 0 , 1 1 次之，1 2 最晚a 只宜蓄爵书洲吸 141210864 一1 。 ， 租 0 -5 1 2 0 .4 8 8一 。:。7“汗 日 日 。452i i i .i i i i i i 0. 2 5 行 子实体鲜重 原基出现时间 。1 5 6 一匕曰4内口， 0八uqoc甘 9侧盆长姚平 0 . 0 4 1 p h 4 p h 5 p h 6 p h 7 p h 8 p h 9 p h 1 0 p h l i p h 1 2 p h 1 3 图7 p h 梯度实 验结 果 四川大学硕士学位论文 2 . 7正交实验结果 由正交实验结果可以看出增加葡萄糖、n 执c 1 在培养基中的含量能够明显 提高星抱寄生菇子实体鲜重， 且温度的影响要明 显于p h 。 这与p h单因素实验 结果相符合，即 星抱寄生菇的适宜p h范围 较广。原基出 现时间是2 号最早， 可以看出葡萄糖、n h 4 c 1 的量对其初期生长影响并不大，原基出现时间主要取 决于温度和 p h的综合效应。 但比较各组实验数据，在葡萄糖 3 . 0叭 ， n h 4 c i 0 .2 叭 ， p h 5 .0 ， 培 养温度2 3 的 培养条件下， 星抱寄生 菇子实体的 产量 最高 ( 见表 2 ) e 表 2 正交实验表 分组 葡萄糖 ( g / l ) n h c 1 ( g / l )温度 p h子实体鲜重 原基出 现时间 ( d ) 一，洲.， 1 1 n 0 _ 0 5 t 8 5 0 . 3 8 3 5 0 . 4 9 6 0 . 2 9 1 门jq户n口二 njn吕八jo n乙q自口乙勺自 亡d 1.ln乙n户11 . 八曰n八n n曰nun八曰 :. jlll门白，妇 q自怪jd五-口 2 . 8抑芽实验结果 从表 3 可以看出，此六种荤菌子实体的水提液均能有效的抑制绿豆和油菜 下胚轴的生长，而这六种覃菌均不含有鹅膏毒肤，则可以看出覃菌的抑芽机理 还存在许多未知因素，不能根据其能否抑芽来判断荤菌是否含有鹅膏毒肤。另 外，根据它们的强抑芽效率，我们可以推断这些荤菌中还含有许多未知的活性 物质，有望从中筛选到新型生物生长调节剂和其他具生物活性的新结构、新物 质。 四川大学硕十学位论文 表 3抑芽实验结果表 双袍蘑菇 绿豆 ( %) 油菜 ( %) 星抱寄生菇香菇 7 1 . 2 7 9 1 . 4 4 5 6 . 3 0 9 5 . 1 4 金针菇 6 6 . 2 4 8 5 . 6 6:一 ;: 平菇 8 7 . 5 0 9 7 . 5 7 金顶侧耳 9 0 . 6 3 9 7 . 0 4 3讨论 四川位于祖国西南，地形地貌复杂，气候及植被类型多样，真菌资源非常 丰富。我们近几年在四川各地采集到大型真菌2 0 0 余种，己鉴定的有1 0 1 种， 其中经纯化培养长出菌丝的有3 1 种。但是只有星抱寄生菇能够人工培养出菇。 所以我们对其进行了培养条件的研究，初步探索其出菇条件和机理。在本实验 以前，国内外仅见对野生星抱寄生菇形态、分类有些许记载。我们对该菌进行 分离、驯化，不仅可以出菇培养，还优化出更佳的出菇培养条件，子实体鲜重 可以提高1 . 7 7 倍。 通过人工出菇培养的研究可以看出该菌为非专性寄生， 可以 在半合成培养基上自 主发育生长。我们推测野生的星抱寄生菇应该存在我们尚 未发现的非寄生型的不常见状态。 对星抱寄生菇的单因子实验可以看出其培养条件与大多数外生菌根菌类 似， 即能 有效的 利用葡萄 糖为 碳源， 利 用按态 氮为 氮 源， 适应的p h范围 广， 对温度很敏感等。但是在这些条件下，大部分外生菌根菌尤其是鹅膏菌，仅有 菌丝生长而不能出菇，揭示可能还缺乏某些出菇关键因素，例如与其共生的树 木含有的活性物质等。目 前人们也在积极筛选这些物质，包括从与野生菌共生 的树木及其生长的土壤环境中提取的物质。 但是仅有这些还是不够的，单纯模仿野生生长条件，很难达到其野生生长 状态。我们要从根本上解决这一问题还依赖于覃菌出菇机制的研究。星抱寄生 菇出菇条件相对简单，易于控制，是一种较好的辈菌出菇研究材料。我们已在 显微镜下观察到其从抱子萌发到原基形成的全过程，为其出菇机理的研究奠定 了基础。 鉴于以上结果，我们可以推断对该菌的深入研究不仅仅在分类及教学上有 价值，还可以应用于覃菌出菇机理和遗传学研究，以及从中发现和分离对其他 覃菌和生物有特殊活性的新物质，提高对该菌的充分认识。 四川大学硕十学位论文 参考文献 赵建， 张杰， 侯若彤。 李达旭， 杨志荣. 鹅膏菌毒素的研究进展。 林产化学与工业. 2 0 0 3 , ( 2) : 9 0 - 9 6 . ij，d r.lc 2 董国日 ， 张志光， 陈作红 鹅膏菌 毒素 及其毒理 研究 进展. 生物学杂志. 2 0 0 0 , 1 7 ( 3 ) : 1 - 3 . 3 1 包 海鹰， n 立古 尔， 李玉. 蘑菇的 毒性 成分及 其应用研究现状. 吉 林农业大学学 报. 1 9 9 9 , 2 1 ( 4 ) : 1 0 7 - 1 1 3 4 1 me i x n e r a . a m a t o x i n n a c h w e i s i n p i l z e n . z my k o l . 1 9 7 9 , 4 5 : 1 3 7 - 1 4 0 . 5 1 s u l l i v a n g , b r a d y l r ,t y l e r v e j r . i d e n t i f i c a t i o n o f a - a n d l3 - a m a n i t i n b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y . j p h a r m s i c . 1 9 6 5 , 5 4 : l 9 2 1 - 9 2 2 . 6 y o c u m r r , s i m o n s d m .a m a t o x i n s a n d p h a l l o t o x i n s i n a m a n i t a s p e c i e s o f t h e n o rt h - e a s t e rn u n i t e d s t a t e s . l i o y d i a . 1 9 7 7 , 4 0 : 1 7 8 - 1 9 0 . 7 1 b e l l i a r d o , f . a n d ma s s a n o , g . d e t e r m i n a t i o n o f a - a m a n t i t i n i n s e r u m b y h p l c . j o u r n a l o f c h ro m a t o g r a p h y . 1 9 8 3 , 6 : 5 5 1 - 5 5 8 . 8 1 卯 晓岚， 文华安， 庄文颖， 等. 中国 大型真菌( 第一 版) . 郑州: 河南科学技术出 版社 . 2 0 0 0 , 1 4 9 . 9 c . 四版) j . 阿历索保罗，c . w . 明斯，m . 布莱克韦尔著 ( 姚一建， 李玉等译). 菌物学概论 ( 第 北京: 中国农业出版. 2 0 0 2 , 4 4 7 - 4 7 9 1 0 1 s h i n j i r o m , n o b u k o f , k i y o h i s m , e t a l . d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f a m a n i t i n s i n t h e w o o d - r o tt i n g f u n g i g a l e r i n a f a s c i c u l a t e a n d g a l e r i n a h e l v o l i c e p s . a p p l i e d a n d e n v i r o n m e n t a l mi c r o b i o l o g y . 1 9 9 9 ,4 2 0 7 - 4 2 1 0 . 1 1 陈 天寿， 严德喜， 李 根生， 等. 微生物培养基的 制造与应用 ( 第一版) . 北 京; 中国农 业出版社. 1 9 9 5 , 4 9 2 - 5 0 9 . ( 1 2 1 方开泰，马长兴. 正交与 均匀试验设计. 北京: 科学出版社. 2 0 0 1 . 1 3 马 建义， 徐礼根， 郑永泉， 等. 植物生长调节 剂生物筛 选方法的 初步构 建. 浙江大学学 报( 理学版) . 2 0 0 2 , 2 9 ( 3 ) : 3 2 9 - 3 3 5 . 四川人学硕十学位论文 第二章 a 一 鹅膏毒肤的分离鉴定 。 一 鹅膏 毒肤英文名a - a m a n i t i n ， 又译为 鹅膏 菌碱， 是 一类双环八 肤分子 m 。 一 鹅膏毒肤主要存在于鹅膏菌( a m a b i t a ) 中， 如毒鹅膏菌( a m a n i t a p h l l o id e s ) 、 白 毒鹅膏菌 (a . v e r n a ) , 鳞柄白 毒鹅膏菌 ( a . v ir o s a ) 等。 但在肉 褐鳞小 伞 ( l e p o s t a b r u n n e o - i n c a r n a t a ) 、毒丝膜菌( c o r t i n a r i u s o r e l l a m u s ) 、细鳞丝膜菌( c . s p e c i o s i s s i m u s ) 、 秋盔抱伞( g a l e r i n a a u t u m u a l is ) 、 条盖灰抱伞( g . .s u l c ic e p s ) 等非鹅膏科菌中 也有分布。a 一 鹅膏毒肤是人和动物误食有毒真菌后导致死亡的主要原因之一。 实验发现小白鼠的l d 5 。 一般为0 .2 -0 .5 m g / k g ，而人的l d 5 0 更低于这一数字。 a 一 鹅膏毒肤属于慢作用毒素，一般病人在中毒后 5 -1 2天死亡，死亡率高达 9 0 %，但是目 前还没有有效的治疗方法2 1 人们发现 。 一 鹅膏毒肤对真核生物 r n a聚合酶 1 1的专一性抑制作用， 从而 使其迅速应用于分子生物学、细胞生物学、发育生物学、医学生物学等学科， 并推动了这些学科的发展。 对。 一 鹅膏毒肤的研究现己倍受重视， 蘑菇也成为寻 找新抗癌物质和 提取抗菌素的 重要资 源之一3 1 。 由 于产生。 一 鹅膏 毒肤的 真菌目 前尚未驯化成功， 而人工合成成本高且性能不稳定， 故其来源主要为野生毒菌。 。 一 鹅膏毒肤易溶于水， 化学性质稳定， 具有很好的热稳定性和强p h适应 能力，不易被生物体内的肤酶和蛋白酶降解，其最大紫外吸收峰一般在 2 9 0 3 0 4 n m之间。目前检测鹅膏菌毒素的方法有点迹法、 纸层层析法、 薄层层析法、 液相色谱法( l c ,高效液相色谱法( h p l c)、放射性免疫测定法( m a ) ，毛细管区 带电 泳( c z e ) 以及 r n a聚合酶抑制法等。 每一种方法都有其优点和不足4 -6 1 h p l c法分析分离生物样品具有速度快、 灵敏度高、分辨率好、 用量少等优点。 现在， h p l c法已 广泛应用于中毒病人血浆和尿液中 肤类毒素的检测7 1鹅膏 菌及其肤类毒素的 研究e - 1 0 1 。 本部分论文拟建立使用 r p - h p l c法分离。 一 鹅膏 毒肤的标准曲线及其分离的色谱条件， 并对鳞柄白毒鹅膏菌的a 一 鹅膏毒肤含量 进行初步研究。 1材料与方法 1 . 1材料、试齐 1 和仪器 四川大学硕士学位论文 1药品与试剂 乙 酸分析纯成都化学试剂厂 z 酸 按分 析 纯成 都 化学 试 剂 厂 乙 睛h p l c色谱纯s c h a r l a u 公司 三氯甲烷分析纯成都科龙化工试剂厂 1 . 1 . 2材料 鳞柄白 毒鹅膏菌( a m a n i t a v i r o s a ) 、 星 抱寄生 菇( a s t e r o p h o r a ly c o p e r d o i d e s ) . 块鳞鹅膏菌 ( a m a n i t a e x c e l s a ) 、雪白毒鹅膏菌 ( a m a n i t a n i v a l is )由本实验室分 别采至三江 自 然保护区、雅安市、大邑县。 1 . 3仪器 岛 津l c - 1 o a t ，岛津v p - o d s ( 1 5 0 m m x 4 .6 m m ,5 u m ) , s p d - mi o a v p检测 方法 1鳞柄白毒鹅膏菌的采集和鉴定 我们根据蘑菇中毒事件的报道和有关人员提供的线索，在三江采集到一菌 并对其进行了形态和分类研究。 ocl么， 器tt株 ， . 2 . 2鳞柄白毒鹅膏菌的毒性试验 取低温烘干的鳞柄白 毒鹅膏菌子实体研碎，按子实体与水1 g : i o m l 的比 例 混合，常温振荡2 h ，纱布过滤， 补充水至浓度为0 . 1 g 子实体干重/ m l ， 得到子 实体浸提液。按同样的方法分别制取星抱寄生菇、块鳞鹅膏菌以及雪白毒鹅膏 菌的 浸提液。 取巧只体重2 0 g 左右的小鼠， 分为五组， 每组三只。 分别用四 种 子实体浸提液 ( 剂量为: 小鼠 体重g * 3 0 u l / g ) 灌胃， 另一对照组用纯水灌胃。 观察记录小鼠死亡情况。 1 . 2 . 3 a 一 鹅膏毒肤的分离纯化 1 . 2 . 3 . 1革菌 抽提液制备 四川人学硕十学位论文 2 . 2鳞柄白毒鹅膏菌的毒性试验 用鳞柄白 毒鹅膏菌子实体浸提液灌胃的 三只小鼠分别在灌胃后 2 4 - 4 8 h死 亡，而用其它三种菌的子实体浸提液灌胃以及用水灌胃的对照组均无死亡。 表1鳞柄白毒鹅裔菌的毒性试验 鳞柄白毒鹅膏菌块鳞鹅膏菌雪白毒鹅膏菌星抱寄生菇水 试验小鼠数 死亡小鼠数 2 . 3 a - a m a n i t i n 标准曲 线制备 2 . 3 . 1色谱结果 标样a - a m a n i t i n 经r p - h p l c分析 ( 图2 ) ，单组分洗脱峰的保留时间约为 1 2 .4 1 10 .2 m i n :其紫外吸收光谱图如图所示，在约2 0 9 n m. 3 0 3 n m波长处有吸 收峰，在约2 4 2 n m波长处有一肩峰 图3 ) e 图2 a - a m a n i t i n 标品色谱图图3 a - a m a n i t i n 标品紫外吸收光谱图 梯度浓度的标样水溶液对应的a - a m a n i t i n洗脱峰面积和加入了鳞柄白毒鹅 膏菌抽提液的梯度浓度标样水溶液对应的洗脱峰面积分别见表 2 . 3 e 表2 标样水溶液对应的洗脱峰面积 浓度( u g / m l ) 峰面积 6 . 6 1 3 . 2 1 9 . 8 1 2 7 8 0 7 0 7 1 2 1 0 3 4 7 5 2 6 . 4 1 4 3 6 2 8 3 3 . 0 1 7 1 1 6 0 四 川 人 y 坝 士字 位 论又 表3 补加了鳞柄白毒鹅裔菌抽提液的标样水溶液对应的洗脱峰面积 浓度( u a / m l ) 峰面积 面积差 6 . 6 1 3 . 2 1 9 . 8 2 6 . 43 3 . 0 1 4 6 3 0 5 6 1 4 9 7 6 7 8 1 5 3 5 6 8 0 1 5 6 7 7 4 01 5 9 8 4 9 01 6 2 8 5 8 7 3 4 6 2 2 7 2 6 2 4 1 0 4 6 8 4 1 3 5 4 3 4 1 6 5 5 3 1 2 . 3 . 2标准曲 线制备 从表 2 和 3中数据以及对应的散点图可以看出，tt - a m a n i t i n洗脱峰面积与 药品浓度之间可能存在线性相关关系。对峰面积与药品浓度做皮尔逊相关系数 ( p e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e ff i c i e n t s ) 分析， 结果显示， 两者在a =0 .0 1 水平， 双尾检 验呈显著性相关，所以可按线性回归计算。 标品浓度 ( u g 加l )曲线1 标品浓遂 ( u g / m l ) p e a r s o n c orr e la t io n 5 咱 . ( 2 - t a ile d ) n 1 6 . 9 9 9* . 0 0 0 6 曲线1 p e a r s o n c orr e la t io n s ig . ( 2 - t a il日 d ) n . 9 9 9* 0 0 0 6 1 6 * * . c o r r e la t io n is s ig n ifi c a n t a t t h e 0 .0 1 le v e l ( 2 - t a ile d ) . 图 4标准曲线 1的皮尔逊相关系数分析 标品浓度 ( u g / ml )曲 线 2 lqc rmmjx ( u g / m l ) p e a r s o n c o r r e la t io n s i g . ( 2 - t a il e d ) n 1 6 . 99 9*