（分析化学专业论文）手性氨基酸构建电流型生物传感器的研究.pdf

两南大学硕十学位论文摘要 曼曼量曼曼量曼曼曼! i le a l 一一一 。鼍曼曼曼鼍曼曼曼皇曼曼曼皇曼曼曼蔓曼曼曼曼曼璺 手性氨基酸构建电流型生物传感器的研究 分析化学专业硕士研究生陈敏 指导老师傅英姿副教授 摘要 手性识别是自然界一种特殊的识别方式，也是近年来随着材料科学、电子技术和检测手 段的进步而逐步发展起来探索生命世界的新方法。认识手性识别，可以帮助我们了解生物体 的运行机制和一些重要的生命过程，在物质检测分析、新型纳米材料研发、新药制备及药理 研究等领域均具有重要的科学意义和实际应用价值。本文主要将手性氨基酸以及氨基酸和纳 米材料形成的手性复合物作电化学活性材料用于构建电流型生物传感器，探讨研究了氨基酸 与生物分子间的手性识别作用，主要内容如下： 1 研究了脯氨酸对映体对免疫分子的手性识别作用。选取具有分子刚性结构的脯氨酸对 映体作手性材料，以癌胚抗原抗体为生物分子模型，将脯氨酸对映体分别组装到化学和电化 学处理过的玻碳电极表面，形成和d - 脯氨酸手性膜，结合癌胚抗体制得两种电流型免疫传 感器。由于脯氨酸特殊的分子结构，在组装过程中能有效的保持其手性。原子力显微仪测定 结果显示：脯氨酸对映体在相同条件下在同种基底上形成的手性膜形态有很大的差异，当癌 胚抗体与两手性膜作用后，抗体与口脯氨酸膜结合成均匀密集的“网状”，而与三。脯氨酸膜 结合成不均匀的“根状”。电l j 二学免疫实验表明d 脯氨酸修饰的癌胚抗原免疫电极比脯氨 酸修饰的有较好的线性和灵敏度。 2 对手性纳米材料识别免疫分子进行了研究。通过手性精氨酸多壁碳纳米管纳米复合物 构建前列腺特异性抗原电流型免疫传感器，研究手性纳米复合物对前列腺抗体的识别作用。 手性纳米复合物分别由三和压精氨酸与多壁碳纳米管共价结合制备。该复合材料具有精氨酸 的手性识别性能，又具备多壁碳纳米管电子性能佳、比表面积大、化学性能稳定等优点，且 可能具有较好的生物相容性。在电极组装过程中，首先电沉积纳米金和修饰具有电化学信号 放大作用的普鲁士蓝到洁净的玻碳电极表面上，再将手性复合物与壳聚糖在普鲁士蓝表面成 膜并用牛血清蛋白封闭，制得电流型免疫传感器。手性纳米材料对前列腺特异性抗体的手性 识别通过该传感器对前列腺抗原的反应来间接检测。 3 分析研究了手性纳米材料对过氧化物酶的手性选择作用。手性纳米材料( 精氨酸多壁 碳纳米管) 以及未功能化的多壁碳纳米管分别与过氧化物酶、壳聚糖形成复合物，在电沉积纳 两南大学硕士学何论文摘要 米金层的玻碳电极表面形成膜，制得三种过氧化氢传感器。采用电化学技术对比这三种传感 器对过氧化氢的测定性能，分析探讨手性纳米材料对生物分子一过氧化物酶的手性识别作用。 关键词：手性识别氨基酸手性复合物电化学生物传感器 两南大学硕十学位论文 a b s t r a c t s t u d yo ne l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sb a s e d o nc h i r a la m i n oa c i d s m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r yp o s t g r a d u a t e ：m i nc h e n s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o ry i n g z if u a b s t r a c t c h i r a ir e c o g n i t i o n ，t h eb a s i co fl i f e ，i sas p e c i a lr e c o g n i t i o np r o c e s si nn a t u r a l i nr e c e n ty e a r s ， a st h ed e v e l o p m e n to fm a t e r i a l ss c i e n c e ，e l e c t r o n i ct e c h n o l o g ya n dt h ea d v a n c e si nd e t e c t i o n m e t h o d s i ti sg r a d u a l l yb e i n gan e ww a yw h i c hn o to n l yh e l pu st of i n do u tt h eo p e r a t i o nm e c h a n i s m o fo r g a n i s m sa n ds o m ei m p o r t a n tl i f ep r o c e s s e s ，b u ta l s oo w ns i g n i f i c a n tv a l u ei na n a l y s i s ，n o v e l n a n o - m a t e r i a lp r e p a r a t i o n , d r u gd i s c o v e r y ，p h a r m a c o l o g i c a lr e s e a r c ha n ds oo n i nt h i sp a p e r , c h i r a l a m i n oa c i d so rc h i r a ln a n o - c o m p o u n d sw e r eu t i l i z e dt of a b r i c a t ea m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r s , t o i n v e s t i g a t et h ec h i r a lr e c o g n i t i o nb e t w e e na m i n oa c i d sa n dt h eb i o - m a c r o m o l e c u l e t h ed i s s e r t a t i o n d e s c r i b l e da sf o l l o w s ： 1 a n i n t e r e s t i n gp h e n o m e n o n o ft h es t e r e o s e l e c t i v ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l ea n da m i n oa c i de n a n t i o m o r p h o u sw a sd e s c r i b e d f i r s t l y ，p r o l i n ee n a n t i o m e r ( l a n d d p r o l i n e ) w a sa s s e m b l e do nt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d es u r f a c e t h e nc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i b o d y ( a n t i c e a ) w a sl o a d e dt ot h ee n a n t i o m e rs u r f a c e ，e l e c t r o - c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) w a su s e dt om o n i t o rt h eg r o w t ho fa m i n oa c i df i l m t h ea s s e m b l yp r o c e s sw a sc h a r a c t e r i z e db y c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n da t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) w a sa p p l i e dt oi m a g et h ec h i r a lf i l m s f i n a l l y ，t h ed e v e l o p e de l e c t r o d e sh a di n t e r a c t e dw i t hc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) i nv a r y i n g c o n c e n t r a t i o ns o l u t i o n s t h ea f ma n da m p e r o m e t r i cr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ep r o l i n ee n a n t i o n e rh a d t h ec h i r a lr e c o g n i t i o nf u n c t i o n t oa n t i b o d y 2 e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a yw a su s e dt os t u d yt h ec h i r a ln a n o c o m p o s i t e s ( c a m s ) i n r e c o g n i t i o no fp r o s t a t e - s p e c i f i ca n t i b o d y ( p s a ) ，w h i c hw e r ef o r m e db yl a n dd - a r g i n i n e ( a r g ) a n d m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( m w n t s ) t h ec h i r a ln a n o c o m p o s i t e sa n dt h em o d i f i e de l e c t r o d e p r o c e s s e sw e r ea n a l y z e db yp h o t o c h e m i c a la n de l e c t r o c h e m i c a lm e a i l s n a n o - g o l da n dp r u s s i a n b l u ea p p l i e df o rs i g n a la m p l i f i c a t i o nw e r ei n t r o d u c e d c a m sh a v ep e r f o r m a n c eo f c h i r a lr e c o g n i t i o n w i t hg o o de l e c t r i c a lc a p a b i l i t ya n dc h e m i c a ls t a b i l i t y 3 d i f f e r e n tn a n o - m a t e r i a l sw e r ee m p l o y e dt ob u i l dt h r e ek i n d so fh y d r o g e np e r o x i d e i 两南大学硕十学位论文 a b s t r a c t 曼鼍n i i m ) m m m j l , 量曼曼寰曼量鼍舅曼曼曼皇曼曼鼍舅 b i o s e n s o r s ，r e s p e c t i v e l y t h em i x t u r ew a sm a d eb yh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h a p ) ，c h i t o s a n ( c s ) a n d n a n o t u b e s 一，d a m so rm w n t s ) ，a n dm o d i f i e do nt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e s ac o m p a r a t i v e s t u d yo ft h r e e k i n d so fh y d r o g e n p e r o x i d eb i o s e n s o r sm o d i f i e db yd i f f e r e n t n a n o t u b e sw a s i n v e s t i g a t e db ye l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e a n dt h ee h i r a lr e c o g n i t i o no fc a m t oh r pw a sa n a l y s e d k e y w o r d s ：c h i r a lr e c o g n i t i o n ；a m i n oa c i d s ；c h i r a lc o m p o s i t e ；e l e c t r o c h e m i s t r y b i o s e n s o r 独创性声明 学位论文题目：至性氢基酸捡建塾速型生堑笾盛墨鲍珏究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中 已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋 友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 ，、- p 学位论文作者： 婀v 舀& 签字日期：f 。年中月弓1 ) 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：融导师签名： 徽缦 签字日期： 川。年￥月2 d 日 签字日期：如，p 年垆月如日 两南大学硕士学俯论文第1 苹 皇曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼! 曼鼍皇曼曼量曼鼍曼量m m mmm lm h i i 鼍皇皇曼曼曼鼍曼曼曼鼍 第l 章绪论 1 1 手性和手性化合物 手性( c h i r a l i t y ) 是自然界的基本属性之一，早在1 8 9 3 年l o r dk e l v i n 就阐明 了手性的定义，即分子或化合物与其镜像不能重合的特性【l i ，就像人们的左、右手 相似却不能重叠的现象，称为手性或手性特征。手性化合物分子中的碳原子与四 个不同的原子或基团相连，空间上呈两种不能重合的镜像对称构型，旋光性和对 映异构现象是判断化合物分子是否具有手性的必要条件，即具有手性的化合物分 子就有旋光性和对映异构现象。 1 2 手性识别 1 2 1 手性识别及其重要性 自然界蕴藏着大量的手性分子，如氨基酸、核酸、蛋白质及多糖等，它们是 构成生命体的基础，这些具有多手性中心的结构单元和具有不对称性质 2 , 3 1 的生物 大分子均由手性单体构成，如构成核甘酸的戊糖都为d 型，构成蛋白质的2 0 种氨 基酸中的1 9 种均为l 型。生物体中分子间的严格手性匹配形成了分子识别基础。 这些手性结构单元在生命活动过程中对内源性的手性生物分子和外源性化学分子 具有立体选择性，当它们与手性的两个对映体作用时仅选择性地与特定手性分子 或化合物结合，这种现象称为手性识别。手性选择功能确保了生物功能分子发生 生化反应的专属性和唯一性以及各种生命活动功能的完成，从而保证了复杂生命 过程的有序性和连续性。 手性及手性识别是生命过程的必然规律，但也产生了严重的手性问题。尽管 对映异构体的物理化学性质几乎完全相同，仅旋光性不同，但它们在生物体内的 药理活性、代谢过程、代谢速率及毒性等存在显著差异。一种构型具有正向生物 效应，相反构型可能有拮抗，甚至致畸、致癌、致突变等毒副作用，如镇静药物 反应停，其s 构型具有镇静作用，而r - 构型却具有致畸性【4 卅。 手性识别研究对化学、生物学、医学和药学等理论与实践都具有重要意义1 5 , 6 】。 近年来，手性分析技术、手性识别理论以及相关科学研究得到了高度重视并迅速 发展，为揭示生命分子的奥妙，寻求更加完善和有效的药物发挥了巨大的作用。 手性科学的研究集中体现在四个方面：( 1 ) 手性药物研究领域，以药物过程中的手 性科学研究为切入点，进行交叉性和综合性研究，通过不对称合成方法学、手性( 药 物) 分子药理学和毒理学的基础研究，深入认识手性科学中的相关问题，如手性的 起源、传递与放大，手性分子与生命体或生物大分子的作用规律，推动合成化学、 药物化学等学科的发展，为生物制药工业尤其手性药物开发、生产提供科学依据。 西南人学硕十学位论文第l 章 ( 2 ) 手性精细化学品研究领域，根据精细化学品手性异构体的性能和用途对其进行 分离分析研究。( 3 ) 生命科学研究领域，研究生物物质的手性与其功能的关系，以 及与其它手性异构体间的相互作用。( 4 ) 手性材料研究领域，研究手性材料的产生 途径和它的特殊性能，研制出具有更多特异功能的新型手性材料，这将为包括手 性传感在内的生物材料科学、信息科学等基础学科的研究发展起到推动作用。 1 2 2 手性识别研究方法概述 目前研究手性识别的方法主要有光谱法，如核磁共振( n m r ) 【7 - 9 、红外光谱 ( 瓜) 【l m l 2 1 、质谱( m s ) f 1 3 1 6 1 、圆二色谱( c d ) t 1 7 1 明等；色谱法，如毛细管电泳( c e ) 、 液相色谱，气相色谱( g c ) 等【2 0 。2 2 1 。这些方法都能实现对分子的识别，但都需要 价格昂贵的仪器设备、苛刻的操作条件、较长的检测时间、难于实现原位和在线 检测，并且光谱法对分析测试样品有极高的要求，色谱法又可能破坏分析样品的 生物活性或由于键和引起污染，因而使研究受到一定的限制。而手性传感器结合 了手性识别和传感器简单、快速、在线和实时等优点，已经受到越来越多研究者 的关注。 1 3 电化学生物传感器概述 生物传感技术已经成为一种发展生物技术必不可少的先进的监控与检测方 法，近年来在理论研究和应用开发方面都取得了巨大的进展，在药物分析、生物 分子水平、环境保护以及生物芯片等研究中有着广泛的应用前景【2 3 2 7 】。半个世纪 以来，随着信息技术的发展，传感技术已从最初的酶电极【2 8 】发展为现今种类众多 的各式生物传感器【2 9 棚】。电化学生物传感器是研究得最早和最广泛的一类生物传 感器，它是以生物活性识别物质为敏感基元，电极为信号转换器，电势、电流或 电容为特征检测信号的一种生物传感器，工作时直接将生化反应产生的信息转化 为电信号，信号采集和处理装置易小型化和集成化，具有制备操作简便，检测灵 敏迅速，能进行原位和在线检测，成本低廉，对环境友善等优点，更具有实际应 用和商业化前景。这种传感器根据传感方式不同，分为电流传感器、电位传感器 和压电传感器，其工作原理是底物与电极上的生物活性物质产生识别，其表达信 息转化为可定量处理的电信号，经二次仪表放大输出，来测定待测物质浓度【5 0 】。 1 4 氨基酸 1 4 1 氨基酸概述 氨基酸是重要的生命物质蛋白质的基本化学单元和重要的生物体系代谢物 质，也是维持机体生长和发育的物质基础，存在于植物、土壤等多种机体中。自 两南大学硕+ 学位论文第1 章 曼皇曼曼曼曼皇曼璺舅舅l lm l _ 。； 一；i i ； - - 皇曼皇曼曼曼曼喜曼毫 然界己经发现的氨基酸有3 0 0 种左右，而构成蛋白的天然氨基酸仅有2 0 种【2 6 1 ，它 们均为三0 【氨基酸( 除甘氨酸) 。除脯氨酸外的这1 9 种氨基酸都具有如下化学结构， 其中r 代表氨基酸的侧链： h r c c o o h i n h 2 图1 1 氨基酸的结构：一般一氨基酸( 左) 和脯氨酸( 右) 属于亚氨基酸 1 8 5 1 年巴斯德( p a s t e u r ) 发现天然氨基酸的溶液具有旋光性后，人们对氨基酸 的构型以及功能开展了长期深入的研究。参照甘油醛构型将氨基酸与之相同的 构型定义为型，相反的定义为d 型。人们对广泛存在的型氨基酸的性质、制 备及应用等已有较详尽的认知，而对仅占自然界己发现氨基酸1 0 左右的口氨基 酸的认识要迟得多。d 和三氨基酸对映异构体除旋光性不同，其它的物理性质几 乎完全相同，但它们的生化和药理功能却差异很大甚至相反。三氨基酸是构成生命 体的基础，而d 氨基酸在生物界中大多存在于某些细胞产生的抗生素及一些植物 的生物碱中。哺乳类动物体内也存在着不参与蛋白质组成的游离d 氨基酸，如存 在于前脑中的d 丝氨酸和存在于脑和外周组织的d 天冬氨酸【5 。近代研究表明虽 然d 氨基酸种类少，但它对研究衰老机制和某些疾病十分重要【5 2 - 5 4 1 ，在生化性质 及功效等方面的显著特性是三氨基酸不可替代的。许多科研学者已将它用于合成 抗生素和生理活性肽的研究，这在医药、食品、农药等方面存在巨大的应用潜能【5 5 】。 1 4 2 氨基酸的等电点 氨基酸分子同时含有氨基和羧基，是一种两性电解质，溶液的酸碱度影响着 其解离方式。在酸性溶液中它与质子( 旷) 结合，形成带正电荷的阳离子( n h 3 + ) ； 碱性溶液中与o h 。结合，失去质子变成带负电荷的阴离子( - c 0 0 3 。当在某一p h 溶液中，其解离成为阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中 性，此时氨基酸达到等电点，其解离如图1 2 。 h h + h h + h r c c 0 0 ；= = = 兰皂r c c 0 0 。= ；= = = 兰生r c c o o h i o h l 0 h 。 i n h 2+ n h 3+ n h 3 图1 - 2 氨基酸的解离 1 4 3 氨基酸的分类 西南大学硕十学位论文 第1 章 根据氨基酸的结构和物化性质，将常见的组成体内蛋白的2 0 种氨基酸分类， 如下表l ： 表1 。氨基酸分类 非极性、疏水性极性、中性 碱性 甘氨酸( g l y ，p i5 9 7 ) h h c c o o 。 i ! i h ： 缬氨酸( v a l ，p l5 9 6 ) h 3 c 一叩一f h c o o c h 3 + n h 3 亮氨酸( l c i l p 1 5 9 8 ) h 2h h 3 c c i h c 一早一c o o c h 3 + n h 3 异亮氨酸( 1 i e ，p l6 0 2 ) h 2 一? h ah h 3 c - - cc h - - c c o o 一 - 一 + i ：| h 3 苯丙氨酸( p h e ，p i5 4 8 ) o 一c o 。， n h 3 脯氨酸( p r o , p l6 3 0 ) 色氨酸( t r p ，p l5 8 9 ) 2 一苎一c o o i ! i h 3 丝氨酸( s c r , p l5 6 8 ) h h o h 2 c 一牟一c o o + n h 3 酪氨酸( t y r , p l5 6 6 ) h 。 泸9 2 - ： _ c o 。， + n h = 半光氨酸( q 悔p i5 0 7 ) h h s h 2 c 一9 一c o o + n h 2 蛋氨酸：m 吒p i5 7 4 ) h h 3 c s h z c h 2 c - - c l - - c o o 。 + n h 3 天冬酰胺( a 蚰，p l5 4 1 ) 氏 h c h 2 c c c o o 。 h 2 n+ h h 3 谷氨酰胺( g i n , p i5 6 5 ) h c c h = c h z c h - - c o o 。 h z n+ n h 3 天冬氨酸( a s p ，p l2 9 7 ) h 2h h o o c c c c o o | ! i h 3 谷氨酸( g l u ，p i3 2 2 ) h h o o c h 2 c h 2 c - - c - - c o o 。 + n h 3 赖氨酸( l y s , p i9 7 4 ) h 2 n h 2 c h z c h 2 c h 2 c c 一 。i c o o + n h = 精氨酸( a r gp l1 0 7 6 ) h n h 2 n c h n h z c h 2 c h 2 c - - c 。c o o + n h = 组氨酸( h i s , p l7 5 9 ) h 2h 届c 1 i 姗。 苏氨酸( t h r , p l5 6 0 ) h o 一罂岂一c o o il c ：4 3 + n h 3 1 5 纳米技术在生物传感器中的应用 由于纳米材料具有表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效 应等基本特性，使其具有优良的光电性质和生物亲和性，在生物分析检测等方面 受到大批研究者的青睐，成为分析化学的研究热点。 4 叮h 芝 酸hti木 氨 争 丙 两南大学硕十学位论文第1 章 皇曼皇曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼蔓曼曼! 量曼曼舅曼皇曼曼曼曼曼舅舅皇曼鼍曼曼皇曼窒皇寰孽鼍曼曼曼鼍- -m m ；i 皇曼皇曼量曼量曼毫舅! 皇曼曼皇皇 纳米材料用作生物固载基质时，能有效保持生物活性、提高反应效率、降低 检测成本，易于实现临床应用，在生物传感、生物医学及药理学等领域具有广阔 的研究前景。随着研究的深入，人们采用掺杂、填充、包覆、共混、接枝等技术， 修饰各种功能基团、集合不同维度的纳米材料、复合有机一无机纳米材料等发展了 传统的纳米材料，使其性能有了更加多样化的发展，可以广泛地应用于敏感分子 固定、信号检测和放大。因此基于纳米技术和手性物质研究设计手性功能纳米材 料复合物，结合生物电化学方法，在生命科学、制药以及材料科学中的应用具有 重要的理论意义和应用前景【5 6 - 5 9 。 1 6 本论文的研究设想与主要工作 本研究论文结合相关手性识别、氨基酸和生物传感器的现有文献，以及实验 室已有的工作基础，开展了手性氨基酸对生物大分子识别的研究。以手性氨基酸 及手性纳米复合材料构建手性表面，作为生物活性识别敏感基元，通过电极修饰 和电极反应，研究手性氨基酸与生物分子间的识别作用，包括以下几部分内容： 一、手性脯氨酸的生物识别研究 脯氨酸对映体分别在处理干净的玻碳电极表面形成三和d 脯氨酸手性膜，以 癌胚抗原抗体为生物模型，三和d 两种手性膜结合癌胚抗体制得修饰电极。对比 研究脯氨酸对映体的手性膜在同一基底上的表面形貌和对生物大分子一抗体的识 别作用；通过修饰电极与癌胚抗原抗体的反应来进一步研究识别的强弱。 二、手性纳米材料对免疫分子识别研究 在羧基化的多壁碳纳米管上接枝精氨酸制得手性纳米复合物。采用电沉积技 术在玻碳电极表面修饰纳米金层，在其上组装普鲁士蓝，利用壳聚糖的分散性和 成膜性，分散手性复合物并成膜于修饰电极上；最后将前列腺特异性抗体分子固 定在手性膜表面，制得前列腺特异性抗体手性纳米复合物普鲁士蓝纳米金修饰 电极。通过免疫反应检测复合材料对免疫蛋白的手性识别。 三、手性纳米材料对酶分子识别研究 将三、d 精氨酸多壁碳纳米管手性纳米复合物和未功能化的多碳壁纳米管分 别与过氧化物酶和壳聚糖混合均匀形成复合物，然后修饰到电沉积了纳米金层的 玻碳电极表面，制得三种过氧化氢电极。对比分析不同电极对过氧化氢的响应， 探讨手性材料对过氧化物酶的手性识别作用。 西南大学硕十学位论文第2 章 第2 章脯氨酸对映体对免疫分子的识别作用 2 1 引言 近年来，氨基酸与蛋白的手性识别作用倍受关注，这对于对映体的分析检测、 生物材料的相容性和药理作用等研究起着重要的推动作用6 0 。6 3 1 。h o f s t e t t e r l 6 4 6 s 】和 孔继烈课题组1 6 9 】曾采用抗体、牛血清蛋白作为手性选择体，应用于电化学识别手 性氨基酸。手性氨基酸是蛋白质的主要组成单位，能够形成手性膜，对生物大分 子有一定的立体选择性1 6 2 刁6 j ，这不仅为制备新型生物材料带来希望，也有助于人 们了解立体选择在药学体系和临床中的作用机理。藉此，我们把手性氨基酸作为 一种材料应用于免疫分析中，以提高对靶分子的选择能力，这在临床诊蝌7 7 , 7 8 l 、 食品工程【7 9 】和环境分析f 8 0 】等方面具有重要的理论意义和应用前景。脯氨酸是生物 体的一种重要单元，上脯氨酸在中枢神经系统中是神经调节器或传递的候选割8 1 l ， 而d 脯氨酸在组织中存在量极少，且被认为是导致肾脏功能错乱的因素之一【8 2 j 。 而且脯氨酸的刚性手性结构使其具有强于其它氨基酸的手性识别作用【8 3 8 6 1 。 研究手性氨基酸的方法有色谱法【8 7 】，核磁共振谱( n m r ) 1 8 踟，分子印迹 ( m i p ) t 8 9 】等等。免疫反应由于具有较高的灵敏度和选择性，是一种研究分子间作用 以及手性识另l j t 6 8 , 6 9 】的简便有效方法。电化学免疫法因灵敏度高，成本低，能量需 求低和相容性高等优点，已成为研究手性识别的一种重要技术 9 0 观j 。 本实验研究了不同构型脯氨酸和口) 在电化学免疫分析中对生物大分子 的手性识别作用，以癌胚抗原( c e a ) ( 一种重要的癌症诱因子凹1 ) 抗体( a n t i c e a ) 为生物分子模型。室温下，使用具有刚性结构的三和d 脯氨酸分别在富含羧、羟 基等含氧基团的玻碳电极表面形成和d 脯氨酸手性分子膜，研究手性膜的表面 形貌差异，以及手性膜结合抗体形成免疫修饰电极在抗原抗体特异性免疫反应中 的手性识别作用。研究中，采用电化学交流阻抗技术( e i s ) 监测脯氨酸手性膜在 电极表面的生长情况：通过原子力显微技术( a f m ) 观测该对映体在相同基体上的 不同形貌、表征界面结构，进行手性识别机理研究；使用循环伏安技术( c v ) 表 征电极修饰过程，测定三与d 脯氨酸癌胚抗体修饰电极对不同浓度癌胚抗原的电 流响应变化。研究表明脯氨酸对映体形成的手性膜对癌胚抗原抗体具有不同的识 别作用，其中d 构型的氨基酸对生物大分子癌胚抗原抗体表现出较强的识别。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂和仪器 6 西南大学硕+ 学位论文第2 章 暑量皇皇i ! i , , i iiii i i 曼量皇曼曼皇曼鼍曼皇曼 三脯氨酸犯) ，d 脯氨酸( d ) ，癌胚抗原抗体( a n t i c e a ，c e a ) ( 上海科华生物试 剂公司) 。其它试剂皆为分析纯。1t o o l l - 1p b s ：o 1t o o l l 。1k c i + 0 1m o l l - 1 磷酸 盐缓冲溶液。实验用水使用二次蒸馏水。 嘭熏划 k ”e 二i 丫l t i 细晒c 队) l v i ； 姜l 漶l 弛 9 5 ，中国科学院成都有机所) ，三和口精氨酸 9 a r g ，9 8 ，成都爱斯特) 。前列腺抗原抗体( a n t i - p s a ，p s a ) 、牛血清蛋白( b s a ， 9 6 9 9 ) ( 郑州博赛生物有限公司) 。氯金酸( h a u c h ) ，碳二亚胺( e d c ) 和n 一羟基 磺酸琥珀酰亚胺( n h s ) ( 美国s i g m a 试剂公司) 。其它试剂均为分析纯。 x s a m 8 0 0 型x 射线光电子能谱仪( x p s ) ( 英国k r a t o s ) 。g e m 1 0 0 c x 透射 电子显微镜( t e m ) ( 日本) 。j a s c o - 2 0 c 圆二色谱仪( c d ) ( 日本) 。其它仪器同2 2 1 。 1 2 叠雪銮耋虿圭耋堡鎏耋耋：耄 322 制备新型纳米复合物 手性复合物( c a m ) 的制各步骤如下：首先，将羧基化的碳纳米管【1 2 2 1 加入 碳二亚胺“0 0r r m m ll 1 ) 溶液中，超声分散。随后加a 一定量的n - 羟基磺酸琥珀 酰亚胺( 2 0 0m m o l 一) ，搅拌反应3h 。离心洗涤活化了的碳纳米管，除去未反应 的e d c 和n h s ；然后将碳纳米管分剐分散在- 和d _ 精氨酸( 6 0m m o ll - 1 ) 溶液 中，进一步反应后洗涤离心除去未反应的厶肛精氨酸5 0 。c 下真空干燥，得黑色 粉末状手性纳米复合物l d - a r g m w n t s 犯d a m s ) 。最后将手性纳米材料分别分 散在0lv e t 生物相容性好、成膜能力强的壳聚耱( c s l 溶液中备用。 323 构建手性界面 把经打磨抛光清洗干净的玻碳电极浸入5m li h a u c l 4 溶液中，控制电位 为02 v 沉积修饰纳米金【i ”】，形成的纳米金膜具有良好的导电性、大的比表面、 强的吸附力等特性删( d p a u g c e s ) 。采用文献方法叫j ，在纳米金上组装普鲁 士蓝c p b ) 形成比机械结台、吸附、包埋、电沉积等更均匀稳定的电子媒介修饰 层旧。1 ”i ( p b d p a u g c e s ) 。然后将和凸碳纳米管的壳聚糖溶液滴涂在普鲁士 蓝表面，空气中干燥形成手性膜界面o i - d a m s p b d p a u g c e s ) ，孩界面形成法 还能有效的防止普鲁士蓝泄据然后置入05m l 的前列腺特异性抗体溶液中于 4 。c 下过夜( 柚n p s d lo r d a m s p b d p a u g c e s ) 。最后用b s a _ e 4 闭非特性吸附， 井将修饰免疫界面( b s a a n t l p s a lo r d a m s p b d p a u g c e ) 置于4 0 c 下备用。 爨。粼 嚼霸鲰、。 ：夕i 嚣 言蟛i 寺，爨 l 。 。一戈= r 圈3 一l 免疫界面修饰过程( 5 表示手性a 甘m w n t s ( c a m s 西南太学硕士学位论文第3 章 324 试验检测 循环伏安扫描从一0 2 到0 6 v ( v ss c 日，扫速为5 0 m vs ，00 1 m o l l - 1p b s ( p h = 7o ) 为测试底液。免疫孵育温度和时间分别为3 7 。c 、2 0 m i n 。检测免疫反应 前后电流的变化。电流变化( 6 ) 根据以下公式计算：，= l o 一，( i o ，稳定的背景 电流值：，抗原抗体反应的电流值) 。 3 3 结果与讨论 3 31 x p s 与t e m 表征 通过x _ 射线光电子能谱实验检测m w n t s ，l a m s 和d a m s 的表面化学信 息如图3 2 。a 是m w n t s 的c l s 和o ls 图，而图b 和c 在4 0 0e v ( n l s ) 位置 出现一新的峰，表明d - 和一精氨酸已成功结合在多壁碳纳米管上。 图3 3 是透射电子显微镜观测到的新复合物的微结构。e 一和d a m s 均为纳米 结构。 _ 百丽面飞1 丽f 百f 11 刁f 飞f 、 弛d h e 噼口州 m 碑e 口哪w 胁m q e 。嘟州 囤3 - 2 不同的纳米管t 拘x p s p n 谱：( 砷( b ) 和( c ) 分别是m w n t s d a m s 和l a m s 的表 面情况 a 线8 j 翩 溪耋 圈3 3l ( a ) 和d a m s ( b ) 的t e m 图 脎 * p 西南大学硕十学位论文 第3 章 !_一 iil一_hal_igl 3 3 2c d 谱图 图3 4 为三和d 纳米材料的圆二色谱光谱图。c o t t o n 效应表明该纳米复合物 的绝对结构呈现出良好的镜面关系，l a m s ( a ) 呈左旋的构型，d a m s ( b ) 呈右旋 的构型。这也表明精氨酸对映体与m w n t s 已结合，并且使纳米材料具有相反的 旋光性，即手性。 差 鼍 蚕| 莹 图3 - 4 l a m s ( a ) 和d a m s ( b ) 的c d 光谱图 3 3 3 电极修饰界面的表征 i ( 心) 2 4 0 、 a置b九 a l ：。! 。以，一 旷m 仨骞 v 2 4 0 - - u z0 00 z0 40 6- o 2o oo 20 40 6 e ( v )e m 图3 5 电极电极修饰过程的表征：( a ) b a r eg c e ；( b ) d p a u g c e ；( c ) p b d p a u g c e ；( d ) d a m s p b d p a u g c e ( a ) ，l a m s p b d p a u g c e ( b ) ；( e ) a n t i - p s a d a m s p b d p a u g c e ( a ) ， a n t i - p s m l a m s p b d p a u g c e ( b ) ；b s a a n t i - p s a d a m s p b d p a u g c e ( a ) ，b s a a n t i p s a l a m s p b d p a u g c e0 3 ) 图3 5 为电化学方法表征前列腺抗体生物界面的修饰过程。玻碳电极和 d p a u g c e 在o 0 1t o o l l dp b s ( p h7 0 ) 工作溶液中( a 和b ) 无氧化还原峰。当 普鲁士蓝修饰在纳米金层表面后呈现出一对良好的氧化还原峰( c ) 。手性纳米材料 的壳聚糖溶液在电极上成膜后，峰电流降低( d ) ，这是由于壳聚糖有电流阻碍效应 1 5 西南大学硕十学传论文 第3 章 曼皇曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼! 皇曼! 曼皇曼曼皇曼鼍曼曼曼毫曼曼曼曼蔓皇鼍i 。1 1 1。i l l i i o 量曼量曼曼苎 的原因。前列腺特异性抗体免疫界面形成( e ) 以及牛血清蛋白封闭后( f ) ，其峰电 流进一步降低。 3 3 4 修饰界面的手性识别检测 手性纳米材料对抗体的识别作用通过抗原抗体反应来检测。m w n t s 、l 和 d a m s 修饰的前列腺特异性免疫界面与不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液反 应并检测，如图3 - 6 所示。c a m s 手性界面在相同的检测范围内有着明显的电流 增强作用，表明精氨酸提高了纳米材料的生物相容性【1 2 1 3 1 ，放大了响应电流信号， 且三和d a m s 修饰电极分别在1 0 l o on g m l 以和1 0 0 1 0 0 0n g m l 以范围内呈良 好的线性响应。其还原峰电流变化值和浓度的线性响应方程及相关系数( r ) 分别 为：y o = 3 7 7 8 x + 1 9 4 6 ( r o = 0 9 8 8 9 ) ，乳2 5 9 8 x + 7 7 7 0 ( r l = 0 9 9 31 ) ；y d = 0 3 4 6 7 x + 6 2 31 ( r d = 0 9 9 31 ) ，y l = 0 2 4 5 8 x + 3 7 6 1 ( = o 9 9 8 0 ) 。其中，d a m s 修 饰的免疫界面比l a m s 修饰的有更好的电流响应，即d a m s 对前列腺特异性抗 体的手性识别强于l a m s 修饰的电极。这可能是由于d a m s 与抗体有着更强的手 性匹配，预示着手性纳米复合材料对提高生物相容性有潜在的意义。 c p s a 、n o 。m l “) a ( n g m l ) 图3 6 不同纳米材料修饰电极对p s a 响应的柱形图( a ) ，线性图0 3 ) d a m s ( a ) ，l a m s ( b ) ， m w n t s ( c ) 前列腺特异性抗体在对映体形成的手性界面上通过静电或氢键结合【9 钔，即这 对对映体的纳米复合物对抗体有着手性识别作用。手性选择加强了抗原抗体的反 应，这种有趣的现象有助于我们研究手性材料，尤其在加强对靶分子的检测( 如 药物) 中的应用，也有助于认识口氨基酸在药理系统和临床检测等方面的重要角 色。 1 6 西南大学硕十学位论文第3 章 3 4 结论 本文研究y h r g m w n t s 纳米复合物在免疫分析中的应用，并用纳米金和普 鲁士蓝放大电流响应信号。实验结果表明三、d 型复合纳米材料具有良好的稳定性 和不同的立体选择性，因而结合前列腺特异性抗体的方式以及结合的量存在差异。 比较l a m 和d a m 修饰结果，d a m 不仅增加了抗体的结合量，有效的保持了 抗体的生物活性，而且增强了电流响应信号。同时，精氨酸以及其它手性分子可 以通过多种方法形成具有特殊功能的纳米材料，用以固定其它生物分子实现对更 多物质的测定。 1 7 两南人学硕十学何论文第4 章 第4 章手性纳米材料对过氧化物酶的手性选择作用 4 1 引言 分子手性识别是生命高选择性的重要生化特性，是构成生命体的基础。大批 研究者对手性及手性识别在生物体机制中的特异机制进行了研究，并在应用于药 物设计和人工移植中取得了