（制糖工程专业论文）核糖核蛋白ssb的分离纯化及elisa检测方法的研究.pdf

摘要 s s b 蛋白与人s s b 蛋白既有高度的同源性，又保持了天然全抗原的生物 活性，因而在临床检测中应用较广泛。获得s s b 蛋白的重要来源是动物组织。 由于动物组织中含量较低，且常与其它蛋白相结合，这就显现出了分离纯化的 必要性，以便达到临床检测所需灵敏度及特异性。 本文根据s s b 蛋白的物理化学性质，采用兔胸腺丙酮粉为原料，采用三 步生化提纯程序( 硫酸铵盐析、d e a es e p h a d e xa 一5 0 阴离子交换层析和 h e p a r i ns e p h a r o s e4 b 亲和层析) 进行了分离纯化工艺的确立。通过这三步层 析，可把细胞中大量杂蛋白除去，从而获得高纯度( 9 8 ) ，高收率( 2 0 ) 的抗原性s s b 蛋白。 在硫酸铵盐析中，斑点免疫印迹法检测抗s s b 抗体特异性表明， 6 0 8 0 段的盐析馏份活性较高；经s d s p a g e 电泳可看出，6 0 8 0 段的 盐析馏份的杂带较少，其中一条色带呈现出宽且浓的特征，而其它色带则很浅 淡。经m a r k e r 分子量比较，该宽且浓的色带分子量为4 7 k d 左右，证明此段 层析对于s s b 蛋白的分离足有效的。 在d e a es e p h a d e xa 5 0 阴离子交换层析中，对离子交换剂的吸附容量及 洗脱分离条件分别进行了优化试验，结果表明：进样蛋白质浓度为2m g m l ， 进样体积为3 8 m l ，进样流速控制在o 5m l m i n ，样品处理液为5 m m o l l p b ( p h 6 5 ) ；用洗脱液为含0 1m o l l 和0 4m o l ln a c l 的5 m m o l lp b ( p h 6 0 1 ，进行二阶段梯度洗脱，洗脱流速为l m l m i n 时对s s b 蛋白的单步收率 最高( 8 7 8 ) 。其洗脱峰中第二峰的s s b 蛋白含量较高，s s b 蛋白的特异性也 较强。经s d s p a g e 电泳分析，其它杂蛋白色带明显比硫酸铵盐析物少。 利用s s b 蛋白与h e p a r i n 生物亲和的特性，进行比阴离子交换更为精细 的纯化。从中摸索出了能获得高收率s s b 蛋白且具有较强抗s s b 抗体活性、 纯度更高的纯化工艺。h e p a r i n 亲和层析实验结果：样品稀释缓冲液为 2 0 m m 0 1 lt r i s h c l ( p h 8 0 1 ；洗脱缓冲液为2 0 m m o l lt r i s h c i ，p h 7 0 ( 含 0 5 5m o l ln a c i ) ：进样浓度： 5 m g m l ；迸样流速：0 5 1 m l m i n ；洗脱 流速：1 2 m l m i n ；收集规格：1 1 5 m l m i n 。由此操作条件可获得抗s s b 抗体特异性较高，纯度达9 8 ，且单步收率为6 0 4 5 ，总收率为2 5 5 1 0 0 。 经免疫学鉴定，完全适合临床上检测的要求。 对纯化后s s b 蛋白的理化性质经间接e l i s a 检测表明，本实验室自制的 s s b 蛋白在下列最佳操作条件下，仍然保持了与病人血清中抗s s b 抗体有着 较强反应活性：一2 0 保存3 个月，在此低温下可反复冻融5 次；4 条件下 华南理工大学硕士学位论文 可保存2 个月：在3 7 条件下可保持2 0 h ；在5 6 加热1 h 后，则s s b 蛋白 完全失活。在p h 6 7 之间s s b 蛋白生物活性较高。s s b 蛋白对胰蛋白酶特别 敏感。 为了将自制s s b 蛋白应用于临床检测，本文在实验室建立了检测抗s s b 抗体血清的问接e l i s a 方法。经方阵实验表明，自制s s b 蛋白包被浓度适宜 量为5 , u g m l ：阳性血清稀释度为1 ：1 0 0 ；酶标抗体稀释度为1 ：4 0 0 0 。封闭 液采用5 新鲜小牛血清与5 b s a 混合物；实验室临界值( c u t o f f ) 为 o 4 2 1 。将自制s s b 蛋白与商用s s b 蛋白包被酶标板的e l i s a 检测以及间接 e l i s a 法和w b t 法进行对比，结果均表明：自制s s b 蛋白包被酶标板建立的 e l i s a 法检测的敏感性及特异性比商用s s b 蛋白包被的e l i s a 法检测和 w b t 法检测强，适合临床诊断应用。 关键词：分离纯化：e l i s a ；e n a ；干燥综合征；s s b i l a b s t r a c t s s b p r o t e i nh a sh i g hi d e n t i t yw i t hh u m a n s s b p r o t e i n i ta l s om a i n t a i n sh i g ha c t i v i t yo f n a t u r a l l yi n t e g r i t ya n t i g e n s oi ti sw i d e l ya p p l i e dt oc l i n i ca s s a y s s bp r o t e i nm a i n l y e x t r a c t e df r o ma n i m a it i s s u e s s s bp r o t e i n sc o n t e n ti nc e l l si sv e r yi o wa n do f t e na s s o c i a t e d w i t ho t h e r p r o t e i n s ，s o i ti si n d i s p e n s a b l et oi s o l a t ea n d p u r i f ys s bp r o t e i nf r o ma n i m a l t i s s u e sf o ro b t a i n i n gt h er e q u i r e m e n to f s e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yi nc l i n i cd i a g n o s i s a c c o r d i n g t ot h e p h y s i c a la n d c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fs s b p r o t e i n ，w ep u r i f i e ds s b p r o t e i nf r o m r a b b i tt h y m u sa c e t o n ep o w e r b y t h r e es t e p sb i o c h e m i c a l p r o c e d u r e s t h e y a r e a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n 、d e a e s e p h a d e x a - 5 0i o ne x c h a n g c h r o m a t o g r a p h y a n d h e p a r i ns e p h a r o s e 4 b a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y al a r g en u m b e r o fo t h e r p r o t e i n si nc e l l sw e r e r e m o v e da f t e rt h r e es t e p sp r o c e d u r e s ，m o r e o v e rh i g l lp u r i f i c a t i o na n dy i e l do fn a t u r a li n t e g r i t y a n t i g e nw e r ea c h i e v e d w eh a v e b u i l tu p p u r o f i c a t i o nt e c h n i c so f t h r e es t e p sp r o c e d u r e si n o r d e rt oa t t a i ns p e c i f i c i t y 、p u r i f i c a t i o na n d y i e l do f s s b p r o t e i nf r o mr a b b i tt h y m u sa c e t o n e p o w e r t h e a n t i g e n i ca c t i v i t yo f s s b p r o t e i ne x t r a c t e du s i n g a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n w a sd e t e c t e db yd o t t e db l o t s t h er e s u l t sd e s c r i b e dt h a tt h e p r e c i p i t a t ef r a c t i o nb e t w e e n 6 0 a n d8 0 o fs a t u r a t i o nh a v eh i 曲e s t a c t i v i t y t h ep r e c i p i t a t ef r a c t i o nb e t w e e n 6 0 a n d8 0 o f s a t u r a t i o nw e r ed e t e c t e db ys d s - p a g e e l e c t r o p h o r e s e d ，i t i sa p p e a rt oh a v ef e wo t h e r s t r i p s a n dm a i n s t r i pt a k eo n aw i d e c h a r a c t e r i s i t y h o w e v e r o t h e r sa r ew e a k t h em a i n s t r i p s m o l e c u l a r w e i g h ti sa b o u t4 7 k db yc o m p a r i n g w i t hm a r k e r p r o t e i n i ti se v i d e n c et h a tt h e a c t i o no fa m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o ni se f f e c t i v ei s o l a t i o nm e a n s w eh a v ep e r f o r m e df a r t h e rp u r i f i c a t i o nb yd e a e s e p h a d e xa 一5 0i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h ya n d t a k eo p t i m u m o p e r a t i n g c o n d i t i o ne x p e r i m e n t a t i o nf o rs a t u r a t i o n a d s o r p t i o nv o l u m n a n de l u t i o nc o n d i t i o n t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ：t h es a m p l e c o n c e n t r a t i o n ：2 m g m l ；v o l u m eo fs a m p l i n g ：3 8 m l ；s a m p l i n g r a t e ：o 5 m l m i n ；s a m p l e b u f f e r ：5 m m o i l p b ( p h 6 5 ) ；e l u t i o nb u f f e r ：5 m m o l lp b ，p h 6 0 ( c o n t e n to i m o l l a n d 0 4 m o l ln a c l ) ，t a k et w os t e p sm e a n st oe l u t e w h e nt h er a t eo fe l u t i o nj s1m i m i n ，t o t a 】 p r o t e i ny i e l di sh i g h e s t ( a t t a i n8 7 8 ) ；s e c o n d a r ye l u t i o np e a k c o n t e n tm o r es s b p r o t e i na n d i t sa c t i v i t ys t r o n g e r s e c o n d a r ye l u t i o n p e a k c o n t e n tl e s so t h e r p r o t e i nt h a nf r a c t i o no f a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o nb ys d s - p a g e e l e c t r o p h o r e s e da n a l y s e a c c o r d i n g t ot h ec h a r a c t e r i s t i c so fs s b p r o t e i nb o u n dh e p a r i n ，w e h a v e p e r f o r m e d m o r er e f i n e dp u r i f i c a t i o na n d e x p l o r e dp u r i f i c a t i o nt e c h n i c so fo b t a i n i n g t h ep r o d u c to f h i g h y i e l d 、a c t i v i t ya n dp u r i f i c a t i o n t h ee x p e r i m e n t r e s u l t so f h e p a r i na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 1 1 1 兰妻翌三奎兰丝圭耋竺兰兰 a r ea sf o l l o w s ：t h e s a m p l eb u f f e r ：2 0 m m o l l t r i s h c i ，p h 8 0 ；e l u t i o nb u f f e r ：2 0 m m o l l t r i s 。h c i ，p h 7 0 ( c o n t e n t0 5 5 m o l l n a c i ) ；t h ec o n c e n t r a t i o no f s a m p l e ： 5 m g m l ；t h e r a t eo f s a m p l i n g ：0 5 一l m l m i n ；r a t eo fe l u t i o n ：1 - 2 m i d m i n ；s t a n d a r do fc o l l e c t ：1 - 1 5 m l t u b e w ec a no b t a i n h i 曲p u r i f i c a t i o n ( 9 8 ) 、s p e c i f i c i t ya n dy i e l d ( s i n g l ey i e l d ：6 0 4 5 ， t o t a ly i e l d ：2 5 5 m g 1 0 0 m g ) o f s s b p r o t e i no n o u r o p e r a t i o n c o n d i t i o n s t h ea i mp r o t e i n c a nr e a c ht h er e q u i r e m e n to fc l i n i ca s s a y b yi m m u n i t yi d e n t i f y t h e p h y s i c a la n d c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fs s b p r o t e i np u r i f i e db y o u r s e l v e sw e r e s c r e e n e db ye l i s a w a y t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h eo p t i m u m o p e r a t i n gc o n d i t i o n st h a tm a i n t a i n s s b p r o t e i nh i 曲l yb i o l o g i ca c t i v i t yo fa n t i - s s ba u t o a n t i b o d yi np a t i e n t s 7 s e r a t h eb e s t o p e r a t i n g c o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：s s b p r o t e i nc a l lb e r e s e r v e df o r3m o n t h s f r o z e t h a w n 5t i m e sa t 2 0 ；i tc a nb er e s e r v e df o r2m o n t h sa t4 。c ；i tc a nb er e s e r v e df o r2 0h o u r sa t3 7 ：i th a s n 。ta n t i - s s ba n t i b o d y b i o l o g i ca c t i v i t yw h e n i ti sr e s e r v e df o r1h o u ra t5 6 。c ；s s b p r o t e i nh a sh i g hs t a b i l i t ya tt h e c o n d i t i o no fp h 6 - 7 ；s s b p r o t e i ni sv e r y s e n s i t i v et ot r y p s i n w eh a db u i l tu pi n d i r e c te l i s a w a y o f c h e c k i n g a n t i - s s ba n t i b o d ya tt h ec o n d i t i o no f e x p e r i m e n t i no r d e rt oa p p l yt oc l i n i ca s s a y p h a l a n xe x p e r i m e n tm a k et h er e s u l t sc l e a r ： c o n c e n t r a t i o no fs s b p r o t e i np u r i f i e dc o a t e de l i s ap l a t e si s5 # g , m l ；d i l u t i o no fp o s i t i v e s e r ai s1 ：1 0 0 ；d i l u t i o no fh r p - s a h i g gi s1 ：4 0 0 0 ；b l o c ks o l u t i o ni sm i x ( 5 c a l fs e r u ma n d 5 b s a ) ；c u t o f f v a l u eo fl a b o r a t o r yi s0 4 2 1 t h er e s u l t so f c o m p a r i n g m a d e s s bp r o t e i n w i t ht r a d e s s bp r o t e i nb y c o a t i n ge l i s ap l a t e sa n dc o m p a r i n g i n d i r e c te l i s a w a y w i t h w e s t e r nb l o tw a yi n d i c a t e dt h a tt h ei n d i r e c te l i s a w a y b u i l tu p b ym a d e s s b p r o t e i nc o a t e d e l i s a p l a t e si sm o r e s e n s i t i v ea n d s p e c i f i ct oa n t i s s ba n t i b o d ye x a m i n e ，s o i ti sa d a p t e dt o t h ea p p l i c a t i o no fc l i n i cd i a g n o s i s k e y w a r d s ：i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ；e x t r a c t a b l e n u c l e a r a n t i g e n ；s j o g r e n ss y d r o m e ；s j o g r e n ss y d r o m e b t y p e i v 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：、a 安矧i 日期：泸# 年占月，f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密哪 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：、匀支烈e l 期：p 。埤6 月r 妇 刷谧锄p 寥醐：衅钥钼 第一章绪论 第一章绪论 可提取性核抗原( e x t r a c t a b l en u c l e a ra n t i g e n s ，e n a ) 是哺乳动物细胞核的 生理盐水抽提物。它包括多种核抗原成分。这些核抗原均由小分子r n a 与核蛋 白构成，其抗原性在蛋白质部分。其中仅有少数几种被鉴定，如s m 、r n p 、 s s b l a 、s s a r o 、s c l 7 0 等。系统性自身免疫疾病( 如干燥综合症( s s ) 、系统红 斑狼疮( s l e l 、新生儿狼疮综合症( n l e ) 、类风湿关节炎( r a ) 、亚急性皮肤型红 斑狼疮( s c l e ) 患者) 的血清中有多种核蛋白复合物( r n p ) 的自身抗体，虽然其 在发病机制中的作用尚不清楚，但在一定的疾病中有一定特异性自身抗体1 2 】。这 些自身免疫疾病的抗原抗体相互作用，有助于进一步研究系统性自身免疫疾病的 发病机制和病理作用，为临床上检测这些疾病的研究提供理论依据。临床上抗 e n a 抗体的检测对系统性自身免疫疾病的鉴别、诊断和治疗都有重要作用。 1 1s s b 蛋白的研究现状 从分子水平上识别细胞核内e n a 是近十余年来a n a 研究主要进展之一。 s s b 蛋白分子性质与结构特点的研究成果，为其结构功能及其临床鉴别、诊断和 治疗的进一步研究打下了基础。 1 1 1 s s b 蛋白的结构 1 9 6 1 年，a n d e r s o n 等人在干燥综合症f s s l 病人血清中鉴定出两种免疫学性 质不同的抗体，分别称为s i t 和s j d 抗体。后来r e i h l i n 等在s l e 病人的血清中 亦发现了类似的两种抗体，分别命名为r o 和l a h a 抗体。1 9 7 5 年a l s p a n g h 和t a n 等人以w i l 一2 细胞提取e n a 抗原，对s s 病人血清中这两种新抗体的活性 进行了研究，并称此两种抗体为s s a 抗体和s s b 抗体。国际有关实验室经血清 交换，在1 9 7 9 年最后确认s s a 实际就是r o ，而s s b 实际就是l a h a p ，4 j j 。 s s b 蛋白与一系列由核苷酸组成的小分子r n a 结合，同时可能与其它一些 自身蛋白如s s a 等相连接【6 ，”，形成较大的r n p 颗粒( 即为s s 蛋白) ，引起自身 免疫反应，产生自身抗体。组成s s b 抗原的r n a 是r n a 多聚酶i i i 的转录物。 组成s s b 抗原的蛋白质不仅能与r n a 聚合酶i i i 转录的r n a 结合，并参与这些 r n a 的成熟【8 】，还能与腺病毒、e b 病毒相关的r n a 结合。s s b 蛋白与u l 小细 胞核r n a 、r n a 多聚酶i i i 转录子相关联【9 , 1 0 1 ，与r n a 末端尿嘧啶残基结合影响 r n a 多聚酶i i i 转录的终止。s s b 抗原通过富含尿苷的3 端与s n r n a 连接，且 在紫光作用下与r n a 起交联作用。s s b 蛋白在3 端有一个u u u o n 的p o l “u ) 华南理工大学硕士学位论文 分子结构【“，1 2 】( 图1 - 1 ) ，从而构成s s b 蛋白一个高度亲和结合位点【13 l 。目前引 人注目的研究是自身免疫反应分子内和分子间 移动、逆转录病毒蛋白与s s b 核蛋白的关系。 已克隆获得的s s b 基因，在体外培养中得 到了表达，从蕴含着重要信息的蛋白质的基因 和氨基酸序列中，利用序列分析软件进行序列 分析与比较，结果表明s s b 蛋白与自身免疫应 答有着强烈的联系。从人c d n a 文库中获得的 s s bc d n a 克隆包括了1 6 3 1 个碱基，开放阅读 框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 含1 2 2 4 个碱 基，5 端a u g 是核糖体转运起始部位，编 码4 0 8 个氨基酸，分子量为4 6 7 8 4 k d l l 4 l 。其 中有两个主要的功能区x 和y ，每个区都含有 抗原决定簇。x 功能区相对分子量为2 8 2 9 k d ， 与r n a37 端寡尿嘧啶核苷酸尾部相连，是甲 硫氨基酸富含区，与r n a 结合功能有关；y 功能 区相对分子量为2 3 2 4 k d ，是磷酸氨基酸富含区， 其中3 6 6 位丝氨酸是磷酸化位点【”】。根据s s b 蛋 盯r 一、 乞一 c 掌 ? 岛 ：暑： ：s ： j 含： u ： c f u c c ： 鲁：； ，蠢；l c w w f o ，o “”表示基因内启动子区域 “一”表示s s b 蛋白结台位点 图1 - 1s s b 蛋白结合位点图【“1 f i g 1 - 1c o n j u n c ts i t eo f s s bp r o t e i n 白的亲水性分析，氨基酸残基8 0 1 1 0 位、1 9 0 2 1 0 位、3 6 9 - 3 7 5 位、3 9 0 4 2 0 位，还可能包括3 2 0 3 4 0 位为s s b 蛋白亲水性较强的区域，在1 9 0 2 1 0 位两侧 分别有一段疏水性区域【i “。 人s s b 蛋白的二级结构：s s b 蛋白4 0 是负电荷氨基酸。亲水性蛋白酶将 s s b 蛋白分解为x 和y 功能区，分别有2 2 4 个、2 2 8 个氨基酸，对应分子量为 2 8 2 9 k d 、2 3 2 4 k d ! ”1 。s s b 蛋白二级结构主要是o 螺旋，o 螺旋依靠共价键、 盐键和范得华力作用而维系【1 3 l 。序列分析表明，s s b 蛋白与肌浆球蛋白重链相 似i ”j 。根据o 螺旋折叠将s s b 蛋白分为三个大约相等部分即l a a 、l a c 和 l a d ，其中c 端2 3 大片段是l a b 。s s b 蛋白中心区域由长o 螺旋构成( 见图1 - 2 1 ，c 端包括2 个a t p 结合位点和3 个p e s t 蛋白敏感区【”j 。s s b 蛋白无折叠结 构( 见图1 3 ) 可分区为：l a a ( 1 - 1 0 7 位) ，l a b ( 1 1 1 - 4 0 8 位) ，l a c ( 1 1 1 - 2 4 2 位) ， l a d ( 2 4 3 4 0 8 位1 ，l a f ( 2 4 3 3 4 5 位) ，l a l 2 3 ( 3 4 6 4 0 8 位) 。其中l a a 、 l a c 、l a d 是三个独立的片段，无重叠。在氨基酸2 1 6 2 2 9 位之间含有许多酸 性、碱性氨基酸，易被蛋白酶酶解【1 6 1 。人和鼠含l a a 表位的氨基末端区域是高 度封闭的。人特异性表位位于c o o h 末端开放的区域，这也暗示l a l 2 3 表位结 构产生自身免疫抗体。r n p 识别序列位于1 5 0 - 1 6 0 位氨基酸间。 2 p r o t e a s e - s e n s l t i v e met。hionine*90nt_a_iningrn c o r c o n s e n s u s 蛔s e g u 蝗6 照n c o e 等唑唑坐盟蝴“ d n 露扣任孓啦嚣h 鹜卜咽甓直釜墨图图圜e s 日_ 日醛c 一 1 0 c b 鉴跚。麝i i x ”。”4”。”。 o n o n h e l i c a lb a c k b o n ee - c l u s t e r so fb a s i cr e s i d u e s 图1 - 2 人s s b 二级结构序列【2 0 l f i g 1 2s e c o n d a r ys t r u c t u r es e q u e n c eo fh u m a ns s b 1 - 一1 0 1 1 4 t _ _ _ _ 2 4 2 “ “ _ 1 - _ _ _ _ 1 0 7 1 1 1 - _ _ _ _ _ _ 1 2 4 2 “”“_ “”1 ” m m t - u u n 图1 3s s b 蛋白无折叠结构域【圳 f i g 1 3 u n f o l d e ds t r u c t u r ed o m a i no fs s b p r o t e i n 人s s b 基因的结构特征f 2 0 t 2 1 】：s s b 上游区9 0 b p 包括3 个转录调节元件( 见 图1 4 1 ： c c a a t 盒：位于1 3 5 b p 处，与多种亚单位蛋白结合： g c 盒：位于 1 0 b p 处；g c 重复区：位于3 0 4 6 b p 处，与其它启动予一样不含t a t a 序列， 具有管家基因特征。s s b 上游区是h r a s 原癌基因相似区。s s b 基因包括1 1 个外 显子，r n p 识别区位于4 4 7 4 7 7 b p 间。 鼠s s b 蛋白的结构：从鼠巨噬细胞c d n a 文库中获得s s bc d n a 克隆， 结果o r f 包括1 2 4 5 b p ，转录起始位置是a n n a u g g ，5 端和3 - 端调控区 分别由1 4 7 b p 和5 9 0 b p 组成【2 2 1 。鼠s s b 蛋白包括4 1 5 个氨基酸，相对分子量4 7 7k d ，c 端第3 3 2 3 4 8 位氨基酸之间具有种属特异性，大约6 5 氨基酸与人同 源【2 。鼠r n p i ( 1 5 1 - 1 5 9 位氨基酸) 和r n p 2 ( 1 1 2 1 1 8 位氨基酸) 是保守性表位， 鼠s s b 蛋白第1 5 6 位氨基酸由颉氨酸变为丙氨酸，具有a t p 酶功能【2 4 2 5 】。从牛 垂体、g t l l 文库中获得s s bc d n a 克隆，牛e d n a 包括2 4 2 3 b p ，编码4 0 4 个氨 基酸，相对分子量4 6 7 8 k d 。5 端调控区约3 0 0 b p ，3 端调控区约9 0 0 b p ， 包括两组p o l y ( a ) 。 1 1 2s s b 蛋白的表位识别 原发型干燥综合征( p r i m a r ys j o g r e n ss y n d r o m ，p s s ) 特点是高滴度i g g 型 s s b 自身抗体与重组s s b 蛋白有多个表位位点结合f 2 6 1 。 3 华南理工大学硕士学位论文 ：竹c a g a - c t a c t a c a c a c 矗赫； = t c t t t 矗赫琵磊期。强 。， t 。， 。肿从 亡c 矗 g c c c “t g 从t 丽磊志，p 面丽盎c g g 缸 c g c c s t c c 6 w c 订 a t 坼 c t c c m 埘c 描c c 髓c c c 卜1 3 0 )( 1 1o ) ：7 3 。 c c 6 强6 2 1 。2 7 啊 嚯至甄事t 6 ：嚣g g “t t 哐亘翌至三q r c c g g g t ， 7 0 ) c c c t g g g g c c c c g g “e c 6 c j “t g c 7 c a g i o c a c a g g 垃c g c = c c c c c g ? c ：g 最? 烹赢譬曼 1 7 + ( 1 三= 譬2 = 三= 皂：暨“c g c g 幻c t g c c g g g i c g g t c c c ：如c t t c t t g 6 g c g c t 竹 ； 6 c ：g c c g g c 凹t 砧7 c g t c f t 黜删t g 船c g 喇c g c g n u w a s p “l ”表示转录起始位点；“一”及“口”表示o c 富含区；“一一”表 示对称区域；“一”表示重复序列；。 图1 - 4 人s s b 基因上游区序列及m r n a 起始位点【1 9 】 f i g 1 - 4a n a l y s i s o ft h em r n as t a r ts i t ea n d u p s t r e a ms e q u e n c e s o f h u m a ns s bg e n e 1 1 2 1 免疫优势表位蛋白质作为b 细胞抗原所暴露的部位取决于蛋白质的 性质和宿主因素，s s b 抗原优势表位与其亲水性位点有差异，其间还涉及抗原、 抗体的其它因素( 如三级结构，翻译后修饰，r n a 结合等) 。s s b 分子的抗原位点 和r n a 结合区位于高度螺旋化和带阳性电荷的区域，至少存在3 个分离的自身免 疫表位。影响免疫反应性的因素有患者血清来源的数量及种属差异、所用技术方 法的不同( 如表达系统、检测方法、抗原制备过程的差异) 、不同抗原位点的竞争 抑制性不同、以及抗原位点、三维结构的确定等。 m c n e i l a g e 等【2 7 l 应用重组s s b 多肽和6 6 份抗s s b 抗体阳性血清反应，结 果9 9 阳性血清与s s b 多肽反应，9 1 阳性血清与l a c 、l a l 2 3 反应。 t z i o u f a s 等【2 8 l 通过化学方法合成了s s b 蛋白的1 4 7h k a f k g s i1 5 4 和3 4 9 g s g k g k v g k k t k f3 6 4 的活性片段。 抗体的灵敏度及特异性分别为9 3 6 和 这些具有活性位点的多肽在检测抗s s b 8 5 6 。b i n i 等 2 9 l 应用免疫印迹法分析 1 3 种重组s s b 蛋白，结果b x 和b a ( 至少7 0 血清识别) 分别位于n 端s s b ( 1 1 0 7 位氨基酸) 和l a l 2 3 ( 3 4 6 4 0 8 位氨基酸) 。进一步研究表明，不同疾病抗 s s b 抗体识别的抗原性多肽具有相似性，免疫优势多肽间抗体的反应显著相关 f r = 0 6 8 ，p o 0 1 ) 。g o r d o n 等1 3 0 l 应用e l i s a 法检测l a a ( 1 1 0 7 位氨基酸) ， l a c ( 1 1 1 2 4 2 位氨基酸) 和l a l 2 3 免疫优势表位抗体，结果免疫优势抗体与i g g 及高y 球蛋自有关，支持了s s b 抗体“抗原驱动”机制。g o r d o n 等人进一步将 4 第一章绪论 抗s s b 抗体阳性血清分为沉淀线阳性和沉淀线阴性两组。结果1 8 例沉淀阴性 中，8 例( 4 0 ) 与全长l a ( l a 3 3 3 ) 反应；5 例( 2 8 ) 与l a a 、l a 3 3 3 反应；4 例 ( 2 2 ) 与l a a 、l a c 反应：1 例与l a a 、l a 3 3 3 、l a c 反应；相反沉淀线阳性血 清全部与l a a 、l a 3 3 3 、l a c 反应，9 2 与l a 2 3 反应。沉淀线阴性血清r f 和 l g g 显著减少。提示沉淀线免疫优势表位识别可能代表s s b 早期自身抗体反应。 1 1 2 2 保守性表位 r n a 识别区( r r m ，1 1 2 1 8 7 位氨基酸1 位于免疫优势表 位l a c f l l l 2 4 2 位氨基酸1 之间。r r m 及其邻近区域与小r n a3 端尿嘧啶结合 形成核糖核蛋白复合体。早期免疫识别位于保守n 端( l a a ) ，晚期免疫识别位于非 保守c 端( l a l 2 3 ) 。c h a n 等( 3 i j 证实了人s s b 蛋白特异性表位位于保守r n a 识 别区和非保守c 端。人s s b 自身抗体与保守性表位反应( l a a 、r r m 、 l a 2 3 ) 。 1 1 3s s b 蛋白的理化性质及生物学功能 1 1 3 1s s b 蛋白的理化性质s s b 蛋白是干燥综合征b 型磷蛋白【”j ，主要存 在于细胞核内，小部分存在于细胞质中。其在细胞质内的主要作用是转运 m r n a ，在细胞核内与t r n a 的转录物结合【3 0 】。分子量范围为4 5 5 0 k d ；p i 为 4 5 ：它具有抵抗r n a 酶的作用；对胰蛋白酶和热较敏感。经胰蛋白酶消化后的 降解物为2 9 k d 无活性的蛋白质。经亲和纯化的s s b 蛋白由于纯度较高不易被降 解。s s b 蛋白特异性表明，4 5 k d 多肽能与9 8 抗s s b 抗体人血清反应，但不 与抗s s a 抗体、抗s m r n p 抗体等其它自身抗体发生交叉反应。s s b 蛋白具有 异质性0 3 1 。 11 3 2 抗8 8 b 抗体与遗传自身抗体的产生是一个复杂的过程，现在多数学者认 为，h l a 的某些等位基因并不决定疾病易感性，而是通过影响患者自身抗体的产 生以及在疾病的分型及预后中起重要作用【3 4 1 。s s a 和s s b 抗原抗体系统能与由 蛋白质和r n a 复合物形成的细胞内微粒发生自身免疫反应。抗s s b 抗体通常与 抗s s a 抗体同时出现，是s s 和n l e 的重要标记物。与d r 3 、d q l d q 2 位点杂 合子相关。对所有相关等位基因核苷酸顺序进行分析可发现，所有抗s s b 抗体阳 性者的d q a l 链第功能区3 4 位为谷氨酸残基，d q b l 链2 6 位为亮氨酸残基， 即“共有表位”，抗s s a + s s b 阳性者的d q a l 和d q b l 链可能有4 个这种氨基 酸残基，这表明这些残基可位于h l ad q a l 和d q b l 双链分子抗原结合裂隙 的底部，并进一步提示“基因剂量”效应在自身抗体反应中的作用 3 5 1 。 国外研究表明 3 6 , 3 7 】：h l a 与抗s s a s s b 抗体的关联跨越了种族界限。与抗 s s a s s b 抗体相关联的h l a 】i 类等位基因为：d q a l + 0 5 0 1 ，d q a l 4 0 1 0 1 、 5 华南理工大学硕士学位论文 0 1 0 4 ，d q a l 0 4 0 2 ，d q b l 4 0