（遗传学专业论文）大花红景天酪氧酸脱羧酶基因的克隆与功能分析.pdf

i n ， ， q 独创性声明 f | i i r l i j f i ii l l l1 1 1 111 i i y 1 8 814 8 7 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：签字日期：年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘j 允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：面不保密， 口保密期限至年月止) 学位黻储始壹瓣叶导师张掰 签字日期：1 1 年6 月1 日签字日期：7 以，年月；日 f j - 1 。， 曩 目录 摘要i a b s t ra c t i i i 略词表v 第l 章文献综述1 1 1 植物次生代谢的基因工程1 1 1 1 关键酶基因或基因抑制l 1 1 2 转录因子2 1 2 红景天属植物研究进展2 1 2 1 红景天生物活性成分2 1 2 2 红景天药理作用- 3 1 2 3 红景天产品的开发应用， 1 3 红景天苷生物合成研究进展4 1 3 1 红景天苷生物合成途径探讨4 1 3 2 酪氨酸脱羧酶的研究进展5 第2 章绪论7 2 1 研究的目的与意义7 2 2 研究的范围与内容7 2 3 技术路线：8 第3 章大花红景天酪氨酸脱羧酶基因的克隆与功能分析9 3 1 实验材料及试剂耗材9 3 1 1 植物材料9 3 1 2 菌株和质粒9 3 1 3 仪器和设备9 3 1 4 购买的试剂盒及试剂9 3 1 5 常规试剂配制1 0 3 1 6 主要培养基的配方l o 3 2 常规实验方法与操作步骤介绍1 l 3 2 1 目的条带的回收l l 3 2 2 连接反应1 2 、 3 2 3 大肠杆菌d h 5 0 r o s e t t a 感受态细胞的制备( c a c l 2 法) 1 2 3 2 4 连接产物或重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞1 3 3 2 5 质粒的提取1 3 3 2 6 重组子的鉴定、测序1 4 3 3r c t y d c 的克隆与分析。1 4 3 3 1 大花红景天总r n a 的提取与检测1 4 3 3 2 从大花红景天总r n a 合成第一链e d n a 1 5 3 3 3 目的基因的克隆1 5 3 3 4r c t y d c 基因的生物信息学分析2 l 3 3 5r c t y d c 基因的原核表达及功能验证2 1 3 4 植物表达载体的构建2 5 3 5 植物表达载体对农杆菌的转化2 5 3 6 大花红景天再生技术的建立2 6 第4 章结果与讨论2 7 4 1r c t y d c 基因全长c d n a 的获得2 7 4 2r c t y d c 基因的生物信息学分析。2 8 4 2 1r c t y d c 基因的序列分析2 8 4 2 2r c t y d c 与其他物种的酪氨酸脱羧酶氨基酸序列的多重比对。2 9 4 2 3r c t y d c 分子进化树的构建。3 1 4 2 4r c t y d c 蛋白的保守结构域分析3 1 4 2 5r c t y d c 蛋白亲疏水性预测。3 2 4 2 6r c t y d c 蛋白二级结构预测3 2 4 2 7r c t y d c 蛋白三位级结构预测。3 3 4 3r c n d c 基因的原核表达及功能验证。3 4 4 3 1r c t y d c 基因原核表达载体的构建3 4 4 3 2r c t y d c 重组蛋白的少量诱导表达。3 5 4 3 3r c t y d c 重组蛋白的大量表达、提取及复性3 6 4 3 4r c t y d c 重组蛋白含量测定。3 7 4 3 5r c t y d c 重组蛋白活性检测3 7 4 4 植物表达载体的构建及工程菌的获得。3 8 4 5 大花愈伤诱导及再生技术的建立3 9 第5 章结论与展望。4 1 参考文献4 3 j g 【谢z 1 7 参 嚼 ， 、 摘要 大花红景天酪氨酸脱羧酶基因的克隆与 功能分析 遗传学专业硕士研究生彭静叶 指导教师廖志华教授 兰小中副教授 ( 摘要) ， 红景天苷是从红景天( r h o d i o l ar o s e al ：) 中提取的一种糖苷( 又称配糖体或甙) ，是由 尿苷二磷酸葡萄糖的半缩醛羟基与另一非糖物质酪醇中的羟基以缩醛键( 甙键) 脱水 缩合而成的环状缩醛衍生物。水解后能生成糖与非糖化合物，非糖部分称为甙元 ( a g l y c o n e ) ，酪醇属于酚类化合物。红景天苷具有抗衰老、增强免疫力、保护心血管、 抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等作用。但天然药源植物红景天中红景天苷含量较低( 0 5 * 0 - - 4 1 ， d w ) ，大大限制了商业化的生产，红景天苷的产量远远不能满足市场的需求。化学合成红景 天苷成本高、回收率低，且国内外报道的化学合成红景天苷的方法相对来说没有从天然红景 天植物中提取的多。近年来，随着红景天生物合成途径相关酶基因的克隆，基因工程方法成 为提高红景天苷含量的有效途径之一。本研究在前人研究的基础上，采用r a c e 技术，以西 藏大花红景天为研究材料，克隆获得了红景天苷生物合成途径中的关键酶酪氨酸脱羧酶基因 ( 乃d c ) ，并对其做了相应的生物信息学分析和功能验证。 t y d c 催化酪氨酸转化生成酪胺( 对羟基苯乙胺) ，是红景天苷生物合成途径中必需的一 个酶。本研究基于r a c e 技术的同源性克隆方法，获得了r c t y d c 基因全长c d n a ，为1 6 5 7 b p ，r c t y d c 编码区长为1 4 7 3b p ，编码长4 9 0 个氨基酸的蛋白质，还包含一段长为7 9b p 的 5 - u t r 和1 0 5b p 的3 - u t r ，p o l y a 长度为1 3b p ，预测分子量大小为5 4 6k d a ，预测等电点 为5 5 5 。 对r c t y d c 编码的氨基酸序列进行生物信息学分析，结果表明r e t y d c 与来源于其他植 物的t y d c 同源性高达4 5 - - 5 1 ，且具有典型的t y d c 催化活性域。在分子发育进化树上， r c t y d c 与来源于植物、藻类、细菌、古细菌的t y d c s 在发育进化树上聚为4 支，r c t y d c 与来源于植物玉米、水稻的t y d c 亲缘关系较接近，同属于植物这一分支。跨膜区分析表明， r c t y d c 整个氨基酸序列均不存在跨膜区，说明其是一个胞质蛋白。对r c t y d c 的三级结构 模型预测表明，r e t y d c 与来源于野猪的t y d c 的晶体模型具有高度的相似性，且具有典型 的t y d c 催化活性位点。对r c t y d c 基因进行功能验证，结果表明将携带r c t y d c 编码区的 质粒p e t 2 8 - r c t y d c 转入大肠杆菌r o s e t t a 进行原核表达之后，能使r o s e t t a 菌株合成大小约 西南大学硕十学位论文 5 3k d a 的重组r c t y d c 蛋白。利用尿素对该蛋白进行提取并透析复性后，以l 酪氨酸为反 应底物，在辅酶磷酸吡哆醛的存在下，检测r e t y d c 重组蛋白的催化活性，并用h p l c 检测 到反应产物酪胺的生成表明本研究中克隆获得的重组的r c t y d c 蛋白具有t y d c 酶的活性 和功能。 本研究还成功建立了大花红景天的无菌苗培养体系，构建了r c t y d c 基因的植物高效表 达载体。本研究的相关工作为红景天苷生物合成的代谢调控奠定了基础，为今后在中草药中 开展代谢途径工程提供了启发意义和借鉴价值。随着红景天苷生物合成相关酶基因的陆续被 克隆，以及红景天苷生物合成途径的进一步认识，利用代谢工程手段提高红景天苷含量越来 越成为可能实施的一种重要手段。 关键词：大花红景天；酪氨酸脱羧酶；基因克隆；原核表达；功能验证 多 气 a b s t r a c t c l o n i n g a n df u c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o n0 f t y r o s i n ed e c a r b o x y l a s eg e n ef r o mr h o d i o l a c r e n u l a t a m a s t e rc a n d i d a t em a j o r i n gi ng e n e t i c s ：j i n g y ep e n g s u p e r v i s o r ：p r o f z h i h u al i a o a s s o c i a t ep r o f x i a o z h o n gl a n ( a b s t r a c t ) s a l i d r o s i d ei sap o t e n tg l y c o s i d e sd r u ge x t r a c t e df r o mr h o d i o l ar o s e al ，w h i c hi sf o r m e db y d e h y d r a t i o nc o n d e n s a t i o nr e a c t i o nb e t w e e nu r i d i n ed i p h o s p h o g l u c o s ea n dt y r o s 0 1 s a l i d r o s i d eh a s t h ef u n c t i o n so fa n t i - a g i n g ，a n t i - t u m o r , a n t i - f a t i g u e ，a n t i - r a d i a t i o n ，e n h a n c i n gi m m u n i t y , p r o t e c t i n g c a r d i o v a s c u l a ra n ds oo n t h es u p p l yo fs a l i d r o s i d ei sf a rf r o me n o u g hi nt h ei n t e r n a t i o n a lm a r k e t , f o rt h er e l a t i v e l yl o wy i e l d ( o 0 1 o 6 ，d w ) o fs a l i d r o s i d ei nw i l d - t y p er h o d i o l ar o s e al ，w h i c h g r e a t l yl i m i t st h ec o m m e r c i a l i z a t i o no ft h ed r u g a l t h o u g hs a l i d r o s i d ec o u l db es y n t h e s i z e d c h e m i c a l l y , i ti sl i m i t e dt ob ep u ti n t op r o d u c t i o nd u et oc o m p l e xr e a c t i o nr o u t e ，l o wt o t a ly i e l da n d c o m p l e xe x p e r i m e n t a le q u i p m e n t w i t ht h es u c c e s s f u lc l o n i n go f g e n e si n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e s i s o fs a l i d r o s i d e ，g e n e t i ce n g i n e e r i n gi st h o u g h tt ob eo n eo ft h em o s tp r o m i s i n ga p p r o a c h e st o e n h a n c et h ep r o d u c t i o no fs a l i d r o s i d e t oi n s i g h ti n t os a l i d r o s i d eb i o s y n t h e s i sa tm o l e c u l a rl e v e l a n dp r o v i d en e wt a r g e tg e n e sf o rm e t a b o l i ce n g i n e e r i n go fs a l i d r o s i d eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y , t h e f u l l - l e n g t he d n a o ft y r o s i n ed e c a r b o x yg e n ei n v o l v e di nt h em e t a b o l i cp a t h w a yo fs a l i d r o s i d ew a s c l o n e db yr a c em e t h o d ，t h e nc h a r a c t e r i z e da n df u n c t i o n a l l yi d e n t i f i e d , w h i c hw a sn a m e d r c f y d c , i nno r d e rt oi n c r e a s es a l i d r o s i d ec o n t e n ti nr h o d i o l ac r e n u l a t ab yu s i n gg e n e t i c e n g i n e e r i n gm e t h o d t y d ci sa ne s s e n t i a l 睨屹炉o ft h es a l i d r o s i d eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y , w h i c hc a t a l y z e st h e c o n v e r s i o no fl - t y r o s i n ei n t ot y l d m m e ( 4 - h y d r o x y p h e n e t h y l a m i n e ) t h ef u l l - l e n g t he d n a o f t y d cw a sc l o n e da n dc h a r a c t e r i z e df o rt h ef n - s tt i m ef r o m 足c r e n u l a t a t h en 哪e d n aw a s n a m e da sr c t y d c t h ef u l l - l e n g t he d n ao fr c t y d cw a s16 5 7b pc o n t a i n i n ga1 4 7 3b po p e n r e a d i n gf r a m e ( o r f ) e n c o d i n gap o l y p e p t i d eo f4 9 0 剐i i l oa c i d s1 j l r i 廿lac a l c u l a t e dm o l e c u l a rm a s s o f5 4 6k d aa n da ni s o e l e e t r i cp o 缸o f5 5 5 c o m p a r a t i v ea n db i o i n f o r m a t i ca n a l y s e sr e v e a l e dt h a tr c t y d ch a de x t e n s i v eh o m o l o g yw i 吐l t y d c sf r o mo t h e rp l a n ts p e c i e s ( 4 5 - 51 i d e n t i t i e s ) r c t y d cc o n t a i n e dt h et y p i c a lt y d c c a t a l y t i ca c t i v i t yd o m a i n ap h y l o g e n e t i ct r e eo ft y d c sw a sc o n s t r u c t e df r o md i f f e r e n to r g a n i s m s i i i 西南大学硕+ 学位论文 i n c l u d i n gp l a n t s ，a l g a e s ，b a c t e r i aa n da r c h a e a t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt y d c s w e r ed e 晰e d f r o ma na n c e s t o rg e n ea n de v o l v e di n t ot h r e eg r o u p si n c l u d i n gp l a n t s ，a l g a e s ，b a c t e r i aa n da r c h a e a t y d cg r o u p s ，a n dr c t y d cb e l o n g e dt op l a n tt y d c s f a m i l y f u r t h e r m o r e ，r c t y d ch a dt h e c l o s e s tg e n e t i cr e l a t i o n s h i pw i t ht y d c so fz e am a y sa n do r y z as a t i v a t h ec l o n i n ga n d c h a r a c t e r i z a t i o no f r c t y d cw i l lb eh e l p f u lt ou n d e r s t a n dm o r ea b o u tt h er o l eo ft y d ci n v o l v e di n t h es a l i d r o s i d eb i o s y n t h e s i sa tt h em o l e c u l a rl e v e l t ov e r i f i c a tt h ef u n c t i o no fr e t y d c ，t h ep l a s m i dp e t 2 8 - r c t y d cc a r r y i n gr c t y d cc o d i n g s e q u e n c ew a st r a n s f o r m e di n t ot h ee c o l is t r a i nr o s e t t a , w h i c hw a sa b l et oe x p r e s sh e t e r o l o g o u s p r o t e i n t h e5 3 k dr e s t r u c t u r i n gr c t y d cp r o t e i nw a ss y n t h e s i z e di nr o s e t t a ，w h i c hw a s e x t r a c t e d a n dp u r i f i e d 诵t l lu r e a , t h e nr e n a t u r e db yd i a l y s i s i n g t h er e a c t i o nw i t hl - t y r o s i n ea ss u b s t r a t e 。 p y r i d o x a l - 5 - p h o s p h a t eh y d r a t ea sc o c n z y m ew a sc a r r i e do u tt od e t e c tt h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo f r e s t r u c t u r i n gr e t y d cp r o t e i n h p l cd e t e c t e dt h a tr e a c t i o np r o d u c tt y r a m i n ew a sp r o d u c e d ，w h i c h s h o w e dt h a tt h i ss t u d yh a s 唧h dr c t y d cw i t ht h ea c t i v i t ya n df u n c t i o no ft y r o s i n ed e c a r b o x y t y r o s i n ed e c a r b o x y 仃y d c ) i sa ni m p o r t a n te n z 徊ei ns a l i d r o s i d eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y t o i n c r e a s et h ey e i l do fs a l i d r o s i d ei n 尼c r e n u l a t at h r o u g hm e t a b o l i cp a t h w a ye n g i n e e r i n g ，t h e r e c o m b i n e dp l a s m i dp 1 3 0 4 + - r c t y d cw a si n t r o d u c e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r d i n e h a l 0 5t og e n e r a t ee n g i n e e r e ds w d i n t h i ss t u d ya l s os u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e da s e p t i cs e e d l i n g s a n dr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fr h o d i o l ac r e n u l a t a t h i ss t u d yo nm e t a b o l i cr e g u l a t i o no fs a l i d r o s i d e b i o s y n t h e s i sh a sl a i da f o u n d a t i o nf o r t h ef u t u r ed e v e l o p m e n to f c h i n e s eh e r b a lm e d i c i n em e t a b o l i c p a t h w a y se n g i n e e r i n g a ss a l i d r o s i d eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y r e l a t e dg e n e sw e r ec l o n e di ns u c c e s s i o n , u s i n gm e t a b o l i ce n g i n e e r i n gm e t h o d s t oe n h a n c es a l i d r o s i d ec o n t e n ti sb e c o m i n gp o s s i b l e k e y w o r d s ：r h o d i o l ac r e n u l a t a ；t y r o s i n ed e c a r b o x y l a s e ；g e n ec l o n i n g ； p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；f u n c t i o n a lv e r i f i c a t i o n i v ， 真 缩词表 略词表 _ - _ - _ - - - - _ _ _ _ _ _ - _ - - _ i l _ _ - _ l _ _ - _ - _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ 一ii _ _ _ _ _ - _ _ l _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ l l _ - _ _ l - _ _ - 一 缩略词英文全称 中译名 a m p i c i l l i n a m m o n i u mp e r s u l f a t e 氨苄青霉素 过硫酸铵 乙酰丁香酮 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l 基本局部比对搜索工具 b a s e p a i r c a u l i f l o w e rm o s a i c v i r u s c a r b c n i c i l l i n 碱基对 花椰菜花叶病毒 羰苄青霉素 c o m p l e m e n t a r yd c o x y r i b on u c l e i ca c i d 互补d n a c h l o r m 坤h e n i c o l d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d l ，d i i h i o t h r e i t o l 氯霉素 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 、 二硫苏糖醇 四乙酸二乙胺 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g 表达序列标签 g e n es p e c i a lp r i m e r k a n a m y c i n k i l o d a l t o n 3 ( n m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d m o l e c u l a rw 啦灿 基因特异引物 潮霉素抗性 异丙基o d 硫代吡喃半乳糖苷 卡那霉素 千道尔顿 3 ( n - 吗啉基) 丙磺酸 信使核糖核酸 分子量 n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n国家生物技术信息中心 o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e 光吸收值 开放式阅读框 聚合酶链式反应 p l l s o e l e c t r i cp o i n t 等电点 v 卸 肚 怂 一 郇 一 西 一 锄 一 跳 呷 一 嘲 姆 l 詈 要 渤 一 一 姗 一 吣 嗽 西南大学硕士学位论文 p m s f p r p r a c e r i f r t p c r s d s p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e 苯甲基磺酰氟 5 - 磷酸毗哆醛 r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s c d n a 末端快速扩增 r i f a m p i c i n 利福平 r e v e r s ew a n s l a t i o np o l y m e r a s ec k l t i nr e a c t i o n 反转录p c r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 s d s p a g es d sp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s十二烷基磺酸钠盐聚丙烯酰胺凝胶电泳 s t r t e m e d u t r 链霉素 n ，n ，n 。，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e n ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺 u n m m s l a t e dr e g i o n非翻译区 ； 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 植物次生代谢的基因工程 随着对植物次生代谢网络的研究和认识的深入，以及分子克隆和遗传转化技术的飞速发 展，应用基因工程对植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，即植物次生代谢基因工程的研 究日益增多，已经发展为具有广阔应用前景的热点研究领域。其主要分为次生代谢关键酶基 因或基因抑制工程及其调控因子的基因工程两个方面n 2 】。 1 1 1 关键酶基因 迄今已经建立的植物次生代谢途径基因修饰的策略主要有：导入单个、多个靶基因例如 编码目标途径限速酶的基因或一个完整的代谢途径，使宿主植物合成特定目标物质或生成新 的特定化合物：通过反义和干涉等技术减少靶基因的表达，从而抑制竞争性代谢途径，改变 代谢流向和增加目标物质的含量。 莨菪碱和东莨菪碱等莨菪烷生物碱是一类重要的药物，主要在天仙子属、颠茄属、莨菪 属等植物中合成。j o u h i k a i n e n 等【3 糯编码天仙子胺一6 p 化酶( h y o s c y a m i n e - 6 p h y d r o x y l a s e ， h 6 h ) 的基因导入埃及莨菪中，并使该基因在毛状根细胞中超量表达，测验结果表明，该转 基因细胞系中东莨菪碱含量较对照含量提高了1 0 0 倍。s a t o 等【4 1 将腐胺n 转甲基酶( p u t r e s c i n e n - m e t h y l t r a n s f e r a s e ，p m r ) 转入野生烟草中，p m t 活性增强了3 3 倍。 木质素是植物细胞壁的组成部分，其存在影响到造纸工业中浆和纸的品质与产率，也是 污染环境的主要因素。科研工作者试图用基因工程方法降低材质中的木质素含量或改变其组 成成分。p a l 、c 4 h 、4 c l 、c c r 和c a d 都是木质素合成过程中的关键酶，在转反义p a l 、 c 4 h 和4 c l 基因的烟草、拟南芥和颤杨销】中木质素含量都有不同程度的降低，但同时也伴 随着植株形态的非正常变化。c h a b a n n e s 等【9 】利用纯合的转反义c c r 基因烟草( 木质素含量降 低明显，非正常发育) 和转反义c a d 基因烟草( 发育正常，木质素组成成分发生改变，含量 无明显变化) 杂交，得到了转双反义基因的烟草。它的形态和发育均正常，木质素含量也下 降了5 0 。利用次生代谢途径中几种酶的协同作用，可以达到改造植物的理想目的，这为植 物次生代谢产物的基因工程开辟了新的思路。 然而由于植物次生代谢的复杂性和种属特异性，次生代谢基因工程还存在许多问题。例 如，一些目标基因的超量表达或抑制，并未提高预期代谢产物的合成量，有的则产生相反的 结果；有的则合成新的物质或其它非目标产物。在不同转化体或不同种类植物中，还存在目 标转基因表达水平差异颇大，限速酶基因表达及酶活性高低与目标产物合成有时不一致等问 题。因此，植物次生代谢途径的基因工程还面临着许多具有挑战性的任务，需进一步深入研 究。 西南大学硕士学位论文 1 1 2 转录因子 植物次生代谢途径大多是由多种酶参与的多步反应，受发育、环境等因素的影响，对单 个基因进行修饰有时难以奏效。研究发现一些转录因子可调控多个参与代谢途径基因的表达， 例如m y b 类转录因子就参与了黄酮类物质的生物合成的调节【1 0 1 。b r o u n 等1 1 1 通过转录因子 的分子操作，调控植物代谢途径中目标代谢物合成的尝试已经取得了成功。在玉米籽粒中， 两种转录因子即r 和c l 通过共同作用调节着花青素生物合成。g r o t e w o l d 掣1 2 1 将转录因子r 和c 1 在离体培养的未分化玉米细胞超量表达，成功地诱导了完整的黄酮类合成途径。在水 稻中，玉米转录因子r 、c ! 和查尔酮合成酶基因的协同超量表达也激活了花青素生物合成途 径，增强了对真菌的抗性等1 3 l 。 有些转录因子则是植物体内天然产物合成的抑制子。采用基因沉默技术关闭这类转录因 子的表达，就能促使相关化合物的合成。例如，拟南芥转录因子a t m y b 4 ，是参与芥子酸酯 ( s i n a p a t ee s t e r s ) 合成的关键酶一肉桂酸4 羟基化酶( c 4 h ) 的抑制子。j i n 等4 1 将a t m y b 4 基因剔除，结果导致了c 4 h 的大量表达，叶子中芥子酸酯增加，提高了抵抗紫外辐射的能力。 a h a r o n i 等【1 5 1 克隆和鉴定了一个参与草毒果实中黄酮类代谢途径的转录因子f a m y b l ，该转 录因子抑制黄酮类合成下游一些步骤。f a m y b l 基因在烟草中的超量表达引起了花青素和黄 酮类化合物减少。相反，抑制或降低f a m y b l 就会增加花青素和黄酮类化合物的积累。上述 这些例子表明，通过一种或几种转录因子的超表达，可以改变植物生长发育过程中自然产物 的合成和积累，甚至在异源植物种中也是可行的。 1 2 红景天属植物研究进展 1 2 1 红景天生物活性成分 国内外已经进行化学成分研究和成分预试的红景天属植物品种约2 0 个，国内对以下种类 研究较多，高山红景天、长鞭红景天、大花红景天、狭叶红景天、蔷薇红景天、圣地红景天 等。其中大花红景天主要生长于西藏高原海拔4 5 0 0 米以上的严寒、缺氧、强日照、无污染地 带，是红景天中的极品，大红花景天中红景天苷、酪醇、酮等成分是其他品种红景天的5 倍， 被誉为“雪域人参。 大花红景天中主要成份为：红景天苷( s a l i d r o s i d e ) 及其苷元酪醇( t r y o s 0 1 ) 、6 氧没食 子醯基红景天苷、l ，2 ，3 ，4 ，6 五氧没食子醯基一b - d 呲喃葡萄糖、草质素7 氧吨l 呲喃 李糖苷、草质素7 氧( 3 氧p - d 一呲喃葡萄糖基) 心i 广呲喃李糖苷；另外还含有黄酮苷、没 食子酸、山奈酚、槲皮素、酪萨维( r o s a v i n ) 、酪生( r o s a r i n ) 、酪萨利( r o s i n ) 等结构等。红景 天根中含有黄酮苷、r h o d i o n i n 、r h o d i o s i n 、r h o d i o l i n ，约有3 0 种挥发油，其中s o s a o l 含量 最高，占约2 6 ，还有p 石竹烯、弘橄香烯等。地上部分含有r h o d i o l g i n 、r h o d i o n i d i n 和 r h o d i o l g i d i n 等。 2 气 第1 章文献综述 1 2 2 红景天药理作用 抗缺氧、抗疲劳作用。红景天能迅速提高血红蛋白与氧的结合能力，提高血氧饱和度， 降低机体的耗氧量，增加运动耐力，恢复运动后疲劳，可用于减轻高原反应。王永新【1 6 】等发 现复方红景天制剂可提高小鼠负重游泳、爬杆的能力，增加小鼠肝糖元含量，降低全血乳酸 和尿素氮含量。复方红景天制剂可明显提高小鼠的运动耐力，具有明显的抗疲劳作用。邓天 吉等f 1 7 】对藏药红景天口服液抗氧化、抗疲劳的临床观察发现红景天强身剂在抗缺氧、抗疲劳 方面对青、中、老年人均有效；对缺氧综合征作用明显，温和、持久，无毒和不良反应，长 期单剂服疗效不减。其总有效率达1 0 0 ，疗效明显优于镇静安神剂。 抗肿瘤作用。实验研究表明，红景天对多种肿瘤有效，如纤维肉瘤、乳腺癌、胃癌、喉 癌、肝癌等，其可能的机制为调节机体免疫力、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑 制肿瘤新生血管生成、影响机体代谢等方面【1 8 】。 良好的心血管系统作用。如改善血管作用、心肌保护作用、改善心功能、抗心律失常及 活血化瘀等心血管作用【1 9 】。临床上现主要用于气虚血瘀所致胸痹，表现为胸闷、刺痛或隐痛、 心悸气短、神疲乏力、少气懒言、头晕目眩等症【2 0 】。 - 7 ，” 、 抗辐射、抗衰老作用。苗燕波等1 2 1 1 研究发现高山红景天2 8g k g - l 灌胃给药，可明显提高 接受单次大剂量( 5 g y ) 深部x 线照射小鼠的存活率，明显增加存活小鼠胸腺、脾指数；对接 受辐射小鼠的心、肝组织过氧化脂质的产生具有明显的抑制作用，说明高山红景天对电离辐 。 射所造成的自由基损伤具有明显的保护作用。任延明等【2 2 】用狭叶红景天根茎醇提物按3 0 0 、 6 0 0m g k g 1 给老年大鼠连续灌胃3 0d ，测血清丙二醛( m d a ) 含量，脑和肝组织脂褐质( l 0 含 量及血清超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - p x ) 活性。发现狭叶红景天两剂 量组均能明显降低老年大鼠血清m d a 含量及脑和肝组织l f 含量，明显提高血清s o d 、 g s h - p x 活性，说明狭叶红景天可能通过改善自由基代谢发挥抗衰老作用。 对内分泌系统的双向调节作用。双向调节肾上腺激素、性激素等的分泌。 总之，红景天作为近年来新发现的适应原样补益药，在国外已进行较为深入的研究，前 苏联保健部药理委员会将红景天列为人参型兴奋剂及“适应原”样药，临床应用于抗疲劳， 提高体力和脑力劳动功能、神经官能症、张力减退综合征、糖尿病和贫血等病症。 1 2 3 红景天产品的开发应用 红景天功能食品与保健品的开发。目前国内已有多家公司开发红景天保健食品上市。其 中红景天系列保健食品主要包括：红景