（食品科学专业论文）同步糖化与发酵大豆异黄酮废水生产酒精中米曲霉的选育.pdf

摘要 摘要 我国每年约产生6 0 万吨大豆异黄酮废水，处理这些废水成为企业无法忽视的经济 负担。根据企业的要求，本论文旨在研究利用大豆异黄酮废水生产酒精，以实现大豆资 源的综合利用，减少生产废水对环境的污染。 大豆异黄酮废水中含有大量的棉子糖和水苏糖等低聚糖，酵母不能完全利用，所以 发酵后的酒精得率很低，残糖浓度很高。本论文筛选出一株产q 半乳糖苷酶酶活较高， 能有效降解棉子糖和水苏糖的菌株，与酿酒酵母进行混合发酵，提高酒精得率，并将最 终的残糖降到最低。 本论文通过u v 和n t g 诱变，筛选出一株高产a 半乳糖苷酶的米曲霉l 0 9 ，菌株 的酶活由1 2 5 0 u m l 提高到3 6 5 0 u m l ，提高了近2 倍。 本论文对米曲霉产酶培养基和培养条件进行了研究。最佳培养基组成( l ) ：异黄 酮废水8 0 ，豆饼粉4 8 ，麸皮4 8 ，在此条件下a 半乳糖苷酶酶活达到5 2 5 7 u m l 。最佳 产酶培养条件：接种量0 6 x 1 0 6 个m l ，装液量2 5 0 m l 三角瓶装液5 0 m l ，培养温度在 3 0 ，培养基初始p h 5 0 ，摇床转速为1 4 0 r m i n 。 本论文对a 半乳糖苷酶的粗酶学性质进行了初步研究。结果表明，米曲霉a 半乳糖 苷酶的最适酶反应温度为5 0 ，酶反应最适p h 5 0 ，最适底物浓度为1 2 。a 半乳糖苷 酶存在显著的产物抑制现象，所以在发酵培养基中要控制伍半乳糖、葡萄糖和果糖的浓 度，使得0 【一半乳糖和果糖的浓度不超过3 ，葡萄糖浓度不超过1 。 为了消除酶水解后的产物抑制现象，本论文采用同步糖化与发酵工艺生产酒精。最 佳发酵工艺条件：大豆异黄酮废水稀释度5 0 ，转速为5 0 r m i n ，消泡剂添加量0 2 9 0 0 ， 通氧不利于酒精发酵，流加补料优于分批补料。发酵6 0 h ，酒精浓度达到1 5 2 ( v v ) ， 转化率达到了理论转化率的9 6 3 。 发酵罐验证试验证明：发酵6 0 h 后，酒精浓度达到1 5 ( v v ) ，残糖3 2 ( w w ) ， 与摇瓶发酵试验的结果基本相符，并且棉子糖含量己由最初的1 2 o 降至0 2 4 ，而水 苏糖含量也由最初的5 0 降至o 0 6 ，利用率分别达到9 8 0 和9 8 8 。 关键词：大豆异黄酮废水，a 半乳糖苷酶，棉子糖，酒精，同步糖化与发酵 a b s t r a c t a b s t r a c t 6 0 0t h o u s a n dt o n so fs o y b e a ni s o f l a v o n ew a s t ew a t e rw a sp r o d u c e de v e r yy e a ri nc h i n a a n dd e w i n gw i t hi tb e c a m ea ne c o n o m i cb u r d e nw h i c he n t e r p r i s e sc a l l ti g n o r e a c c o r d i n gt o t h er e q u e s to fe n t e r p r i s e s ，t h i st h e s i sa i m e dt of e r m e n te t h a n o lu s i n gs o y b e a ni s o f l a v o n ew a s t e w a t e r , i m p l e m e n tt h ec o m p r e h e n s i v eu s eo fs o y b e a nr e s o u r c e sa n dr e d u c et h ep o l l u t i o no f w a s t ew a t e rt oe n v i r o n m e n t s o y b e a ni s o f l a v o n ew a s t ew a t e rw a st h em a i nl i q u i db y p r o d u c to fi s o f l a v o n ep r o d u c t i o n p r o c e s s e ，a n di t s s u i t a b l ef o rb i o e t h a n o lp r o d u c t i o n h o w e v e r a st h es o y b e a ni s o f l a v o n e w a s t ew a t e rc o n t a i n s h i g hc o n c e n t r a t i o no fr a f f i n o s ea n ds t a c h y o s e w h i c hc a nn o tb e c o m p l e t e l yf e r m e n t e db ys a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et op r o d u c ee t h a n 0 1 t h ea i mo ft h i s d i s s e r t a t i o nw a st os c r e e no u tas t r a i nw i t hh i g h 伍- g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t ya n dt od e v e l o pa n e f f e c t i v ef e r m e n t a t i o np r o c e s st om a x i m i z et h ee t h a n o lp r o d u c t i o nu s i n gs o y b e a ni s o f l a v o n e w a s t ew a t e r a s p e r g i l l u so r y z a el 一0 9 ，as t r a i nw i t hh i g ha - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t yw a so b t m n e dt h r o u g h s e l e c t i o na f t e ru v ，a n dn t gt r e a t m e n t 1 1 1 ee n z y m ef o r m e db ya s p e r g i l l u so r y z a el 一0 9w a s i n c r e a s e df r o m12 5t o3 6 5u m l 。 t h eo p t i m i z a t i o no ft h em e d i u mc o m p o n e n ta n dt h ec u l t u r ec o n d i t i o ns h o w e dt h a tt h e o p t i m u mm e d i u mw a sc o m p o s e do f ( g l ) s o y b e a ni s o f l a v o n ew a s t ew a t e r8 0 ，s o y b e a nf l o u r 4 8a n dw h e a tb r a n s4 8 t h ea g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t yo f5 2 5 7u m lw a so b t a i n e di nt h e o p t i m u mm e d i u m t h er e s u l t sa l s os i g n i f i e dt h a tt h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o nw a s i n o c u l a t i o n0 6 xl0 。y e a s tc e l l sp e rm l ，5 0m lm e d i u mi n2 5 0 m lf l a s kb o t t l e s c u l t u r e t e m p e r a t u r e3 0o c i n i t i a lp h4 9 5 5a n dt h er o t a t es p e e d1 4 0r r n i n t h ec h a r a c t e ro ft h er a we n z y m ew a ss t u d i e d i tw a sf o u n dt h a to p t i m u mc a t a l y z i n g t e m p e r a t u r e ，p h ，a n ds u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw e r e5 0o c ，5 0a n d1 2 ，r e s p e c t i v e l y m e a n w h i l e ，t h es u b s t r a t ei n h i b i t i o no c c u r r e ds i g n i f i c a n t l yi nt h ep r o c e s so fh y d r o l y s i s ， t h e r e f o r e ，i nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，i ti sn e c e s s a r yt oc o n t r o lt h ec o n c e n t r a t i o no ft h e 口一g a l a c t o s e ，f r u c t o s ea n dg l u c o s e ，w h i c hs h o u l db el o w e rt h a n3 e s p e c i a l l y , t h eg l u c o s e c o n c e n t r a t i o ns h o u l db el o w e rt h a n1 i no r d e rt o i m p r o v et h ee t h a n o lp r o d u c t i o n t h es i m u l t a n e o u s s a c c h a r i f l c a t i o na n d f e r m e n t a t i o np r o c e s sw a su s e di nt h ep r o c e s s t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a s s o y b e a ni s o f l a v o n ew a s t ew a t e rd i l u t i o nr a t i o1 ：1 t h er o t a t es p e e d5 0r m i n i tw a s a l s of o u n d t h a tt h ed e f o a m e ra f f e c t e dt h ee t h a n o lp r o d u c t i o na n dc o n v e r s i o ne 伍c i e n c yd r a m a t i c a l l y , a n d t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no ft h ed e f o a m e rw a s0 2 o a e r a t i o nw a su n f a v o r a b l et ot h e e t h a n o lp r o d u c t i o n a n df e d b a t c hc u l t u r ew a ss u p e r i o rt ob a t c hc u l t u r e u n d e rt h e s eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，e t h a n o lc o n c e n t r a t i o no f15 ) w a so b t a i n e di n6 0h ，a n dt h e c o n v e r s i o ne m c i e n c yw a s9 6 3 o ft h em a x i m u mt h e o r e t i c a ly i e l d e x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tt ov e r i f yt h er e s u l to b t a i n e di nt h ef l a s kf e r m e n t a t i o n n l e r e s u l t ss i g n i f i e dt h a ta f t e r6 0ho ff e r m e n t a t i o n , t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o la n dr e s i d u a l s u g a rw e r e15 v ) a n d3 2 ( w w ) ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t o b t a i n e df r o mf l a s kt e s t m e a n w h i l e ，t h ec o n t e n to ft h er a f f i n o s ea n ds t a c h y o s ew e r e i i d e c r e a s e df r o m12 0 t o0 2 4 a n d5 t o0 0 6 ，r e s p e c t i v e l y ，a n dt h ec o n v e r s i o n e f f i c i e n c i e so fw h i c hw e r e9 8 0 a n d9 8 8 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：s o y b e a ni s o f l a v o n ew a s t ew a t e r ；a g a l a c t o s i d a s e ；r a f f i n o s e ；s i m u l t a n e o u s s a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ； i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：王治目 日 期：) o o g b j 、7 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：王涪月导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景与意义 1 1 1 大豆异黄酮废水简介 大豆异黄酮废水( s o y b e a ni s o f l a v o n ew a s t ew a t e r , s i w w ) 是在大豆异黄酮生产过程 中，经离心分离工艺分离出异黄酮湿滤饼后而得到的高浓度有机废水。大豆异黄酮的生 产工艺流程如图1 1 。 图卜1 大豆异黄酮生产y - e , 流程图 f i g l - 1 n l ef l o wc h a r to f s o y b e a ni s o f l a v o n ep r o d u c t i o n l 江南人学硕十学位论文 该废水呈焦糖色，液体粘稠，含有大量的糖类( 蔗糖、棉子糖和水苏糖等) 和少量 蛋白质，不容易处理，如果直接排放，将严重污染环境。 大豆产业是我国农产品深加工的支柱产业，我国0 6 年产大豆1 , 5 9 0 万吨，进口量达 到3 , 2 3 0 万吨，其中一半以上用于提取油脂、大豆异黄酮、大豆皂甙等高附加值产品【1 1 。 江苏邳州市某天然药物制品有限公司是一家以大豆胚芽为原料，生产大豆异黄酮的厂 家。产量约3 0 t 年，产品远销同本、美国等地。该厂在生产过程中，豆胚投料量为3 t 天，产生废水5 0 t 天1 2 j 。目前，全国从事大豆异黄酮提取的正规企业有百余家，达到上 吨位产量的有3 0 余家。如果这3 0 家企业每天产废水均为5 0 t ，那么一年就可产废水5 0 t 3 6 5 d 3 0 = 5 4 7 ，5 0 0 t ，数字相当惊人。 同时，有资料显荆3 | ，由于大豆异黄酮具有防治绝经期综合症、癌症、骨质疏松症、 心血管疾病等方面的作用和功能，其生产能力正以平均2 0 - 2 5 的增长率增长。目前 国际大豆异黄酮的市场需求在1 5 0 0 t 年，但总的产量只有5 0 0 t 年，有较大缺口。欧美等 西方国家种植的大豆多为基因工程改性的大豆，而以此为原料生产的大豆异黄酮产品， 欧美国家的消费者不愿服用。以中国传统大豆为原料生产的大豆异黄酮，可以有稳定的 国外市场。对国内市场而言，随着人民生活水平地不断提高，消费人群正在日益扩大。 大豆异黄酮的需求量和生产量越来越大，大豆异黄酮废水也越积越多。大豆异黄酮废水 的处理与排放问题一直困扰着我国大豆加工产业。 1 1 2 大豆异黄酮废水的处理方法 大豆异黄酮废水的处理可以从三个方面来考虑： ( 1 ) 改进大豆异黄酮生产工艺，使无废水产出，达到清洁生产的目的。 2 0 0 3 年，国家大豆深加工推广中心发明了一项以高温( 或低温) 豆粕为原料，在一 条生产线上连续生产高纯度( 9 0 ) 异黄酮、皂甙、核酸、低聚糖、复合大豆保健功能 因子、浓缩蛋白的新技术，在大豆加工领域首次实现了清洁生产，无废渣、无废水排出。 该技术将固体排放废渣加工成纤维饲料或高纤维食品。废水经该技术处理后，化学需氧 量( c h e m i c a lo x y g e nd e m a n d ，c o d ) 可由2 , 0 0 0 m g l ，下降至2 4m g l ，实现废水循环 使用( 国家标准规定，一级排放标准c o d 值为1 5 0m g l ) ，解决了国内外大豆加工领域 废水污染的一大难题。该生产工艺包括的技术有“大功率、高声强超声破膜、破壁技术 、 “逆向分离留存蛋白技术 、“树脂吸附”、“电渗析除盐”、“反渗透”、“超速离心 、“纳 米膜分离 、“减阻喷雾干燥等【4 】。但由于高额的技术转让费，采用此技术的企业寥寥 无几。 ( 2 ) 采用物理、化学等方法对大豆异黄酮废水进行处理，使其达到排放标准。 朱洪里等【2 】采用厌氧好氧工艺处理大豆异黄酮废水，废水的c o d 盯值由处理前的 1 6 2 1 0 4m g l 下降到处理后的3 9m g l 。出水水质稳定，顺利通过环保验收。但设备 投资大，设备的维修和保养更使企业有出无入，加重了企业的经济负担。 ( 3 ) 将大豆异黄酮废水有效利用，变废为宝。 大豆异黄酮废水中含有大量的功能性低聚糖棉子糖和水苏糖。大量研究结果表明【5 】， 2 第一军绪论 棉子糖和水苏糖能有效促进人体肠道内双歧杆菌有益菌群的生长，具有促进肠蠕动、防 止便秘、预防肠癌、提高机体免疫力、降血脂、降血压、降血糖、预防龋齿和护肝等保 健功能，其产品在国外非常畅销。袁其朋等1 6 j 采用膜分离技术处理大豆乳清废水，废水 经截留分子量为8 , 0 0 0 的超滤膜，可回收几乎所有的蛋白质，然后选择一种可部分脱除 蔗糖和单糖的纳滤膜对超滤透过液进行了浓缩，大豆低聚糖中功能性成分水苏糖和棉子 糖的回收率超过9 0 ，纳滤透过液经反渗透处理，可回收大量纯水。采用这一工艺处理 大豆乳清废水，可大大降低排放量，且可获得较大的经济效益。鉴于此，许多企业尝试 分离纯化大豆异黄酮废水中的功能性低聚糖，以变废为宝，增加效益。山东长润生物有 限公司曾引入膜分离设备生产低聚糖，但是，由于高纯度的低聚糖产品对分离纯化工艺 要求很高，企业不愿对设备和技术进行大量投资，所以得到的低聚糖产品纯度不高，一 般在4 0 左右，因此销路不好，再加上膜分离设备巨额的维修和保养费用，企业难以承 受，最后该工艺停产，设备闲置。 所以企业希望能寻找到其它更经济的方法来处理大豆异黄酮废水，由于大豆异黄酮 废水中含有大量的糖类以及少量的蛋白质和脂肪，是微生物良好的发酵培养基，另一方 面，在萃取大豆异黄酮过程中需要消耗大量的酒精，近年来酒精的价格也在不断地上涨。 因此，如果能以大豆异黄酮废水为原料发酵生产酒精，将生产出的酒精再回用到大豆异 黄酮乙醇萃取工艺中，就可以节约成本。于是提出了发酵大豆异黄酮废水生产酒精的解 决方案。这种方法较前述几种方法而言投资少，工艺也比较简单，另外生产出的酒精还 可以回用到大豆异黄酮乙醇萃取工艺，从而节省开支，对缓解我国能源短缺和环境污染 也具有一定的意义。 1 1 3 研究依据及意义 事实上，企业曾经尝试过利用大豆异黄酮废水发酵生产酒精，不过，由于发现发酵 结束后，仍然有大量的糖残留在发酵液中，为酒精废水的处理增加了困难，最后不得不 停止了这种尝试。为了寻找到原因，本研究对大豆异黄酮废水的成分进行了分析，大豆 异黄酮废水中各成分的分析结果见表1 1 。 表1 - 1 大豆异黄酮废水成分 t a b l e1 1t h ec o m p o n e n to f t h es o y b e a ni s o f l a v o n ew a s t ew a t e r 成分c o m p o n e n t大豆异黄酮废水s l w w ( ，w w ) 总糖t o t a ls u g a r 蔗糖s u c r o s e 棉子糖r a f f i n o s e 水苏糖s t a c h y o s e 蛋白质p r o t e i n 脂肪f a t 灰分a s h 水分w a t e r 9 7 m o 6 2 0 3 铂 坦殳z l l 江南人学硕十学位论文 由表1 1 可知，大豆异黄酮废水中含有大量的糖类，总糖含量达到了4 6 9 ，其中蔗 糖占到了2 3 7 ，棉子糖和水苏糖占到了1 7 。棉子糖( r a f f i n o s e ) 3 l 称蜜三糖，是q d 吡喃半乳糖( 1 6 ) 0 【一d 一吡哺葡萄糖( 1 2 妒d 一呋哺果糖，分子式为c 1 8 h 3 2 0 1 6 ，相对分子 量为5 0 4 ，其化学结构如图1 2 所示。 h o k h 5 h hh 爿断 h rl j 州l o h , c h z o h 6 h i o ih o h h 图1 2棉籽糖结构式 f i g l 一2t h ef o r m u l ao f r a f f i n o s e 水苏糖( s t a c h y o s e ) 是蔗糖的葡萄糖基一侧以1 ，6 糖苷键结合2 个0 【半乳糖而形成的 糖类，分子式为c 2 4 h 4 2 0 2 l ，相对分子量6 6 6 ，化学结构如图1 3 所示。 h ho hho hho hh oh 图1 3 水苏糖结构式 f i g l 3t h ef o r m u l ao fr a f f i n o s e 由于酿酒酵母不产a 半乳糖苷酶，只能利用1 3 的棉子糖和1 4 的水苏糖，所以发 酵后剩下的残糖主要是蜜二糖和蜜三糖等酵母不可利用的糖类，并没有将糖全部转化为 酒精，酒精浓度只达到7 左右，造成了原料和能源的浪费，也为后期酒精废水的处理 增加了困难。因此要实现大豆异黄酮废水高效生产酒精的目的，关键就在于寻求并确定 一种能有效降解棉子糖和水苏糖为酵母可利用的糖的方法，以进一步提高酒精的转化 率。针对棉子糖和水苏糖的结构，初步想用半乳糖苷酶来水解棉子糖和水苏糖。 仅半乳糖苷酶即蜜二糖酶，是催化仅半乳糖苷水解的酶类。该酶能分解0 【半乳糖苷 低聚糖，如棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。棉子糖和水苏糖被伍一半乳糖苷酶分解时可产生 半乳糖和蔗糖，这两种糖均能被酵母直接利用。 目前a 半乳糖苷酶主要是利用微生物发酵法生产的，菌种来源主要是焦曲霉和毛 霉。据报道【7 】，美国、丹麦和日本已有这方面的基因工程菌，并且还发酵生产了少量产 品。但是由于价格高，目前只用于实验。a 半乳糖苷酶酶制剂产品是为有效消除饲料中 a 半乳糖苷的抗营养作用而开发并应用的，目前世界上只有丹麦的n o v o z y m e 和韩国的 e a s y b i o 等少数几家公司能生产，我国还未有此类产品的生产企业。所以，我国开始对 饲用a 半乳糖苷酶酶制剂的生产技术展开研究，国家饲料工程技术研究中心通过物理化 学诱变技术得到高产c 【半乳糖苷酶菌株扬奇青霉，采用旋转式圆盘制曲工艺进行固 4 第一苹绪论 态厚层通风发酵，其固态发酵干曲中a 半乳糖苷酶酶活力达到1 5 0 u g ，是国外同类产 品的3 倍。 虽然固态发酵单位体积的酶产量往往比液态发酵高5 1 0 倍，但固态发酵机械化程 度低，劳动强度大，很难进行大规模的工业化生产；通过液体发酵工艺制备的a 一半乳糖 苷酶具有酶活稳定、杂质少、微生物及代谢中间体污染低等优点，所以本论文将从选育 a 半乳糖苷酶高产菌株入手，以解决大豆异黄酮废水发酵生产酒精过程中的关键问题。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 发酵大豆异黄酮废水为酒精的研究现状 欧美国家是大豆异黄酮产品的主要消费国，而中国则是主要的生产国，所以未见有 国外资料对大豆异黄酮废水的处理作相关的报道。国外研究主要关注乳清废水的处理。 乳清是乳制品行业的副产品，含有大量的蛋白质和乳糖。w a l t e rv g u i m a r a e sa n d g r e g o r yl d u d e n 研究出一种新的生物体用于乳清的酒精发酵。这种生物体是含有编码 了运动单胞菌乙醇合成路径基因的大肠杆菌重组体。该菌在含有乳糖1 4 0 9 l 的肉汤培 养基中发酵1 0 8 h 后，酒精的最大得率为6 8 9 l 。此法既降低了b o d 值，又减少了废水 处理的费用【8 】。本课题是筛选能有效降解棉子糖的菌株与酿酒酵母同步糖化发酵大豆异 黄酮为酒精，与他们的研究十分相似。y a n a s eh 尝试研究出一种利用肠道a 一半乳糖苷酶 基因和运动单胞菌的重组体来发酵棉子糖，并且已经取得了部分成功。 我国对大豆异黄酮废水的处理问题十分关注。处理方法有上面提到的一条生产线上 连续生产高纯度( 9 0 ) 异黄酮、皂甙、核酸、低聚糖、复合大豆保健功能因子、浓缩 蛋白的无废渣、无废水清洁生产新技术；厌氧好氧工艺处理大豆异黄酮废水顺利达标排 放；膜分离法从大豆异黄酮废水中提取功能性低聚糖。由于大豆异黄酮废水中的大量低 聚糖不能被酿酒酵母所利用，工业生产中得到的酒精浓度只有7 左右，造成了原料和 能源的极大浪费，限制了其大规模生产。随着经济的发展和高新技术的不断涌现，我国 在现有技术优缺点的基础上将继续加大对这方面的研究。 1 2 2 伍半乳糖苷酶研究现状 我国于7 0 年代后期开始进行微生物产a 半乳糖苷酶及其酶学性质研究，已筛选出不 少产a 半乳糖苷酶活性的微生物，主要有短双歧杆菌、青霉菌、酵母菌、放线菌等。山 东大学的肖敏等【9 】人通过对短双歧杆菌的厌氧培养，得到发酵液酶活为1 7 6 i u m g 。李孝 辉等【l o 】通过青霉n 3 菌株固体发酵法，在2 8 。c 发酵7 2 h 后达到产酶高峰，酶活为5 6 8 i u g 。 蔡国林等【l i l 从黄酒麦曲中筛选出一株黑曲霉w x 0 7 ，并对其产q 半乳糖苷酶的发酵条件 进行了研究，优化后的a 半乳糖苷酶活力达到2 4 0 u m l ，是优化前的约3 0 8 倍。山东大 学的陆宇等【1 2 】人通过将短双歧杆菌0 【半乳糖苷酶基因克隆到大肠杆菌温度诱导表达质 粒p b v 2 2 0 q b ，构建重组质粒p b v a g a l ，转入大肠杆菌进行温度诱导表达，使a 半乳糖苷 酶比活由原来的1 7 6 1 u m g 最高提高n 2 8 0 8 i u m g 。 国外从6 0 年代开始在微生物中筛选产a 半乳糖苷酶的菌种【1 3 , 1 4 】，主要来源于双歧杆 江南人学硕十。孚依论文 菌、焦曲霉和梨头霉等，1 9 7 2 年，b e u t l e r t 和k u h l l l 5j 首次研究了半乳糖苷酶动力学和热 力学稳定性，使人们对理一半乳糖苷酶的特性有了更深一步了解。进入8 0 年代以后，分子 生物学的迅速发展为o t 半乳糖苷酶的研究开创了新的领域，通过基因工程技术，人们从 动物器官、咖啡豆、双歧杆菌等生物体中克隆出a 半乳糖苷酶基因【l 刚，并在大肠杆菌、 毕赤酵母中获得高效表达。通过基因工程获得高活力、热稳定的酶是c 【半乳糖苷酶在大 规模应用中急需解决的问题。国外在这方面有较深入的研究，f r i d j o n s s o n - 等【l7 j 克隆来源 于t h e r m u sb r o c k i a n u si t l 3 6 0 的a 半乳糖苷酶基因，命名为a g a t ，编码4 7 6 个氨基酸，分 子量为5 3 8 1 k d a ，能耐受最高温度达9 3 ，在e c o l i 中表达，酶的比活力为4 6 u m g 。r u b e n c r u z 等【l8 j 人在研究米曲霉合成小半乳糖苷酶时，比较了不同糖类物质的诱导作用。在淀 粉、水苏糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、豆粕碳水化合物这些物 质中，只有水苏糖、棉子糖、豆粕碳水化合物具有诱导作用。g sa n i s h a 和pp r e m a i l 圳利 用链霉菌0 【半乳糖苷酶粗酶液来降解马豆粉和绿豆粉中人体不能消化的低聚糖，马豆粉 中棉子糖的利用率为9 7 5 ，水苏糖为9 3 2 ，绿豆粉中棉子糖的利用率为9 6 3 ，水苏 糖的利用率为9 1 8 。这一研究对不含能引起肠胃胀气低聚糖的马豆粉和绿豆粉的大规 模生产十分有利。 1 2 3 同步糖化与发酵工艺的研究现状 当纤维素生物质作为原料的时候，纤维素酶对于纤维素生物质的水解被水解产物一 葡萄糖和纤维二糖所抑制，为了克服反馈抑制作用，g a u s s 等1 2 0 l 提出在同一个反应罐中 进行纤维素水解( 糖化) 和乙醇发酵的同步糖化发酵法( s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n d f e r m e n t a t i o n ) 。同步糖化发酵法是将酶水解和乙醇发酵结合起来，在同一发酵罐中进行， 而且因发酵罐内的纤维素水解速度远低于葡萄糖消耗速度，从而使葡萄糖的浓度保持很 低。然而，乙醇对于纤维素酶的影响也已经在同步糖化发酵法中得到了证实，但是乙醇 对于纤维素酶的抑制作用不如纤维二糖和葡萄糖的抑制作用大，所以水解的同时将糖转 化成乙醇会为动力学方面创造有利条件，并且会提高纤维素酶的效率。同步糖化发酵法 能够获得较高的乙醇得率( 达到4 0 ) 。这一方法的优点还包括发酵时间短、减少了外 部微生物污染的危险性及反应介质中可以有乙醇存在和厌氧性条件1 2 。k a z u y o s h io h t a 等【2 2 j 利用黑曲霉和酿酒酵母同步糖化发酵菊芋粉来生产高浓度酒精，酒精产量达到 2 1 ，转化率为理论转化率的8 4 。葛向阳等【2 3 j 利用从自然界中新分离得到的生淀粉酶 产生菌根霉w 一0 8 ，并首次采用固态和液态相结合的培养方法，使生淀粉糖化酶活量达到 7 2 i u m l ，然后以生玉米粉为底物，利用根酶w 2 0 9 和酿酒酵母z 2 0 6 采用同步糖化与发酵 工艺，3 0 ，4 8 h ，发酵醪酒精浓度达到2 1 v ) ，转化率为理论转化率的9 4 5 。 1 3 主要研究内容 ( 1 ) 高产0 【半乳糖苷酶菌株的选育； ( 2 ) 米曲霉q 半乳糖苷酶发酵条件优化； ( 3 ) 米曲霉a 半乳糖苷酶粗酶学性质的初步研究； ( 4 ) 米曲霉与酿酒酵母同步糖化发酵酒精工艺条件的研究； 6 第一章绪论 ( 5 ) 发酵罐验证试验。 1 4 主要解决问题 ( 1 ) 筛选出高产a 半乳糖苷酶的菌株； ( 2 ) 通过同步糖化与发酵工艺将发酵液的残糖降到最低，得到较高的发酵强度和转化 率。 7 江南人学硕十学位论文 第二章产c t 一半乳糖苷酶曲霉高产菌株的选育 2 1 引言 菌种选育的方法有多种，其中诱变育种是最常用的和较有效的一种育种手段。它是 在研究诱变机制的基础上选择合适的诱变因子、处理剂量和处理方法，然后运用合理的 筛选程序及适当的筛选方法，把优良的菌株选育出来，这是一种较古老的育种方法，又 是一种方便、费用低、收效较好的育种方法【2 4 , 2 5 。 本研究选用糖化酶活力较强的曲霉与酿酒酵母进行同步糖化与发酵，通过筛选确定 出一株高产0 【- 半乳糖苷酶的米曲霉菌株，并通过紫外线和亚硝基胍诱变，进一步提高酶 活力。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要仪器 l s b 5 0 l 立式圆形压力蒸汽灭菌器上海医用核子仪器厂 p y x d h s 隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械厂 回转式恒温摇瓶柜上海新星自动化控制设备成套厂 7 2 1 分光光度计上海第三分析仪器厂 p h s 2 5 酸度计 上海天达仪器厂 数显式恒温水浴锅上海申顺生物科技有限公司 电子天平梅特勒托利多仪器有限公司 超净工作台苏净集团安泰公司 生物显微镜南京江南光学仪器厂 g t l 一1 6 a l 高速台式离心机江苏省兴化市分析仪器厂 电热鼓风干燥箱上海第二五金厂 2 2 2 茵种及材料 米曲霉l 一0 9 ( a s p e r g i l l u so r y z a el 一0 9 ) 和黑曲霉s l 一0 9 ( a s p e r g i l l u sn i g e rs l - 0 9 ) 为本 实验室分离保藏的菌株：两株菌分别采用黄豆汁和马铃薯琼脂培养基斜面培养，4 c 保 藏，每月转接一次。 塞尔维亚酵母z 一0 6 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ez 0 6 ) ：本实验室分离、驯化并保藏； 采用麦芽汁琼脂培养基斜面上培养，4 保藏。 大豆异黄酮废水：由山东长润生物有限公司提供。 2 2 3 主要材料与试剂 马铃薯农贸市场购买 第二章产a - 半乳糖首酶曲霉高产菌株的选育 “一 萸显 蛋白胨 酵母膏 琼脂 葡萄糖 棉子糖 亚硝基胍( n t g ) 去氧胆酸钠 3 ，5 二硝基水杨酸 酒石酸钾钠 苯酚 亚硫酸钠 m g s 0 4 。7 h 2 0 n a n 0 3 h 2 s 0 4 k c l f e s 0 4 7 h 2 0 k e h p 0 4 3 h 2 0 n a e h p 0 4 n a h 2 p 0 4 k h 2 p 0 4 2 2 4 培养基及试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 农贸市场购买 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 百灵威 s i g a m a s i g a m a 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海联试化工试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 ( 1 ) 棉子糖选择性培养基( g l ) ： n a n 0 33 ，k c io 5 ，k 2 h p 0 4 - 3 h 2 01 ，f e s 0 40 1 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，棉子糖2 0 ， k h 2 p 0 42 ，琼脂2 0 。p h 6 7 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 ( 2 ) 麦芽汁培养基【2 6 1 ( 3 ) 马铃薯葡萄糖培养基( g l ) ： 马铃薯2 0 0 ，葡萄糖2 0 ，琼脂2 0 。p h 自然，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 ( 4 ) 黄豆汁琼脂培养基： 豆汁2 0 0 m l ( 2 0 9 黄豆加水2 0 0 m l 浸提过液，煮沸2 h ，用纱布过滤即可) ，蔗糖6 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，k 2 h p 0 4 。3 h 2 00 0 8 9 ，琼脂4 9 ，p h 自然，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 ( 5 ) 酵母种子培养基( g l ) 酵母膏1 0 ，蛋白胨2 0 ，葡萄糖2 0 ，自然p h ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 ( 6 ) 曲霉摇瓶产酶培养基：大豆异黄酮废水：水为1 ：9 稀释，自然p h ，1 2 1 灭菌1 5m i n 。 ( 7 ) 发酵培养基：大豆异黄酮废水，稀释一倍，自然p h ，1 2 1 灭菌1 5m i n 。 ( 8 ) 3 ，5 二硝基水杨酸溶液： 9 江南人学硕十学位论文 6 3 9 3 ，5 - 二硝基水杨酸和2 6 2 m l2 m o l ln a o h 加到酒石酸钾钠的热溶液中( 1 8 2 9 酒 石酸钟钠溶于5 0 0 m l 蒸馏水) ，再加5 9 重蒸酚和5 9 亚硫酸钠于上述溶液内，搅拌使溶 解。冷却后以蒸馏水定容到1 0 0 0 m l ，储于棕色瓶中。 ( 9 ) 1 棉子糖溶液： 准确称取棉子糖1 0 0 0 9 ，用磷酸盐缓冲液定容至1 0 0 m l ，配制成1 的底物溶液， 低温保存。 ( 1 0 ) 0 2 m o l l 磷酸盐缓冲液( p h 5 o ) ：取0 2 m o l l 磷酸二氢钠溶液一定量，用n a o h 试 液调节p h 至5 0 即得。 q 1 ) o 2 葡萄糖标准溶液： 取1 0 5 。c 干燥2 h 的恒重的葡萄糖o 2 9 ，加蒸馏水溶解并定容至1 0 0 m l 。 2 3 实验方法 2 3 1 诱变方法 ( 1 ) u v 诱变 孢子悬浮液的制备：取3 0 。c 培养3 d 的斜面菌种，加无菌生理盐水洗下孢子，两层 擦镜纸过滤至盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，3 0 0 、1 0 0 r m i n 振荡1 2 h 使孢子分散，将其 浓度调至1 0 6 m l 。 诱变：吸取1 0 m l 单孢子悬浮液于直径为9 c m 的培养皿中，磁力搅拌下距1 5 w 紫 外灯1 0 c m 照射不同时间，适当稀释，取o 1 m l 涂布棉子糖选择性平板。 ( 2 ) n t g 诱变 孢子悬浮液的制备：取3 0 c 培养3 d 的斜面菌种，加入无菌p h 6 0 的磷酸缓冲液洗 下孢子，两层擦镜纸过滤至盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，3 0 、1 0 0 r m i n 振荡1 2 h 使孢 子分散，将其浓度调至1 0 6 m l 。 诱变：加入等体积的孢子悬浮液于l m g m l 的n t g ( 用p h 6 0 的磷酸缓冲液配制) 溶液中，3 0 、1 0 0 r m i n 振荡3 0 m i n ，立即稀释1 0 0 0 倍停止作用，然后以1 0 一、l o 一、 1 0 4 三个稀释度分别吸取l m l 涂布棉子糖选择性平板。 2 3 2 茵种选育的方法 ( 1 ) 旺半乳糖苷酶高产菌株的初筛 分别取实验室分离保藏的一株黑曲霉和两株米曲霉，用无菌水洗下，稀释并均匀涂 布于棉子糖选择性平板上，3 0 。c 培养4 8 h ，选择较大的菌落进行摇瓶实验，检测口半乳 糖苷酶活力，选出酶活较高的菌株继续进行酒精发酵实验，检测其对酵母活力和耐酒精 能力提高的程度，筛选出用于进一步诱变的菌株。 ( 2 ) 产酶实验 将lm l 曲霉孢子悬液( 1 0 6 个m l ) 接入装有1 0 0 m l 培养基的5 0 0m l 烧瓶中，3 0 ，摇瓶( 1 4 0r m i n ) 培养。定时取样，用p h = 5 0 的磷酸盐缓冲液稀释，5 , 0 0 0r m i n 离 心5r a i n ，取上清液进行酶活的测定。 1 0 第二章产q 一半乳糖苷酶曲霉高产菌株的选育 ( 3 ) u v 与n t g 复合诱变 先作诱变剂对菌株的致死曲线，选择诱变剂量，再进行诱变育种。将诱变后的菌株 接种在棉子糖选择性培养基上培养，以菌落大小挑选产酶较强的菌株，然后进行摇瓶复 筛。 ( 4 ) 酵母种子的制备 从斜面上取一环酵母接入装