（化学工程专业论文）米曲霉综合利用与固定化氨基酰化酶拆分乙酰dl蛋氨酸.pdf

摘要 本文系统地研究了应用固定化氨基酰化酶拆分乙酰d l 蛋氨酸这一课 题。首先研究了从实验室液相培养的米曲霉菌体中综合提纯胞内氨基酰化酶 和胞外。一淀粉酶的具体步骤及操作条件。确定了氨基酰化酶提取液的组成， 通过分步盐析、透析和浓缩使氨基酰化酶纯化了2 i 倍，单位酶活可达 1 0 0 0 w m ，总收率为7 7 9 。确定了a 淀粉酶是米曲霉产的胞外酶，使用丙 酮沉淀法从发酵液中提取0 淀粉酶，得到的酶粉( 含高岭土) 酶活2 9 1 2 u g ， 收率为8 9 。8 。 使用实验室制各的氨基酰化酶溶液进行了固定化研究，对国产弱碱性大 孔阴离子交换树脂d 3 8 0 、d 3 9 2 及新研制的甲基丙烯酸酯类弱碱型树脂w b 、 g m a 、e i - i 和d e a e - e h 的固定化效果进行了比较，测得d e a e ，e h 载体的 酶活收率和吸附效果最佳，固定化酶活力可达1 4 0 0 1 5 0 0 u g ，且近似于定向 固定化。考察了固定化酶的最适反应温度、p h 值、热稳定性和表观动力学常 数k ：和吒。研究了该新型固定化氨基酰化酶拆分乙酰d l 一蛋氨酸反应的动 力学性质，并从理论上探讨了有关机理。将实验结果与e a d i e - h o f s t e e 图对照， 判断出反应体系中产物l - 蛋氨酸的抑制类型为竞争性抑制，副产物乙酸的抑 制类型为非竞争抑制，并求解了底物、产物和副产物的抑制常数。 设计了固定化酶填充床反应器，研究了料液流速及底物浓度对反应器出 口转化率的影响。对固定床反应器中的连续拆分反应进行了模拟，模型计算 结果与实验值吻合较好。乙酰l 。蛋氨酸在料液流速为6 m l h ，底物浓度为 0 1 m o l l 情况下出口转化率为9 8 4 8 。考察了系统的操作稳定性，3 7 c 下其 半衰期为2 7 d a y 。 关键词：提纯，固定化，氨基酰化酶，蛋氨酸，光学拆分 a b s t r a c t t h eo p t i c a lr e s o l u t i o no fn m c e t y l - d l m e t h i o n i n eu s i n gt h ei m m o b i l i z e d a m i n o a c y l a s ei ss y s t e m a t i c a l l y s t u d i e di nt h ep a p e r e n d o c e l l u a ra m i n o a c y l a s eo f a s p e r g i l l u so r y z a e h a sb e e np u r i f i e db ( n h 4 ) 2 s 0 4f r a c t i o n a t i o nf o l l o w e db y d i a l y s i sa n dc o n c e n t r a t i o n t h ec o m p o n e n t so fe x t r a c t i o ns o l v e n ta r ec o n f i r m e d ， a n dt h ep u r i f i c a t i o nf o l di s2 1 ，t h ee n z y m ea c t i v i t yi s1 0 0 0 u m l ，t h er e c o v e r yi s 7 7 9 a s p e r g i l l u so r y z a ei sf o u n d t os e c r e t e - a m y l a s ei nl i q u i dc u l t u r e b y a c e t o n ef r a c t i o n a t i o nt h e a a m y l a s ep o w d e r sa c t i v i t y i s2 9 1 2 u ga n dt h e r e c o v e r yi s8 9 8 as e r i e so fw e a kb a s et y p ea n i o oe x c h a n g e r sh a v eb e e nu s e dt oa d s o r b a m i n o a c y l a s ep u r i f i e d a b o v e t h er e s u l ti st h a tt h en e wp r e p a r e dd e a e e h o b t a i n se x c e l l e n ti m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t ya n dr e t e n t i o np e r c e n t a g e t h e o 皿m l m lt e m p e r a t u r ea n dp ho ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ea r em e a s u r e d a n d c o m p a r e dw i t ht h e f l e e e n z y m e t h ek i n e t i c c h a r a c t e r s k 。a n d 吒o f t h e t m s y m m e t r i c a th y d r o l y s i so fn - a o e t y l - d l m e t h i o r d n ea r ee x p l o r e dt h e o r e t i c a l l y a n de x p e r i m e m a l l y b yc o m p a r e dt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sw i 也e a d i e h o f s t e e f i g u r e s i ti ss h o w n t h a tt h eh r l do fi n h i b i t i o no fl - m e t h i o n i n ew a s c o m p e t i t i v e a n dt h eb y - p r o d u c ta c e t i ca c i dw a s n o n c o m p e t i t i v e ，a n d t h ek i n e t i cp a r a m e t e r s l e c a l c u l a t e d f u r t h e r m o r e 。a nl m m o b i l i z e d - a m i n o a c y l a s ep a c k e db e dh a sb e e n d e s i g n e d t o h y d r o l y z en - a c e t y l - d l m e t h i o n i n ec o n t i n u o u s l y a m o d e lo f i m m o b i l i z e d a m i n o a c y l a s ep a c k e d b e di se s t a b l i s h e da n dt h es i m u l a t i o n c o m p u t a t i o n i sc o n s i s t e n tw i t ht h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t si n p r i n c i p l e 。u n d e r c o n d i t i o n so f6 m l ht i c wr a t ea n do 1 m o l ls u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n ，t h e c o n v e r s i o np e r c e n ti s9 8 ，4 8 t h es t a b i i i t yo ft h er e s o l u t i o ns y s t e mh a sb e e n s t u d i e da n dt h eh a l f - l i f eu n d e r3 7 。ci s2 7d a y s ： k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u so r y z a e ，p u r i f i c a t i o n ，i m m o b i l i z a t i o n ，a m i n o a c y l a s e ， m e t h i o n i n e ，o p t i c a lr e s o l u t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘壅盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：j 袋葡t 屯e 签字日期：7 口才年f 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨壅盘茎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫韭盘生可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：4 智j 确扛匠 签字日期：w 广d 年f 月7 日 导师签名：稍、 签字日期：3 ，年1 月7e l 第章文献综述 1 1 l 蛋氯酸的制备 第一章文献综述 l 一蛋氨酸 z i ( m e t h i o n i n e ) ，又称甲硫氨酸，即甲硫基丁氨酸( a a m i n o v - m e t h l m e c a p t o b u t y r c i a c i d ，2 a m i n o - 4 一m e t h y l t h i o b u t a n o i c a c i d ) ，c 5 h l l n 0 2 s ，分子量为 1 4 9 2 0 7 ，结构式c h 3 s c h 2 c h ( n h 2 ) c o o h 。l 蛋氨酸从稀醇中结晶成六方片晶，熔点 2 8 0 2 8 1 ，解离常数( 2 5 ) ：p k l = 2 2 8 ；p k 2 = 9 2 1 ，等电点为5 7 4 ( 2 5 ) ，能 溶于水，但其晶体先呈抗水性，不溶于醇、醚、苯。 蛋氨酸是一种含硫最丰富的氨基酸，它在大多数的蛋白质中含量高达2 4 ， 是一种必需氨基酸，在生物学甲基化中起重要作用。早期蛋氨酸的主要用途是作为饲 料和食品添加剂，通常饲料食品中缺乏蛋氨酸，不能达到氨基酸平衡的营养标准，影 响其营养价值。添加一定量的蛋氨酸，可大大提高其营养价值。近年来随着科技的飞 速发展，l 一蛋氨酸的用途越来越广泛，在医学上，蛋氨酸是人体必需氨基酸之一，它 可作为蛋氨酸缺少的病人或蛋白质吸收不足的肝脏病人的蛋白质营养补充剂【2 j ；l 一蛋 氨酸还可以用来治疗婴儿尿布疹，以及与肌醇、胆碱配合可用来治疗高胆固醇血症和 动脉粥样硬化等病症。蛋氨酸具有抗脂肪肝作用，可用于生产保肝制剂。工业上，蛋 氨酸还具有乳化性，可用于照相技术中。随着l 一蛋氨酸应用领域的不断扩展，国内 市场需求量也在飞速增长，近两年来进口量已超过万吨。目前国内仅有渤海罗纳普朗 克蛋氨酸有限公司和几家小厂生产蛋氨耐卦，产品远不能满足当前市场需求，绝大部 分产品依赖进口。且目前蛋氨酸还不能用发酵法生产，而水解法由于含量少很难分离， 因此被认为是稀缺的氨基酸品种。目前，只有采用化学合成法生产，而在很多情况下， 通过化学合成法只能得到一氨基酸的消旋混合物。要得到具有光学活性的l 一蛋氨 酸，采用光学拆分方法是必要的【4 】。氨基酸的光学拆分方法可以分成两种类型：一种 是使用氨基酸的立体特异性的物理或化学方法，如：结晶法、色谱法、化学拆分法、 萃取法等1 5 】：另一种是建立在活细胞中氨基酸的特性上的生物法或酶法。 1 结晶法 结晶法是最早被使用的拆分方法【6 j ，也是目前工业上应用比较广泛的拆分方法。 该方法是利用化合物的消旋异构体在一定温度时较外消旋体的溶解度小，易析出的性 质，在外消旋体的溶液中加入某一种旋光异构体作为晶种，诱使与晶种相同的异构体先 行析出，以此达到分离目的。由于该方法的操作条件不容易控制，在拆分过程中，往 往因对映体浓度的增加而导致夹带析出现象，因而不能很好地保证光学纯度。 第一章文献综述 2 化学拆分法 化学拆分法又称为非对映体盐法，是通过有机酸、碱形成的非对映体盐经逐级结 晶而拆分手性化合物的一种方法。该法一直是制各手性化合物最重要和最普遍的方法 之一 7 1 。在这种拆分方法中，化学拆分剂的筛选、回收以及新型手性拆分剂的设计和 合成是此种拆分方法的关键。长期以来，化学拆分法一直存在着拆分剂筛选上的盲目 性，并且在拆分化合物的类型上也存在着一定的局限性。且目前还没有用此法成功拆 分d l 一蛋氨酸的报导。 3 萃取拆分法 萃取拆分法 5 1 是利用萃取剂与拆分物中的两对映体的亲和作用力的差异或化学作 用的差异来进行拆分的一种新型方法。萃取拆分法除具有传统液- 液萃取技术的特点 外，还可以实现萃取拆分过程与外消旋化反应一体化，从而克服了单纯外消旋过程的 严重缺陷。不过，与传统的萃取过程相比，最大的区别在于拆分过程中所选择的萃取 剂是具有手性的。因而，萃取剂的选择也是拆分过程中的关键所在，也是目前研究的 热点。 4 色谱法 用手性固定相拆分外消旋氨基酸衍生物具有较好的效果，色谱法拆分纯度最高， 成本也较高，主要是用于分析与小规模制备嘲。 5 酶法拆分法 近年来，随着酶技术的发展，利用酶的高度立体选择性进行外消旋体的拆分，从 而获得光活性纯的化合物已成为制备手性药物的重要途径p l o l 。酶由其活性中心，构 成了一个不对称环境，有利于自旋体的识别。酶作为天然的手性催化剂，用于光学 活性药物的合成颇具有应用潜力。酶法具有拆分效率高和立体选择性高、反应条件温 和、专一性强、操作简单和有利于环保等优点。但由于酶在酸碱性较强的条件下，稳 定性较差，重复利用性差，与底物和反应物分离困难等缺点，阻碍了酶法在实际生产 中的应用。随着细胞和菌体固定化技术的发展和固定化材料的改进，在很大程度上克 j i l t 上述不足。本文即采用固定化氨基酰化酶作为催化剂来生产l 一蛋氨酸，其反应 过程如下： e n z d l c h 3 8 ( c h 2 ) 2 f h c o o h + h 2 0 l 。c h 3 s ( c h 2 ) 2 f h c o o h + d 。c h 3 s ( c h 2 ) 2 f h c h + c h 掘0 0 h n h c o c h 3n h 2n h c o c h s 消旋 l 利用酰化酶 1 2 】( 主要来自曲霉、青霉、假单胞杆菌、酵母以及动物肾脏等) 只 2 第一章文献综述 作用于酰化d l - - 氨基酸的l 一体而对d 一体无作用的原理，先将d l 氨基酸进行酰 化，然后用酶水解，经结晶而将l 一氨基酸同酰化d 一氨基酸分开，余下的酰化d 一 氨基酸可用化学或酶法消旋化后，继续拆分，直到几乎全部的d l 氨基酸转变成l 一型。 1 2 氨基酰化酶的来源 酶是活细胞所产生的一种生物催化剂，是由简单的或者复合的蛋白质构成，能在 温和的条件下高效、专一地催化化学反应。目前己知的酶已达两干余种。生物体内的 新陈代谢，其大部分的化学变化是在酶的参与下有控制地、有秩序地进行，所以没有 酶就没有新陈代谢，也就没有生命活动。虽然酶只由生物体才能合成，但它们可以脱 离生物体而独立存在。 氨基酰化酶( a m i n o a c y l a s e e c 3 5 1 1 4 ) 存在于动植物和微生物中旧”，1 5 】。主 要用于拆分酰化一d l 一氨基酸，生产l 一氨基酸和d 一氨基酸。1 9 5 7 年g r e e n s t e i n 【l 驯 报道利用猪肾中的酰化酶i 拆分4 0 余种酰化一d l 一氨基酸，每种氨基酸及其异构体 产率达6 0 9 0 ，含量9 9 9 。从动物肝脏和。肾脏中提取氨基酰化酶的过程为，将 新鲜的猪肾在低温下绞碎，然后用冰水不断搅拌提取，将提取液离心分离，除去细胞 碎屑，上清夜经透析除去游离的氨基酸等物质，即可测定其提取液酶活力。该上清夜 还需经多步纯化处理才可得到粗酰化酶。用这种方法制备氨基酰化酶受到其来源的限 制，而且提取纯化的过程也很复杂。因此，人们试图寻找其它途径获得氨基酰化酶。 首先以细菌作实验，发现发酵液中有氨基酰化酶，但酶活力很低。后来对米曲霉 ( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 作实验，发现米曲霉有较高的酶活，c h i b a t a 等人【1 6 】比较霉菌 6 0 余不同菌种的酰化酶活力，发现米曲霉n o 9 活力最高，葡酒色青霉菌( p e n ，v i n a c e u m ) 次之，酵母( b r e w e r sy e a s t ) 酰化酶活力高，但纯化方法不如霉菌简便，大肠杆菌 ( e c o l i k 1 2 ) 酰化酶活力低，仅能不对称水解少数酰化氨基酸。k a r n a d a t l ”比较了1 7 个 假单胞菌( p s e u d o m o n a s es p ) 种酰化酶的专一性，多数菌种酰化酶水解并非不对称性， 少数菌种能不对称水解2 0 余种氨基酸酰化衍生物，尚未做过纯化研究。c h i b a t a 等人 1 8 】进一步研究了米曲霉菌的氨基酰化酶与4 0 多种载体固定化的效果，以d e a e 一葡聚 糖凝胶a 2 5 制得的固定化酶活力最高，产率最好，并将此技术用于工业生产5 种l 一氨基酸，1 0 0 0 升酶柱月产量1 0 3 2 吨。不同来源的酰化酶拆分不同氨基酸时的相 对活力的比较见表1 1 。 目前国内大多以米曲霉6 0 2 和3 0 4 2 菌株为酶源，米曲霉所产的氨基酰化酶水解 酶的结构中含有两个亚基，分子量约7 3 ，2 0 0 ，等电点4 0 ，在p h = 7 1 0 之间稳定【l9 】。， 3 第一章文献综述 作为产酶菌株米曲霉含有多种酶系，除氨基酰化酶以外还有a 一淀粉酶【2 0 i 、蛋白酶 2 1 1 、木聚糖酶口2 1 、磷酸酶2 3 l 、半乳糖苷酶 2 4 1 、羧肽酶【25 1 、糖甙酶1 2 6 1 、核酸酶刚、 植酸酶 2 8 l 、果胶酶【2 9 等。本文希望能在提取氨基酰化酶的同时综合利用其他的酶。 表1 1 不同来源的酰化酶霉菌相对活力对比8 1 1 1 1 11 ：!里i 塑! 兰! ! ! 坐! 呈苎! 型竺! ! ! ! 型监! ! ! i 丝竺! ! 苎i ! 坐! ! 竺! ! ! 酰化氨基酸6猪肾a s p p e n 酵母菌大肠杆菌 酰化酶 o r y z 。 v i n4 ( b r e w e e r s ) 饵c o l i k 一1 2 ) a ：以乙酰一蛋氨酸为1 0 0 活力： c ：a s p o r y z 为米曲霉菌n o 9 中酰化酶 1 3 酶的分离与纯化 b ：表中氨基酸均为d l 型； d ：p e n v i n 为葡酒色青霉菌中酰化酶。 就目前而言，酶的纯化过程还是一门实验科学。酶的纯化过程一般包括以下步骤 d 0 ：( 1 ) 建立一个适当的测活方法：( 2 ) 选择含酶丰富、取材方便、经济的酶源；( 3 ) 酶的提取；( 4 ) 酶的提纯；( 5 ) 酶的纯度检验。 微生物酶有的存在于细胞内部，有的透出细胞壁存在于细胞外部。工业上使用的 酶制剂，一般是使用量较大，纯度不高，通常在提取过程中包括如下步骤：如果是胞 内酶，首先分离收集其菌体，使之破碎，将酶抽提至液相之中，这就是出发酶液；如 果是胞外酶，它的深层发酵液或固体培养物的抽提液就是出发液。制取工业酶制剂的 第一步就是除去出发酶液中的悬浮固形物，获得澄清的酶液。考虑到后续步骤的经济 性，一般用减压浓缩法进行适当程度的浓缩。第二步，根据质量的要求和经济性采用 适当的沉淀手段将酶沉淀分离( 如盐析淀法等) 。第三步是收集沉淀，干燥，研磨成 粉，加适当的稳定剂，填充剂等，做成粉末制剂。 如果是生化研究用酶，则要求特别高的纯度，达到接近于单一蛋白的程度。要达 到这一点，还必须采用精制手段如凝胶过滤，层析，电泳，超过滤等技术口”。 1 3 1 细胞破碎 米曲霉3 0 4 2 氨基酰化酶主要是胞内酶，存在于细胞之内。为了将其提取和分离 4 第一章文献综述 就要将细胞组织破碎。常用的细胞破碎方法f 3 2 1 主要有：机械方法、物理方法、化学方 法及酶法等。 1 机械破碎方法 通过机械运动所产生的剪切作用力，使细胞破碎的方法。常有的有下列几种：( 1 ) 高速组织捣碎机利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎：( 2 ) 匀浆器 用于破碎那些比较柔软、易于分散的组织细胞的器具；( 3 ) 研磨器将预破碎的细胞 置于钵体中，反复研磨将细胞组织研碎。加入少量的石英砂则效果更好。研磨器常用 于微生物与植物细胞的破碎。 2 物理破碎方法 通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。常有的物理因素有：温度、 压力、超声波等。( 1 ) 温度差破碎法通过温度的反复变化而使细胞破碎。此法对热 敏性酶的提取不适用；( 2 ) 压力差破碎法通过压力的变化而使细胞破碎。此方法适 于细胞壁柔软、易分散的；( 3 ) 超声波破碎法通过超声波的作用，使细胞结构解体， 该法多用于微生物细胞的破碎。对于如氨基酰化酶等对温度敏感的酶系，在破碎过程 中要考虑和避免升温。 3 化学破碎方法 通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。常 用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。有机溶剂主要有丙酮、甲苯、丁 醇、氯仿等。常用的表面活性剂有十二烷基硫酸钠( s d s ) 、氯化十二烷基吡啶、特 里顿( t r i t o n ) 、吐温( t w e e n ) 和去氧胆酸钠等。 对于米曲霉细胞破碎的系统性研究尚未见报道，常见的方法为机械破碎方法。 1 3 2 酶的提取与沉淀分离 1 3 2 1 影响提取的因素 提取是在一定的条件下用一定的溶剂处理样品，使预分离的物质充分释放到溶液 中的过程，又称为抽提或萃取 3 3 j 。影响提取效果的主要因素是被提取物在所用溶剂中 溶解度的大小以及该物质向溶剂相扩散的难易。大多数酶能溶于水或稀盐、稀碱、稀 酸溶液中，因此提取时一般采用水溶液提取。其中稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质的溶 解度大，稳定性好，在酶提取过程中常采用。提取时要注意控制好盐浓度、温度、p h 值等因素。c h i b a t a 等人【l8 】用o 0 5 m ，p h 7 0 的磷酸缓冲溶液从固相培养的米曲霉n o 9 中提取氨基酰化酶，得到活力为2 0 u m l 的出发酶液。 5 第一章文献综述 1 3 2 2 盐析沉淀法 经提取得到的出发酶液中含有各种杂质，必须经过进一步的分离纯化，才能获得 纯度较高的酶。分离纯化的方法有很多，归纳起来主要有四种i 3 l j ：沉淀分离、层析分 离、电泳分离和超速离心分离等，其中后三种主要用于酶蛋白的精制。沉淀分离包括 两种方法：有机沉淀法和无机盐沉淀法。盐析沉淀法是蛋白质和酶分离纯化中应用最 早而且至今仍广泛使用的方法。酶在水溶液中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响，一 般在低盐浓度的情况下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，称为盐溶；而当盐浓度 升高到一定程度后，酶的溶解度随着盐浓度的升高而减少，结果使酶蛋白沉淀析出， 即盐析作用。在某一浓度的盐溶液中，不同酶蛋白的溶解度也不一样，借此可到达彼 此分离的目的。李民勤等人p “，将l k g 米曲霉3 0 4 2 固体培养物加入0 0 5 m ，p h 7 0 的磷酸缓冲溶液6 0 0 0 m l ，室温下搅拌2 h 后用纱布除去残渣，4 下冷冻离心收集上 清液，取4 0 7 0 饱和硫酸铵沉淀蛋白，离心后用缓冲溶液溶解，经过s e p h a d e xg 2 5 柱脱盐得到氨基酰化酶溶液，活力为5 0 0 u m l 。 在从米曲霉中提取氨基酰化酶研究过程中，谢志东】利用聚7 , - - 醇和磷酸盐组成 的水溶液双相系统，经过两步萃取得到的酶液活力为1 2 7 f f m l ，收率9 0 ，纯化倍数 9 ，为氨基酰化酶的提取提供了新的方法。 1 3 3 米曲霉d 一淀粉酶 如前所述米曲霉是复合酶源，分泌多种胞内和胞外酶。其中n 一淀粉酶含量较高， 且其提纯工艺及检测方法在实验室现有条件下便于实现，因此确定了在提纯氨基酰化 酶的同时提取a 一淀粉酶，实现综合利用米曲霉。 o 一淀粉酶是一1 ，4 一葡聚糖一4 一葡聚糖水解酶( q 一1 ，4 - g l u c a n 一4 g l u c a n o h y d r o l a s e e c3 2 1 1 ) ，它作用于淀粉时，可从分子内部切开d 一1 ，4 键而生成糊精和还原糖。 产物的末端葡萄糖残基c 1 碳原子为c t 一构型，故称a 淀粉酶口“。在我国a 一淀粉酶被 广泛应用于食品、酿造、制药、纺织以及石油开采等许多方面。近年来，为了实现啤 酒和麦芽糖浆生产中淀粉的水解，越来越多的人对米曲霉n 一淀粉酶感兴趣。霉菌的 a 一淀粉酶大多采用固体曲法生产；细菌n 一淀粉酶则以液体深层发酵为主。a 一淀粉 酶的提取方法 3 7 , 3 8 1 目前主要有以下五种：( 1 ) 超过滤浓缩试验( 2 ) 酒精沉淀试验( 3 ) 丙酮沉淀试验( 4 ) 硫酸铵沉淀试验( 5 ) 冷冻干燥试验。从下表1 2 中可以看出不 同方法对酶活力及收率的影响。 6 第一章文献综述 表1 - 2n 一淀粉酶提取方法的比较 t a b l e l - 2 c o m p a r i s o n o f v a r i o u sa b s t r a c t i o nm e t h o d s 提取方法试剂用量酶活力总收率( ) 超过滤浓缩3 次8 7 6 8u m l9 0 5 硫酸铵沉淀 7 0 9 0 67 0 1 3 u m l4 5 4 酒精沉淀 1 ：2 4 。 2 4 1 8 7 u g 5 5 2 丙酮沉淀 l ：1 2 。 2 3 5 7 6 u g 9 4 1 注：a ：超过滤浓缩次数b ：7 0 9 0 为硫酸铵饱和度c ：粗酶液与溶剂比 从表卜2 中可以看出，丙酮沉淀方法效果最好，在本文中即采用此方法提纯n 淀粉酶。 1 4 固定化氨基酰化酶 日本从1 9 5 4 年就开始用氨基酰化酶拆分乙酰d l 氨基酸，得到l 一氨基酸。但遇 到了一系列的困难，因为酶是一种蛋白质，稳定性差，对热、强酸、强碱、有机溶剂 等均不够稳定 3 9 】，即使在酶反应最适条件下，也往往会很快失活，随着反应时间的延 长，反应速度会逐渐下降，反应后又不能回收，而且只能采用分批生产。因此造成了 产品分离纯化困难、劳动成本高、反应难以控制等问题 4 0 o 到了6 0 年代末期，由于 固定化酶技术的发展，得到了固定化氨基酰化酶，从而实现了酶法连续拆分混旋氨基 酸的工业化。 固定化酶与自由酶相比有以下优点 4 1 , 4 2 1 ： ( 1 ) 反应完成后经过滤或离心等简单的方法就可以回收，重复使用，降低了酶制 剂的成本； ( 2 ) 可以装成酶柱，当底物溶液流经酶柱时，就能发生酶促反应，适合于工业化； ( 3 ) 酶经过固定化后，稳定性一般都有所提高。 固定化酶是束缚在一定空间内的酶 4 3 , 4 4 1 ，通过化学或物理的手段将原来溶于水的 自由酶与载体结合起来成为不溶于水但仍具有生物活性的生物催化剂。如图1 1 所示 酶的固定化方法主要有四种：包埋法( e n t r a p m e n t ) 、吸附法( a d s o r p t i o n ) 、共价法 ( c o v a l e n tb i n d i n g ) 、交联法( c r o s s l i n k i n g ) 。 7 第一章文献综述 70 墨盈舀舀芒足墨卫巴口年圈 包埋法交联法吸附法共价法 图1 - 1 酶的固定化方法示意图 f i g u r e l 一1 s c h e m a t i cd r a w i n go f i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s 包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中。这样可以防 止酶蛋白释放，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触。此法比较简便，酶分子仅仅是 被包埋起来，生物活性破坏少，但此法对大分子底物不适用。 吸附法是最简单的方法，也是经济上最具有吸引力的技术。酶与载体之间的亲和 力是范德华力、离子键和氢键。此方法又可分为物理吸附法和离子吸附法。使用吸附 法制备的固定化酶催化荆可再生。 共价法是酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价 键连接的方法。其优点是酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，但反应条件激烈， 操作复杂，控制条件苛刻。 交联法，使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维 交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶。与共价结合法一样，都是靠化学结合 的方法使酶固定化。其区别在于交联法使用了交联剂。常用的交联荆有戊二醛、鞣酸。 在固定化酶研究过程中的两个重要因素是固定化载体和固定化方法，因此研究 工作也集中在这两个方面。固定化载体有许多种，总体而言可以分为两大类，即有机 载体和无机载体f 4 ”，见表1 3 。有机载体的表面有许多活性基团，如，o h 、一n h 2 、一c o o h 等，因此被认为是很好的固定化酶的载体。无机材料中含有各种氧化物，具有很高的 热稳定性和很好的流动性，并因此而受到重视。有一类无机载体在溶液中，它们的表 面被水解，形成的一o h ，可以直接与- n i l 2 或一c o o h 反应，这类载体被称为非嫁接的。 而另一类无机载体则需要在其表面接上有机化合物，才可以与酶反应形成固定化酶， 这类无机载体称为嫁接的，所有的特殊的有机化合物为偶联试剂。 8 第一章文献综述 表1 - 3 固定化载体分类 t a b l e l 3c l a s s i f i e di m m o b i l i z a t i o nc a r r i e r s 有机载体无机载体 卡拉胶c a r r a g e e n a n氧化铝a l u m i n a 纤维素c e l l u l o s e 氧化锆 z i r c o n i a 多琼脂 a g a r 非 嫁 氧化镁m a g n e s i a 糖果胶p e c t a t e 氧化硅s i l i c a 琼脂糖a g u r o s e 接 的 玻璃 g l a s s 葡聚糖s e p h a d e x陶瓷c e r a m i c s 蛋白质 骨胶c o l l a g e n 铁磁体 f e r r o m a g n e t s 口 丙稀酰胺a c r y l a m i d e 成 酚醛树脂p h e n o l i c嫁 的 r e s i n接用各种偶合剂 聚 聚脂p o l y s t e r u m e 的 合 聚合物p o l y m e r s 物 从载体材料特性和大量关于多种酶的固定化方法的资料中，归纳出选用固定化方 法的一般依据见表1 4 ，可作为基本的使用原则。 表1 - 4 各种固定化方法的比较 项目制法酶活力结合力再生制法普遍性固定化成本 包埋法难高强不可高低 吸附法易高中可能高低 共价法难高强不可高高 交联法难中强不可高中 可以看出，固定化方法和固定化载体是很多的，但是没有种方法是对任何一种 酶都普遍适用且效果很好的a 因为各种酶的化学性质和组成差别很大，底物和产物性 质不同，产物的用途也不一样。因此，根据不同的要求，对一种酶的固定化载体及方 9 第一章文献综述 法的选择都必须通过实验来确定，筛选工作是大量而复杂的。， 对于氨基酰化酶的固定化，日本做了比较系统的工作，对多种固定化方法及载体 进行了考察，部分研究结果 4 7 , 4 8 见表1 5 。 表1 - 5 各种固定化酶及其活力 方使用的酶液固定化酶 法 固定化载体 总活力( u ) 总酶活( u )活力收率( ) 物 a c t i v a t e dc a r b o n 1 2 1 000 理 a c i d i ca l u m i n u mo x i d e 1 2 1 0i31 0 n e u t r a la l u m i n u mo x i d e 1 2 1 01 00 8 吸 b a s i ca l u m i n u mo x i d e 1 2 1 0o0 附 1 2 1 000 s i l i c ag e l p a b c e l l u l o s e1 2 1 000 e c t e o l a - c e l l u l o s e1 2 1 02 9 32 4 2 t e a e - c e l l u l o s e1 2 1 06 2 35 1 5 离 d e a e c e l l u l o s e1 2 1 06 6 85 5 2 c m s e p h a d e x c - 5 01 2 1 00o 子 s e - s e p h a d e x c 一5 01 2 1 000 健 d e a e - s e n h a d e xa 2 51 2 1 07 1 35 8 9 d e a e s e p h a d e x a 一5 01 2 1 06 8 05 6 r 2 a m b e r l i t ei r c - 5 01 2 1 0o0 a m b e f l i t ei r - 4 b1 2 l oo0 d i a z o t i z e dp a b c e l l u l o s e1 2 1 06 45 3 d i a z o t i z e da r y l a m i n o g l a s s1 2 1 05 2 54 34 d i a z o t i z e de n z a c r y la a1 2 1 04 43 6 共 c m - c e l l u l o s ea z i d e1 2 1 000 价 b r c n - a c t i v a t e dc e l l u l o s e1 2 1 01 21 o 健 b r c n - a c t i v a t e ds e p h a d e x1 2 1 01 51 2 c h l o r o a c e t y ic e l l u l o s e 1 2 1 01 3 71 1 3 b r o m o a o e t y lc e l l u l o s e 1 2 1 03 3 92 8 0 i o d o a c e t y lc e l l u u o s e 1 2 1 04 7 23 9 0 偶 a e c e l l u l o s e 联 1 ，4 一b u t y l e n ed i b r o m i d e 1 4 4 0604 法 1 ，4 - b u t y l e n ed i c h l o r i d e 1 4 4 0604 l o 第一章文献综述 d i c y c l o h e x y lc a r b o d i i m i d e 1 4 4 01 71 2 d i i o d o m e t h a n e1 4 4 05o 3 偶 g l u t a r a l d e h y d e 1 4 4 0806 联 h e x a m e t h y l e n ed i i s o c y a n a t e 1 4 4 02 316 法 t o l u e n ed i i s o c y a n a t e 1 4 4 030 2 g l u t a r a l d e h y d e 1 4 4 02 i i1 4 7 t o l u e n e d i i s o c y a n a t e 1 4 4 01 81 3 格子 a c r y l a m i d e 1 0 0 05 2 65 2 6 包埋h p m c p - d e a e 1 0 0 01 9 01 9 o 以上表明，有以下几种方法和载体较好：( 1 ) 通过离子键将氨基酰化酶固定在 d e a e 葡聚糖凝胶上，酶活力收率可达到5 8 9 ；( 2 ) 通过共价键将氨基酰化酶固定 在碘乙酰纤维素上，酶活力收率为3 9 ；( 3 ) 用包埋法将氨基酰化酶固定在聚丙烯 酰胺凝胶中，酶活力收率为5 2 6 。其它载体的固定化酶活很低，不适合工业生产中 的应用。为了选择合适的工业化方法，对上述三种固定化方法又进行了系统研究【1 ， 并进行比较，结果如下表1 - 6 。 表1 - 6 各种固定化氨基酰化酶的性质4 t a b l e l 一6c h a r a c t e r so f v a r i o u si m m o b i l i z e d a m i n o a c y l a s e 固定化酶 性质自由酶 d e a e - s e p h a d e x 碘乙酰纤维素聚丙稀先酰胺 最佳p h 值 7 5 8 07 07 5 8 07 0 最佳温度( ) 6 07 25 56 5 活化能( k c a l m 0 1 )6 97 o3 9 53 最佳c 0 2 + 浓度( r a m )0 50 50 5 0 5 k m ( m m )5 78 76 75 o v m a x ( m o l e h r )1 5 23 3 34 6 52 3 3 6 0 6 2 51 0 07 7 57 8 5 热稳定 1 0 m i n 性o ( )7 0 1 2 58 7 56 2 53 4 5 1 0 m i n 操作稳定性 5 0 6 5 d a y 3 7 4 8 d a y ( 半衰期) 。 第一章文献综述 a 所有分析在3 7 1 2 ，p h = 7 0 的条件下进行，底物为乙酰- - d l - - 蛋氨酸 b 酶的残余活力 c 酶活为初始值的5 0 时的操作天数。 表卜6 中的结果表明，d e a e s e p h a d e x 一氨基酰化酶拆分乙酰- - d l - - 蛋氨酸反应， 最佳p h 值为7 0 ，即中性；最佳温度7 2 。c ，比另外两种都高。关键的是有较高的热 稳定性，这点在工业生产中是非常重要的一个因素。 此外在酶的催化过程中，有的金属离子对酶反应有激活作用，而有的则有抑制作 用【4 9 。在表卜6 中给出了最佳c 0 2 + 离子浓度，是因为c 0 2 + 离子对氨基酰化酶水解乙 酰一d l 一氨基酸时有明显的激活作用。下表卜7 中给出了各种金属离子对自由和 d e a e s e p h a d e x 一氨基酰化酶的影响。在对其它各种固定化酶的研究中，发现c o ”离 子也具有最好的激活作用。 表卜7 金属离子对酶活力的影响 金属离子 脖 无 b a 2 +c e +c d 2 +c 0 2 +f e 2 + h 9 2 + 自由酶 1 0 01 0 59 691 4 61 0 17 7 d e a e s e p h a d e x 1 0 08 07 61 21 4 15 97 固定化酶 从上述各列表中可以看出，用离子健将氨基酰化酶固定在d e a e s e p h a d e xa 一2 5 上，固定化的酶活可达到7 0 0 u h ：g ，应用到工业生产l 一氨基酸较其它固定化酶更优。 k o n gh l e e 等人 s o , 5 1 l 将氨基酰化酶包埋在海藻酸钙小球中，并且小球表面上再包裹 一层聚赖氨酸或壳聚糖，可以显著提高载体的寿命，并有效地解决了酶泄漏的问题。 国内对于氨基酰化酶的研究始于二十世纪八十年代初，从固体培养得到米曲霉中 提取胞外氨基酰化酶。武汉大学生命科学院 5 2 1 、清华大学f 5 ”、南开大学高分子研究 所 s 4 , s 5 】、吉林大学酶工程国家重点实验室口6 l 曾做过氨基酰化酶的固定化研究。用吸附 法将酶固定在d e a e s e p h a d e xa 一2 5 或国产大孔树脂d 3 8 0 、功能基化丙烯酸甲酯二 乙烯基苯交联共聚物上，可以拆分多种天然氨基酸，但对固定化氨基酰化酶的实际应 用情况尚未见报道。d e a e s e p h a d e xa 2 5 是被公认为较好的固定化氨基酰化酶载体， 但在我国这种载体价格比较昂贵，且是进口的。而且d e a e s e p h a d e xa 一2 5 粒径小 第一章文献综述 9 0 - 2 0 0u “5 7 1 、易变形，流体力学性质不是很好。因此，寻找价廉的国产载体，对固 定化氨基酰化酶在我国的应用是很有意义的。 1 5 固定化对酶促反应动力学的影响 要讨论固定化酶催化的反应动力学就必须先对溶液酶反应动力学有一定的了解， 而溶液酶反应动力学的讨论又必须从酶反应的基本动力学关系开始。 1 5 1 米氏方程的推导及意义 对于酶促反应，经常用m i c h a e l i s - - m e n t e n 方程口目( 米氏方程) 来描述其动力学 关系。其理论基础是被较多实验所支持的活性中间络合物学说，即认为酶反应的进行