（生物物理学专业论文）电场对过氧化氢酶分子构象及其酶活性的影响.pdf

内蒙古人学硕一l 二毕业论文 电场对过氧化氢酶分子构象及其酶活性的影响 摘要 本文应用圆二色光谱测定了不同电场强度和不同电场处理时间对过氧化氢酶二级结 构和三级结构的影响，并对其二级结构含量变化以及三级结构与酶活性之间的关系进行了 初步的探讨，为电场作用蛋白酶机理的研究提供了实验与理论依据。 5 0 h z 正弦波电场处理过氧化氢酶，实验研究结果表明： 1 ，处理时间为5 分钟时，二级结构均有不同程度的变化，1 3 一折叠含量在场强为 4 o k v c m 时极显著增加，1 3 一转角在场强为2 o k v c m 时极显著降低，无归卷曲在场强为 2 o k v c m 时显著增加。 处理时间为1 0 分钟时，a 一螺旋含量在电场强度为2 o k v c m 时显著增加，1 3 一折叠 含量在场强为2 o k v c m ，3 o k v c m ，4 o k v a m 时有显著增加。b 一转角含量在 2 o k v c m ，3 o k v c m ，4 o k v c m 时有显著降低。 处理时间为1 5 分钟时，q 一螺旋含量在场强为3 o k v c m 时显著降低，在场强为 1 o k v c m ，2 o k v c m ，4 o k v c m ，5 o k v c m 时显著增加。1 3 一折叠含量在场强为2 o k v c m ， 3 o k v c m ，4 o k v c m ，5 o k v c m 时显著增加。b 一转角含量在2 o k v c m ，4 o k v c m ，5 o k v a m 时显著降低；无归卷曲含量在1 o k v c m ，5 o k v c m 时显著降低。 这表明随着处理时问的增加，电场作用更容易对过氧化氢酶的二级结构产生显著的影 响。折叠和无归卷曲有向q 一螺旋结构和b 一折叠结构转化的趋势，整体趋于有序化。并 且这种趋势随着处理时间的增加越明显。 2 ，酶活性在电场强度为1 o k v c m ，2 o k v c m ，4 o k v c m ，5 0 k v c m ，处理时间为1 5 分 钟酶活性显著增加。处理时间为5 分钟和1 0 分钟时，酶活性没有显著性变化。 3 ，在场强为1 0 k v c m ，2 o k v c m ，4 o k v c m ，5 o k v c m ，处理时间为1 5 分钟时，q 一 螺旋含量和b 一折叠含量都显著增加，酶活显著增加；在场强为3 0 k v c m ，处理时间为1 5 分钟时，a 一螺旋含量显著降低，1 3 一折叠含量显著增加，q 一螺旋和1 3 一折叠总体含量 内蒙古人学硕f ：毕业论文 是增加的但不显著，酶活性有不同程度的增加但不显著；这表明过氧化氢酶活性和g t 一螺 旋和1 3 折叠总体含量有关。 4 ，电场作用对过氧化氢酶的三级结构类型没有影响，而二级结构发生改变，酶活性 发生改变。其可能的原因时电场并没有改变酶活性中心的空问构象( 三级结构) ，只是改变 了酶活性中心的局部构象( 二级结构) ，从而引起酶活性的变化。 关键词：电场：过氧化氢酶； - - 色光谱；二级结构，酶活性 2 内蒙古大学硕l 毕业论文 s t u d yo ft h ee l e c t ricf ie l do nc a t a l a s e c o n f o r m a tio na n dlt sa c t ivlt y a b s t r a c t t h i sp a p e rs t u d i e dt h ee f f e c t so fe l e c t r i cf i e l do nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f c a t ( c a t a l a s e ) b yc i r c u l a rd i c h r o i s mt e c h n o l o g y ，m e a n w h i l et h ee f f e c t so f d i f f e r e n t e l e c t r i cf i e l d s t r e n g t h a n dd i f f e r e n tt r e a t m e n tt i m ew e r ed e t e r m i n e d t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec h a n g e so f t h es e c o n d a r ys t r u c t u r ec o n t e n ta n dt h ee n z y m e a c t i v i t yw a st e n t a t i v e l yd i s c u s s e d t h er e s e a r c ho f f e r e dt h ee x p e r i m e n tb a s i so ft h e f u n c t i o na n dm e c h a n i s mo fe l e c t r i cf i l e do ne n z y m ep r o t e i n m a t ： c a t a l s ew a st r e a t e dw i t h5 0 h zs i n e w a v ee l e c t r i cf i e l d ，t h er e s u l t ss h o w e d 1 ，a f t e r5m i n u t e s ，1 3 - s h e e th a ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t 4 0 k v c m ，- t u r n h a ds i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e da t2 0 k v c m ，r a n d o mc o i lh a ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t 2 0 k v c m a f t e r10m i n u t e s ，a - h e l i xh a ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t2 0 k v c m 1 3 - s h e e th a d 3 内蒙古大学硕i 二毕业论文 s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t2 0 k v c m ，3 0 k v c m ，4 0 k v c m 1 3 - t u r nh a ds i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e da t 2 0 k v c m ，3 0 k v c m ，4 0 k v c m ，r a n d o m c o i lh a dn os i g n i f i c a n t l y c h a n g e s a f t e r15m i n u t e s ，0 【一h e l i xh a ds i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e da t3 0 k v c ma n dh a d s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t1 0 k v c m ，2 0 k v c m ，4 0 k v c m ，5 0 k v c m 1 3 - s h e e t h a d s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t2 0 k v c m ，3 0 k v c m ，4 0 k v c m ，5 0 k v c m 1 3 - t u r n h a d s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e da t 2 0 k v c r n , 4 0 k v c m , 5 0 k v c m r a d o m c o i lh a d s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e da t1 0 k v c m ，5 k v c m t h er e s u l t ss h o w e d ：w i t ht h et r e a t m e n tt i m ei n c r e a s e d ，l o n g e rt i m ee l e c t r i c f i e l dt r e a t m e n th a v em o r es i g n i f i c a n t l yi n p a c to nc a t a l s es e c o n d a r ys t r u c n l r et h a n s h o r t e rt i m et r e a t m e n t 1 3 - s h e e ta n d l 3 一t u mt e n dt ot r a n s f o r mi n t o a - h e l i xa n d l 3 - s h e e t ， t h ew h o l es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fc a t a l a s et e n dt oo r d e r i n g ，a n dw i t ht h et r e a t m e n t t i m ei n c r e a s e dt h i st e n d e n c yb e c a m em o r eo b v i o u s 2 ，a f t e r 15 m i n u t e s ，a c t i v i t yo fc a t a l a s eh a ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t 1 0 k v c m ，2 0 k v c m ，4 0 k v c m ，5 0 k v c m b u ta c t i v i t yo fc a t a l a s eh a dn o s i g n i f i c a n t l yc h a n g e sa f t e r5 m i n u t e sa n d10m i n u t e st r e a t m e n t 3 ，0 【- h e l i xa n di - s h e e th a ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t1 0 k v c m ，2 0 k v c m ， 4 0 k v c m ，5 0 k v c ma f t e r15m i n u t e st r e a t m e n t ，a n dt h ea c t i v i t yh a ds i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e da ta b o v ep r o c e s s i n gc o n d i t i o n s 0 【- h e l i xh a ds i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e da t 3 0 k v c ma f t e r15 m i n u t e s ，b u t1 3 - s h e e th a ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da ts a m e p r o c e s s i n gc o n d i t i o n t h eo v e r a l lc o n t e n to f 0 【一h e l i xa n d1 3 - s h e e th a di n c r e a s e db u t h a dn os i g n i f i c a n t l yc h a n g e s ，a c t i v i t yo fc a t a l a s ea l s oh a di n c r e a s e db u th a dn o 4 内蒙古人学硕l 二毕业论文 s i g n i f i c a n t l y t h i ss h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yh a dt h er e l a t i o n s h i pw i t ht h eo v e r a l l c o n t e n to f a - h e l i xa n d1 3 - s h e e t 4 ，t h ee l e c t r i cf i e l dh a dn oe f f e c to nt h i r ds t r u c t u r eo fc a t a l a s e ，b u ts e c o n d a r y s t r u c t u r ea n da c t i v i t yh a dc h a n g e s t h i si sb e c a u s ee l e c t r i cf i e l dm a yn o ta f f e c t s p a c ec o n f o r m a t i o n ( t h i r ds t r u c t u r e ) o ft h ea c t i v ec e n t e r ，b u tm a ya f f e c tp a r t i a l c o n f o r m a t i o n ( s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) ，t h e nl e a d e dt ot h ec h a n g e so fa c t i v i t y k e y w o r d s ：e l e c t r i cf i e l d ；c a t a l a s e ；c i r c u l a rd i c h r o i s m ；s e c o n d a r ys t r u c t u r e ； e n z y m ea c t i v i t y 5 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得内錾直太堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 同期： 指导教师签名： 日期： 在学期间研究成果使用承诺书 l 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将 学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允 许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。 为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使 用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于 发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：绉型釜兰 指导教师签名： 同 肌芈同 肌l 内蒙古大学硕 ：毕业论义 第一章绪论 随着生命科学研究的不断深入及领域的拓展，更多的物理学、化学的方法已经应用到 这一领域，其中物理方法越来越受到重视。除了物理仪器物理方法在该领域的广泛应用外， 物理因子对生物体的影响也引起了很多人的注意。近二十几年来，国内外有许多人就电场 的生物学效应做了大量的研究，许多实验结果都证明电场对生物体产生了作用。但是人们 对于电场的生物效应的具体物理，化学过程还是很不了解。因此，对于电场生物学效应的 研究还不能通过理论分析，正确预言某种电场作用于某种生物系统必将导致某种生物效应， 只能通过生物化学检测，发现其产生的生物学效应，进而在大量实验的基础上进一步研究 其产生的机理。 1 1 1 电场宏观生物效应 1 1 电场生物效应的研究现状 1 1 1 1 电场对植物的生物效应 目前国内外电场植物生物效应研究主要集中在电场对植物种子的影响及对植株的影响方 面。利用高压静电场处理植物种子，以提高种子活力是电场生物效应研究最早、范围最广的领 域，涉及植物有经济作物、大田作物、药用植物、蔬菜、水果、树木等等。国外从上个世纪五、 六十年代就开始了这方面的研究，在2 0 世纪6 0 年代，m u r rl e 与s i d a w a yg h 曾分别研究了 电场对植物细胞伤害和植物呼吸强度的影响n 2 1 。2 0 世纪8 0 年代，c k a z i m i e r z 用静电场精选燕 麦种子时，发现提高了种子的发芽势，缩短了发芽时间口1 。2 1 世纪初，r c r a m a r i u c 和j d m o o n 等人也发现电场处理可使马铃薯和番茄种子发芽势提高，缩短发芽时间并增加其产量h 5 1 。我国 的科研工作者从2 0 世纪8 0 年代起在研究电场对植物的影响方面做了大量的工作，引起了国外同 6 堕茎重叁兰婴：竺兰些堡三兰 行的重视。南京农业大学的康敏等人采用l o k v c m 的电场处理番茄及小青菜种子，可使番茄出 苗数增力h 3 0 ，产量增加9 9 1 ：小青菜出苗数增力f 1 3 3 4 ，产量增1 8 3 1 。石贵玉、张振球等 人n 1 用高压静电场处理水稻种子提高了种子的发芽指数和活力指数，比对照提高8 o 一1 0 0 ， 而且电场处理提高了各种酶的活性，促进膜修复。杨体强等人阳1 采用电场处理油葵种子发现， 外电场处理能提高油葵种子抗旱性。 电场处理不仅对植物种子有影响，同时对植物植株的生长也有不同程度的影响。把植物置 于高压静电场中，观察植物生长发育情况发现高压静电场对植物的生长发育均有促进作用睁噶1 。 对小麦、玉米、高粱、水稻、大麦、沙棘、花生、槐树等施以一定的静电压，其株高、茎、叶 片、颜色都有显著的提高，蕃茄在1 8 k v 静电场中，株高增力n 1 2 ，三蔟花穗增加1 8 6 倍，结果数 增加1 4 9 倍，产量增加1 8 5 倍，结果期提f i 仃5 d ，大豆、玉米施以2 5 k v 的静电场，大豆植株增高 1 5 ，分枝多了5 ，小区产量增加了3 0 ，玉米果实效应也较明显，其行多、粒多、粒重，秃兴 减少0 9 7 c m 。高压静电场处理后的猴头菇和平菇与无静电场的对照组相比，猴头菇产量提高 3 7 0 ，生长时间缩短2 6 0 ；平菇产量提高5 1 o ，生长时间缩短4 4 0 9 6 ，效果明显。 1 1 1 2 电场对动物的生物效应 由于动物是一个更为特殊的电场等势体，具有比植物更为复杂的生理特性，因此电场对 动物影响的研究也不同于植物。近年来，高压静电场对动物的影响也做了不少实验研究。实验 结果表明，电场作用对动物的体重、精子活力、受精率、禽类孵化率及免疫系统的功能等均 有一定影响。甘平等人以5 0 k v m 场强进行小白鼠增重实验，结果表明：实验组体重均高于对 照组1 8 1 - - - 1 9 5 n 制。董振勇等人研究发现高压静电场对绵羊精子存活率的提高有显著影响 h t 。李小玲和王全喜等人研究发现，电场对鸡和鸭刺激胚胎发育，可以提高种蛋孵化率。同 样电场对人体的影响也做了一定的研究n 吼1 引。朱绍忠，王起恩等研究了工频电场对人免疫系 统的影响，结果表明工频电场处理后淋巴细胞数和血清1 9 6 、i g h 含量明显降低啪1 。鲍重光的 研究表明，静电场对人体生理有明显的影响，2 0 0 - 6 0 0 v 静电场对人体神经衰弱治疗的有效率 达到9 4 3 ，而且对挫伤，扭伤，神经炎，支气管哮喘等疾病均有显著的疗效口。 1 1 1 3 电场对微生物的生物效应 电场对微生物的影响主要表现为诱变、致死及灭菌等方面。丁如宁等人静电场处理大肠埃 希菌时，发现中、低电压的静电辐射对微生物的生长代谢有明显的刺激作用，可促使生长率提 7 内蒙古人学硕t 毕业论文 高2 0 - - 3 3 心副。高压静电场处理酿酒酵母菌时发现，高压静电场对酿酒酵母茵具有明显的生物 刺激作用，并具有诱变作用心引。范青等人的研究表明，高压静电场处理可使柑桔青霉菌和绿霉 菌的病菌孢子萌发率、芽管长度和产孢量降低，都显著低于对照，而且处理时间越长，效果越 明显心引。处理的孢子接种在柑桔果实上的感病率也显著低于对照，并能有效地抑制感病果实病 斑的扩展。祖国仁等人的研究乜5 1 表明，高压方波脉冲电场对食品中常见的腐败菌枯草芽孢杆菌， 狄绿青霉有致死作用，并比较了几种微生物的灭活效果，发现微生物的致死率随电场强度、脉 宽、脉冲个数的增加而增大，同一灭菌条件下，高压脉冲电场对微生物的致死率不同，酵母菌 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 灰绿青霉。电场作用后死亡酵母细胞表面现凹陷，局部有孔洞产生。 徐洪斌等人用高压静电场处理细菌时发现，当电场强度为2 0 k v m ，作用时间为6 h 以上时，杀 菌率可达9 1 3 ，当作用时间达到1 4 d 以上时，灭菌率可达1 0 0 啪1 。 电场生物效应的研究和开发作了大量工作，并在一定范围内应用于工农业，但研究对象 和内容还远远不够。特别是对动物及微生物的研究还很少，有待于继续深入研究。 1 1 2 电场生物效应微观机理的研究 电场的生物效应是以生物的宏观现象来表现的，而这些宏观现象与生物体的微观过程和 作用机制有着密切的联系。只有对电场生物效应的微观机理作相应的研究，才能更好的对电 场的宏观生物效应作出合理的解释，进而对电场的宏观生物效应做出正确的预测。近几十年 来，人们对电场的生物效应的微观机理进行了一些有益的探讨。如高压静电场与生物体内自 由基活动、各种酶活性、膜通透性、代谢等的关系。 1 1 2 1 电场对自由基活动的影响 自由基是含未配对电子的顺磁性物质，其生成和代谢在正常生理活动中处于某一动态平 衡，因外界因素改变使其浓度瞬时改变都会导致细胞功能的损伤。自由基含有未配对电子而 具有磁矩，能跟外周电场相互作用，影响生物正常的代谢和生化反应。当电场直接作用于自 由基分子时，除能够使其产生电离外，还能使自由基的电子产生胁迫振动，导致电子偏离正 常的运行轨道；另外，电场还能影响自由基的代谢，抗氧化酶的活性和氧化产物的含量，从 而引起机体氧化应激态的改变心 。 8 内蒙古大学颁l ：毕业论文 1 1 2 2 电场对酶活性的影响 酶在生命活动过程中，扮演着极其重要的角色。理论研究表明汹1 ，酶蛋白的分子构象 ( 空间结构) 对酶的功能至关重要，即使及其细微的扰乱，也能够极大地影响酶的活性。 电场对酶的影响是目前电场生物效应研究的重要内容。酶具有高度的催化活性。它的活 性与分子结构特别是高级结构( 二级、三级和四级) 密切相关，如果高级结构发生变化或某种 功能团受影响，酶活性将发生变化。酶在细胞的正常代谢过程中起着十分重要的作用，一旦 酶构象发生改变，必然对活性产生影响，从而改变机体的功能状态，表现为新陈代谢能力的 改变。已有研究表明降3 ，酶的活性改变主要通过以下两方面来实现：1 ) 电场的极化作用 酶 一般都带有大量的正负电荷，这些电荷在水溶液中会使其周围产生水化层( 定向排列的水分 子) 。高压电场对酶溶液会产生极化。电场强度越高，完成极化所需时间越短，如果电场强度 较低，无法拉动电荷周围的水化层，水分子热运动的能量比电场极化同体积水分子的产生的 能量还高时，电场作用无效。另外电场照射对机体超氧化物歧化酶活性影响具有双向性，即 在有效的场强下，超氧化物歧化酶活性被激活而提高；但是，如果超出了有效范围，超氧化 物歧化酶活性会受抑制而下降。电场辐照对激活酶的活性具有滞后性效应d 引。2 ) 电场改变 酶的分子构象用高压脉冲电场处理辣根过氧化物酶，测试电场处理前后辣根过氧化物酶的 圆二色光谱和荧光光谱，结果显示两种图谱均发生明显改变，说明高压脉冲电场使酶分子构 象发生了改变d 3 1 。静电场处理月见草种子萌发期酶谱谱带变化表明m 3 ：场强和时间的协调作 用可使生物体内荷电物质的分布、排列、运动发生变化，引起各种次级键的变化从而改变了 体内蛋白质和酶的构象及活性，对生命活动产生调节作用。但是酶蛋白分子的构象和酶活性 之间的构效关系，特别是二级结构变化引起的三级结构的变化对酶活性的影响还有待进一步 的研究。 1 1 2 3 电场对生物细胞膜通透性的影响 在静电环境下，静电场改变了细胞膜的跨膜电位，若外加电场方向与膜电位方向一致，则 膜电位差增大，反之则减少，那么膜电位的改变必然伴随着膜两边的带电离子的定向移动或移 动趋势，从而可能产生了生物流，带动了生化反应。其中最明显的例子就是线粒体内a t p 的合 成是由跨膜电势差e m 所控制的。由于a t p 的合成率决定于激活的a t p a s e ( 三磷酸腺苷酶) 的 数量，而激活的a t p a s e 的数量n 又是膜电位差的函数，即n = f e m ) 。在适宜的外部电场的激 励下，氧化磷酸化水平提高，从而促进a t p 的合成，加快细胞生理代谢过程5 刮。 9 内蒙古人学硕i ：毕业论文 1 1 2 4 电场对遗传基因的影响 电场处理可以使基因转录和表达发生变化，高剂量的电场处理能使核酸、蛋白质等分子 的氢键断合，导致遗传变异。张汝民等人用静电场处理花棒、柠条种子时发现，电场处理 能增加种子萌发过程中的d n a 含量、提高r n a 在萌发过程中的转录并增加蛋白质合成。还有 研究表明洲，电场处理会引起细胞的染色体畸变，其畸变类型包括染色体断片、染色体落 后、染色体桥、不等分裂、单极纺锤体和多极纺锤体等。郭维生h 2 1 等人用高压静电场处理鲱 鱼d n a ，测试电场处理前后鲱鱼d n a 的x 射线衍射谱，衍射谱的变化表明高压静电场可改变 d n a 的构象，改变细胞的功能状态。 1 2 本文研究的主要内容和意义 电场生物效应经过几十年的研究，宏观生物效应研究及应用方面取得了不少的成果。但 电场作用于生物系统的什么成分，特别是电场对生物体处理的原初作用机理目前了解较少， 电场生物效应的研究中缺乏理论指导，这在一定程度上制约了电场生物效应的开发研究。本 文以过氧化氢酶为研究对象，用远紫外圆二色光谱仪测定过氧化氢酶经不同电场条件处理后 二级结构含量的变化，并探讨二级结构含量变化和酶活性之间的关系。远紫外圆二色光谱数 据除了能用来计算蛋白质二级结构的含量外，人们还发现它也能提供有关蛋白质三级结构的 信息h h 引。本文用远紫外圆二色光谱简单的探讨了过氧化氢酶经电场处理后三级结构的变化 情况。 过氧化氢酶( c a t a l a s e ，e c i 1 1 1 1 6 简c a t ) ，是一种高效、安全、无毒的生物催化剂。 该酶是铁卟呤酶，每分子中含有4 个铁原子，其作用基团是血红素，活性中心的主要催化残基 时h is 5 4 ，a s n l 2 7 m 1 ，能够快速催化双氧水分解为水和氧气。几乎所有的生物机体都存在过 氧化氢酶，其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、 动物的肝和红细胞中。 本文研究电场直接作用过氧化氢酶冻干粉，可以消除溶液状态下各种因素对电场作用的 影响，对二级结构以及三级结构与酶活性之间的构效关系进行了简单的探讨，为解释电场宏 观生物效应提供实验与理论依据，对推动电场生物效应微观机理的研究有重要意义。 1 0 内蒙古大学硕 ：毕业论文 1 3 蛋白质空间构象与其功能活性的关系 蛋白质的二级结构( s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) 是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构 象，不涉及侧链部分的构象，它们是完整肽链构象( 三级结构) 的结构单元，是蛋白质复 杂的空间构象的基础，故它们也可称为构象单元。通常将其分为q 一螺旋( q - - h e l i x ) 、b 一折叠( b - - s h e e t ) 、b 一转角( b - - t u r n 或b - - b e n d ) 和无规卷曲( r a n d o mc o i l ) 。各类二 级结构的形成几乎是由于肽链骨架中的羰基上的氧原子和亚胺基上的氢之间的氢键所维 系。其他的作用力，例如范德华力等，也有一定的贡献。某一肽段，或某些肽段间的氢键 越多，他们形成的二级结构就越稳定，即二级结构的形成有一种协同的趋势。蛋白质的各 二级结构是完整肽链构象的结构单元，是蛋白质复杂空间结构的基础。 蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是 其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间 构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。 在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象 发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应。蛋白质( 或 酶) 的别构效应，在生物体内普遍存在，这对物质代谢的调节和某些生理功能的变化都是 十分重要的。 内蒙古人学硕十毕业论文 第二章蛋白质结构的研究方法和圆二色光谱基本概念 1 9 6 9 年，g r e e n f i e l d 最早用圆二色光谱数据估计了蛋白质的构象h 7 1 ，相关的研究方法陆 续有报道h 巩4 9 。特别是近十几年来，用远紫外圆二色( f a r - u vc d ) 数据分析蛋白质二级结构， 不但在计算方法和拟合程序上有了很大地发展舭引，而且随着x 一射线晶体衍射与核磁共振技 术的提高，越来越多的蛋白质的精确构象得到测定，为c d 光谱的拟合提供了更精确的数据库 嘞删。研究者还发现用c d 光谱研究蛋白质三级结构具有独特优点，发展了用远紫外c d 光谱辨 认蛋白质三级结构类型的方法。c d 光谱技术作为研究溶液状态下蛋白质或多肽构象的一种重 要手段，已受到研究者的广泛关注。 2 1 蛋白质结构的研究方法 目前蛋白质结构分析的常用方法很多，包括x 射线衍射技术、核磁共振光谱、圆二色光 谱、紫外光谱、荧光光谱与红外光谱技术等。这些方法各有优缺点删。 x 一射线晶体学技术是最早用于蛋白质结构测定的方法，也是唯一能给出高分辨率的技术， 它可以分辨到一个原子水平。它的缺点是：一、实验中需要取得蛋白质的结晶，但不是所有 的生物大分子都能够获得良好的结晶，有些大分子的复合物晶体获得比较困难达不到测定的 要求；二、分子在晶体中往往是被锁定于某一状态，晶体培养的时间较长，所得到的晶体往 往是分子处于基态，而分子功能的行使多发生在激发态，过渡态，x 一射线晶体技术很难捕捉 到分子的功能状态；三、它只能反映蛋白质的一种静态结构，不能用于测定蛋白质溶液构象， 不容易说明大分子在生理状态下结构与功能的关系。 核磁共振光谱是对x 一射线晶体衍射的有力补充，应用于蛋白质一蛋白质、蛋白质一d n a 等 分子间的相互作用方面，核磁共振光谱技术同样具有高分辨率的特点，仅次于x 一射线晶体学 技术，可以在溶液中操作，接近生理状态。缺点是所做样品的分子量要比较小，一般在5 0 k d 1 2 塑茎直叁兰竺圭兰些丝兰 以下，而且分子量越大所测到的谱线就越多，有时各谱线很难分辨，随着超导磁铁的发展， 有可能分子量向大分子挺进，但还是有一定限制。近年发展的高分辨核磁共振光谱可以测定 分子量小于3 0 k d 的蛋白质溶液三维结构。但是，对于分子量大于3 0 k d 的蛋白质，由于共振 峰数目的增多，以及强的偶极耦合作用和化学位移各向异性引起的谱线增宽，给核磁共振光 谱谱峰归属和分子结构测定带来很大困难。这种困难随着分子量的增加更趋严重。此外，在 蛋白质等生物大分子的结构测定中，核磁共振光谱固有的低灵敏度，以及较长的实验周期， 都在一定程度上限制了核磁共振光谱的普遍使用。 此外还有红外光谱与荧光和紫外光谱技术。虽然傅立叶变换红外光谱技术是研究氢键的强 有力手段，此外还具有样品用量较少、蛋白质分子的大小几乎无影响，没有光散射和荧光的影 响及使动力学性质的研究成为可能等优点，但是在样品制备方面还存在着许多问题；荧光和紫 外光谱只能测定蛋白质分子中少数带有发色团的氨基酸残基( 女【l t r p ，t y r 等) 恻。 相比之下，圆二色( c i r c u l a rd i c h r o i s m ，简称c d ) 光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一 种快速、简单、较准确的方法。 2 2 圆二色光谱技术基本原理 2 2 1 椭圆偏振光的产生及光学活性物质的圆二色性 众所周知，光波是横波，其电场矢量e 与磁场矢量h 相互垂直，且均与光波传播方向垂直。 由于产生感光作用的主要是光波的电场矢量e ，因而一般情况下将电场矢量e 作为光波的振动 矢量来讨论。光波电场矢量e 与其传播方向所确定的平面称为光波的振动面。如果一束光的振 动面不随时间变化，这束光就称为平面偏振光。 图2 1 平面偏振光的产生 f i g u r e2 1 l i n e rp o l a r i z e d1i g h t 自然光可以看成是由各种平面偏振光混合而成，只是没有固定的振动方向。自然光通 1 3 内蒙古人学硕i ：毕业论文 过一个偏振器之后，便产生了平面偏振光( l i n e rp o l a r i z e d ) ，如图2 1 所示。 当传播方向相同，电场矢量相互垂直，但位相相差为i 4 波长的两个等幅平面偏振光 相叠加时，便产生圆偏振光( c i r c u l a r l yp o l a r i z e d1 i g h t ) 。朝传播方向上看，此电场矢 量端点在作圆周运动。朝光源看去( 逆光的传播方向) ，若电场矢量按逆时针方向旋转的圆 偏振光，则称为左圆偏振光( l ) ，若电场矢量按顺时针方向旋转的圆偏振光，则称为右圆 偏振光( r ) 。当振幅相同( e 。= e r ) 、相位相同的左、右圆偏振光相互叠加时，便产生了平面 偏振光，如图2 2 所示。 图2 2 等振幅圆偏振光的叠加产生平面偏振光 f i g u r e2 2l i n e rp o l a r i z e d1 i g h tc a nb ev i e wa sas u p e r p o s i t i o no fo p p o s i t ec i r c u l a r p o l a r i z e dli g h to fe q u a la m p li t u d ea n dp h a s e 当振幅不相等( e l e 。) ，但相位相同的左、右圆偏振光相互叠加时，便产生了椭圆偏振 光( e 1 1 i p t i c a l l yp o l a r i z e dl i g h t ) ，其电场矢量绕传播方向作椭圆前进，如图2 3 所示。 图2 3 不等振幅圆偏振光的叠加产生椭圆偏振光 f i g u r e2 3t h el e f t a n d r i g h th a n dp o l a r i z e dc o m p o n e n tl e a d st oe 1 1 i p t i c a l l y p o l a r i z e dl i g h t 1 4 当一束光通过物质时，光波的电场矢量与该物质的原子中的电子发生相互作用。这种 相互作用产生两种效应：一种是降低光的传播速度；另种是减小电场矢量的振幅。前者 称折射，后者称吸收，他们决定于光的波长、分子的电子结构和几何形状。 一束平面偏振光通过光学活性分子后，由于左、右圆偏振光的折射率不同，偏振面将旋 转一定的角度，这种现象称为旋光( o p t i c a lr o t a t i o n ) 。偏振面旋转的角度称为旋光度。能 使平面偏振光的偏振面发生旋转的特性称为旋光性。光学活性物质使左、右圆偏振光产生旋 光度随平面偏振光的波长不同而改变的光学现象，称为旋光色散( o p t i c a lr o t a t o r y d i s p e r s i o n ，简称o r d ) 。 如果旋光物质对特定波长的入射光有吸收，而且对左旋和右旋圆偏振光的吸收能力不同， 那么在这种情况下，不仅左旋和右旋圆偏振光的传播速度不同，而且振幅也不同，于是，随 着时问的推移，左右旋圆偏振光的合成光振动矢量的末端，将循着一个椭圆的轨迹移动。这 就是说，由速度不同振幅也不同的左右旋圆偏振光叠加所产生的不再是线偏振光，而是椭圆 偏振光，这种现象称为圆二色性( c i r c u l a rd i c h r o i s m ，简称c d ) 。 旋光色散和圆二色是同时产生的，他们包括同样的分子结构信息，并且可以由 k r o n i g k r a m e r s 转换方程相互转换。 五= 争，。音钾见， 亿l ， 卫= 一寺，。”导精名， 亿2 ， 其中 。为入处的摩尔比旋， 0 。为入处摩尔椭圆度。 2 2 2 蛋白质的圆二色性 蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子。在蛋白质或多肽中， 主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过 这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同， 产生吸收差值。由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆 偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。蛋白质的c d 光谱一般分为两个波长范围，即1 7 8 2 5 0 n m 为远紫外区c d 光谱，2 5 0 - - 一，3 2 0 n m 为近紫外区c d 光谱。近紫外c d 光谱反映蛋白质中芳香氨基酸 残基和二硫键微环境的变化。远紫外区c d 光谱反映肽键的圆二色性。在蛋白质或多肽的规则 二级结构中，肽键是高度有规律排列的，排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。因 塑鍪吏叁兰堡：兰兰兰竺堡壅 此，具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生c d 谱带的位置、吸收的强弱都不相同。远紫外 圆二色光谱的形状与肽链构象有密切的关系。图2 4 是标准蛋白质的典型c d 谱：q 一螺旋结构 的c d 谱在2 2 2 n m 处和2 0 8 n m 处呈负峰，在1 9 0 n m 处附近有一正峰。无规卷曲构象的c d 谱在1 9 8 n m 附近有个负峰，在2 2 0 n m 附近有一个小而宽的正峰。b 一折叠结构的椭圆值不像q 一螺旋结构那 样恒定，给出1 9 0 n m 处的正峰和2 1 5 n m 左右的负峰。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外 c d 谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息。尽管，处于不对称微环境的芳香氨基酸残 基、二硫键也具有圆二色性，但它们的c d 信号出现在2 5 0 3 2 0 n m 近紫外区，这些信息可以作 为光谱探针研究它们不对称微环境的扰动，对肽键在远紫外区的c d 信号并不造成干扰。 2 2 3 圆二色性大小的表示 弋扫曲细蓬级 广絮搬一衙o d 三位n 钟捃o d 擞7 一 毫 一 图2 4 蛋白质二级结构圆二色光谱 f i g u r e2 4c ds p e c t r ao fp r o t e i n 圆二色性的大小可以用椭圆度、摩尔椭圆度、平均残基摩尔椭圆度以及摩尔削光系数来 表示。 光学活性物质对左、右圆偏振光的吸收率之差( 鲋) 定义为： 鲋= a l a r ( 2 3 ) 其中a 和a 冉分别代表光学活性物质对左、右圆偏振光的吸收率。 所谓椭圆度，就是椭圆短轴b 与长轴a 之比的反正切函数，通常用幺表示，单位为弧度 ( r a d ) 。 岛：口陀留一b ( 2 4 ) 1 6 塑茎直叁兰堡：兰望些堡茎 它与吸收率之差鲋的关系，可近似地表示为： 幺一b 2 3 0 3 竽 ( 2 5 ) 由于吸光率之差a a 与光学活性物质溶液的浓度和光径有关，为消除他们对圆二色性的影 响，因而可以用摩尔椭圆度表示圆二色性的大小。其表达式为： 吲= 罕c a l - a r ，爿( 羔卜嵩 亿6 ， 其中，m 为光学活性物质的分子量( 摩尔质量) 。c 为浓度，单位为g m l 。1 为光径，单位为 在研究蛋白质的圆二色性时，由于蛋白质的分子量大小悬殊，为了比较方便，通常用平 均残基分子量为标准，用平均残基摩尔椭圆度来表示蛋白质的圆二色性的大小。其关系式为： 吲= - 2 3 4 0 3 、 a 1 讪8 0 - 1 ( m m 万卜熹 ( 2 7 ) 有时文献上常用摩尔消光系数占来表示圆二色性： g ：气一靠：竺 ( 2 8 ) g = 气一靠= 了 ( 2 8 ) 它与平均残基摩尔椭圆度 9 】的关系式常近似为： 【o = 3 2 9 8 a s ( 2 9 ) 其中，m 代表蛋白质的平均残基分子量； 0 】的单位为度厘米2 分摩尔( d e g c m 2 d m o l _ ) ； a t r 的单位是m 一c m 。 2 2 4 圆二色光谱仪工作原理 圆二色光谱仪基本原理如图2 8 所示。 一圈一 单色光 与i 回一日 斗i 口l 斗回斗l 检测器i q o 左右圆偏振光 之差 图2 5 圆二色光谱仪示意图订 f i g2 5t h es c h e m a t i cd r a w i n go ft h et h e o r yo fi n s t r u m e n to fe l l i p t i c a l l yp o l a r i z e d li g h t 6 1 1 1 7 光振奉10偏面平 塑鍪圭叁兰堡兰兰些堡壅 由光源产生的自然光，经单色器后变为单色光；再经起偏器，变为平面偏振光。平面偏 振光经过一个电光调制器( 晶体) 时，产生左右圆偏振光，左右圆偏振光交替通过样品池后 由检测器给出c d 值。 2 2 5 圆二色光谱测量的样品制备及条件选择 由于c