（植物病理学专业论文）枣树上类病毒种类鉴定及序列分析.pdf

摘要 对采自河北沧州、保定和邯郸的9 5 个枣树样品进行类病毒的检测与序列分析。采集的样品 进行了低分子量r n a 的提取，然后运用斑点杂交、r t - p c r 、二维电泳并转膜杂交和生物学检测 等方法进行了检测。结果显示：采自沧州地区齐桥同一“枣树梨树”问作地块的2 个枣树样品检 测到了啤酒花矮化类病毒( h o ps t u n tv i r o i d , h s v d ) ，其他地区样品均未检测到，总检曲率为2 1 。 本研究发现枣树成为h s v d 新的寄主这是世界上首次报道。 分别对检测呈阳性的2 个枣树样品进行h s v d 的克隆、测序分析，首先与首次从啤酒花中分 离到的h s v d 序列( x 0 0 0 0 9 ，19 8 3 ) 进行比较同时与g e n b a n k 中已报道的h s v d 序列进行对比。 结果显示： 1 从c z 3 和c z a 中各克隆的2 个h s v d 序列与首次从啤酒花中分离出的h s v d 序列 ( x 0 0 0 0 9 ，1 9 8 3 ) 对比中共发生了2 5 个碱基位点突变，同源性较低。 2 从中国枣树上分离得到的h s v d 序列总体变异较小，在g e n b a n k 序列对比中同源性从9 2 一1 0 0 ，且序列变异与地域、寄主等无明显相关性。 关键词：枣树，啤酒花矮化类病毒，检测技术，序列分析 a b s t r a c t n i n e t y f i v ej u j u b et r e es a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o mc a n g z h o u , b a o d i n ga n dh a n d a ni nh e b e ip r o v i n c e o fc h i n a t h e s es a m p l e sw e r eu s e df o rd e t e c t i o na n ds e q u e n c ed i v e r s i t ya n a l y s i so fv i r o i d s l o w m o l e c u l a r w e i g h t r n a sw e r ee x t r a c t e da n du s e df o rd o t - b l o t h y b r i d i z a t i o n ， r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) ，t w o - d i m e n s i o n a lp a g e ( 2 - d - p a g e ) a n d t r a n s f e rm e m b r a n ef o rh y b r i d i z a t i o na n db i o l o g i c a li n d e x i n g r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e2j u j u b et r e e s a m p l e sw h i c hw e r ec o l l e c t e df r o mt h es a m ef i e l do f “j u j u b et r e e p e a r i n t e r c r o p i n gi nq i q i a o ， c a n g z h o uw e r ep o s i t i v ef o rh o p s t u n tv i r o i d ( h s v d ) t h eo t h e rt w oa r e a sw e r ea l ln o td e t e c t e dh s v d i nj u j u b et r e e s t h ed e t e c t i o nr a t ew a s2 1 t h i si st h ef as tr e p o r to fh s v di nj u j u b et r e e si nt h ew o r l d b o t ho ft h e2s a m p l e sw e r es e l e c t e df o rc l o n i n g ，s e q u e n c ea n a l y s i so fh s v da n dt h e nc o m p a r i n gw i t h t h ef a s th s v ds e q u e n c e ( x 0 0 0 0 9 ，19 8 3 ) f r o mt h eh o pa n da l s ot h eh s v ds e q u e n c e si ng e n b a n k r e s u i t si n d i c a t e dt h a t ： 1 e a c ho f 2h s v ds e q u e n c e sw e r ec l o n e df r o mc z 3a n dc z 4 ，t h e nc a m p a r e dw i t ht h eh s v d s e q u e n c e ( x o o 0 0 9 ，19 8 3 ) w h i c hw a s f i r s tr e p o r tf r o mt h eh o p ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t2 5g e n es i t e sh a d b e e nm u t a t e d , t h e yh a dl o wh o m o l o g y 2 t h eh s v ds e q u e n c e si nj u j u b et r e ef r o mc h i n aw e r er e l a t i v e l yc o n s e r v e da n de a c ho f t h e h s v d s e q u e n c eb l a s ti ng e n b a n ks h o w e dt h a th o m o l o g y sw e r ef r o m9 2 t o1 0 0 ，a n dt h e r ew e r e1 1 0 c l e a rr e l a t i v i t ya m o n gs e q u e n c ev a r i a t i o n , r e g i o na n dh o s t k e yw o r d s ：j u j u b et r e e ，h o ps t u n tv i r o i d , d e t e c t i o nt e c h n o l o g y , s e q u e n c ea n a l y s i s 英文缩略表 英文缩写英文全称 a m pa m p i e i l l i n b i s n ，n - m e t h y l e n eb i s a e r y l a m i d e b p b a s e p a i r c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a c t a b c e t y lt r i e t h y la m m o n i u mb r o m i d e e b蹦d i u mb r o m i d e e c o i le s c h e r i c h i ac o l i e d 呵a e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ea c i d l bl u r i a - b e r t a n im e d i a m gm i c r o g r a m m l m i c r o l i t r e m r n a m e s s e n g e rr n a n a a cs o d i u ma c e t a t e p a g e p 0 l ya c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p c r e o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r t - p c r r e v e r s e - t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h r i i lr e a c t i o n s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 2 - 【卜p l a g et w o - d i m e n s i o n a lp o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 眦t r i s - a c e t a t e e d t a t b e晦b o r i c e d t a 啊孙i 正d n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e n e d i a m i n e uu n i t a p sa m m o n i u mp e r s u l p h a t e p s t v dp o t a t os p i n d l et u b e rv i r o i d c s v d c h r y s a n t h e m u ms t u n dv i r o i d c e v dc i t r u se x o c o r t i sv i r o i d c c c v dc o c o n u tc a d a n g - c a d a n gv i r o i d a s b v da v o c a d os u n b l o t c hv i r o i d h s v d h o ps t u n tv i r o i d p l dp e a c hl a t e n tm o s a i cv i r o i d a s s v d a p p l es c a rs k i nv i r o i d c b v dc o l e u sb l u m e iv i r o i d 中文名称 氨苄青霉素 亚甲基双丙烯酰胺 碱基对 互补妊 十六烷基三乙基溴化铵 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 l b 培养基 毫克 微升 信使r n a 乙酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 反转录聚合酶链式反应 十二烷基磺酸钠 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 t r i s 乙酸电泳缓冲液 嘶s 硼酸电泳缓冲液 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 酶活单位 过硫酸铵 马铃薯纺锤形块茎类病毒 菊花矮化类病毒 柑橘裂皮类病毒 椰子死亡类病毒 鳄梨日斑类病毒 啤酒花矮化类病毒 桃潜隐花叶类病毒 苹果锈果类病毒 锦紫苏类病毒 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果， 并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论 文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都 在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人 承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名： 刎德 日期： 以( 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论 文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采 用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位论文作者亲笔签名： 指导教师亲笔签名： 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 两1 埒 福建农林大学硕士学位论文1 前言 1 前言 类病毒是迄今为止发现的最小病原物，1 9 7 1 年美国科学家d i e n e r 在研究马铃薯纺锤块茎病 的过程中，提出了“类病毒”的概念【l l ，类病毒是一类高度碱基配对、无外壳蛋白、不编码可供翻 译的遗传情报、能在受侵染寄主植物中自我复制的单链闭合环状低分子量r n a 分子，被认为是 和病毒起源不同的病原物。由2 4 6 - 4 7 5 个核苷酸组成，无抗原性，依赖于寄主细胞的酶系统进行 复制【2 】。 类病毒侵染性强，能导致组织产生异常的细胞质膜体，细胞壁膨大畸形。侵染后一般引起类 似病毒感染的矮化、斑驳、叶变形和坏死等症状，除此之外还有裂皮、斑果等症状。类病毒侵染 症状发展速度慢，潜伏期长。类病毒可侵染许多重要的经济植物( 马铃薯、啤酒花) 、果树( 桃、 杏、李、扁桃、苹果、柑桔、梨、樱桃等) 、蔬菜( 番茄和黄瓜等) 以及观赏植物( 菊花、锦紫 苏等) 。植物受到类病毒侵染后有些呈潜伏侵染有些则产生明显症状。有些类病毒病害曾经对农 业生产造成了严重的危害严重的经济损失，例如：椰子死亡类病毒( c o c o n u tc a d a n g - c a d a n gv i r o i d , c c c v d ) 曾使马来西亚椰子生产几乎绝产；以及马铃薯纺锤形块茎类病毒( p o t a t os p i n d l et u b e r v i r o i d , p s t v d ) 、菊花矮化类病毒( c h r y s a n t h e m u ms t u n dv i r o i d , c s v d ) 、柑橘裂皮类病毒( c i t r u s e x o c o r l i sv i r o i d , c e v d ) 以及鳄梨日斑类病毒( a v o c a d os u n b l o t c hv i r o i d , a s b v d ) 等严重影响品质。 植物感染类病毒后一些常见的症状有：植株矮化；叶片卷曲、上翘；果实扭曲、褪色：茎叶坏死 等，且因环境和寄主种类的不同而不同。h s v d 可降低啤酒花的接穗数和平均穗重，而且降低了 a 酸的含量，因此尽管外部表现有时不明显，但类病毒对植物的危害非常大，类病毒间或类病毒和 病毒间的混合侵染有时能加重田间病害的发生。 目前类病毒防治措施主要是农业防治，主要种植无毒的植株和使用无毒的繁殖材料来阻止类 病毒的侵染和传播。 1 1 类病毒的特性 1 1 1 分子生物学特性 2 0 世纪6 0 年代末到7 0 年代初，在研究马铃薯纺锤形块茎病时发现了一种新奇的病原物，该 病原物具有分子量小、无外壳蛋白、单链、闭合环状等特点( 图1 1 ) 。 类病毒分子内发生配对【3 训，而且e 屺含量很高，具有紧密折叠的二级结构，大多数类病毒 r n a 可分为五个功能区，即左手末端区( t l ) ，致病区( p ) ，中央保守区( c ) 。可变区( v ) 和 右手末端区( t r ) 。t l 和t r 的保守序列有利于复制酶的结合，与类病毒的复制起始有关，且 t l 和t r 在类病毒之间可以互换，因此它的基因重组在类病毒进化中扮演着重要角色【5 叫t l 与 决定类病毒致病性的构造因子有关1 7 j ，t r 是通过控制类病毒的复制量来调节致病性强弱的【引。p 福建农林大学硕士学位论文1 前言 区与类病毒所致植物瘸害症状有关，如在c e v d 中起调节致病性强弱的作用【9 1 。c 区含9 5 n t 左右 的中央保守序列，并有一个9 n t 反向重复序列，能形成颈环结构，该区可能是类病毒复制的一个 重要控制区域，c 区含有一个中央保守区( c c r ) ，是类病毒复制的重要控制区域l o - l l 。v 区的变 异程度最大，即使是很相近的类病毒，同源性也都小于5 0 ，该区也与致病性有关。a v s u n v i r o i d a e 科的类病毒没有c c r ，但是具备核酶结构，可以进行自我切割【1 3 】。 ( 3 e n o mc $ e q le n c ea n 0p ? 0 0 0 s e gs e 0 0 nc i a i vs ? u e ：u i e ( i n t e r m e d i a t es l m i n ) 嘞缃确萨科丽嘞夤晡辑碲滞感勺南一镌孵确耐幂f 禳黼翻节耐孵碲常一 _ 雌却 俨严秤；，p 2 铲e 。靠_ l ，哪；，蕾州_ _ 气警诵，r 留吗一 #ci l e f tt e r m i n a l p a t h o g e n 嘶c e 加固c = i m s e r w d v a r m n e r i 曲ft e 爪i n a 图1 1 p s t v d 的基因组序列及其二级结构 f i g 1 - 1 g e n o m i cs e q u e n c ea n dp r o p o s e ds e c o n d a r ys t n l c t u r eo f p s t v d 目前已知的类病毒有3 0 种，根据其结构及序列同源性可分为两个科：具有中央保守区( c c r ) 但不具有核酶活性的马铃薯纺锤块茎类病毒科( p o s p i v i r o i d a e ) 和不具有c c r 但具有核酶活性的 鳄梨日斑类病毒科( a v s u n v i r o i d a e ) 。两科类病毒在细胞内存在的部位也明显不同，p o s p i v i r o i d a e 科的类病毒主要存在于细胞核内，而a v s u n v i r o i d a e 科的类病毒主要存在于叶绿体内。与 p o s p i v i r o i d a e 科的类病毒相比，a v s u n v i r o i d a e 科的成员寄主范围比较窄，参考【1 4 】所述的类病毒分 类表格，稍有改变，具体如( 表1 1 ) 所述。 表l - 1 类病毒的分类( 病毒分类学第八次国际会议报道) t a b l el - lv h o i dc l a s s i f i c a t i o n ( e i g h t hr e p o r t , i n t e r n a t i o n a lc o m m i t t e eo nt a x o n o m yo fv i r u s e s ) 2 福建农林大学硕士学位论文 1 前言 苹果锈果类病毒属 a p s c 内嘧记 苹果锈果类病毒 a p p l es c 甜s b nv i r o i d ( a s s v d ) 苹果凹果类病毒 a p p l ed i m p l e f r u i tv i r o i d ( a d f v d ) 苹果皱果类病毒 a p p l e f r u i tc r i n l d ev i r o i d ( a f c v d ) 澳洲葡萄类病毒 a u s t r a l i a ng r a p e v i n ev i r o i d ( a g v d ) 柑橘卷叶类病毒 c i t r u sb e n tl e a f v i r o i d ( c b l v d ) 柑橘类病毒号 c i t r u sd w a r f i n g ( c d v d ) 葡萄黄痘类病毒l 号 g r a p e v i n e y e l l o ws p e c k l ev i r o i d i ( g y s v d l ) 葡萄黄痘类病毒2 号 g r a p e v i n ey e l l o ws p e c k l ev i r o i d 2 ( g y s v d 2 ) 梨疱状溃疡类病毒 p e a rb l i s t e rc a n c e rv i r o i d ( p b c v d ) 3 2 9 - 3 3 3苹果、梨 3 0 6苹果 苹果 3 6 9葡萄 3 1 5 3 2 9柑橘 2 9 1 2 9 7柑橘 3 6 5 3 6 8葡萄 3 6 3葡萄 3 1 4 - 3 1 6梨、温柏 3 福建农林大学硕士学位论文1 前言 1 1 2 复制 类病毒侵入寄主细胞后，大多数分布于被侵入细胞的核内，但有3 种类病毒，a s b v d t ”d7 1 ， p l m v d 0 8 1 和c c h m v d 分布于叶绿体中。类病毒由于其r n a 本身无m r n a 活性，不编码任何蛋 白质，因此复制完全依赖于寄主的转录酶系统。类病毒以滚环模式进行复制1 1 9 l 。滚环模式可分为 两种类型，即非对称式和对称式。非对称式滚环复制模式常见于p o s p i v i r o i d a e 科的类病毒【2 0 - 2 2 1 ，非 对称式滚环复制模式，复制时以( + ) 链为模板转录生成多个单位长度的( ) 链复制中间体，不 经剪接，而直接作为模板转录成( + ) 链复制中间体，再经过切割和连接，形成单体环化的类病 毒分子。该模式常见于p o s p i v i r o i d a e 科的类病毒。对称式复制模式，复制时先以( + ) 链为模板 生成多个单位长度的( ) 链复制中间体，被切割成单位长度的线状( ) 链分子，自我环化后以 环化的( ) 为模板转录出多个单位长度的( + ) 链复制中间体，再进一步切割连接，形成具有感 染性的单体环化的类病毒分子【”彩】。a v s u n v i r o i d a e 科的a s b v d 和p l m v d 以此种模式进行复制 1 2 6 ( 图1 - 2 ) 。 4 福建农林大学硕士学位论文1 前言 oo 于 艇附 邂捧曝， + ：手+ l 互绷n显n 1 1 3 移动 ，q ? = 7 府 _ ，、 k 甲夕 镶头嚣梭菇 _ 。 t 壁：韭_ 显! 显 _ 强烈纭奠 荻台麓? 叶姆髂r n 生l o 、o ( a ) 鼍# 对称线滚环复制镆式( 鑫) ；l 孪称武i 鬻环复制镘或 张蹲圳奶嘏暂z i 嚣) 赢强鼢p 嬲f d 图l - 2 类病毒的两种滚环复制模式图( 李世访) f i g 1 - 2t w ot y p e so fr o u i n gm o d e l f o rv i r o i dm u l t i p l i c a t i o n ( l i - s h i - f a n g ) 到目前为止，高等植物仍然是类病毒的唯一寄主，而且全部都是系统侵染的。类病毒系统侵 染寄主植物是一个多步的复杂过程，首先进入一个寄主细胞，然后移动到细胞内的复制位置，复 制完成后，后代从该位置移出并且侵入相邻细胞，最后类病毒从一个组织到另一个组织，直到侵 染整株植物【2 7 1 采用微注射法研究证明，p s t v d 是通过胞间连丝向相邻细胞移动的。他们推测 p s t v d 分子内可能存在决定通过胞间连丝的序列信号或构造区域 2 8 】。研究表明，类病毒在植物体 内是通过韧皮部进行长距离运输的。 1 1 4 传播 在田间和温室中的研究结果均证明类病毒很容易通过机械接种传播，通过污染了的农事操作 工具，如修剪工具、嫁接工具等农具、以及人手接触等来进行有效的传播。类病毒还可以通过嫁 接、相邻植株之间的汁液接触来传播。有时浇水也会增加传播的机会。许多类病毒( 但并非全部) 已经被证明可以通过种子传播，在西红柿上面还可以通过花粉来传播【2 9 】 据报道，t p m v d 可以通过昆虫传播，如：蚜虫、桃蚜可以将该类病毒从野生寄主传播给实 验寄主西红柿。p s t v d 也能够通过昆虫传播【3 0 j 。实验证明，蚜虫传播类病毒是非持久，低效率的。 1 1 5 防治与控制 对类病毒而言，目前未发现自然抗性和耐病性的高等植物，控制类病毒疾病最有效的方法是 使用未被感染的植物材料，且一旦发现被感染的材料就应该立即淘汰或连根拔除。一些感染有类 病毒的果树可以通过热温疗法和分裂组织培养的方法而脱毒，如：苹果中的a s s v d 3 1 】；通过对 5 福建农林大学硕士学位论文 1 前言 热处理后的茎尖进行组织培养得到不带有类病毒的菊花；另外，也可以通过冷处理消除梨中的 a s s v d 3 2 1 。利用转基因技术来获得抗类病毒的转基因植物，在马铃薯上已经获得成功【3 3 - 3 4 ，但出 于生物安全等方面的考虑，现在尚未大面积的推广应用。 1 2 类病毒的检测方法 类病毒不能编码任何蛋白，因此不能利用免疫学( 血清学) ，如酶联免疫吸附( e l i s a ) 的方 法来检测，只能通过生物学，生物化学和分子生物学的技术来检测。 1 2 1 核酸杂交 核酸杂交( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) 灵敏度较高，忠实性强，一次可对大量样品进行检测， 但需要有特异性探针。非放射j l 生探针的使用克服了放射性探针存在的如半衰期、安全性、放射性 废弃物处理和操作不便等固有的缺陷。用灵敏的荧光底物代替显色底物，尼龙膜代替硝酸纤维素 膜，可以提高非放射性检测的灵敏度。使用c r n a 探针的信号背景比c d n a 探针要好，说明c r n a 探针有较高的灵敏度 3 5 - 3 7 】。在类病毒的检测过程中常用的方法有，斑点杂交( d o t b l o t h y b r i d i z a t i o n ) ，n o r t h e r n 印迹杂交( n o r t h e r nh y b r i d i z a t i o n ) ，组织印迹杂交( t i s s u ep r i n th y b r i d i z a t i o n ) 等方法。据报道，组织印迹杂交在检测马铃薯中的p s t v d ，苹果中的a s s v d ，桃子中的h s v d 和菊花中的c s v d 很有效，且这种方法比d o t - b l o th y b r i d i z a t i o n 简便、快捷并省却了核酸的抽提 过程，但仅适合于对新鲜的组织进行检测，而且有时结果并不十分可靠 3 s l 。斑点杂交是一种可取 的方法，适合新鲜的组织和干组织，另外适当加大用于斑点杂交检测时的核酸量是保证检测准确 的重要前提。 1 2 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 是一种基于类病毒r _ n a 分子的特殊环状结构进行检测的方法。 它能检测出一种病原物是否为类病毒，且该方法是唯一一种不需要知道类病毒核酸序列就可以进 行检测的方法。该方法最初主要是用于分离和提纯类病毒或类似于类病毒的环状r n a ，现在被 进一步改善并用于类病毒的检测。 该方法的原理是，在非变性电泳条件下分子内碱基高度配对的类病毒r n a 和线形r n a 分子 ( 小分子量) 迁移速度几乎等同；在变性条件下，类病毒碱基对被打开由棒状变成环状，致使迁 移速度变慢，因此可以把来自寄主的线性核酸分子和类病毒的环状分子分开【3 9 4 1 】。但是与分子杂 交和r t - p c r 检测相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳的灵敏度较低。 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测类病毒的方法常用的有两种，第一种是二维电泳 ( 2 d i m e n s i o n a l - p a g e ) ( 图1 3 ) ，在非变性电泳下切割类病毒条带，放在梳子齿孔部位，或放 入底部，将凝胶中加入8m 尿素使其在变性条件下进行电泳，该方法一次只能对一个样品进行检 6 a 、譬 7 福建农林大学硕士学位论文 1 前言 分析。 1 2 4 生物学检测 生物学检测( b i o l o g i c a li n d e x i n g ) 的基础建立在敏感和便利的指示植物的症状之上，该方法被 植物病理学家广泛应用于侵染机理的研究。指示植物接种的标准方法是通过机械摩擦或嫁接进行。 对于一些比较坚硬的指示植物，如菊花、柑橘以及天鹅绒三七等，用“刀割法”，即以带有接种源的 刀片在指示植物的茎或叶柄上猛烈切割，比汁液摩擦接种更有效。另一方面，生物学检测有时在鉴 定病原类型上很有用。生物学鉴定方法比较费时而且对温室的温度、湿度等各方面的要求都比较高 4 4 1 生物学检测的缺点是一次不能对大量的样品进行检测、费时、劳动强度高、需要建立占地面积 较大的可控温室、加速症状的表现还需要2 8 3 0 c 高温条件等。但有时不同种类的类病毒在相同的 指示植物上可以引起相似甚至相同的症状，致使仅靠表观症状很难判断是由哪一种特定的类病毒引 起的，因此必须结合分子杂交、电泳等手段进行综合判断。 1 3 枣树上发生的类病毒研究 世界上枣树的种植面积9 8 以上集中在中国，虽然国内外陆续不断有发现类病毒新寄主的报 道，但到目前为止对枣树上类病毒发生情况，种类，危害范围，类病毒来源及序列变异等情况目 前国内外均未报道，所以该研究在枣树感染类病毒方面的实验材料，有关资料和数据都是空白的， 本研究的开展借鉴国内外相关方面的研究成果，新技术，新思路结合本实验室对类病毒多年研究 的技术沉淀，经过不断对类病毒检测技术的完善，摸索并在反复验证的情况下进行的。 1 4 本研究的目的和意义 枣为鼠李科( r l m n a e e a e ) 枣属( z i z y p h u sm i l l ) 的多年生落叶果树。该属植物约有5 0 多种，但栽 培用主要种类为枣，原产中国，我国枣树的种植面积和枣的产量均占世界总产量的9 8 以上同时 我国也是世界上最大的枣产品出口国。据出土的炭化枣核推测，枣树在我国的栽培历史可追溯到 7 0 0 0 年以前，有文字可考的历史也在3 0 0 0 年以上。时至今日枣树仍然是我国第一大干果，而河 北省沧州地区是我国金丝小枣之乡仅据2 0 0 5 年3 月河北省农业厅的统计数字显示：金丝小枣在 我国河北沧州种植面积及产量最大，已达1 4 4 4 万亩，分别占河北省、全国和世界红枣面积的4 4 、 1 4 4 和1 4 3 ，年产量3 7 5 亿斤，分别占河北省、全国和世界红枣总产量的4 3 2 、1 4 6 和1 4 4 ， 年产值7 4 亿元，成为国内外最大的红枣生产基地。但是最近几年多种类病毒在我国不同的果树 上陆续被检测到，如李树上检测到h s v d 和p l m v d ，桃树上检测到的h s v d ，葡萄上检测到的 a g v d ，g y s v d , 啤酒花上检测到h s v d 和h l v d 等等，另外在我国沧州地区的部分县镇( 如齐 桥镇等) 存在较为严重的枣树与其它果树混栽或间作的情况( 如枣梨，枣李等) 。加上国内不同 地区之间的枣树引种、嫁接以及不同果树修剪工具之间混用现象的存在增加了类病毒的交叉跨地 8 福建农林大学硕士学位论文1 前言 域传播的机会，不同果树感染类病毒后表现的症状不同，有些果树( 或同一种果树的不同品种) 会产生明显症状表现( 如苹果锈果类病毒等) ，严重影响果实的外观及商品价值，有些品种虽表 现为潜伏侵染，但可能成为另一种栽培植物的潜在毒源，而果树一旦感染类病毒后，最有效的控 制方法就是将被感染的植株连根拔除，这样必将严重影响其经济效益。目前对于类病毒的复制、 致病机理及起源仅存在于假说阶段，还没有成熟的理论形成，因此对类病毒的防治还没有很有效 的措施，主要还是农业防治。在国内类病毒的研究相对比较薄弱，除马铃薯纺锤块茎类病毒、苹 果锈果类病毒、柑桔裂皮类病毒外，其它类病毒的发生分布及序列变异等情况尚未明确。 此外随着我国对外交流的扩大，种质资源交换的日益频繁，加强检疫检测，对保证我国枣树 苗木的安全和保持枣产品的国际竞争力极为重要。同时随着国外对进口我国农产品的门槛要求越 来越高，形式逼迫我们做好对内对外检测检疫工作，另外研究类病毒的发生及其分布情况，将会 对国内枣树苗木的生产、引种、种质交换等具有重要的参考价值，所以进行检测意义重大。建立 并完善类病毒的检测体系，能够有效防止类病毒的传播，通过对其序列分析比较，了解类病毒在 不同地域、寄主问的变异情况，并结合生物学接种，观测其症状表现等研究，可以进一步了解序 列变异与致病性等之间的关系，进而为研究类病毒的致病机理提供一定的理论依据。因此，进行 枣树感染类病毒情况的研究对于今后正确指导生产实践，以及其相关基础性研究等都是很有意义 的 9 福建农林大学硕士学位论文2 材料与方法 2 1 实验材料与仪器 2 1 1 供试材料 2 材料与方法 从河北沧州、邯郸和保定三地不同区域共采取9 5 个枣树一年生枝条样品，其中包括6 8 个沧 州齐桥样品( 编号：c z l c z 6 8 ) ，沧州齐桥古枣树样品4 个( 5 0 0 年以上树龄) ( 编号：c z g l - c z g 4 ) ， 1 5 个沧州朴寺古枣树样品( 树龄5 0 0 年以上) ( 编号：c p s l c p s l 5 ) ；保定枣树样品6 个( 编 号：b d l b d 6 ) ；邯郸枣树样品2 个( 编号：j z l j z 2 ) ( 所有样品信息如表2 1 ) 。将所采样品枝条 需要用小刀割取其韧皮部，然后将这些树皮分装并放入- 2 0 冰箱，作为材料备用，切忌反复冻融， 防止组织变褐。 表2 1 枣树供试材料的名称及采样地 t a b l e2 - 1s a m p l i n gp l a c e sa n dt h en a m e so f j u j u b et r e ev a r i e t i e si nt h i ss t u d y 金丝小枣沧州 金丝小枣沧州 棉枣沧州 棉枣沧州 金丝小枣沧州 酸灵沧州 棉枣沧州 酸灵沧州 大枣沧州 大枣沧州 无核沧州 大枣沧州 大枣沧州 酸灵沧州 酸灵沧州 金丝小枣沧州 金丝小枣沧州 金丝小枣沧州 金丝小枣沧州 金丝小枣沧州 金丝小枣沧州 金丝小枣沧州 金丝小枣沧州 c z 3 4金丝小枣 c z 3 5金丝小枣 c z 3 6金丝小枣 c z 3 7金丝小枣 c z 3 8大枣 c 2 3 9 金丝小枣 c z 4 0金丝小枣 c z 4 1金丝小枣 c z 4 2金丝小枣 c z 4 3金丝小枣 c z 4 4金丝小枣 c z 4 5金丝小枣 c z 4 6 金丝小枣 c z 4 7 酸灵 c z 4 8 金丝小枣 c z 4 9金丝小枣 c z 5 0金丝小枣 c z 5 l金丝小枣 c z 5 2金丝小枣 c z 5 3金丝小枣 c z 5 4 金丝小枣 c z 5 5 金丝小枣 c z 5 6金丝小枣 t 0 沧州c z 6 7金丝小枣沧州 沧州c z 6 8金丝小枣沧州 沧州c z g l( 古) 小枣沧州 沧州c i z g 2( 古) 小枣沧州 沧州c z g 3( 古) 小枣沧州 沧州c z g 4( 古) 小枣沧州 沧州c p s i( 古) 小枣沧州 沧州c p s 2( 古) 小枣沧州 沧州c p s 3( 古) 小枣沧州 沧州c p s 4( 古) 小枣沧州 沧州c p s 5( 古) 小枣沧州 沧州c p s 6( 吉) 小枣沧州 沧州 c p s 7 ( 吉) 小枣 沧州 沧州 c p s 8 ( 古) 小枣沧州 沧州 c p s 9 ( 古) 小枣 沧州 沧州 c p s l 0 ( 古) 小枣沧州 沧州 c p s i l ( 吉) 小枣沧州 沧州a p s l 2( 古) 小枣沧州 沧州 c p s l 3 ( 古) 小枣 沧州 沧州 c p s l 4( 古) 小枣沧州 沧州c p s l 5( 古) 小枣沧州 沧州b d l未知保定 沧州b d 2未知保定 囱 泣 似 皤 踊 叼 馏 锄 一 锄 一 伽 咄 一 嘶 一 黜 一 一 蚴 一 锄 福建农林大学硕士学位论文 2 材料与方法 c z 2 4 金丝小枣沧州 c z 5 7 金丝小枣沧州 b d 3 c z 2 5金丝小枣沧州c z 5 8金丝小枣沧州b d 4 c z 2 6金丝小枣沧州c z 5 9金丝小枣沧州b d 5 c z 2 7 金丝小枣沧州 c z 6 0金丝小枣 沧州 b d 6 c z 2 8 金丝小枣沧州 c z 6 1 金丝小枣沧州 j z l c z 2 9 金丝小枣沧州 c z 6 2 金丝小枣沧州 j z 2 c z 3 0金丝小枣沧州c z 6 3金丝小枣沧州 c z 3 l金丝小枣沧州c z 6 4金丝小枣沧州 c 乙3 2金丝小枣 沧州 c z 6 5金丝小枣 沧州 c z 3 3 金丝小枣沧州 c z 6 6 金丝小枣沧州 备注：c z 代表沧州；c p s 代表沧州朴寺样品：b d 代表保定样品；j z 代表邯郸样品 n o t e ：c zs t a n d sf o rt h es a m p l e so f c a n g z h o u ；c p ss t a n d sf o rt l l cs a m p l e so f p u s i , c a n g z h 叫 b ds t a n d sf o rt h es a m p l e so f b a o d i n g ；j zs t a n d sf o rt h es a m p l e so f h a a d a n 2 1 2 试剂 未知 未知 未知 未知 未知 未知 保定 保定 保定 保定 邯郸 邯郸 限制性内切酶、修饰酶、d n t p s 等购自t a k a r a 公司：d i gd n al a b e l i n ga n dd e t e c t i o nk i t , d i g e a s yh y b 、d i ge a s yh y b 购于r o c h e 公司；m - m l v 反转录酶购自p r o m e g a 公司；、p m d l8 - t 载 体( 图2 一1 ) 、r n a s i n 购自宝生物工程( 大连) 有限公司；2 x t a q p c r m a s t e r m i x 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i a e o l i ) d h 5 a 购自天根生化科技( 北京) 有限公司；分析纯化学试剂均为市售；测序由北京宝生 物公司完成。 j 咀 绝一阜掣芦嘎盎醒f 1 垒型 兽岛 囊，q l i o 一丁n 弹a l a l o q u 榭口口霄0 a n m o 下旧氍口a 嘲帆0 0 0 啪埘0 孙口 2 1 3 引物设计 f ” ：“ l g l l ”l 。= tt = ：搿：。阳哪。鼻”删 。 t r o o 图2 1 载体p m i ) 1 8 t f i g u r e2 - 1v e c t o ro f p m d l 8 - t h s v d 引物参考g e n b a n k 中登录的( 登录号：d 1 3 7 6 4 ) 核苷酸序列，设计了3 条引物，其中 篓舞誊群系 福建农林大学硕士学位论文 2 材料与方法 h s v d p i 用于r t ，h s v d p 2 和h s v d p 3 用于p c r ，下划线的部分为酶切位点。 以上引物均由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列详见( 表2 2 ) 表2 2 h s v d 的引物序列 t a b l e2 - 2p r i m e r ss e q u e n c eo f h s v d 2 1 4 仪器 r c - 2 6 立式超速低温离心机( 美国) 、5 8 0 4 r 台式低温离心机( 德国) 、m yc y c l e rt h e r m a lc y c l e r p c r 仪( 美国) 、h z - c 型台式恒温振荡器( 中国) 、e a g l e e y e l is y s t e m 紫外凝胶成像仪( 美国) 、 恒温水浴( 中国) 、干式恒温器( 中国) 、t p 2 0 0 s 电子天平( 美国) 、d y y - 6 b 型稳压电泳仪( 中 国) 、真空干燥器( 英国) 、紫外透射反射仪( 中国) 、f l a 5 1 0 0 核酸蛋白扫描仪( 日本) 。 2 2 实验方法 2 2 1 低分子r n a 的提取 ( 1 ) 取3 9 样品( 树皮) 放于研钵中加入适量聚乙烯吡硌烷酮( 防止氧化) 、石英砂和液氮用研 棒充分研碎后转入离心管，加入2 倍体积重量比的1 mk 2 h p 0 4 和一滴巯基乙醇( 约4 0 i l ) ， 再加入2 倍体积重量比的水饱和酚氯仿( 1 1 ) ，充分混匀，用水饱和酚氯仿配平8 0 0 0 r p m ， 2 0 m i n 。 ( 2 ) 取上层液体，加入同体积的水饱和酚氯仿( 1 1 ) ，充分混匀，用水饱和酚氯仿配平 8 0 0 0 r p m , 2 0 m i n 。 ( 3 ) 取上层液体，加入2 5 倍体积的无水乙醇，混匀，在- 2 0 c 保存2 - 4 h ，用无水乙醇配平8 0 0 0 1 0 0 0 0 r p m ，2 0 m i n - ( 4 ) 取固体沉淀，加入2 5 m l 的d d w 充分溶解后，加入2 5 m l 的2 5 mk 2 h p 0 4 再加入2 5 m l 的7 - - 醇单甲醚，充分混匀，用乙二醇单甲醚配平8 0 0 0 r p m 2 0 m i n 。 ( 5 ) 取上层液体，加入d d w 至3 1 2 5 m l 再加入0 3 1 2 5 m l2 的c t a b 摇匀放入冰上3 - 4 h ，用 d d w 配平8 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 r p m , 2 0 r a i n 。 ( 6 ) 取沉淀，加入5 m l 的d d w 充分溶解后，再加入1 2 5 m l 的无水乙醇、o 5 m l 的3 m n a a c ， 摇匀，- 2 0 ( 2 至少2 h ，用无水乙醇配平8 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 r p m 2 0 r a i n 。 ( 7 ) 取沉淀，干燥后，分两次每次取2 0