（应用化学专业论文）杜仲中高纯活性成分的分离制备新工艺研究.pdf

摘要 本文立足于药效实际，从杜仲原料出发，采用制各高效液相色 谱分离、天然澄清剂絮凝、超滤、大孔吸附树脂纯化等现代分离技 术，并运用色谱保留和吸附平衡等理论优化工艺参数，分离纯化出 可用于新药开发的四种高纯活性化合物和两种杜仲活性部位产品， 走出了一条对杜仲进行精深加工和综合开发的新工艺路线，取得了 一系列有意义的成果： 1 对杜仲原材料进行提取工艺研究。通过对原材料进行研究， 筛选出杜仲鲜皮为提取环烯醚萜化合物京尼平甙酸( g p a ) 、桃叶珊 瑚甙( a u ) 和京尼平甙( 6 p ) 的原料；杜仲叶为提取杜仲绿原酸 ( c a ) 的原料。首次将微波提取技术应用于杜仲活性成分提取，同 时与常规浸提、超声波提取等方法进行比较研究，确定了合适的工 艺参数。研究证明：超声波提取法快速、高效，但选择性不好；微 波提取效果最佳，不仅快速、高效，而且选择性好、稳定性高、能 耗低，前景突出。 2 对杜仲提取物进行纯化工艺研究。杜仲皮提取物采用溶剂萃 取、大孔吸附树脂分离纯化以及特种吸附剂处理等方法将环烯醚萜 类物质富集纯化，得到环烯醚萜活性部位；杜仲叶提取物采用天然 澄清剂絮凝、超滤膜分离及树脂纯化组合工艺富集纯化得到c a 活性 部位。研究表明此方法操作简单、易于扩大、能耗低、材料可反复 使用。 3 运用高效液相色谱制各技术对g p a 、a u 、g p 及c a 等活性成分 进行分离制备研究，提出了在一个制各流程中同时得到三种高纯产 品的新工艺。 根据色谱保留理论首次建立了制备色谱流动相组成与保留因子 之间关系的保留模型，用于优化色谱分离参数；探讨了环烯醚萜类 化合物结构与其色谱保留行为之间的关系，总结出该类化合物色谱 洗脱规律；对制备色谱流动相组成、流速、洗脱方式、进样量、进 样体积等工艺参数进行优化，创造性地在制备色谱上提出了速度梯 度和台阶梯度洗脱法，得出同时制备g p a 、a u 和g p 三种产品的工艺 条件；制备出四种高纯产品，其中g p a 和a u 单体产品填补了国内空 白。同时充分考虑了溶剂回收、杜仲资源综合利用等问题，实现了 绿色化工。 4 对杜仲活性成分进行分析方法研究。提出了杜仲皮中三种主 要环烯醚萜类化合物的r p h p l c 同时分析方法，适用于原材料及产 品的质量控制，快速、准确；建立了同时快速测定杜仲叶及制剂中 g p a 和c a 的r p h p l c 方法：建立了回收率高、专属性强、重现性好 的h p l c m s 法；给出了高效灵敏的a u 分光光度法。 采用均匀设计试验对a u 分光光度法复杂的显色条件进行优化， 得出最佳显色参数；并将反馈人工神经网络法应用于a u 显色条件参 数的优化预测，得到较好的拟合结果，展示了这种新方法在该领域 的应用前景。 5 对四种高纯单体产品进行结构表征和稳定性研究。采用紫外 ( u v ) 、红外( i r ) 、核磁共振( 删r ) ”c 谱和1 h 谱以及质谱( m s ) 等手段对g p a 、a u 、g p 及c a 进行结构表征，并考察了它们对酸、 碱、有机溶剂、光、热等因素的稳定性。 6 对杜仲活性成分进行生物活性研究。通过建立的相关动物实 验模型首次对杜仲c a 活性部位进行药效研究，实验表明：杜仲c a 活性部位在治疗老年痴呆症( a d ) 方面显示出明显的效果。 关键词制备色谱，杜仲，环烯醚萜化合物，绿原酸，分离纯化 i i a b s t r a c t i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，m o d e mt e c h n o l o g i e ss u c ha sp r e p a r a t i v eh i 曲 p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( p h p l c ) ，f l o c c u l a t i o nb yn a t u r a l c l a r i f i c a t i o na n dm a c r o p o r o u sr e s i nw e r eu s e dt op u r i f yt h ef o u rb i o a c t i v e c o m p o u n d s a n dt w ok i n d so fa c t i v em i x t u r e sf r o m e u c o m m i a ( e u ) u n d e r t h e g u i d a n c e o fr e l a t i v et h e o r i e s s o m es i g n i f i c a t i v er e s u l t sw e r eo b t a i n e d a sf o l l o w ： 1 s t u d yo nt h ee x t r a c t i o nt e c h n i q u e s b a s eo nt h ec h o i c eo f v a r i o u s r a wm a t e r i a l s ，f r e s hb a r kw a sc h o s e nt oe x t r a c ti r i d o i d sc o m p o u n d ss u c h a sg e n i p o s i d i ca c i d ( g p a ) ，a u c u b i n ( a u ) a n d g e n i p o s i d e ( g p ) l e a v e s w e r eu s e dt oe x t r a c tc h l o r o g e n i ca c i d ( c a ) t r a d i t i o n a la n dn e we x t r a c t t e c h n o l o g i e ss u c ha sh o ts o l v e n te x t r a c t i o n ；u l t r a s o n i cw a v ee x t r a c t i o n a n dm i c r o w a v ee x t r a c t i o nw e r eu s e dt od e t e r m i n et h es u i t a b l em e t h o dt o e x t r a c ta c t i v em i x t u r e s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tu l t r a s o n i c e x t r a c t i o ni s q u i c ka n de f | i c i e n t b u t h a sl o ws e l e c t i v i t y m i c r o w a v e e x t r a c t i o ni st h eb e s to n e i tn o to n l yi saq u i c ka n de f 五c i e n tm e t h o db u t a l s oh a sh i g hs e l e c t i v i t y ，l o we n e r g yc o n s u m e d 2 s t u d y o nt h e s e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d s t h eb a r k e x t r a c t i o nw a sd e a l tw i t hs o l v e n te x t r a c t ，a d s o r p t i o n b ym a c r o p o r o u s a d s o r p t i o nr e s i no rs p e c i a la d s o r b e n tt oe n r i c ha n dp u r i f yi r i d o i d s s ot h e m a t e r i a l su s e di n p r e p a r a t i v eh p l c w e r eo b t a i n e d i n s t e a do fe t h a n o l s e d i m e n t a t i o n ，n a t u r a lc l a r i f i c a n tc o m b i n gw i t hu l t r a f i l t r a t i o nt e c h n o l o g y w e r ep e r f o r m e dt og e tc ae x t r a c tf r o mt h el e a v e so fe u i ts h o w st h a t t h e s et e c h n i q u e sa r es i m p l e ，l o wc o s ta n d e a s y t oe n l a r g e 3 g p a ，a u ，g pa n dc a w e r ep r e p a r e db yp h p l cm e t h o d an e w t e c h n o l o g yw a sp r e s e n t e dt h a tt h r e et a r g e tc o m p o u n d s c o u l db eo b t a i n e d i n o n e s t e p c h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o r so fg p a ，a u ，g pa n dc a i np h p l c w e r ei n v e s t i g a t e di nt h ee x p e r i m e n t s , i tw a st h ef i r s tt i m et oe s t a b l i s h m a t h e m a t i c sm o d e lt od e s c r i b et h e i rr e t e n t i o nb e h a v i o ro np h p l c s y s t e m ，w h i c hc a nb eu s e d t og u i d et h eo p t i m i z a t i o no fm o b i l ep h a s e t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h er e t e n t i o nb e h a v i o ra n dt h es t r u c t u r eo f i r i d o i d s w a sd j s c u s s e d i i l s u i t a b l ec h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e dt op r e p a r eg p a a ua n dg pi no n es t e po rc a ，s u c ha st h ec o m p o s i t i o no fm o b i l e p h a s e f l o wr a t ea n de l u t i o nm o d e ，e ta 1 f l o wr a t e g r a d i e n ta n ds t e p w i s e g r a d i e n tm o d e sw e r ep r e s e n t e do r i g i n a l l y t h ep r o d u c t so fg p a a n da u c a nf e e dt h en e c e s s i t yo fo u rc o u n t r y t h er e c y c l eo ft h e1 a r g ea m o u n to f m o b i l e p h a s e c o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no f t h er e s o u r c e so fe ua n d g r e e n c h e m i c a l e n g i n e e r i n g w e r ei n v e s t i g a t e di nt h ew h o l e p r o c e s s 4 f l e x i b l ea n a l y t i c a lm e t h o d so fe f f e c t i v ec o m p o n e n t si ne uw e r e e s t a b l i s h e di nt h ed i s s e r t a t i o n s i m u l t a n e o u sa n dq u i c kd e t e r m i n a t i o n m e t h o d so ft h r e em a i ni r i d o i d si ne ub a r ko rg p aa n dc ai ne ul e a v e s o rc h i n e s ed a t e n tm e d i c i nb yh p l cw e r ep r e s t n t e d h p l c m sw a s a d o p t e d t o a n a l y s i z e i r i d o i d si ne us a m p l e s i tw a s p r o v e d t ob e r e p e a t a b l e ，s p e c i f i c ，a c c u r a t e a n d e a s y t o o p e r a t e ah i g h s e n s i t i v e s p e c t r o p h o t o m e t r y t od e t e r m i n ea uw a sb u i l t u n i f o r i n e x p e r i m e n t a ld e s i g nw a su s e dt oo p t i m i z et h ea n a l y s i s c o n d i t i o no fa u b a c kp r o p a g a t i o na r t i f i c i a ln e l l f a l n e t w o r k ( a n n ) t e c h n i q u ew a sa p p l i e dt of o r e c a s tt h er e s u l t 5 t h es t r u c t u r ee l u c i d a t i o no fg p a g p a ua n dc aw e r ec a r d e do u t b ys p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u e ss u c ha su v ，i r ，n m r ( ”c a n d1 均a n dm s t h es t a b i l i t i e so ft h ef o u rc o m p o u n d si nt h ec o n d i t i o no fd i f f e r e n tp h ， t e m p e r a t u r e ，l i g h ta n do r g a n i cs o l v e n t s w e r ed i s c u s s e d 6 i tw a st h ef i r s tt i m et os t u d yo nt h ee f f e c to fc ao na l z h e i m e r d i s e a s e ( a d ) i n t h i sp a p e r ，a n ds a t i s i f i e dr e s u l t sw e r eo b t a i n e d a n dt h e r e l a t e da n i m a lm o d e lh a sb e e nb u i l ta sw e l l k e yw o r d sp r e p a r a t i v eh p l c ，e u c o r n m i au l m o i d e s ，i r i d o i d c o m p o u n d s ，c h l o r o g e n i ca c i d ，s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特另t l d n 以标注和致 谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材 料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了 明确的说明。 作者签名：谢日期： 2 q q 垒年上月l 日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学 位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学 位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者躲塑铈签名篼期：巡年王月盟日 l 尊士学位论文第一章绪论 第一章绪论 杜仲( 肋c d 沏妇u j m o i d e s0 1 i v ) 是我国特有的名贵中药材，它是杜仲科杜 仲属多年生落叶乔木，是国家二级保护植物。其皮入药已有二千多年历史， 神农本草经中将其列为“上品”，名为“思仙”，是名贵滋补药材。 杜仲在我国栽培历史悠久，主要分布于长江中下游各省，尤以湖南、贵 州、四川和湖北居多。3 。近年来，杜仲资源在全国的栽培面积已发展到3 5 万 多公顷( h m 2 ) ，占世界杜仲总量的9 9 以上”1 。 1 1 杜仲资源精深开发的必要性 中药是我国传统药物，随着我国加入w t o ，研究自主知识产权的新药已十 分紧迫。研究、开发新的中药，是发挥中医药优势的途径，也是中医药研究的 重要方面。本课题研究的杜仲活性成分单体化合物及杜仲环烯醚萜活性部位、 绿原酸活性部位有望成为新药开发的原料。 虽然我国杜仲资源丰富，但利用率不高，大部分原料处于自生自灭状态， 造成了资源的极大流失和浪费。目前国内对杜仲资源的开发利用多是停留在杜 仲茶、酒、冲剂、可乐、饲料添加剂等初加工产品”1 ，生产水平低、科技含量 不高，缺乏市场竞争力。因此，深入开展杜仲活性成分的精深加工，进行杜仲 中高附加值、高效活性成分的分离提取等深层次研发工作，变废为宝，不仅能 够有效利用我国特有而宝贵的杜仲资源，开发出一系列具有医疗和保健作用的 药品、食品，而且可以推进我国杜仲产业由资源优势向产业和经济优势的转 化，这对加速我国中草药国际化进程，增强我国加入w t 0 后中草药在国际市场 上的竞争力，具有巨大的社会和经济效益。 1 2 杜仲主要化学成分研究进展 对杜仲化学成分的研究始于二十世纪五十年代，为了确定杜仲的活性物 质，各国学者对杜仲进行了大量研究，发现其主要化学成分为环烯醚萜类、苯 丙素类、木脂素类、黄酮、多糖、氨基酸及杜仲胶等有机化合物，以及钙、 铁、锰、锌等无机元素。近代研究证实杜仲叶与皮化学成分基本一致【，且有 一定的互补性。 1 2 1 环烯醚萜类( ir i d o i d s ) 博士学位论文第一章绪论 环烯醚萜类化合物是由植物中臭蚁二醛转变而来的单萜类化合物”1 。目前 已从杜仲皮、叶中分离出1 5 种环烯醚萜类成分”( 见图卜1 和表卜1 ) 。其中 最主要的是京尼平甙酸( g e n i p o s i d i ca c i d ，g p a ) 、京尼平甙( g e n i p o s i d e ， g p ) 、桃叶珊瑚甙( a u c u b i n ，a u ) “”“3 等。因为环烯醚双键性质活泼，羟基呋哺 环极不稳定，而甙易被酶和酸水解，故其在鲜品和陈品的含量差别较大。杜仲 环烯醚萜类有效成分因产地、收获时间、采后处理方式不同，其含量也有明显 变化“，因此应该适时采摘原料，并进行合适的预处理。 t h 0 0 r 1 a c o 1 34 56 - 8 1 c 1 2 一1 5 图卜1 杜仲环烯醚萜类化合物结构简图 1 2 2 苯丙素类( p h e n y l p r o p a n o i d s ) 迄今为止，从杜仲中能分离得到绿原酸( c h l o r o g e n i ca c i d ，c a ) 、咖啡酸 等十儿种简单酚类及苯丙素类物质“，主要的苯丙素类物质见图卜2 及表1 2 。目| j 寸对苯丙素的报道主要集中在杜仲叶中含量较高的绿原酸( c a ) 上。大量 竖主堂堡堡塞 蔓二童竺笙 研究表明，杜仲叶中c a 含量明显高于杜仲皮，在落叶中可达到5 。汤诗杰等 对不同地理种源杜仲叶片c a 含量的研究表明，不同地理种源和不同季节杜仲叶 片中c a 的含量差异很大，为适时适地采集叶片提供t _ n 论依据。 表卜1 杜仲环烯醚萜类化合物 l京尼平甙 g e n l p o s l d e 京尼平甙酸 g e n l p o s l d l c a c l d 京尼平 g e n l p l n 桃叶珊瑚甙 a u c u b i n 杜仲甙 u l m o s i d e c 1 7 h 2 4 0 1 0 cj 6 h 2 2 0 i 。 c l l h l 0 5 c 1 5 1 1 2 2 0 9 c 2 i h 0 1 筋骨草甙c 。t 1 2 。0 。 a j u g o s i d e 哈帕甙乙酸酯 h a r p a g i d e c , t h 2 6 0i a c e t a t e 雷朴妥甙c ，h 。o r e p t o s i d e 杜仲醇c 出* 0 。 e u c o m m i o l 杜仲醇甙c ，m * 吼 e u c o m m i o s i d e 脱氧杜仲醇 l d e o x y& h t 6 0 3 e u c o i i f f i 1 0 1 3 8 8 3 7 4 2 2 6 3 4 6 5 0 8 3 9 0 4 0 6 3 9 0 1 8 8 3 5 0 1 7 2 无色针晶1 6 3 17 5 皮 无色针晶1 3 0 ，51 9 3皮时 ( e t o h ) 枝 无定型 粉末 白色 粉末 无定型 粉末 无定犁 粉末 晶体 无定型 粉末 油 无色糖 浆状 油 1 2 0 11 3 5 皮 1 7 6 91 6 3 1 州皮 种枝 2 0 1 11 6 6 1 2 1 51 5 5叶 1 5 5 51 3 2叶 2 0 1 i- 4 5叶 一3 0 5 叶皮 枝 1 3 5 叶皮 枝 一1 5 4 叶枝 r 1 - h r 2 = c o o c h ， r ：t = g l c r = h r 2 = c o o h r 3 = g l c r i = 氐= h = c o o c h 。 r 1 = 1 t r a = g l c r f o d g l c r t = h r l = o h r 2 = h r f r 2 = 0 t t r ，= h r 2 = o b r - - b r = g l c 1 2u l m o i d o s i d e c n 8 f 6 2 0 2 日1 0 8 6 淡黄色7 5叶r = h a 粉末种n = l 1 3u lm o i d o s i d e c s o b 6 0 2 。l1 2 8淡黄色83 州r = a c b 粉末 种n = l 1 4 u l m o i d o s i d eh 8 2 0 ”1 4 4 2 淡黄色9 5 6叶r = h c 粉末种n = 2 1 5 u l m o i d o s i d ec 6 6 h 目0 1 4 8 4淡黄色 1 5 5叶r = a c d 粉末种n = 2 6 7 8 9 m u 博+ 学位论文 第一章绪论 h 悉二h 。兮一一。h o h 12 图1 - 2 苯丙素类化合物结构简图 表卜2 杜仲苯丙素类化合物 1 23 黄酮类( f l a v o n e s ) 黄酮类化合物也是杜仲的活性成分之一。对杜仲黄酮的研究报道多见于含 量测定。n a k a m u r a ，t 已从杜仲叶中提取出5 种黄酮“；成军等人从杜仲叶中 分离得到了7 种黄酮类物质，包括山萘酚、槲皮素、紫云英甙、陆地锦甙，芦 丁等。药理研究表明，这些黄酮化合物均具有较强的生物活性“。 1 2 4 木脂素类( 1i g n a n s ) 木脂素是一类在生物体内出双分子苯丙素衍生物聚合而成的化合物“，是 杜仲化学成分中研究最多、结构最清晰、成分最明确的一类化合物。迄今为 止，从杜仲皮分离出的该类化合物已有2 8 种，可分为单环氧木脂素、双环氧木 脂素、环木脂素、新木脂素、倍半木脂素等类型，其中多数为甙类化合物“”】。 木脂素类在杜仲皮中含量较杜仲叶中高。张丽萍“”等研究认为在杜仲夏叶和秋 叶中均含有主要降压成分松脂醇二葡萄糖( p i n o r e s i n o ld i o b d g l u c o p y r a n o s i d e ，p d g ) ，而落叶中较低。d e y a m at 等从杜仲中分离得到 p d 6 ”“，c h a r l e dj s h i 等分离并合成了化学成分p d g 。“。 1 2 5 其它重要成分 1 25 1 杜仲胶 4 博卜学位论文 第一章绪论 杜仲胶( g u t t a p e r c h a ) 1 ”是反式异戊二烯聚合物，具有独特的 “( 橡) 胶一塑( 料) 二重性”，可做很好的医用夹板、运动员护具和高科技领 域的形状记忆功能材料。 1 25 2 杜仲籽油 杜仲籽油脂肪酸中q 一亚麻酸含量极为丰富( 高达6 1 ) ，它是人体的必需 脂肪酸，可以降低血压、降低血脂和血小板凝固，同时还具有促进神经系统、 脑和视网膜的发育，预防老年痴呆症等功效1 。 12 5 3 多糖、抗真菌蛋白、甾醇、氨基酸、维生素及微量元素 g o n d a “”等从杜仲中分离出的杜仲多糖a ( e u c o m l i a na ) 对网状内皮系统 有活化作用，可增强机体非特异性免疫。赵晓明”1 从杜仲叶提取的多糖，经红 外光谱证实其糖甙键为8 一构型，不含羟基；紫外光谱显示不含核酸、多肽和蛋 白质。从杜仲茶中提取了一种多糖类物质1 ，具有抗破坏人体免疫系统病毒的 功能，研究人员认为这种物质有抗h i v 作用，有可能用于治疗和预防艾滋病。 r e n h u a ih u a n g 等b 0 1 从杜仲皮中提取出了两种新的抗真菌蛋白e a f p i 和 e a f p 2 。 从杜仲中分离的甾类化合物有胡萝卜甙( d a u c o s t e r 0 1 ) 、0 一谷甾醇、白桦 脂醇( b e t a l i n ) 、白桦脂酸( b e t u l i ca c i d ) 和熊果酸( u r s o l i ca c i d ) ” 等。 王俊丽、减友维等研究表明杜仲中含有1 7 种水溶性氨基酸，必需氨基酸种 类齐全，并含有鸡蛋、牛奶中缺乏的必需氨基酸一酪氨酸及婴儿生长发育所必需 的组氨酸。2 “。 于学玲。”1 等研究发现杜仲中含有丰富的维生素e 以及1 3 一胡萝h 素等。杜仲 皮、叶及枝中可检测出1 3 种必需微量元素，尤其是杜仲叶中钙、镁、钠及钾的 含量远高于杜仲皮9 ”1 。 杜仲活性成分g p a 、g p 、a u 、c a 及杜仲黄酮等均为杜仲次生代谢物。王亚 琴等”对引种地与原产地杜仲叶次生代谢物含量进行了比较，表明杜仲品种的 栽种有地域性。张康健。等的研究表明在同生态环境下生长的杜仲，其次 生代谢物不仅个体间差异显著，而且同一个体不同部位之间差异也很显著。这 些研究为更有效、更有针对性地开发杜仲资源，提供了理论指导。 1 3 杜仲的药理作用研究进展 虽然我国将杜仲皮入药已经有两千多年的历史，但对于其中所含的药理活 性成分却一直未予深究，对它的认识长期处于感性认识阶段。杜仲现代药理研 究始于上世纪5 0 年代。中外科学工作者五十多年来深入细致的研究表明杜仲具 博士学位论文 第一章绪论 有多种药理活性，其物质基础主要是环烯醚萜类的g p a 、c - p 和a u ，木脂素类 p d o 及苯丙素类的c a 和杜仲黄酮等。 1 3 1 降压作用 多年的临床证实，杜仲是高质量的天然降压药物，并具有调节血脂、改善 血液流变异常、保护心脑肾等器官的作用。 美国学者研究认为，杜仲含有的p d g ，是降压的主要成分“。d e y a m at “” 研究表明6 p a 有特别强的抗高血压活性，3 0 m g k g 的剂量使大鼠血压下降2 0 一 4 0 i 啪h g ，在降压方面效果比p d o 更明显。为此日本健康与福利部已确认杜仲是 一种具有预防高血压作用的特殊食品。 我国学者研究证明杜仲的各种制剂均有一定的降压作用，炮制品比生药 强。李家实“1 等认为生物碱、c a 等物质均有不同程度的降压作用。阴健。”证实 大鼠服用环烯醚萜甙或木脂素类物质后，血压降低，效果明显，且对机体健康 无任何不良影响。朱丽青”等人认为杜仲对心血管系统有较好的药效，对豚鼠 离体心脏有明显的增加冠脉流量的作用及明显的镇痛作用，并且无毒。杜仲降 压机理的研究和探讨认为：杜仲降压主要是杜仲药剂作用于血管平滑肌，使外 周血管扩张所致”。 1 3 2 提神、抗疲劳 赵晖等“”研究了喂食杜仲叶并进行白发跑步训练对大鼠的影响，发现大鼠 骨骼肌中同工酶分布及乳酸脱氢酶和3 羟乙酰基辅酶活性明显增强，证明杜 仲叶中的g p a 等成分能提高肌肉抗疲劳能力。 1 3 3 增强免疫功能 杜仲能激活单核巨噬细胞系统的吞噬活性，增强肌体的非特异性免疫功 能：徐诗伦“”“1 进行的药理实验表明杜仲对细胞免疫有双向调节作用；周华珠“6 等观察了衰老小鼠血和肺组织抗氧化功能改变及中药杜仲叶的抗氧化性损伤作 用，认为杜仲对啮齿动物的体液免疫和细胞免疫具有双向调节作用；朱宇红“73 等 对杜仲不同炮制品对免疫作用的增强效果进行了比较研究，结果表明，杜仲炮 制后有抑制d n c b 所致小鼠迟发型超敏反应作用，同时还具有激活单核巨噬细胞 吞噬功能和增强腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用。 1 3 4 提高胶原蛋白合成、抗肌肉骨骼老化 美国宇航局专家研究认为，杜仲可促进人体皮肤、骨骼和肌肉中胶原蛋白 的合成和分解，有促进新陈代谢、防止衰退的功能“。d e y a m at 等研究表明， 杜仲中起主要作用的是g p 、g p a 等活性物质“。杜仲叶甲醇提取物中的g p a 和 从是杜仲叶促进假老龄模型大鼠胶原合成及表皮细胞增殖的活性物质“，从蛋 白代谢及角质层更新方面探讨了杜仲的抗衰老机制”。胶原蛋白与衰老有关， 6 博士学位论文第一章绪论 m e t o r i ”减少小鼠蛋白摄入量，注射杜仲叶提取液，发现其胶原蛋白合成提 高，认为g p a 及a u 发挥了主要作用。“”，研究发现新鲜杜仲皮的提取液比自然 风干的皮效果好”“。此外，杜仲叶水提取物可刺激小鼠肉芽扩大增生，促进伤 口愈合并加快假性衰老小鼠角质层转化率，而g p a 是其主要作用成分6 。杜仲 茶对肝、心脏中的超氧阴离子0 j 自由基的清除率可达7 6 8 以上，表现出抗衰 老作用。 1 3 5 防癌、抗癌 h s uh y ”等研究证明，g p a 和g p 对抗癌变有非常重要的作用，可用以防 止x 射线导致的肿瘤的发生，对血液系统的辐射损害也可以起到一定的防护作 用”。g p 还可有效预防1 2 0 一十四酰佛波醇一1 3 一乙酸盐( t p a ) 诱发的肿瘤、 增生、表皮炎及浮肿，抑制氢过氧化物的产生。g p a 、g p 及甙元京尼平等对t p a 诱发的e b 病毒( 非洲淋巴细胞瘤病毒) 有一定的抑制作用“。丝裂霉素实验也 证明，6 p a 、g p 等环烯醚萜类物质有抗突变活性n 7 。杜仲茶的抗诱变作用研 究表明“3 ，g p a 和g p 对老鼠和c h o 细胞有抑制断裂的作用，可显著降低染 色体失常，从面表现出抗癌活性。研究表明杜仲黄酮类物质也具有一定的抗癌 作用”，c a 等酚酸类物质可有效抑制a f b l 、b b p 及4 一硝基喹啉氧化物 ( 4 一n q o ) 等的致癌性，并可以防止y 一射线对白鼠脊髓及白鼠染色体造成的损 伤。 1 3 6 保肝利胆活性及利尿作用 杜仲中咖啡酸及c a 等酚酸类物质、环烯醚萜类物质可促进肝功能和肝组织 再生，有效预防溴苯，四氯化碳对白鼠肝细胞造成的损伤”“。a u 可抑制肝细胞 r n a 及蛋白质的合成，对四氯化碳诱发的肝损伤有明显的保护作用“。d o n g h y u n ”等研究认为这归因于a u 的开链的糖苷配基可与蛋白质的亲核部分形成亚 胺结构。g p 可有效降低食用高糖的白鼠肝中三酰甘油酯、胰岛素及谷丙转氨酶 的水平，对急性黄疸肝损伤也有良好的预防功效蛳1 。 6 p a 、g p 还是杜仲利胆主要成分。它们能改变胆汁成分，对阻止胆固醇结 石的形成有一定的作用。据t a k e d a 和m a s a h o r i 报道，g p a 和g p 是通过其水解 产物京尼平起利胆作用，臧友维”“、乔卫”等也有类似报道。此外杜仲中的 c a 也有利胆作用，能促进胆汁和胃液的分泌。 杜仲的各种制剂都有利尿作用。2 。该作用主要是与a u 成分有关a u 能刺 激副交感神经枢，加快尿酸转移和排出，利尿作用明显。 1 3 7 抗菌、抗病毒作用 杜仲煎剂对十几种常见细菌如大肠杆菌、炭疽杆菌、肺炎杆菌及白喉杆菌 等均有不同程度的抑菌作用。a u 无抗病毒作用，但它与葡萄糖甙酶一起培养后 7 第一章绪论 作用明显，埘革氏阴性和阳性菌均有较强的抑制作用，临床上可用于促进伤口 愈合。c a 及咖啡酸也具有广泛的抗菌活性，且咖啡酸还有抗脊髓皮质炎，i 型 和副流感i it 型病毒及i 型单纯疱疹病毒的活性o “。 1 3 8 其他药理作用 g p a 具有抗胃溃疡功效，可显著抑制胃酸分泌，并有预防性功能低下、增 强记忆的作用。高桥周七“。等证实g p a 、g p 及丁香脂醇二葡萄糖甙可有效预防 因紧张、压力等原因所引起的记忆力衰退。g p 及其甙元可抑制因乙酸引起的大 鼠痉挛“。最近g o w - c h i ny e n “”等研究认为g p a 对h ：0 ：诱导的淋巴细胞d n a 氧化损伤具有抑制作用，且表现出浓度依赖关系。杜仲c a 及g p a 具有兴奋垂体 一腺上肾皮质系统，提高其功能的作用”“。杜仲皮、叶有强壮作用，可提高小 鼠抗疲劳、抗冻及耐缺氧能力”1 。 1 39 在农业上的作用 g p 具有调节植物生长功能，能有效提高棉花、黄瓜等作物的产量。张伯熙 等”“实验表明，用g p 及复方水溶液浸泡种子，可使黄瓜增产2 5 以上。张焕裕 等研究证明”4 。7 ，g p 可用作植物生根促进荆，显著增加棉花、小麦产量。 用杜仲叶喂食鸡、鳗鱼、兔、牛，可增加胶原的含量，减少中性脂肪，使 其瘦肉多而嫩，营养更丰富。特别是杜仲作为饲料喂鸡，产蛋量提高，且蛋中 胆固醇含量降低，高密度脂蛋白含量提高”。 1 4 杜仲主要活性成分提取纯化工艺研究进展 1 4 1 杜仲环烯醚类萜化合物的研究进展 杜仲成分复杂，很多化合物结构和性质相近，因此，活性成分的提取分离 较为困难。 周贵新”7 1 发明了一种用超临界二氧化碳从杜仲中提取g p a 、c a 、丁香脂二 糖甙的方法，设备投入大，产品纯度有限：董娟娥等进行了提高杜仲叶中主要 活性物质a u 及杜仲黄酮提取率的研究，得到最佳提取条件”；马柏林等对杜仲 a u 等进行提取研究，并用吸附剂进行了纯化”，他们采用混合脱色剂对a u 粗 提液进行脱色研究，得到较优配方”：邓勇等”“研究了杜仲叶中以a u 为代表的 活性成分的溶出过程，认为提取温度、p h 值以及水的离子总量对提取率具有明 显的影响；刘大川等对杜仲翅果的研究表明，杜仲种子中主要含a u ，采用乙醇 乙醚法提取a u 的得率可达4 ”；d e y a m at 。”等也有研究报道”5 。“。 到目前为止，国内外对杜仲环烯醚萜类化合物的研究大多停留在分离分析 上，一般采用传统的提取纯化工艺，经萃取、沉淀、聚酰胺柱层析、大孔树脂 吸附及硅胶、氧化铝等”方法进一步分离提纯，展后结晶得产品。一般存在产 8 博士学位论文第一章绪论 率低、工艺复杂、操作繁琐、成本高等不足，很少有适宜较大规模生产的研究 报道。 1 ，42 杜仲c a 的研究 c a 的研究报道较多。目前c a 提取方法有甲醇提取法、乙醇提取法、水提 取法、氯仿一乙醇提取法、酸性正丁醇提取法曲7 。8 8 3 等。钱骅1 等研究了杜仲c a 的最佳浸提条件，并筛选出一种性能优良的大孔吸附树脂进行纯化；高锦明等 利用混合溶剂提取，c a 等活性成分含量可达到6 9 3 ；张风云。”比较了乙醚提 取法、甲醇提取法和水提取法从杜仲叶中提取c a 的优缺点，认为水提法最经济 实用。 对于杜仲c a 纯化方法，文献报道有石硫法。“、异戊醇法。”、乙酸乙酯萃取 法。4 4 、大孔吸附树脂纯化法“”等。汪洪武等采用铅盐沉淀，酸化后用乙酸 乙酯萃取，最后重结晶得到c a 纯品”；戚向阳等采用水提树脂分离后，再萃取 ”“：马希汉”1 等用化学萃取、无机盐沉淀得到少量c a 纯品；还有从金银花提取 分离c a 的报道1 。而国外主要从咖啡豆、苹果、蒲公英等植物中提取c a 。 但队e 对c a 纯化方法一般要消耗大量的有机试剂，生产效率低，成本高， 工艺复杂，不适宜工业化生产。 1 。4 ，3 杜仲深度开发存在的问题 我国的杜仲资源占绝对优势，为杜仲的开发提供了充足的资源保障。杜仲 含有多种化学成分并具有广泛的药理作用，所以应用前景广阔。但目前市场上 的杜仲产品大多数为杜仲复方制剂及保健饮料，未见有高纯度、高附加值产品 面市。现有的杜仲产品加工工艺都存在提取率低、产品纯度低、工序复杂、操 作繁琐、消耗溶剂多、材料不易再生、不利于环保等不足。 要实现杜仲产业的的规范化，促进杜仲产业的健康、有序的发展，必须采 用现代化的新工艺、新技术替代旧工艺技术，提高杜仲产品的科技含量。 1 5 制备液相色谱理论及应用进展 色谱是迄今人类掌握的对复杂样品分离效率最高的一种方法。近十年来， 制备液相色谱技术得到了迅速发展。该技术对于天然药物的分离纯化尤为有 利，因为其分离条件温和，一般在室温下进行，分离检测过程中一般没有样品 的破坏，活性成分和热不稳定成分不易被分解，从而保持其天然活性“1 ”1 。 1 5 1 制备色谱与分析色谱的区别“1 分析型色谱由于进样浓度低，处于吸附等温线的线性区域，得到的色谱峰 是对称的高斯曲线。制备色谱往往进样浓度高，柱超载条件下运行“”1 ，组分浓 度落在吸附等温线的非线性范围内，平衡常数随流动相中溶质浓度的改变而改 9 | 尊士学位论文 第一章绪论 变，使所得的色谱峰不对称，甚至导致峰重叠现象。 柱超载一般有两种方法，一种是体积超载，另一种是采用溶质超载。柱超 载时柱效将会大大降低，但这种制备方式能够最大限度地利用昂贵的高效液相 谱填料，使单位时间内的制备量大幅度提高。这时适当地切割部分馏分，用循 环进料的方法，可提高产品的产量“1 “1 。 工业制备色谱中，超载点的确定非常重要。，国外对超载状态的表征方法 提出了许多方法“。1 ”3 作为衡量柱超载的标准。工业上还要考虑溶剂回收的能耗 和设备操作等费用。 1 5 2 制备液相色谱动态理论 色谱过程动力学研究物质在色谱过程中的运动规律，主要是解释色谱流出 曲线，探求影响色谱区域宽度扩展的因素和机理，从而为获得高效能的色谱系 统提供理论上的指导，为选择色谱分离条件奠定理论基础。制备色谱是非线性 体系，溶质在床层中的动态过程要十分复杂，其模型求解往往要借助于数值计 算。描述色谱动态过程的模型有随机步进模型、瞬问平衡模型、等板高度模 型、速率理论模型“”“”等等。 153 制备液相色谱分离条件优化及色谱保留与溶质结构关系研究 色谱的分离条件优化，是指对影响溶质保留规律和选择性的色谱参数进行 优化的方法。可以根据具体的研究对象选择等度或梯度分离条件优化。 制备色谱的分离一般分为用于生产的色谱制备与实验室制备，在具体操作 时两者完全不同。生产过程必须考虑成本和产率，考虑的指标包括处理量、产 率、得率( 回收率) 、纯度、上样量、周期等“1 。在色谱柱确定的基础上考察 流动相组成、温度、流速、溶液p h 值等条件对分离效果的影响。”1 ”1 十分重 要。 a k u l i k 等人研究了反相制备色谱柱上，溶质的溶解性、流动相溶剂的强 度、样品浓度、进样体积、固定相颗粒大小等因素对色谱分离效率的影响“”1 。 认为选择合适的溶剂溶解溶质、控制好溶剂的强度对柱效的提高十分有效。 近年来，分子结构与色谱保留相关性方面的研究日益引起色谱学家的瞩 目，尤其是保留值的预测。国内对该方面的研究很少，大连物化所单亦初、张 玉奎等建立了一种预测线性梯度洗脱条件下溶质保留时间的新方法，对一些结 构较为简单的化合物的保留规律进行了研究“2 1 。”；刘江云采用r p h p l c 法对天 然酚酸类化合物进行定性和定量分析，探讨了酚酸的结构与保留行为之间的关 系”1 ；国外对色谱溶质的结构与保留之间的关系的研究很多也停留