（发酵工程专业论文）阿维菌素的工艺优化研究.pdf

摘 要 i 摘 要 阿维菌素具有很强的杀虫活性，是一种良好的杀螨虫、昆虫和寄生虫的药 物，可以用于畜和农作物。现行工艺中存在对基础理论的研究不足；提取收率 较低、溶剂消耗量大、结晶次数多、时间长等问题；阿维菌素废水属于难降解 的高浓度有机抗生素废水。由于现有处理技术资源化程度低、废水稀释倍数高、 水资源浪费严重等缺点，导致处理成本很高。本论文主要针对这些问题开展研 究。 1. 工业生产中阿维菌素在不同比例的水溶剂中的溶解度是重要的基础依 据，本实验采用平衡法测定了阿维菌素在甲醇含量 100%- 70%、乙醇含量 100 %- 60 %的水溶剂中，温度范围为 30- 70 的溶解度，并采用多项式经验方程、 半经验关联模型对实验测定溶解度数据进行关联，相关系数都在 98 %以上，结 果较为满意。结果表明在甲醇- - - 水溶剂体系中随水的比例增加，溶解度减少较 为明显， 以 32 时为例， 90%甲醇- 水溶剂比纯甲醇做溶剂的溶解度下降了 67 %， 而乙醇- - - 水体系随水的比例增加，溶解度减小较缓和，同样条件下下降了 28 %。 2. 本文研究了菌丝体含水量、甲醇用量、浸提温度、浸提时间与浸提收率 之间的关系；初步研究补水结晶工艺。研究结果表明：菌丝体含水量在 80左 右，甲醇用量为菌丝体重量的 6 倍，浸提时间为 2 个小时，浸提温度为 40时， 浸提收率最高；通过研究补水结晶工艺，发现流加补水结晶法的收率明显好于 静置结晶法。且随着晶溶剂中水分含量的升高，b1a 结晶收率呈现升高的趋势， 而 b1a 纯度则呈现下降的趋势。当结晶溶剂中水分含量为 5时，b1a 结晶收率 和 b1a 纯度都高于冷却结晶。 3. 本论文研究利用阿维菌素发酵废液生产酵母单细胞蛋白。首先从废液中 筛选出可以耐受残留阿维菌素的酵母菌种，其次对其发酵工艺条件的优化进行 了初步研究。结果表明：摇瓶试验中，在装液量 51.60 ml、ph=4.0、温度 30 、 接种量 10%、发酵周期 28.68 h条件下，发酵效果最佳，生物量可达 9.84 g/l， cod 去除率可达 74.5 %；在此条件下，采用 2 l小型发酵罐曝气培养，得生物 量为5.74 g/l， cod去除率为42.5 %； 采用30 l曝气池培养， 生物量可达5.33 g/l， cod 去 除率可达 45.2 %。所得酵母干粉水分含量为 8.12 %，灰分为 5.18 %， 总氮为 40.02 %，各项指标均达到国家相关标准。本研究所采用的方法不仅能将 废水中的有机物资源化，生产酵母单细胞蛋白，而且还能有效去除废液中的 cod，并且降低了废水的总稀释倍数，减少了吨产品的水消耗。实现环境效益 和经济效益的双丰收。 河北科技大学硕士学位论文 ii 关键词：阿维菌素；溶解度；关联；浸提；补水结晶；废水处理 abstract iii abstract avermectins shows strong insecticidal activity, which can be used as insecticide in both agriculture and animal. there are many problems in the current extraction technology, such as lack of fundamental theory, lower extraction yield, high solvent requirement, and the complex crystallization, time- consuming. meanwhile, waste water from avermectin production is refractory with high output and high cod concentration and high cost further. the present waste water treatment technology, with little reuse of the organic material, needs high dilution ratio during treatment. in this paper those problem was investigated 1. the solubilities of avermectins in different system of alcohol - water are very important for the industrial production of avermectin. in this paper, the solubility curves of avermectins in binary solvent of methanol- water (methanol content 100%- 60%) and ethanol- water (ethanol content 100%- 70%) were determined by equilibrium method in the temperature range of 30- 70. the experimental results were correlated with mathematic models by empirical polynomial equation and the semiempirical equation respectively, the correlation coefficient were above 98%. it was found that in the binary solvent of methanol- water mixture, the higher the water content, the lower the solubility. at 30, the solubility in 90% methanol- water decrease by 67% of the solubility in a bsolute methnol. in the similar system of ethanol- water mixture, the solubility decreased by 28%, much lower than that of methanol- water system. 2. the relations between the water content of the mycelium and the extraction yield, the amount of methanol and the extraction yield, the extraction temperature and the extraction yield, the extraction time and the extraction yield were studied. and the process of watering- out crystallization was also studied. the results showed that the extraction yield was best when the water content was around 80%, the amount of methanol was 6 times than the weight of mycelia, the extraction temperature was 40 and the extraction time was 2 hours. the yield of watering- out crystallization was better than that of cooling crystallization by the study of the process of water crystallization. the yield of avm b1a was increased but the product purity was falling with the increase of the water content in the crystallization system. the yield of b1a and the product purity were better than those of cooling crystallization when the water content was 5% in the crystallization system. 3. yeast single cell protein is produced from the spent beer of avermectin 河北科技大学硕士学位论文 iv fermentation in this research. first of all, the yeast which can resist avermectin is screened from the waste water. second, the optimization of fermentation conditions was conducted. the results showed that in the shake flask experiments, conditions at the liquid volume of 51.60 ml, ph = 4.0, temperature 30 , inoculum volume of 10%, the fermentation period of 28.68 h , the fermentation shows the best, with dry biomass up to 7.64 g/l, and cod removal ratio up to 74.5%. with the same culture conditions, a 2 l fermenter is employed for further investigation. the results showed the dry biomass can be up to 5.74 g / l, and cod removal rate can be up to 42.5%. besides, yeast was cultivated in the 30 l aeration pool with biomass up to 5.33 g / l and cod removal rate up to 45.2%. the moisture content of dry yeast powder is 8.12%, and the ash content is 5.18% while 40.02% for crude protein. all these comply with national standards. methods used in this study can not only turn the organic matter in waste water into yeast single cell protein, but also remove cod in waste water, and reduce wastewater general dilution times, reduce water consumption per ton of product. the results will help avermectin manufacturers become more environmental friendly and make more money. key words avermectins; solubility; correlation; extraction; watering- out crystallization; wastewater treatment 第 1 章 绪 论 1 第 1 章 绪 论 avermectin具有很强的杀虫活性，是一种良好的杀螨虫、昆虫和寄生虫的药物， 可以用于人、畜和农作物。作为杀虫剂，avermectin具有高效性和广谱性，它可以同 时驱杀几乎所有的线虫类、昆虫类和螨虫类寄生虫，且一次用药能达到80%100% 的驱净率。avermectin的残毒低，有很好的杀虫选择性，是一种良好的大面积控制害 虫的杀虫剂1。据报道，阿维菌素的降解速率非常之快，在一定范围内，当底物浓度 增加时，降解速率常数相应加快。这对于阿维菌素的应用具有重大的意义2。 阿维菌素的发展具有良好的前景。2007年全面禁止高毒农药（甲胺磷、对硫磷、 甲基对硫磷、久效磷等）的替代效应，直接为阿维菌素等高效低毒的生物杀虫剂的 发展提供了空间，强调绿色、环保、建立和谐社会，给阿维菌素带来空前发展机遇3。 1.1 阿维菌素现状与前景 1.1.1 阿维菌素发展历史与现状 21 世纪是生物农药的世纪，阿维菌素是一种生物农药，符合世界农药发展趋势 和我国产业政策。现在，我国已成为世界阿维菌素的主要制造基地。原药生产已经 规模化，其制剂多剂型，并与 30 多种其它有效成份混用或复配，成为国内主要农药 品种。因此，可以说阿维菌素是生物农药的奇葩4。 阿维菌素起源于上世纪 70 年代。 1975 年日本北里大学大村智等从静冈县土样中 分离出一种灰色链霉菌 streptomyces avermitilis ma- 4680（nrrl8165） ，随后，默克 公司从该菌发酵菌丝中提取出一组由 8 个结构相近同系物组成的次级代谢产物，即 十六元大环内酯化合物，并命名为阿维菌素（avermectin，简称 avm） 。其中以 b1a 的活性最高。原药为白色至浅黄色结晶粉，微溶于水，易溶于有机溶剂，常温下稳 定，无腐蚀性，遇紫外光易分解。1981 年该公司实现了阿维菌素的产业化，并逐渐 应用在农牧业和卫生上。 20 世纪 80 年代末，上海农药所着手开发阿维菌素，1993 年中国农大立项开发 并，于 1994 年第一个获得 1.8%阿维菌素乳油（爱福丁）临时登记，同时上市。直到 1996 年，我国有一个企业获得阿维菌素原药临时登记，十个单剂和五个混剂也获得 临时登记。 因此阿维菌素已成为我国生物农药的奇葩，在农业上的应用和作用将会更加突 出和重要4。 1.1.2 阿维菌素的应用及其优点 （1）阿维菌素的应用 河北科技大学硕士学位论文 2 a 阿维菌素在农业上的应用 阿维菌素是一种高效低毒的新型农药，它的商品名有：agri- mek，affirm，avid， ivemectin，zephyr等。 阿维菌素是一种杀螨剂，对柑桔锈螨、柑桔红蜘蛛、叶螨、棉花害虫及蔬菜的 潜叶蛾、害螨、粘虫、番茄晓虫等均有很高的防效。4” - 脱氧- 4” 甲基氨基- 4” 表齐墩螨 素bi盐酸盐（mk- 234）是一种新型阿维菌素杀虫剂，对防治包括对阿维菌素敏感性 低的粘虫在内的经济上重要的鳞翅目动物虫有高度的潜在活性5。 b 阿维菌素在畜牧业上的应用 阿维菌素对多种动物寄生虫有卓效，可用做兽药和饲料添加剂。伊维菌素注射 液是一种新型大环内酯类抗生素类驱虫剂，具有广谱、高效、低毒等优点。对线虫、 螨虫有极佳杀灭效果。伊维菌素预混剂专以驱除猪的寄生虫。 c 阿维菌素在医学上的应用 阿维菌素为广谱抗寄生虫抗生素。本品口服、注射有效，是一高校、广谱的抗 寄生虫药物。其抗蠕虫及杀虫活性显著，几乎对所有线虫有效。与砷剂合用对绦虫 病可起作用。 （2）阿维菌素的优点 作为一种新型抗生素类生物农药，阿维菌素具有结构新颖、高效、安全、农畜 两用的特点，也是当前生物农药市场中最受欢迎的新产品之一6。 首先，阿维菌素具有独特的作用机制，不易使害虫产生抗性。阿维菌素的作用 靶体为昆虫外周神经系统内的 r氨基丁酸（gaba）受体。它能促进 r氨基丁 酸从神经末梢释放，增强 r氨基丁酸与细胞膜上受体的结合，从而使进入细胞的氯 离子增加，细胞膜超极化，导致神经信号传递受抑，致使麻痹、死亡。这种独特的 作用机制，不易使害虫产生抗性，与其它农药无交互抗性，能有效地杀灭对其它农 药已经产生抗性的害虫。 其次，杀虫谱广。目前报道 avermectin杀虫谱有 84 种，能有效防治双翅目、同 翅目、鞘翅目和鳞翅目害虫及多种害螨，如柑桔锈螨（锈壁虱） 、桔全爪螨、桔芽瘿 螨、桔短须螨、斑真叶螨、茶半趺螨、矢尖盾蚧及实硬蓟马；棉花的各种螨类及潜 蛾、棉叶夜蛾；观尝植物的潜叶蛾、苜蓿蓟马、小长管蚜类、桃蚜；蔬菜斑潜蝇幼 虫、菜青虫、茎叶蛾；马铃薯叶甲；果树螨类、圆盾蚧、梨木虱及烟草夜蛾、天夜、 烟粉虱等 80 多种害螨和害虫。我国多用来防治虫体小、世代多、易出现抗药性的害 虫，如梨木虱、棉蚜等，潜叶性的害虫如美洲斑潜蝇等，害螨如二斑叶螨、茶橙叶 螨、山楂叶螨和寄主广、食性杂的害虫如小菜蛾等。 再次，阿维菌素具有高生物活性。阿维菌素对害虫具有触杀和胃毒作用，无内 吸性，但有较强的渗透作用。药液喷到植物叶面后迅速渗入叶肉内形成众多的微型 第 1 章 绪 论 3 药囊，并能在植物体内横向传导，杀虫活性高，比常用农药高 550 倍，亩施用量 仅 0.1- 0.5 ga.i。螨类成虫、若虫和昆虫幼虫接触阿维菌素后即出现麻痹症状，不活 动、不取食，2- 4 天后死亡。能有效防治双翅目，同翅目，鞘翅目和鳞翅目害虫及多 种害螨。如:柑桔锈螨（锈壁虱） 、桔全爪螨、桔芽瘿螨、桔短须螨、斑真叶螨、茶半 趺螨、矢尖盾蚧及实硬蓟马；棉花的各种螨类及潜蛾、棉叶夜蛾；观尝植物的潜叶 蛾、苜蓿蓟马、小长管蚜类、桃蚜；蔬菜斑潜蝇幼虫、菜青虫、茎叶蛾；马铃薯叶 甲；果树螨类、圆盾蚧、梨木虱及烟草夜蛾、天夜、烟粉虱等 80 多种害螨和害虫。 1.1.3 国内生产现状 阿维菌素系列农药作为高效、安全、与环境友好的生物农药产品，市场不断拓 展、扩大，因此吸引了很多投资者进入这一产业领域。尤其是 2004 年其价格暴涨后， 丰厚的利润吸引众多外围企业转产，使其价格在 2005 年再次回落4。 国内主要生产经营阿维菌素的企业较多。河北威远生物化工股份有限公司，河 北省首家上市公司，在业内生产阿维菌素的规模最大，为 300t/a，已经获得原药正式 登记，也是 avm衍生物国内开发最早，最全的企业之一，现有全国规模最大的伊维 菌素生产装置和甲氨基阿维菌素生产装置。 威远生化是全国最早生产阿维菌素产品的企业之一，因此在技术和生产上都积 累了相当的经验，有较强的产品深加工能力。比如，在阿维菌素系列深加工的能力 上，公司能够将阿维菌素深加工为附加值更高的伊维菌素、甲氨基阿维菌素以及乙 酰氨基阿维菌素。其中伊维菌素主要作为兽药出口，目前正在申报 fda 认证；如果 通过，将打开规范市场，提升产品的销售量和销售价格。甲氨基阿维菌素对某些虫 害的防治效果是阿维菌素的数倍乃至上千倍，并且毒性和残留更低，售价较高，附 加值更高；乙酰氨基阿维菌素在国内只有威远生化有能力生产，不过产量比较少。 由于威远生化的阿维菌素深加工比例高达 40，其产品毛利率得以显著提高。 国内的生产企业还有：山东齐鲁制药股份有限公司、浙江升华拜克、浙江钱江 生化、华药爱诺、浙江海正药业、大庆志飞等。众多的企业在分割阿维菌素这个市 场，具备市场开拓能力的企业在于拥有成本、产能和技术积累方面的优势，这样才 能够在产业竞争者众多、竞争对手不断退出之时，维持可观利润率，进一步扩大市 场份额7。 1.1.4 阿维菌素的发展前景 阿维菌素的发展具有良好的前景。就国内市场而言，十一五规划意味着新工业 时代的到来，强调绿色、环保、建立和谐社会，给阿维菌素带来空前发展机遇，也 给阿维菌素衍生产品带来空前发展机遇8。 阿维菌素在国内面临的机遇首先是 2007 年全面禁止高毒农药的替代效应。我国 河北科技大学硕士学位论文 4 每年的高毒农药使用量占全部农药使用量的 30左右，而甲胺磷、对硫磷、甲基对 硫磷、 久效磷和磷胺等 5 种高毒有机磷农药的使用量占高毒农药使用量的 80左右。 从保护生命安全和健康、保护环境、增强农产品国际市场竞争力、促进农药工业结 构调整和产业升级出发，国家发展改革委员会、农业部决定从 2004 年到 2007 年分 3 个阶段削减 5 种高毒农药使用，其中 2004 年到 2005 年将 5 种高毒农药的使用范围 缩减到玉米、小麦、水稻、棉花四种作物上，在 2007 年 1 月 1 日将全面禁止其在农 作物上的使用。 2006 年作为国家强制淘汰五个高毒农药的最后期限，直接为阿维菌素等高效低 毒的生物杀虫剂的发展提供了空间；同时，经农业部组织科学试验后，avm作为替 代高毒农药的品种推荐应用在水稻上将指日可待，长期以来 avm的这块使用禁地 将变成了绿色通道。未来五年，国家将加大林业病虫害防治投入的力度，除了专项 投入外，还将以增加的 10 亿元林业补偿金来体现。这项投入的增加对我国相关农药 企业来说就是一个潜在的巨大市场，也是 avm 的潜在巨大市场。2005 年，遍及全 国 28 个省市自治区共 400 家企业累计登记产品达 1300 个，其中原药登记企业十四 家， 有两家企业获得正式登记。 全国阿维菌素总生产能力超过 800t/a； 据不完全统计， 全国销售收入（含出口）超过 10 亿元。 avm的生产企业这些年来快速发展，创新意识和创新能力有所增强，为保证产 品质量，创造了条件。几十年来的改革开放，骨干农药企业的经营管理水平明显提 高，已经由传统的销售向营销转变，培育和配备了相应的售前和售后服务人员，有 能力和实力为农民提供质优价廉的 avm及其衍生物商品，并能提供良好的服务。国 家也将加大力度，严格管理农资市场，为农药和兽药市场的规范运作创造更好的条 件，骨干农资生产企业正当经营的外部环境只会越来越好9。 对于阿维菌素等生物农药的需求也不断上升。目前全球农药市场中生物农药及 转基因技术销售额已占 10，但中国则不到 5，这也为阿维菌素在国内的运用和 市场拓展提供了广阔空间。十几年来，我国的广大农民已经认识阿维菌素及其衍生 物，并积累了丰富的使用经验，具有使用 avm 及其衍生物的知识和经验，加上国家 免农业税为他们增加了购买能力，因而增加了购买需求的欲望。而欧美和日本对我 国农产品出口的各种限制政策，也从另一个角度刺激国内 avm应用的增长8。 就国际市场而言， 欧盟于 2003 年 12 月 31 日起正式对 320 种农药实施重新登记， 又制定了 reach 法规（欧盟关于化学品注册、评估和限制制度）正在征求意见。 日本制定了肯定列表制度，从 2006 年 5 月开始，对 714 种农药、兽药和饲料添加 剂设定了二万多项最大允许残留限量标准，即暂定标准。同时，对尚不能确定具体 暂定标准的农药、兽药和饲料添加剂，设定 0.01ppm 的一律标准。一旦食品中残 留物含量超过暂定标准或一律标准，禁止进口和流通。对于化学农兽药来说，这 第 1 章 绪 论 5 些都是坏信息，对生物农兽药来说，又有有利的一面10。 因此我们认为阿维菌素是一种应用前景十分广阔、经济效益和社会效益都非常显著 的微生物发酵产品 1.2 阿维菌素的结构与理化性质 1.2.1 阿维菌素的结构 avermectin是由灰色链霉菌streptomyces avermitilis 产生的一组大环内酯类物 质8，包括结构相似的8种天然组分，结构见图1。根据c- 5位上取代基不同，c- 22 和 c- 23 之间的单双键差异及c- 25位上取代基的不同，分别用a、b； 1、2； a、b 组 合表示，b 组分药效较a组分强，b1组分较b2组分强，b1组分中又以b1a药效更好 一些。所以avermectin的提纯一般针对b1a组分11。 1.2.2 阿维菌素的理化性质 （1）物理性质 原药精粉为白色或黄色结晶（含b1a=90%），蒸气压200mpa，熔点150 155，溶解度（21）：水中为10微克/升、丙酮中100克/升、甲苯中350克/ 升、异丙醇70克/升、氯仿25克/升，常温下不易分解。在25，ph59的溶液 中无分解现象。农药上常用的叫做阿维菌素油膏，是阿维菌素精粉提炼后的附 属品，为二甲苯溶解乳油装，含量在3- 7%之间。 （2）化学性质 a 稳定性 阿维菌素对弱酸稳定，对强碱敏感。用稀强酸处理可使其迅速失去一个齐 墩果糖而剩下的部分则是相当稳定的。 阿维菌素的冰醋酸溶液在室温下较稳定。 b 酰化作用 阿维菌素在c位有一个叔羟基，其中阿维菌素a2在c23位还含有仲羟基，它 们都可被酰化。 c 烷基化作用 由于阿维菌素对强碱敏感，因此不太容易烷基化。但在氧化银存在下，烷 基碘可迅速与5- 羟基反应，从而将阿维菌素“ b” 组分转化成“ a” 组分的5- 甲氧基 化合物。在上述条件下，分子中其它羟基也可缓慢地甲基化。 河北科技大学硕士学位论文 6 图1- 1 天然阿维菌素的化学结构 fig. 1- 1 chemical structure of avermectins avermectin r1 x y r2 a1a ch3 ch = ch c2h5 a1b ch3 c h = ch ch3 a2a ch3 ch2 ch（oh） c2h5 a2b ch3 ch2 ch（oh） ch3 b1a h ch = ch c2h5 b1b h ch = ch ch3 b2a h ch2 ch（oh） c2h5 b2b h ch2 ch（oh） ch3 d 氢化作用 阿维菌素都含有8，10- 二烯，及c2和c14位两个孤立双键。“ a1” 和“ b1” 组分 在分子的螺酮部分还有一个孤立双键， 它是分子中唯一的双取代顺式孤立双键， 因此可以（ph3p3）rhcl为催化剂，用wilkinson法进行氢化，结果得22，23- 双 氢阿维菌素a1和b1。含有多于80的22，23- 双氢阿维菌素b1a和少于20的22， 23- 双氢阿维菌素b1b的混合物即为伊维菌素。 e 氧化作用 阿维菌素的c4” ，c5及c23位上的3个仲羟基容易受到氧化，如“ b1” 和“ b” 组 第 1 章 绪 论 7 分的烯丙位5- 羟基可用二氧化镁将其氧化成?， 不饱和5- 酮。 f 阿维菌素的互变现象 阿维链霉菌在发酵中所产生的主要是阿维菌素 a2、b1 和 b2。由于在应用 上使用的是“ b1” 组组分，特别是它的氢化产物，因此，由其它组分向“ b2” 的转 化就有很重要的意义。这种转化首先需用形成 22，23- 双键，这可通过对 c23 羟基的消除而得到，在微生物体内这种转化即为此形式。另外，也通过脱氧作 用而间接得到双键已氢化的伊维菌素。从 “ a2” 组分向“ b1” 组分的转化还需要 5- 甲基选择地去甲基， 此时需要 4- 和 5- 羟基加以保护， 保护剂可用苯氧乙酸等 12。 1.3 阿维菌素的提取方法研究现状 从细胞中浸取出阿维菌素所采用的是有机溶剂破壁的方法，其破壁的原理为： 有机溶剂被吸收进细胞壁的类脂中，使胞壁膜溶胀，进而使细胞破碎，胞内物质被 释放出来。甲醇和正丁醇的结晶纯度较高，去除杂质效果较好，甲醇结晶可以去尽 a2a、a1b，正丁醇结晶基本可以去尽a2b、a2a、a1b，对另外几种杂质的去除效果 也较好。但甲醇易回收，可重复利用，因此用甲醇进行浸取和结晶。 从发酵液中分离出阿维菌素以及其中的重要组分阿维菌素b1，所报道的方法有 所不同。 80年代初期，先将发酵液进行酸化过滤，然后用有机溶剂萃取，再将萃取 液通过硅胶柱层析获得b1组分。 90年代中期，国内的生产工艺主要是：先将阿维菌素发酵液过滤得到菌丝 滤饼后，用95和75的乙醇两次萃取过滤，再将乙醇萃取滤液经过大孔树脂 吸附后，用丙酮解析得到洗脱液，然后经减压浓缩得到膏状物，最后膏状物多 次结晶纯化得到阿维菌素b1的成品 15。 目前的阿维菌素生产中基本还引用90年代中期的工艺。一种提取工艺流程为： 发酵液经板框过滤后收集滤饼，用56倍的有机溶剂分3次浸泡滤饼，合并浸提液， 并减压浓缩，然后用2倍体积的乙酸乙醋萃取两次，经1活性炭脱色后，减压浓缩 得到黄色油状物加热油状物使其溶解， 趁热滴入阿维菌素结晶液中，并不断搅拌， 静置冷却过夜，结晶阿维菌素b1，离心收集阿维菌素b1的粗结晶，用乙酸溶解，脱 色过滤，减压浓缩得到白色阿维菌素b1重结晶。 经过对上述工艺中的有关数据分析，其中还有很多问题需要改进和完善。主要 问题是： （1）萃取过程中乙醇的消耗量大，它占生产用的总原材料成本的60以上。 （2）大孔树脂的选择性不强，它在阿维菌素b1的纯化过程中对各个组分的分 离作用很小。 河北科技大学硕士学位论文 8 （3）丙酮作为洗脱剂，对阿维菌素各个组分的溶解度差异性不明显。因此它在 阿维菌素各组分的分离纯化工艺中起的作用不显著。 （4）结晶时加热的温度高，时间长，结晶纯化的次数多，影响阿维菌素产品质 量和收率。 据目前报道，提取方法研究的主要改进点是在发酵液过滤工序之后增加湿菌丝 体干燥处理工序，采用旋转闪蒸干燥机将含湿量为6090的湿菌丝体干燥为含湿 量为535的干菌丝，其中物料与热空气的接触温度为50100 。 据刘吉等14报道：avermectin结晶过程中难以去除的杂质实际上是发酵过程中伴 随着b1a生成的一组与b1a结构非常类似的物质。avermectin一次粗粉中杂质含量较 高的是a 1a、b2a、a2a，b1b其余的几个杂质组分的含量相对较低，经过一次重结晶 之后，a2a极易除去，b2a、a 1a的去除率也相对较高，但随着重结晶次数的增加， 晶体的纯度提高不再明显，某些杂质成分如a1a、b1b、b2a的含量在一次重结晶之 后就基本上不再降低， b1a的纯度提高很小。 利用结晶很难再将少量的这些杂质去尽， 说明普通的冷却结晶方法难以得到更高纯度的avermectin（b1a）结晶。蒸发结晶为 蒸发溶剂，使溶液由不饱和变为饱和，继续蒸发，过剩的溶质就会呈晶体析出， 但 蒸发结晶能耗大，且间歇操作。目前工业上所采取的结晶方法大多数为传统结晶方 法。溶析结晶则很少应用到。 溶析结晶是通过向结晶体系中加入结晶剂（亦称媒晶剂、沉淀剂） ，以降低溶质 在原溶剂中的溶解度，促进溶质的析出，达到溶质从溶液中分离的目的。所加入的 结晶剂可以是气体、液体或固体。结晶剂必须和主溶剂互溶，但和溶质不互溶，可 以显著降低溶质的溶解度，使之结晶析出。溶析结晶在工业结晶中起到很重要的作 用，它以其操作简便、快速、无需高温常被用来做药物的快速结晶方法。 目前溶析结晶方法广泛存在的问题是：晶体粒度小、变异系数高、产品过滤分 离难度大、杂质含量高。由于以上所存在的问题，溶析结晶在工业上还没有得到广 泛的应用。然而，由于溶析结晶有其特有的优点和应用价值，所以近年来溶析结晶 在理论和工艺应用上都有较大的发展，并且有着良好的应用与发展前景。 从发酵液中分离纯化 b1组分就可以采用补水结晶的方法 13。可以流加纯水， 也可以流加水溶性溶剂。其中水溶性溶剂包括：碳原子数为 13 的醇，丙酮， 氰化甲烷等。除此之外，也可流加酸、盐和表面活性剂等能促进晶体形成的物 质。以水溶剂代替非水溶剂来结晶，使非水溶剂的使用量减少，具有节能、环 保、安全的优点。 1.4 阿维菌素废液的现行处理方法 1.4.1 uasb 法处理阿维菌素废水 第 1 章 绪 论 9 采用uasb 生物转化器 生物接触氧化工艺处理阿维菌素废水的研究结果表 明, 通过控制进水中阿维菌素浓度和对厌氧污泥的长时间培养驯化, 阿维菌素对厌 氧消化的基质抑制影响基本消除； 当进水ph在45、 cod为890012100 mg/l和bod 为45005000 mg/l时, uasb反应器cod容积负荷达到10 kg/(m3 d),cod去除率达到 85%,系统cod和bod去除率可分别达到97.4%和98.6%,出水cod0.98 第 3 章 阿维菌素的提取工艺优化 17 第 3 章 阿维菌素的提取工艺优化 本章题针对阿维菌素破壁不够完全、浸提收率较低，且溶剂消耗量大、浸提时 间长等问题开展研究，做单因素试验，从中选择最佳优化组合，从而优化提取工艺， 以达到提高阿维菌素 b1a 组分的收率、降低以后处理工序的复杂程度、降低成本的 目的。通过对冷却结晶和补水结晶的比较，达到减少结晶时间，降低结晶过程能量 消耗，提高收率的目的。 3.1 材料与方法 3.1.1 试剂 名称 规格 生产厂家 甲醇 分析纯 天津市博迪化工有限公司 甲醇 色谱纯 天津康科德科技有限公司 纯净水 超纯水 娃哈哈有限公司 3.1.2 仪器与设备 名称 型号 生产厂家 集热式恒温加热磁力搅拌器 df- 101s 巩义市英峪予华仪器厂 水分测定仪 ma30 sartorius 精密电子天平 jj- 200 常熟双杰测试仪器厂 电热恒温鼓风干燥箱 dhg- 9076a 上海精宏实验设备有限公司 料理机 jyl- 350 九阳股份有限公司 蠕动泵 bt01- 100 保定兰格恒流泵有限公司 恒温循环器 hx- 10555 北京四环科学仪器厂 低速大容量多管离心机 lxj- b 上海安亭科学仪器厂 高速台式离心机 h- 1650 长沙湘仪离心机仪器有限公司 架盘药物天平 hctp11b10 北京医用天平厂 循环水式多用真空泵 shb- 郑州长城科工贸有限公司 电子天平 ar1140 梅特勒- 托利多仪器有限公司 高效液相色谱仪 lc- 10a 日本岛津公司 河北科技大学硕士学位论文 18 电磁炉 sh209 美的有限公司 摇瓶柜 hyg- b 上海欣蕊自动化设备有限公司 3.1.2 试验方法 3.1.2.1 hplc 法测定阿维菌素含量 hplc仪器：配备lc- 10at溶剂输送泵，spd- 10a紫外检测器的岛津高效液相色 谱仪，色谱柱为c18不锈钢柱（4.6mm 250mm，5m ）。 hplc条件：流动相为甲醇：水=90：10；流速为1ml/min；检测波长245nm；柱 温为室温；进样量为10 l。 3.1.2.2 水分测定仪法测定阿维菌素水分含量 水分测定仪设定参数：温度：100；lcd显示end字样时，过程结束，记下烘 干后重量。用下面公式计算菌丝体含水量。 含水量 湿菌丝体重量 菌丝体重量湿菌丝体重量烘干后 1 0 0 ( 3 - 1 ) 3.1.2.3 阿维菌素提取工艺研究 （1）菌丝体浸取 从工厂中取来的发酵液用电磁炉加热，之后，经离心机离心，倒掉上清液，将 菌丝体放于冰箱中保存。称取一定量离心后的菌丝体放入水分测定仪中，控制其含 水量在某一定值，放于锥形瓶中，加入甲醇浸泡，甲醇用量按照菌丝体重量的某倍 体积加入，在一定温度下充分搅拌，浸提时间作为控制变量。过滤，收集滤液。 （2）浓缩洗涤 将收集的滤液在电炉上进行常压蒸发（70左右） ，使大部分甲醇蒸出，控制浓 缩物的体积为原溶液体积的1/5，根据容器内物料体积加入1- - - 2倍体积的热水 （80- - - 90） ，保持温度搅拌洗涤30分钟，冷却分层，倒去上层洗液；再次加入热水， 保温搅拌洗涤30分钟，冷却分层，到去上层洗液；再洗涤一次，冷却分层倒去上层 洗液，待容器内油膏冷却后，倒去多余洗液，得到膏状固体物料。 （3）初次结晶 将膏状固体物料用料理机打碎后，称取一定量的膏状物，用5倍体积的甲醇加热 升温至65- - - 70溶解膏状物料， 边溶解边搅拌， 至膏体全部溶解后68保温搅拌2- - - 3 小时。之后进行初次结晶。 冷却结晶：将膏状固体物料溶解后，自然降温，至温度降到15左右，结晶结 束，过滤后用冷甲醇淋洗得到初晶。 第 3 章 阿维菌素的提取工艺优化 19 补水结晶：将膏状固体物料溶解后，用蠕动泵向其中加入一定量的水，补水速 度和补水量作为变量因素。补水完成后让其自然降温，至温度降至15左右，结晶 结束，过滤后用冷甲醇淋洗得到初晶。 3.2 结果与讨论 本次实验研究了浸提过程对阿维菌素提取收率的影响，优化提取工艺；通过对 冷却结晶、补水结晶的研究，对两种结晶方法进行了比较。 3.2.1 浸提过程对阿维菌素提取收率的影响 将发酵液用电磁炉加热到80以上，然后将加热后的发酵液经离心机离心5分 钟，转速为4000 r/min。 用水分测定仪ma30测定离心后菌丝体含水量，测定3次，取平均值。 菌丝体用量及每次含水量如下表所示。 表 3 - 1 测定离心后菌丝体含水量 tab. 3- 1 the water content of mycelium after centrifugation 1 2 3 湿菌丝体重量（g） 0.175 0.124 0.127 烘干后菌丝体重量（g） 0.05 0.034 0.037 含水量（%） 71.43 72.58 70.86 平均含水量（%） 71.62 误差（%） 0.265 1.34 1.06 由表3- 1可以看出：每次测量的含水量与平均含水量的误差小于5，所以所测定 菌丝体的平均含水量为71.62。 3.2.1.1 菌丝体含水量与浸提收率之间的关系 本实验过程中，称取 11 份不同重量的湿菌丝体，用水份测定仪控制其含水量在 1.6297之间变化 （其中本次试验所需含水量超过平均含水量的湿菌丝体是由离 心后的菌丝体加水配制而成的），得到所需含水量的菌丝体后，加 6 倍菌丝体重量 的甲醇溶液（分析纯）于浸提温度为 40的恒温加热磁力搅拌器中搅拌 2 个小时。 之后离心 5 min，转速为 4000 r/min，收集滤液，用高效液相色谱检测其含量,菌丝体 含水量及收率如表 3- 2 所示： 次 数 类 别 河北科技大学硕士学位论文 20 本实验所采用的计算收率的方法为： 收率（g/g干菌体） 平均含水量）（湿菌体重量 甲醇用量效价 1 / g mlmlg (3- 2) 以第一组数据为例：收率（g/g干菌体）= 1138 g/ml 16.2ml 9.06g(1- 71.62%) =7157（g/g干菌体） 其他组数据计算收率方法同上。 含水量与浸提收率之间的关系如3- 1图所示： 0%20%40%60%80%100% 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 收率（ g / g 干菌体） 菌丝体含水量（ % ） 图 3- 1 菌丝体含水量与浸提收率之间的关系曲线 fig. 3- 1 the curve of water content of mycelium and extraction yield 注：第8组为平均含水量71.62的菌丝体加水形成的平均含水量为77.29的菌丝体；911组为离心后的菌丝体 加水配制而成。 由图3- 1可以看出：当浸提过程中甲醇用量、浸提温度和浸提时间不变时，当菌 丝体含水量在小于80%时，浸提收率随含水量的增加而逐渐增加，当菌丝体含水量大 于80%时，浸提收率随含水量的降低而降低。其原因可能为：甲醇溶液和水能以任意 比例互溶，如果菌丝体含水量较低，可能会影响有机溶剂进入到细胞壁的类脂中， 进而会减少细胞膜的涨破而影响浸取收率；已知阿维菌素溶于甲醇，而难溶于水， 如果菌丝体中的含水量大，就会降低萃取液中甲醇的浓度，进而降低了阿维菌素在 萃取相中的溶解度，导致萃取效果低，同时萃取混合相中含水多，菌丝体中水溶性 第 3 章 阿维菌素的提取工艺优化 21 杂质（如蛋白质等）易进入萃取相中，影响其精制。因此，本次实验证明：菌丝体 含水量在80%左右时，浸提收率达到最大。 这与彭柏林的阿维菌素生产工艺的研究一 篇论文结论有些不同，该篇论文结果显示菌丝体含量为60%时提取效果最佳28，而 本篇论文结论为80%。但当菌丝体含水量在80%左右萃取时，溶剂加量增多，并且该 实验方法使萃取过程和下一道浓缩工序的工作量加大。因此，通过增加菌丝体含水 量而提高收率的办法是不可取的。 3.2.1.2 甲醇用量与浸提收率之间的关系 在上述的实验组浸提过程中，使用的是菌丝体重量的6倍甲醇加量，为了研究用 最少量的甲醇获得最大的提取收率而开展了本次研究。 在本次实验过程中，称取4份湿菌丝体，用水份测定仪控制其含水量为21.62， 分别加入47倍甲醇，于恒温加热磁力搅拌器中搅拌2个小时，浸提温度为40 。浸 提完全后，将浸提液离心5 min，转速为4000 r/min，收集滤液，用高效液相色谱检测 阿维菌丝的含量。甲醇用量及收率如图3- 2所示： 4567 0 2000 4000 6000 8000 10000 收 率（ g / g 干菌体） 甲 醇 用 量（ 倍 ） 图 3- 2 甲醇用量与浸提