（环境科学专业论文）固定化菌藻体系净化养殖废水协同作用的研究.pdf

a bs t r a c t a b s t r a c t ：i nr e c e n ty e a r s ，t h es e w a g eo fa q u a c u l t u r e ，t h ec h a r a c t e r i s t i co fw h i c hi s h i g l lc o n t e n to fo r g a n i cm a t t e r ，n i t r o g e na n dp h o s p h o r u s ，l e s si n o r g a n i cp o l l u t a n t sa n d h e a v ym e t a l si sc o n c e r n e d t h em e t h o do fs e w a g et r e a t m e n tb ys y s t e mo fb a c t e r i a - a l g a e n o to n l ys o l v e se n v i r o n m e n t a lp r o b l e m s ，r e d u c ee n e r g yc o n s u m p t i o na n di se a s yt o o p e r a t e ，b u t a l s oa c h i e v e sw a s t er e u s e b a s e do nt h i s t h e o r yt h ei m m o b i l i z e d b a c t e r i a - a l g a et e c h n o l o g yg r a d u a l l yd e v e l o p e d h o w e v e r , t h ep h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fm i c r o o r g a n i s m si m m o b i l i z e da r es t i l li n s u f f i c i e n t t h ep u r p o s eo ft h i st h e s i si st or e v e a lt h es y n e r g yi ni m m o b i l i z e db a c t e r i a - a l g a l s y s t e m ，w h i c hc o n t a i n sn i 臼o b a c t e r ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ，s e l e n a s t r u mc a p r i c o r n u t u m a n ds c e n e d e s m u sq u a d r i c a n d a e s t a b l i s h i n gt h em o d e lo fm a t e r i a lt r a n s f e ra n d t r a n s f o r m a t i o ni ni m m o b i l i z e db a c t e r i a - a l g a ls y s t e mb yc o m p a r i n gt h er e m o v a le f f e c t s o fn u t r i e n t si ns e w a g ew h i c ha r ed e a l e d 、析廿lb yi m m o b i l i z e db a c t e r i a - a l g a ea n df r e e s t a t eo fb a c t e r i a - a l g a e ，a n di t p r o v i d e s t h e o r e t i c a lb a s i sf o rp u r i f y i n gw a t e rb y b a c t e r i a - a l g a es y s t e m i ft h et e c h n o l o g yi sw i d e l yu s e di np r a c t i c e ，i ts h o u l dr e g u l a t et h e b e s tr a t i oc o m b i n a t i o n sf o rd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lf a c t o r s t h er e s u l t so f t h i ss t u d ya r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h er e s u l t ss h o wt h a tb a c t e r i a - a l g a es y s t e mr e m o v e sn i t r o g e na n dp h o s p h o r u s e f f e c t i v e l y 2 t h r o u g ht h ec o m p a r a t i v es t u d i e s ，t h eb a c t e r i a , a l g a ea n db a c t e r i a - a l g a es y s t e m u n d e ri m m o b i l i z e ds t a t ei nw a t e rp u r i f i c a t i o ns y s t e ma r eb e t t e rt h a nf r e es t a t e t h e n i t r o g e nr e m o v a lr a t e sa r e5 7 5 ，5 3 7 ，9 0 4 ，1 4 4 ，5 0 0 ，7 6 5 ；t h en i t r a t e r e m o v a lr a t e sa r e 4 9 8 ，6 1 3 ，6 2 1 ，2 7 4 ，3 4 7 ，4 3 6 ；t h ed i s s o l v e d p h o s p h o r u sr e m o v a lr a t e sa r e3 2 3 ，4 8 5 ，7 2 5 ，3 2 1 ，5 9 6 ，8 2 3 u n d e r i m m o b i l i z e ds t a t e t h i sa r t i c l ec o n c l u d e st h a tt h ep r e s e n c eo f b a c t e r i ai nt h e b a c t e r i a - a l g a es y s t e mi si m p o r t a n tt or e m o v en h 3 - na n dn 0 3 - n ，a n d t h ep r e s e n c eo f a l g a ei st h em o s ti m p o r t a n tf a c t o ro fr e m o v i n gn 0 3 - na n dd eb a c t e r i a - a l g a es y s t e m i nt h er e m o v a ln u t r i e n t sr e a c t i o nf o l l o w sf i r s to r d e rr e a c t i o n 3 i nd i f f e r e n te n v i r o n m e n tf a c t o r s ，c o m p a r i n gd i f f e r e n te x p e r i m e n t a lg r o u p ss h o w s t h a tt h ee f f i c i e n c yo fi m m o b i l i z e db a c t e r i a - a l g a ei nw a s t e w a t e ri sr e l a t i v e l ys t a b l e ，a n d t h er e m o v a lr a t e so fn u t r i e n ti nt e s tg r o u ph a sl i t t l ed i f f e r e n c e i m m o b i l i z e d b a c t e r i a - a l g a eh a st h eo p t i m a le f f e c ti nd e a l i n gw i t hs e w a g eu n d e rt h ec o n d i t i o n so f t h er a t i oo fna n dpi s1 2 5 ，t e m p e r a t u r ei s3 0 ，l i g h ti n t e n s i t yi s3 5 0 0 1 x ，叙e d b r i g h t n e s sr a t i oi s2 ：1 t h e r ea r e10f i g u r e s ，14 t a b l e s ，a n d7 5r e f e r e n c e s 关键词：t h es e w a g eo fa q u a c u l t u r e ：i m m o b i l i z e d ；b a c t e r i a - a l g a ls y s t e m ；n i t r o g e na n d p h o s p h o r u sr e m o v a l ；t h es y n e r g y e f f e c t 分类号：x 5 2 2 v 致谢 本论文的工作是在我的导师于海琴副教授以及何连生副研究员的共同指导下 完成的，于海琴老师严谨的治学态度和科学的工作方法给了我极大的帮助和影响， 何连生老师广博的学识拓宽了我的眼界，为我提供了大量试验所需的知识。在此 衷心感谢于老师和何老师对我的关心和指导。 席北斗研究员悉心指导我完成了实验室的科研工作，给我提供了很好的科研 环境和学术交流活动，并在学习上和生活上都给予了我很大的关心和帮助，在此 向席老师、何老师表示衷心的谢意。 李进等老师对于我的科研工作和论文都提出了许多的宝贵意见，在此表示衷 心的感谢。 在实验室工作及撰写论文期间，孟睿师姐给予了无私的帮助和指导，黄姗、 张靖天等同学对我论文中的水质测定，藻类培养等的研究工作给予了热情帮助， 在此向他们表达我的感激之情。 另外也感谢我的家人，他们的理解和支持使我能够在学校专心完成我的学业。 序 本论文研究内容源于8 6 3 项目“固定化菌藻一复合生态床联合修复水产养殖 环境的技术研究”，课题编号：2 0 0 6 a a l 0 2 4 1 1 ，依托单位是中国环境科学研究院。 该项目分为三部分，一部分是筛选最优菌藻种类、配比及研发相应的固定化方法； 一部分是研究菌藻协同净化水质的机理，建立物质转移模型；最后一部分是选择、 优化影响固定化菌藻净化效果的环境因子，得到最佳的操作条件，使菌藻体系效 能达到最大。本人主要完成固定化菌一藻体系净化养殖废水的协同作用和确定各环 境因子的最佳组合方案的研究。 1 引言 近年来，全球经济快速发展，人口急剧增长，有数据显示世界人口正以每天 增加2 1 万人的速度增长。为了满足越来越多的人对水产品的需求，各地水产养殖 业高度发展，并且普遍采用高密度的养殖方式。水产品产量有了很大提高，我国 水产品总产量居世界首位，但同时环境污染问题也日益突出，尤其是氮、磷等过 量排放，导致水体富营养化问题日趋严重。有关文献【i i 指出畜牧养殖已成为水环境 污染的三大源头之一。有资料表明仅有2 5 3 5 的饲料物质通过形成鱼体成分 而被利用，很大部分未被摄食或形成粪便及其它代谢废物进入水域 2 1 ，这样不仅造 成饲料的浪费，而且也可导致水体有机负荷不断增加，水体溶解氧减少，氨氮、 硝酸盐、总磷的浓度升高，使养殖水体以及周边水域水质恶化。我国是个干旱缺 水严重的国家，虽然淡水资源总量居世界前列，但人均占有量仅为世界平均水平 的四分之一、美国的五分之一，而且我国水资源分布极其不均，大量淡水资源集 中在南方，北方淡水资源只有南方淡水资源的四分之一。截止1 9 9 7 年我国7 大水 系近一半河段污染严重，城市附近的河流大多受到不同程度的污染。日趋严重的 水污染不仅降低了水体的使用功能，加剧了水资源水质型短缺的矛盾，在人口密 度较大的城市更为突出 3 1 。为了改善水环境质量，缓减水资源利用压力，我国颁布 实施的污水综合排放标准( g 8 8 9 7 9 一1 9 9 6 ) 明确规定了适用于所有排污单位的 较严格的污染物排放标准，规定了6 9 种水污染物最高允许排放浓度及部分行业最 高允许排放量。这就意味着必须严格控制养殖业废水中营养物质的含量，其中氮、 磷含量的控制更为严格。 水产养殖废水的处理方法主要有物理处理法、化学处理法、物理化学处理法、 生物处理法。由于养殖废水中含有大量的有机物质，一般认为生物处理技术经济、 高效、低耗，符合可持续发展的观点。因此，在常规生化处理技术基础上开发新 的、具有高效脱氮除磷作用的生物处理技术成了当前养殖废水处理研究的热点。 2 水产养殖废水处理技术概述 随着人们对水产品的需求不断增加，养殖技术的提高及推广，我国水产养殖 已经越来越多的采用高密度集约化养殖模式。水产养殖废水对水环境造成的影响 已引起广泛重视，养殖废水处理技术也随之发展起来。养殖废水中的污染物主要 有：剩余饵料、富含氮、磷的有机排泄物、化学品残留物及毒性物质。高浓度的 氮磷会导致水体富营养化。水产养殖废水的处理主要有物理处理法、化学处理法、 物理化学处理法、生物处理法。 2 1 物理处理技术 常规物理处理技术主要包括过滤、中和、吸附、沉淀、曝气等处理方法。其 中机械过滤、泡沫分离技术和臭氧净化处理效果较好。 ( 1 ) 机械过滤 过滤基本原理是阻隔吸附。由于养殖废水中的剩余残饵和养殖生物排泄物等 大部分以悬浮态颗粒形式存在，因此采用物理过滤去除是最快捷、经济的方法。 常用的过滤设备有固定筛、旋转筛、沙滤器等( 4 】。 ( 2 ) 泡沫分离技术 泡沫分离技术又称浮选分离技术，是利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载 体对液相中的溶质或颗粒进行分离。该技术不仅可以将溶解蛋白质等有机物去除， 而且可向养殖水体提供所需的溶解氧，对水体生态环境有良好作用【5 】o ( 3 ) 臭氧净化 臭氧的净化原理是：一方面臭氧在水中分解的中间产物羟基自由基，具有很 强的氧化性，可以分解难分解的有机物；另一方面臭氧能够破坏和分解细胞的细 胞壁( 膜) ，迅速扩散渗入细胞内，从而杀死病原菌【6 】。 2 2 电化学处理技术 用电化学法去除水中溶解的亚硝酸盐和氨氮的研究结果表明，亚硝酸盐完全 去除的时间和能耗随着传导率的增加而降低，输入电流最大为2 a 时，耗能最少， p h 相对于输入电流和电导率来说几乎没有影响；在酸性条件下有利于亚硝酸盐的 去除，碱性条件有利于氨的去除，氨的去除速度低于亚硝酸盐的去除速度【刀。 2 2 3 生物处理技术 生物处理技术是当前水产养殖废水处理技术和养殖污染控制方法的研究热 点。其最大的优点是使用不可再生材料和能源比较少，并且不会对环境造成二次 污染。 ( 1 ) 活性污泥法 活性污泥法是以活性污泥为主体的废水生物处理技术。典型的活性污泥法是 由曝气池、沉淀池、污泥回流系统和剩余污泥排除系统组成。之后发展起来的有 a b 法、间歇式活性污泥法、a 2 0 法和氧化沟等。 ( 2 ) 生物膜法 生物膜法【8 】是利用附着生长于某些固体表面的微生物( 即生物膜) 进行有机污 水处理的方法，主要有生物滤池、生物转盘、生物接触氧化设备和生物硫化床等。 生物膜法具有以下特点：对水量、水质、水温变动适应性强；处理效果好并 具良好硝化功能；污泥量小( 约为活性污泥法的3 4 ) 且易于固液分离；动力 费用省。 ( 3 ) 生物滤池 生物滤池是由碎石、焦炭或塑料蜂窝等填料构成的生物处理构筑物。污水与 填料表面上生长的微生物膜接触，使污水得到净化。其性能特点：处理效果非 常好；不产生二次污染；耐冲击负荷的能力强；运行稳定；管理简单； 能耗低等1 9 1 。 ( 4 ) 生物转盘 生物转盘是由水槽和部分浸没于污水中的旋转盘体组成的生物处理构筑物。 盘体表面上生长的微生物膜反复地接触槽中污水和空气中的氧，使污水得到净化。 ( 5 ) 生物转筒 生物转筒是一种包含氧化槽、进出水管、转轴的具有填充物的生物转筒( 鼓) 的污水处理装置。生物转筒是生物转盘的变型，是从2 0 世纪7 0 年代中期发展起 来的，在丹麦、德国发展很快。 ( 6 ) 生物流化床 生物流化床【1 川是指为提高生物膜法的处理效率，以砂( 或无烟煤、活性炭等) 作填料并作为生物膜载体，废水自下向上流过砂床使载体层呈流动状态，从而在 单位时间加大生物膜同废水的接触面积和充分供氧，并利用填料沸腾状态强化废 水生物处理过程的构筑物，应用于污水的二级处理( 有机物氧化、部分硝化) 。 ( 7 ) 自然生物处理 用自然生物处理水产养殖水体主要有湿地、稳定塘和土地处理系统等，其优 3 点是处理含氮和磷的水体，能达到比较彻底的处理效果。人工湿地净水处理技术【l l 】 开始于2 0 世纪7 0 年代，在处理水产养殖废水方面取得一定进展。鱼塘水生生态 系统本身有很强的净化能力，在水产养殖水体的处理中完全可以利用鱼塘对污染 物的净化能力来净化污水。 ( 8 ) 生物工程技术 伴随着生物技术的发展，水产养殖业越来越多地运用生物工程技术。比如利 用生物筛选技术和基因工程培育一些去污能力强的植物( 特别是藻类) 和微生物 来净化水产养殖废水。目前国内的研究主要集中在光合细菌在水产养殖水体净化 中的应用【1 2 - 1 3 1 。 ( 9 ) 生物修复技术 生物修复技术包括植物、动物、微生物及复合生态系统，利用生物的生长代 谢来吸收、降解、转化水体和底泥中的污染物，使受污染的水体能够部分或者完 全恢复到原始状态的过程。能够净化水的植物【1 4 1 有：水芹菜，水浮莲等高等植物 和石花菜、石纯等大型藻类以及一些单细胞藻。能够净化水的水生动物有：滤食 性鱼类，双壳贝类以及水蚤等小型浮游动物等。能够净化水的微生物制剂主要有： 光合细菌，芽孢杆菌，硝化细菌和硫化细菌等。 2 4 水产养殖废水处理技术遇到的问题及研究前景 随着全球水资源短缺和水环境污染的日趋严重，养殖废水的综合利用与无害 化必然是今后各国研究的方向。虽然传统的物理化学处理方法简单，但是需要花 费大量的人力，且处理费用较大，不符合可持续发展的要求。传统的微生物处理 技术大多是对自然生长的微生物群体加以选择、繁殖利用，对污染物的降解水平 较低，必须进行遗传学改造，定向选育出降解能力极高的工程菌种，才能大幅度 提高微生物的降解能力，以适应废水处理要求。为了提高生物酶活性，固定化技 术是当今十分活跃的研究方向。固定化细胞稳定性好，催化效率高，其成本低， 因而固定化细胞技术引起了国内外广泛关注，并取得了大量的成果。 2 5 固定化菌一藻技术发展简介 固定化菌一藻技术是利用菌藻的协同作用，将菌藻按照一定比例固定在特定载 体上处理污水的技术。利用藻类去除污水中的氮、磷污染物在国内外研究历史较 长，许多研究【1 5 - 1 6 】早已证实了藻类对污水中的氮、磷的去除作用和效果，并同时 对污水中的b o d 和c o d 有不同程度的降解。在藻类培养一废水净化一水产养殖 4 的联合体系中所获得的藻体可用作禽畜和鱼的饲料，有很好的应用价值【1 7 】。利用 菌藻系统处理猪场废水的同时还可以生产菌藻蛋白，通过微藻回收动物粪尿水中 的碳、氮、磷具有很高的经济效益l l 州。自然界中，及在土壤、淡水、海水和污水 处理系统中有大量的微生物，这些微生物可以直接或间接地作用于水产养殖对象 或养殖环境，分解养殖生物排泄物、残饵以及浮游植物残体等，同时微生物链在 水质净化中通过氧化、还原、光合、同化、异化把复杂的有机物转化为简单的无 机物，保证了水质的正常功能，从而维持了水生生态系统中水生生物、病原、水 质问的平衡【l 川。 将藻类对污水中氮磷营养物和有机物的摄取去除功效，与细菌强大的污染物 降解能力有效地结合起来，形成菌藻共生系统，可促进污水的净化。好氧细菌将 含碳有机物降解为二氧化碳和水；对含氮有机物进行氨化，继而进行硝化，生成 氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐；将含磷有机物最后降解为正磷酸盐。由氧化降解产生 的能量供给细菌的代谢活动。c 0 2 又是藻类的主要碳源，促进了藻类的光合作用。 在藻类新陈代谢的过程中，能将细菌代谢中产生的物质吸收转化为藻类的细胞物 质。藻类光合作用释放出的氧，增加了水中的溶解氧，促进了好氧菌的代谢活动， 使其能够维持正常的生命活动【2 0 】。目前，菌藻净化系统开始广泛用于水质改善和 水体修复。如氧化塘净化水质具有能耗小的优点。2 0 世纪8 0 年代o s w a l d 等提出 的高效藻类塘饵i g h r a t ea l g a lp o n d s 简称为h r a p ) 也是利用菌藻共生关系处理污 水的一种新工艺【2 l 】。但是游离态的菌一藻共生系统存在一系列问题，如生物量少、 藻类难以收获、水力停留时间长、占地面积大。而固定化菌藻技术，能够大大提 高细菌和藻类的浓度，可有效地解决废水的脱氮除磷和有机物去除问题，控制水 体的富营养化，同时回收有用物质实现废物资源化再利用 2 2 1 。研究【2 3 j 发现固定化 菌藻系统中，菌藻细胞浓度高，反应速度快，细胞不易被水流冲刷流失，活性较 游离态的大，并能长时间保持稳定，具有一定抗毒性，且容易与水分离。 5 3 国内外研究现状 固定化藻技术是基于菌藻共生技术和固定化微生物细胞技术发展起来的。菌 藻共生系统利用藻类和细胞两类生物之间的生理功能协同作用来净化污水。藻类 植物通过光合作用利用水中的c 0 2 和硝酸盐、亚硝酸盐、n h 4 + 、p 0 4 3 。等营养物质， 合成氨基酸和蛋白质等自身细胞物质并释放出o z ；好养细菌则利用0 2 对有机污染 物进行分解、转化，产生c 0 2 和上述营养物质，以维持藻类的生长繁殖，如此循 环往复，实现污水的生物净化作用，这种系统以氧化塘为代表。 固定化微生物细胞技术是在2 0 世纪6 0 年代发展起来的一门新兴技术，但将 该技术运用于藻类固定化却在8 0 年代末。淡水藻类的研究相对海洋微藻的研究早 一些。该技术对污染物的去除可以达到很好的效果，近年来在污水处理中有逐渐 推广的趋势 2 4 - 2 7 1 。 3 1 固定化菌藻技术的应用研究 固定化菌藻技术目前还在实验室研发阶段，研究结果表明固定化菌藻可有效 的净化富营养化水体、水产养殖废水、含酚类废水、重金属类废水等。郑耀通【l 】 利用光合细菌( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 、红酵母( r h o d o t o r u l a ) 、产朊假丝酵母 ( c a n d i d au t i l i s ) 、乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ) 和小球藻( c 忍l o r e l l a ) 组成高效 菌藻生态系统处理猪场废水，在4 8 h 内b o d 5 、n h 3 - n 的去除率分别达9 6 8 、 9 8 7 ，同时产生6 5 4 9 l 菌蛋白，处理出水还可以作为猪场场地冲洗水。王爱丽 等团】将铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ) 和细菌在相同条件下共同培养，比较 铜绿微囊藻和细菌混合固定和单独固定对氨氮和磷酸盐的净化效率，结果表明， 固定化混合菌藻体系去除率明显高于单独固定化体系，并且随着试验的进行，氨 氮和磷酸盐的去除效率逐渐增高。郑耀通等【2 9 j 利用建立的小球藻( c h l o r e l l a ) 与螺 旋藻( s p i r u l i n a ) 、光合细菌( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 、硝化细菌( n i t r o b a c t e r i a ) 的固定化菌藻混合代谢生态体系处理含氨氮的污水，表明该固定化菌藻系统对氨 氮的去除率要高于游离菌藻的氨氮去除率，且效果稳定。黄翔鹄等【3 0 1 7 1 入固定化 波吉卵囊藻( o o c y s t i sb o r g e i ) 和微绿球藻( n a n n o c h l o r i so c u l a t a ) 于凡纳对虾养 殖环境中，固定化波吉卵囊藻对氨氮的吸收能力较强，而微绿球藻对亚硝酸盐氮 的吸收能力较强。邢丽贞等【3 l 】用褐藻酸钙分别固定小球藻、细菌以及菌藻，研究 表明固定化菌藻对氮磷的去除效果优于固定化细菌和固定化藻类；菌藻固定化在 6 4 4 h 时对氨氮和磷酸盐去除分别达到1 0 0 和8 9 8 。潘辉，熊振湖等【3 2 】以p v a 为 主要包埋材料，将活性污泥和蛋白核小球藻共固定化，结果表明该共固定化菌藻 共生系统适用于处理高有机负荷、低氮磷浓度的市政污水，n h 3 - n 的最高去除率 接近1 0 0 ，p 的最高去除率可达9 3 6 。陈灿等【3 3 】指出藻类对重金属具有一定的 抗性，而且当重金属的毒性超出藻类的耐受能力而死亡时，死亡的藻体同样对重 金属具有吸附能力。w i l k i n s o n 等【3 4 j 用海藻酸钙固定小球藻去除污水中重金属汞， 固定在载体内的小球藻能富积7 0 的汞，而悬浮的小球藻仅富积4 0 。g e o f f r e y 等【3 5 】是将小球藻固定在藻朊酸盐小球中，用来富集c o 、z n 和m n 等金属。m a b a n 等【3 6 】用硅藻土固定化藻类吸收废水中重金属，发现对痕量铅有很好的吸收作用。 国内学者研究发现固定化小球藻在合适条件下对h 矿、c ，和c u 2 + 等离子有较好 的吸附效果【3 7 刁9 】。熊振湖等【4 0 】分别以聚乙烯醇( p v a ) 和海藻酸钠为载体包埋蛋 白核小球藻，对比了两种载体对城市污水的脱氮除磷效果，结果表明虽然海藻酸 钠的传质性能好于p v a ，但是在脱氮除磷和使用寿命上不如p v a 。王高学等【4 l 】以 正交法建立了由栅藻( s c e n c d e s mu so b l i q u u s ) 、小球藻( c h l o r e l l av u l g a n s ) 、亚硝化 细菌( n i t r i t eb a c t e r i a ) 、硝化细菌( n i t r a t eb a c t e r i a ) 组成的复合藻一菌净化系统用于 去除氨氮和亚硝酸态氮，利用最佳配比去除率分别为9 7 1 3 和6 8 1 8 ，远远高 于单藻组和单菌组。除了降解水中的营养盐和有机物，细菌与藻类协同作用也可影 响病毒的活性。o s w a l d l 2 2 1 分析得出高效藻类糖内藻类光合作用的方程式： 1 0 6 c 0 2 + 2 3 6 h 2 0 + 1 6 n h d t + h p 0 4 z 乙c 1 0 6 i - l s l 0 4 5 n 1 6 p + 1 1 8 0 2 + 1 7 1 h 2 0 + 1 4 w 上式表明，每合成l m o l 的藻类细胞，需消耗1 0 6t o o l 的c 0 2 ，并伴随着1 1 8m o l 0 2 的产生。由于藻类细胞的分子量为2 4 2 9 ，则其产氧量重量比为：1 1 8 x1 6 2 4 2 9 = 1 5 5 ，即在光合作用的过程中每单位重量的藻类细胞产生1 5 5 单位重量的氧气。 郑耀通等【4 2 】研究了污水稳定塘生态系统去除与灭活植物病毒的效率与机理，试验 结果显示，稳定塘系统中的悬浮固体( s s ) 可在短时间内吸附烟草花叶病毒 ( t o b a c c om o s a t i cv i r u s ，咖且达到一个饱和值，纯培养的枯草芽孢杆菌及小球 藻对t m v 的存活无明显不良影响，而光合细菌和稳定塘中的混合细菌群却对t m v 具灭活作用。 3 2 固定化菌一藻发挥效能的影响因素研究 固定化菌藻技术近年逐渐发展起来，然而，固定化对微生物生理特性影响方 面的知识还很缺乏，相关文献不多。研究主要集中在固定化对微生物生长速率、 微生物活性、生物量变化等方面的影响，严重滞后于固定化菌藻的应用研究。 藻细胞经过固定化后，其生长、形态、新陈代谢等都可能发生变化。对于固 7 定化细胞生长速率的降低，最可能的解释是由于固定化细胞的传质限制引起的。 m o n b o u q u e t t e 等【4 3 】利用扫描荧光显微镜对固定化细胞进行了观察，结果发现，对 于同一固定化细胞颗粒内部，在不同的部位，微生物的生长速率会发生变化。游 离细胞生长速率最大，固定化细胞内部有的部位甚至停止生长。另一方面，固定 化对微生物的生长有促进作用，可能由于固定化载体对微生物提供的保护作用。 例如由于固定化载体的传质限制使得重金属等有害物质进入载体内部的浓度大大 减少，从而减弱了对微生物的影响。 此外，固定化也可能影响藻的生长速率，但是不会影响整个生长量。r o b i n s o n 等j 在对比自由藻体与固定藻体生长的试验中发现，虽然生长初期固定藻体的速 度落后于自由藻体，但最后的生长量却并无差别。 固定化方法会改变藻细胞大小，b a i l l i e t 4 5 】观察到藻酸钙包埋的布朗葡萄藻群 体形状更有规则，固定藻细胞的平均直径为自由藻细胞的2 5 倍。b a i h i e z 4 6 在1 9 8 8 年的研究中，又发现固定藻的氧气释放量更多，这表明固定化改变了藻的新陈代 谢。严国安【4 7 j 认为固定化能促进藻的新陈代谢，固定的藻类的叶绿素含量、光合 耗氧量相比自由藻体增加。 大多数研究表明，固定化细胞可以提高微生物次级代谢产物，如酶、抗生素 等的比生产速率和产率。但是，也有研究表明，固定化细胞的比生产率不发生变 化，或甚至于下降。固定化细胞的传质限制可能引起比生产速率的改变。如海藻 酸钙固定丛粒藻平均直径是自由固定藻细胞生理活动的改变和c 0 2 在载体中的扩 散限制等因素造成的，认为藻细胞分布与c 0 2 的扩散限制有关。固定化提高了藻 类的合成代谢，并在一定程度上降低了藻类的分解代谢，能较长时间保持藻细胞 活性，延迟衰老。r o b i n s o n 等郴】发现固定化小球藻的平均呼吸率比自由细胞低。 严国安等【4 9 j 发现固定化栅藻的过氧化物酶活性低于悬浮藻，并认为固定化载体中 藻细胞浓度直接影响藻类呼吸代谢活性。细菌和微藻在生长过程中也能向周围释 放一些酶物质，如葡萄糖苷酶、乳糖苷酶、磷酸酶、硫酸酯酶、脂肪酶等，这些 胞外酶主要通过水解作用分解多糖、蛋白质等，使之变成可以通过细胞质膜的小 分子物质【5 0 】。b e l l t 5 1 】以动力学模型为基础，研究了菌藻系统的生物量变化和胞外 产物的分泌，其结果背离线性关系也正说明了细菌和微藻之间以胞外产物为介质 的交感作用。j a n s s o n 5 2 j 研究细菌和藻类对磷酸盐的利用，提出细菌对磷酸盐的利 用效率较高，但细菌对能量物质的需求更甚于对磷酸盐的需求，当藻类分泌的能 量物质减少时，细菌对磷酸盐的吸收也会受到限制。 o m a r 5 3 认为，固定化细胞在培养过程中，营养物和氧气会形成浓度梯度。在 固定化颗粒内部，由于营养物的耗尽，微生物会停止生长，出现惰性区间。因此 微生物趋向于生长在颗粒的边缘部分。除了固定化细胞内营养物和氧气的浓度降 8 低外，固定化微生物微环境的变化，如渗透压和水活度的改变，也可能导致微生 物生长速率降低。c h e n 等【剐在固定化载体中包埋微生物生长促进因子，以改善固 定化凝胶颗粒内部由于传质限制引起的底物可获得性差的状况，有效地改善了固 定化微生物的微环境。固定化细胞的扩散阻力也可能有益微生物生长，并通过限 制有毒抑制性底物的局部浓度来提高微生物的活性。 3 3 本论文研究目的、研究内容和技术路线 本论文研究对象是由硝化细菌、地衣芽孢杆菌、月芽藻、四尾栅藻组成的固 定化菌一藻体系，目的是揭示固定化菌一藻体系的协同作用。虽然菌藻固定化已经 开始在废水处理中广泛研究，但是菌藻之间的协同作用的研究相对滞后，对于相 关的理论研究也仅限于通过微生物的生物量、生长速率来表现，而对于菌藻之间 营养物质的转化和转移没有系统的研究。固定化菌藻协同净化水质作用是固定化 菌藻发挥最大效能的关键，也是调控固定化体系操作参数的重要依据，因此研究 固定化菌藻协同作用是很有必要的，也是很有现实意义的。 本文研究内容主要分为两大部分：第一部分：通过对比固定化菌藻与游离菌 藻对营养物质的去除研究，揭示固定化菌藻协同作用和营养物质反应动力学规律。 第二部分：研究固定化菌藻处理养殖废水过程中，环境因子对其净化作用的影响， 通过正交试验得出最佳环境因子组合值，为达到高效、稳定地净化水质的目标提 供技术支持。技术路线图如下： 9 1 0 1 不同环 境因子 对菌藻 净化效 果的影 响，得到 最佳环 境因子 组合值， 为实际 应用提 供技术 支持。 4 固定化菌藻协同作用机理试验研究 本论文研究对象是固定化菌藻体系。虽然菌藻固定化已经开始在废水处理中 广泛研究，但是菌藻之间的协同作用的研究相对滞后，对于相关的理论研究也仅 限于通过微生物的生物量、生长速率来表现，而对于菌藻之间营养物质的转化和 转移没有系统的研究。固定化菌藻协同净化水质机理是固定化菌藻发挥最大效能 的理论基础，也是调控固定化体系操作参数的重要依据，因此通过研究固定化菌 藻与游离态菌藻在净化水质过程中各种营养物质的变化，揭示固定化菌藻协同作 用机理以及传质代谢关系是很有必要的，也是很有现实意义的。 4 1 试验菌藻的选择及作用机理 试验菌种为地衣芽孢杆菌和硝化细菌，藻种为四尾栅藻和月芽藻。孟睿等【5 5 】 通过对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、光合细菌、硝化细菌、四尾栅藻、螺旋鱼 腥藻、蛋白核小球藻、月芽藻这八种微生物净化养殖废水效果的比较得出，八种 微生物均有不同程度的净化效果。其中地衣芽孢杆菌、硝化细菌、四尾栅藻和月 芽藻在净化过程中具有较好的优势。 4 1 1芽孢杆菌 芽孢杆菌，革兰氏染色阴性，是普遍存在的一类好气性细菌，多属芽孢杆菌 属。该类细菌无毒性，能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种水解酶以及一些分 解植物性饵料中非淀粉多糖的酶类1 5 6 1 和抗生素。近年来被作为益生菌广泛应用予 水产养殖业中。其作用机理是可降解水体中的有机碎屑，减少水体中的氨氮、亚 硝酸盐、硫化氢等有毒有害物质，从而起到改善水质的作用。芽孢杆菌还能利用 其分泌的多种酶类及抗生素，抑制其它细菌的生长，减少甚至消灭病原体的影响， 改善水质。曹煜成等【5 7 】指出定期施用芽孢杆菌，养殖废水的透明度及水色有了很 大改观，微藻生物量大幅增长，改善了养殖水体，提高了养殖鱼类的成活率。 4 1 2硝化细菌 硝化细菌属化能自养菌，专性好氧，大多是专性无机型，在氮循环水质净化 过程中扮演着重要的角色。它们包括形态互异类型的一种杆菌、球菌以及螺旋型 细菌。硝化细菌可分为2 个亚群：亚硝化细菌( n i t r o s o m o n a s ) 和硝化细菌 ( n i t r o b a c t e r ) 。亚硝化细菌是在水中生态系统中将氨消除( 经氧化作用) 并生成 亚硝酸的细菌类，一般被称为“氨的氧化者 ，可以将水体中的氨氮转化为亚硝酸 氮。硝化细菌是可将亚硝酸分子氧化转化为硝酸分子的细菌类，一般被称为“亚 硝酸的氧化者”，将亚硝酸盐氧化为对水生动物无害的硝酸氮。因这些硝化细菌能 将水中的有毒的化学物质( 氨和亚硝酸) 加以分解去除，故有净化水质的功能。 不过需要注意，硝化细菌在p h 中性、弱碱性的水质环境下发挥效果最佳，在酸性 水质中发挥效果最差。 4 1 3微藻 微藻是一类分布广，环境适应性强，光合速率高，繁殖快的自养微生物。一般 情况下，藻类在污水处理中的作用主要有两方面，( 1 ) 起供氧者的作用。藻类通 过光合作用向水体供给氧气，使好氧微生物能够不断地分解有机物质；( 2 ) 去除 氮、磷等无机成分。藻类是自养型生物，在光合作用过程中，它们以光能为能源， 利用简单的无机物合成有机物，不断生长繁殖。因此。通过藻类的吸收利用，可 大大降低污水中氮、磷等物质的含量。特别是在养殖废水中，藻类除了可以净化 水质以外，还可以为鱼类提供天然饵料，真正实现能量的回收利用。本试验采用 的微藻是四尾栅藻和月芽藻两种常见的绿藻。 四尾栅藻( s c e n e d e s m u sq u a d r i c a n d a ( t u r p ) b r e b ) ，定形群体扁平，常见的为 4 8 个细胞的群体，群体细胞排列成一直线。分布极广，夏秋能大量繁殖。杨苏文 等【5 3 j 发现铜绿微囊藻、四尾栅藻和小环藻的竞争试验中，最大生长量k 分别为 8 9 8 3 3 、1 3 2 6 3 0 、1 1 4 0 0 ，最大比生长速度r 分别为0 5 9 3 、0 4 4 5 、0 2 1 2 。由此可 见四尾栅藻在生长量和生长速率方面要占优势，并且适应性较好。 月芽藻( s e l e n a s t r u mc a p r i c o r n u t u m ) , 属于绿藻门绿球藻目，近头状伪蹄形， 生长快速，便于培养。吴重华等【5 9 ，6 0 多次选用羊角月芽藻做实验藻种研究湖水中 藻类生长量与磷形态之间的关系和摄取磷形态动力学。 4 2 试验方法及仪器 4 2 1试验方法 试验采用模拟研究方法。采用血细胞计数板计数法测定藻类的生物量；采用 1 2 平板菌落计数法测定细菌的生物量；用扫描电镜分析不同环境条件下凝胶载体剖 面结构及内部菌藻的分布；n i - 1 3 - n 、n 0 3 - h i 、d p 等指标的测定方法按照水和废 水监测分析方法【6 。 5 2 1 1 血细胞计数板计数法 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数 板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短 横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方 格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方 格分成2 5 个中方格，而每个中方格又分成1 6 个小方格；另一种是一个大方格分 成1 6 个中方格，而每个中方格又分成2 5 个小方格，但无论是哪一种规格的计数 板，每一个大方格中的小方格都是4 0 0 个。每一个大方格边长为l m m ，则每一个 大方格的面积为1 删n 2 ，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0 1 m m ，所 以计数室的容积为0 1 删一( 万分之一毫升) 。计数时，通常数五个中方格的总数， 然后求得每个中方格的平均值，再乘上2 5 或1 6 ，就得出一个大方格中的总数，然 后再换算成l m l 待测液中的总数。设五个中方格中的总数为a ，待测液稀释倍数 为b ，如果是2 5 个中方格的计数板，则l m l 茵液中的总数 = a 5 x 2 5 x 1 0 4 x b = 5 0 0 0 0 a b ( 个) 。同理，如果是1 6 个中方格的计数板，l m l 菌 液中的总菌数= a 5 x 1 6 x 1 0 4 x b = 3 2 0 0 0 a b ( 个) 。本论文采用的计数室为第一种规 格。 ( 1 ) 器材 待测液，仪器或其他用具血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 ( 2 ) 操作步骤 a 待测悬液的制备：以无菌生理盐水将待测液制成浓度适当的悬液。 b 镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需 清洗，吹干后才能进行计数。 c 加样品：将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将 摇匀的悬液由盖玻片边缘滴- d , 滴，让悬液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数 室，一般计数室均能充满悬液。取样时先要摇匀悬液，加样时计数室不可有气泡 产生。 d 显微镜计数：加样后静止5 m i a ，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台 上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光 线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视 野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。在计数前若发现悬液太 浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。般样品稀释度要求每小格内约有5 1 0 个微生物为宜。每个计数室选5 个中格( 可选4 个角和中央的一个中格) 中的微 生物进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。计数一个样品要 从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。 e 清洗血细胞计数板：使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净， 切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有 残留或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 5 2 1 2 平板菌落计数法 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单 个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖 而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落 数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。为了清楚地阐述 平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位( c o l o n y f o r m i n gu n i t s ，c f u ) 而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 ( 1 ) 器材 a 菌种悬液。 b 细菌培养基。 c 仪器或其他用具lm l 无菌吸管，无菌平皿，盛有4 5 m l 无菌水的试管， 试管架，恒温培养箱等。 ( 2 ) 操作步骤 a 编号 取无菌平皿9