（细胞生物学专业论文）水杨酸对蚕豆重金属镉毒害的影响.pdf

四川师范大学硕士学位论文 水杨酸对蚕豆重金属镉毒害的影响 细胞生物学专业 研究生胡晓琼指导老师韩善华教授 本文以蚕豆( v f a b a l l i n n ) 为实验材料，采用毒理学实验方法，着重研 究了不同浓度水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞有丝分 裂、染色体畸变、微核和早期生长发育的影响。研究结果表明：镉污染对蚕 豆根尖细胞的有丝分裂、染色体畸变、微核和早期生长发育等具有明显的毒 害作用。随着c d 2 + 浓度的不断增加，对蚕豆根生长发育的抑制程度不断加深， 根尖细胞的有丝分裂指数不断下降，微核率不断上升，其中以最高浓度为 0 5 0 m m o l l 的c d 2 + 对蚕豆根生长的毒害作用最为显著。一般情况下，植物内 源保护系统的防御功能在受到一定程度的重金属胁迫时可被诱导加强，但随 着c d 2 + 毒害程度的逐步加重，植物体的这种自我防卫能力亦趋减弱。而水杨 酸能在一定程度上缓解c d 2 + 的毒害作用，对植物的生长有一定的促进作用。 当水杨酸浓度1 0 0 m m o l l 时，随着其浓度的增加能不断提高c d 2 + 胁迫下蚕 豆根尖细胞的有丝分裂指数，降低其微核率，促进蚕豆根的生长发育，s a 浓 度为1 0 0 m m o l l 时为最佳。当水杨酸浓度超过1 0 0m m o l l 对，随着其浓度 进一步的不断增加，却出现了有丝分裂下降，抑制蚕豆根生长的现象。这说 明水杨酸对重金属毒害的缓解效应是有一定浓度限度的，低浓度能很好的缓 解其毒害作用，促进植物生长，而高浓度时，这种拮抗作用减弱，甚至反而 会抑制生长。 关键词：蚕豆；水杨酸；镉毒害；染色体；微核；拮抗作用 承杨酸对蚕豆重金属铺毒害的影响 e f f e c t so f s a l i c y l i ca c i dt ot h ed a m a g eo fv i c i a f a b a l i n n u n d e rt h es t r e s so fh e a v ym e t a l sc d 2 + m a j o r c e l lb i o l o g y m a s t e ro fs c i e n c ec a n d i d a t e ：h ux i a o - q i o n g s u p e r v i s o r ：h a ns h a n - h u a 1 kr e l i e fe f f e c t so ft h es a l i c 如ca c i o ( s a ) t ot h ed a m a g eo fh c a f a b a “m p r o d u c e db yh e a v ym e t a l gc d 2 + w e i em e a s u r e db ym i e r o n u c l e u sm e t h o d s ，t h e r e s u l t ss h o w e do b v i o u sd a m a g et ot h eg r o w t ho fv f a b al b yt h eh e a v ym e t a li o n o fc a d m i r i t l t h em i t o t i ci n d e xd e c l i n e d , c h r o m o s o m a la b e r r a t i o n s ( ) a n d f e q u c yo fm i c r o n u c l c u sa s c e n d e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fc d ”i n c r e a s e di n r o o tt i pc e i l so fe f a b al r e s i s t a n c ea b i l i t yf r o me n d o g e n o u sp r o t e c t i v ee n z y m o s y s t e m sa n da n t i o x i d a n ts u b s t a n c ec o n t e n ti nt h ep l a n t sw e r ee n h a n c e db yt h e i n d u c e m e n to fh e a v ym e t a ls t r e s si nar e s t r i c t e dr a n g e ，w h i l ed e f e n c er e a c t i o n c r i p p l e da st h ea g g r a v a t i o no ft h ei n j u r y s a l i c y l i ca c i dc o u l dr e l i e v et h i sd a m a g e a n da d v a n c eg r o w t h t h ee f f e c t so fb e a t m e n tb ya f f i l i a t es a l i c y l i ca c i dt om i t o s i s , f r e q u e n c yo f m i c r o n u c l c u s ，钢u 吼c yo f c h r o m o s o m ea b e r r a n c ea n dg r o w t ho f 矿 丘施l r o o tt i pc e l l sw o r ee v a l u a t e d mr e s u l t ss h o w e dt h a tl o w e rc o n c e n t r a t i o n o fs a l i c y h ca c i dc o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho fh f a b al r o o t , w h i c hd a m a g e db y c d 2 + , t h em i t o t i ci n d e xa s c e n d e d , c h r o m o s o m a la b e r r a t i o m ( ) a n d 白c q u e n c yo f m i c r o n u c l c u sd e c l i n e dn o 组b l e l y , w h e nt h es a l i c y l i ca c i dc o n c e n 廿a t i o nw a s1 0 0 m m o l l , t h er e l i e fe f f e c t sw a sb e s t , b u tw h e nt h es a l i c y l i ca c i dc o n c c n 舡a d o nw a s h i g h c rt h a n1 。0 0m m o l l t h er e l i e fe f f e c tw e a k e n e d , a n ds a e v 锄i n h i b i t st h e 四川师范大学硕士学位论文 g r o w t ho fv f a b al r o o t i ts h o w e dt h a tt h et h er e l i e f e f f e c t so f t h es a l i c y l i ca c i d t ot h ed a m a g eo f 矿a b al p r o d u c e db yh e a v ym e t a l sc d ”i sr e s t r i c t e db yt h e c o n c e n t r a t i o no fs a l i c y l i ca c i d ：l o w e rc o n c e n t r a t i o nc a np r o m o t et h eg r o w t hw h i l e h i g hc o n c e n t r a t i o nc a r l v o l ll e a d st oa p o p t o s i s k e yw o r d s ：h c i a b al i n n 4s a l i c y l i ca c i d ；c a d m i u md a m a g e ；c h r o m o s o m e ； a n t a g o n i s t i ca c t i o n 。 1 1 1 四川师范大学硕士学位论文 表格目录 表ic d 2 + 胁迫对蚕豆根长的影响 表2c d 2 + 胁迫对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响1 3 表3c d 2 + 胁迫对蚕豆根尖细胞微核率的影响1 4 表4s a 对c d 2 + 胁追下蚕豆幼苗根长的影响 表5s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响2 0 表6s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞有丝分裂指数下降速率的影响2 1 表7s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞染色体畸变率的影响2 2 表82 4 hs a 对c d 2 + 胁迫蚕豆根尖细胞主要染色体畸变率的影响2 4 表94 8 hs a 对c d 2 + 胁迫蚕豆根尖细胞主要染色体畸变率的影响2 5 表1 07 2 hs a 对c d 2 + 胁迫蚕豆根尖细胞主要染色体畸变率的影响2 6 表1 19 6 hs a 对g 矿胁迫蚕豆根尖细胞主要染色体畸变率的影响2 7 表1 22 4 hs a 对o 酽+ 胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体断片的影响2 8 表1 34 8 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体断片的影响2 9 表1 47 2 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体断片的影响3 0 表1 59 6 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体断片的影响3 l 表1 62 4 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞落后染色体的影响3 2 表1 74 8 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞落后染色体的影响3 3 表1 87 2 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞落后染色体的影响3 4 表1 99 6 hs a 对c d z + 胁迫下对蚕豆根尖细胞落后染色体的影响3 4 表2 02 4 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体桥的影响。3 6 表2 14 8 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体桥的影响3 6 表2 27 2 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体桥的影响3 7 表2 39 6 hs a 对c d 2 + 胁迫下对蚕豆根尖细胞染色体桥的影响“3 8 表2 4s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞微核率的影响3 8 表2 5s a 对c 击+ 胁迫下蚕豆根尖细胞微核平均直径的影响4 0 表2 62 4 hs a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞微核直径分布范围的影响4 1 表2 74 8 hs a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞微核直径分布范围的影响4 2 表2 87 2 hs a 对c d 2 + 剧f j , 追下蚕豆根尖细胞微核直径分布范围的影响4 3 水扬酸对蚕豆重金属锅毒害的影响 表2 99 6 hs a 对c d 2 + 胁追下蚕豆根尖细胞微核直径分布范围的影响。4 3 表3 02 4 hs a 对酣胁迫下蚕豆根尖细胞各时期微核数量的影响。4 4 表3 14 8 hs a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞各时期微核数量的影响。4 5 表3 27 2 hs a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞各时期微核数量的影响。4 6 表3 39 6 hs a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞各时期微核数量的影响4 7 图片目录 图1s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆幼茁根鲜重的影响 1 7 图2s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆幼苗根干重的影响1 8 图3s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆幼苗根灰重的影响1 8 图4s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆幼苗根有机成分的影响1 9 图版。 v m l 匹l l l l 师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师整羞坐熬援指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而 引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥 有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印 刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索；2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位 论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。 论文作者签名： 们峨施、 2 0 0 7 年4 月2 0 日 四川师范大学硕士学位论文 i 前言 无人为因素影响下，水体中重金属的含量主要取决于水与土壤、岩石的相 互作用，其值一般很低，不会对人体健康造成危害。随着科技的发展，特别 是工农业的迅猛发展，“三废”和各种化学物质通过各种途径不断进入环境中， 全球土地重金属污染越来越严重。因而，目前重金属污染治理已经成为国际 科学界研究的热点问题【l 】。这种污染造成的生态破坏和环境质量的恶化往往 通过食物链给人类健康带来巨大的危害【2 “。因此，在诸多环境胁迫中，重金 属污染备受关注 植物是食物链中的初级生产者，重金属极易被其从污染介质中吸收，成为 植物体内代谢较强的胁迫因子。吸收到植物体内的重金属不仅能诱导其体内 产生某些对酶和代谢具有毒害作用和不利影响的物质，如某些重金属胁迫下 植物体内产生的过氧化氢、乙烯等物质对体内代谢和酶活性具有负效应而间 接引起植物伤害1 5 】，而且会影响细胞的核酸代谢，造成染色体畸变，还能诱 发乳过氧化物酶( l p o ) 产生大量脂质自由基和活性氧自由基，造成d n a 损 伤，使d n a 单链断裂，对植物体带来直接损伤，甚至导致植物体死亡。 1 1 重金属镉( c d ) 污染对植物毒害作用的研究进展 镉在环境中不能生物降解，在体内极易蓄积，生物半衰期长( 在动物机 体内半衰期长达1 0 - - 3 5 年) ，排泄缓慢，有致癌、致畸、致突变等毒性作用。 各种畜禽均能发生重金属中毒，而且镉通过对动植物食品的污染，给人类健 康带来很大的威胁。随着工业的发展，镉对环境的污染已成为危害生态环境 和人畜健康最严重的公害之一。 植物受镉毒害后能影响到植物体生长发育的整个过程；抑制种子萌发 6 , 7 1 ， 抑制根系发育，使个体生长缓慢，植株矮小，退绿，产量下降，植物萎蔫甚 至停止生长等外部症状珥棚。在生理代谢方面表现出叶绿素含量下降，光合作 用呼吸代谢减弱u o - 1 3 i ，可溶性蛋白含量减少，与膜脂过氧化相关的生理指标 水杨酸对蚕豆重金属镉毒害的影响 如m d a 量、r o s 产生速率、膜透性及h 2 0 2 的积累等随重金属浓度的加大而 不断增加，从而破坏膜的完整性，损害膜的功能1 9 恪惜l 。与此同时，重金属胁 迫下植物保护酶系统活性会受到抑制。在遗传毒理学方面则能导致细胞有丝 分裂指数下降，生长减慢 1 7 l ，使染色体产生染色体断片、染色体桥、落后染 色体、染色体环和多极分裂等多种染色体畸变类型，造成遗传物质的改变， 引起变异。染色体断裂是一种不可逆的重度毒害作用，能诱导细胞凋亡l 博，1 9 l 。 同时，镉是较强的脂质过氧化诱导剂，它能诱发1 2 0 产生大量脂质自由 基和活性氧自由基，活性氧族可以攻击多不饱和脂肪酸，启动脂质过氧化反 应，形成脂质自由基l 、烷氧型自由基l o - 、过氧自由基l o o 圾其它终产物。 氧自由基和脂质过氧化反应产生的自由基可造成d n a 损伤，使d n a 单链、 双链断裂f 2 0 1 ，引起染色体畸变，损害d n a 修复系统，导致细胞凋亡 2 1 】。d n a 链的断裂可在荧光显微镜下观察到拖尾现象，犹如彗星，彗星尾长与镉剂量 之间存在剂量依赖关系，因此常用彗星尾长变化来显示d n a 损伤程度( 2 2 刀l 。 除此之外，还能形成碱基修饰物8 羟基脱氧鸟苷( 8 o h d g ) ，而8 - o h d g 被认 为是在致癌作用中细胞氧化应激的标志物。8 - o h d g 的含量与d n a 单链断裂 均与镉浓度呈正相关【“。s i l a n o 等【2 5 】研究了镉对大鼠睾丸8 - o h d g 的影响。 镉能显著提高睾丸8 - o h d g 的水平，而且修复8 - o h d g 的活性也被抑制。丁 胱亚磺酰胺( l - b u t h i o n i n e 一 s , r s u l f o x i m i n e ，b s 0 ) 能抑制谷胱甘肽的合成， 也能抑制修复8 - o h d g 的活性，提示细胞谷胱甘肽可能是修复8 o h d g 所必 需的物质。镉能降低细胞内谷胱甘肽的水平，表明镉通过降低g s h 的水平， 使细胞对8 - o h d g 的修复能力下降。 1 2 重金属镉毒害作用机制的研究进展 镉对d n a 的毒害机制主要包括：直接攻击核酸分子；促进自由基链式反 应；抑制d n a 损伤的修复；干扰细胞分裂f 2 6 】。 镉对d n a 损伤的机制目前认为是与d n a 直接作用或通过各种间接途径 损伤遗传物质。镉的毒性机制可能是镉与d n a 直接作用而不是与核苷酸切除 修复蛋白或x p a 相连所致2 孔。镉直接与d n a 分子中的磷酸、碱基等 2 四川师范大学硕士学位论文 作用引起d n a 受损，形成修饰碱基8 - - 羟基鸟嘌呤，胞嘧啶二醇等。鸟嘌呤 最易被氧化损伤生成8 一羟基鸟嘌呤、8 一氧化鸟嘌呤。由于镉既直接损伤 d n a 。又损害了d n a 修复系统f 2 ，所以d n a 损伤更为严重。哺乳类细胞有 3 种重要d n a 修复系统：核苷酸切除修复系统、错配修复系统和d n a 烷基 转移酶系统。在人外周血淋巴细胞的d n a 损伤就是由于镉抑制了与修复酶中 有关的r a r p 酶活性f 2 9 l 。有研究指出，镉可抑制d n a 修复中的两个锌指蛋白 酶x p a 、f p g ，加人与镉同等浓度的锌，f p g 活性恢复6 0 ，说明锌与镉竞 争与f p g 作用，导致f p g 酶活性恢复1 3 0 l 。进一步研究指出，在x p a - n b d ( x p a 最小d n a 结合区) 结构中，由于镉离子与硫配体相连比锌离子有更高亲和性， 镉替代x p a 中的锌导致x p a 结构改变，阻止受损的d n a 与其他核苷酸切除 修复酶0 娓r ) 蛋白相连，使d n a 修复受阻。但通过磁共振光谱观察这2 种 x p a ( 锌组成的及镉替代的) 蛋白未显示结构上不同，表明镉诱导d n a 损伤并 不是由于干扰x p a 的锌结合中心结构改变而导致的阿。镉毒性的可能机制是 镉与x p a 上的带阴离子表面残基相连，从而干扰d n a 与x p a 的连接。d n a 的复制也可被抑制。锌对d n a 保护作用，可能与锌是酶蛋白的必须金属有关 t 3 1 1 。 细胞的有氧代谢过程以及暴露于环境诱变剂可产生活性氧，活性氧在体 内可被自由基清除剂，如维生素e 、维生素c 、超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧 化氢酶( c a t ) 等清除。但生物的抗氧化能力有一定限度，在一些情况下d n a 仍会受到活性氧攻击引起d n a 损伤。镉引起的活性氧自由基参与了镉导致 d n a 单链断裂的作用，造成d n a 损伤f 弦叼。 除了以上几种机制，镉还可能干扰细胞有丝分裂，通过对钙调素的刺激作 用而对微管产生解聚作用，影响与细胞分裂有关的细胞器从而产生遗传毒性 1 3 4 1 。 水杨酸对蚕豆重金属镉毒害的影响 1 3 水杨酸( s a ) 对抗逆性的作用机理 1 3 1 s a 在植物体内的代谢 水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) 是植物体内普遍存在的一种酚类化合物，化学 名称为邻羟基苯甲酸。纯品为粉状结晶，熔点1 5 7 - 1 5 9 ，易溶于极性有机 溶剂，低毒，其饱和水溶液的p h 为2 4 f 3 鲥。在3 0 1 r i m 波长光激发下，可发出 4 1 2 r i m 的荧光，利用这个性质可用荧光分光光度计检测植物组织中的s a 含 量。2 0 世纪6 0 年代。人们逐渐发现了s a 在植物上的某些生理作用，外施 s a 能影响植物体的气孔开闭、种子萌发、果实产量、离子吸收和抑制乙烯的 生物合成等，因而s a 及其盐类被认为是一类新的植物激素”j 。2 0 世纪9 0 年代以后s a 被作为一种植物对胁迫反应所需的信号分子来研究，认为它能 增强植物在臭氧、低温、热胁迫、干旱、盐害和除草剂等非生物胁迫条件下 对活性氧的清除能力，降低氧化损伤【3 刖。 s a 在植物体内有两种存在形式，即自由态和结合态【3 9 j ：自由态的s a 有 生理活性，能在韧皮都中运输，可以通过维管组织向外运输。烟草受烟草花 叶病毒( t m v ) 侵染后，s a 的水平显著增高，产生的s a 很快与葡萄糖形成 s a - b 葡萄糖苷( s a g ) 。s a g 不表现生理活性，作为s a 的一种储藏形式调节 体内s a 的水平，故s a g 同样具有重要的生理意义m 】在植物中s a 是苯丙 氨酸代谢途径的产物。苯丙氨酸代谢途径的第一个关键酶是苯丙氨酸氨解酶 ( p h e n y l a l a n i n ea m o n i al y a s e ，p a l ) ，在p a l 的催化下苯丙氨酸生成肉桂酸。肉 桂酸经羟基化和氧化作用生成s a ，也可能由肉桂酸先氧化成苯甲酸，再羟基 化成s a l 4 l l 。在植物的发育过程中以激活p a l 为起点，通过s a 的信号传导途 径使植物维持足够的来自叶绿体光合作用和线粒体氧化磷酸化所产生的h 2 0 2 的水平，对于提高植物自身的防御系统能力是十分重要的1 4 御。 1 3 2s a 与氧化还原酶系统 植物细胞内普遍存在氧化还原酶系统，包括超s o d 、过氧化物酶( p o d ) 、 c a t 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 和谷胱苷肽还原酶( g r ) 等。s o d 将 4 四川师范大学硕士学位论文 0 2 歧化为h 2 0 2 ，而c a t 和p o d 等则负责清除h 2 0 2 以减轻其对细胞的伤害。 植物细胞对矿物质的吸收、运输等都与氧化还原酶系统有关【4 3 ) 。而水杨酸对 酶系统具有保护调节和促进催化、并能清除植物体内氧自由基起到保护植物 体的作用。研究发现，烟草中的一种s a 结合蛋白( s a - b i n d i n g p r o t e i n ，s a b p ) 与过氧化氢酶基因高度同源，且也有直接清除h 2 0 2 自由基，提高植物体抗氧 化性的能力，而当这种s a 结合蛋白与s a 结合后就失去了这种能力，使植物 体中h 2 0 2 增加，有利于0 2 的积累1 4 2 1 。s a 能提高小麦根中s o d 和p o d 酶 活性洲。m i s h r a 等证明外旌s a 可减轻膜脂过氧化，有助于缓解重金属毒害， 增强植物的抗性反应【4 5 】。在大麦胚胎中，过氧化氢酶活性随着外源水杨酸浓 度的增加呈下降趋势，当水杨酸浓度大于3 蛐l l 时，其降低趋势特别显 著，而且过氧化氢酶基因的n 心d q a 量的降低与该酶活性的下降趋势是一致的 l 铂】。 综上所述，水杨酸可能的作用方式是：植物体在逆境条件下，体内s a 水 平提高，与s a b p 结合，抑制过氧化氢酶的活性，导致体内h 2 0 2 的水平增高及 自由基产生，高水平的s a 作用于s a 防卫信号传导链的上游和( 或) 下游，也可 能在诱导交替氧化酶基因表达的过程中起一定的作用，从而产生一种在呼吸作 用或产热过程中起主要作用的酶1 4 7 “8 】。s a 也可能通过抑制顺乌头酸酶的活性 来诱导交替氧化酶基因，从而使顺乌头酸酶作用的底物( 即柠檬酸，同时也是 交替氧化酶的有效诱导剂) 积累【晡l 。这样，s a 通过与多个细胞因子的相互作用 对植株产生广泛的影响。 1 3 3s a 与信号转导 s a 作为一种酚类化合物，是植物体内重要的信号分子嗍，参与系列的 生理过程，包括生热作用【知1 ，对病原体侵袭的抵御【4 1 l ，乙烯的合成和果实 成熟1 5 矾，研究证实s a 在植物对一些非生物胁迫( 如u v 辐射和臭氧) 的应 答中也具有重要作用f 5 3 。5 5 j 。 已知s a 诱导植物细胞r o s ( 活性氧) 浓度升高有2 种途径：一是s a 通 过提高s o d 的活性，加速0 2 一歧化为h 2 0 2 ，因而提高了h 2 0 2 浓度l 剐；二 水杨酸对蚕豆重金属镉毒害的影响 是s a 可以与c a t 特异结合，抑制其活性，因此有助于r o s 积累( 5 w 这些研 究结果说明h 2 0 2 是s a 下游信号物质。同时，外施s a 可以增加诱导病程相 关蛋i 刍( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n , v r ) 表达，并建立s a r 系统获得性抗性) t s s 。可以推测，在调节植物抗病反应中，s a 和h 2 0 2 相互作用可能形成了一 令信号自我放大反馈环( s e l f - a m p l i f y i n gf e e d b a c kl o o p ) ，放大氧化信号，诱导一 系列防御反应，建立s a p t 5 9 l 。可见，s a 和r o s 浓度升高、s a r 形成是抗病 信号转导中非常关键的调节过程 一 随着人们对丙二烯氧化酶( a o s ) 研究的深入，普遍认为植物具有一种先 天的免疫系统一氧化猝发，即植物细胞在胁迫条件下能迅速产生a o s ，进而 启动体内其他信号级联过程，引起抗性反应i 唧。在对葡萄抗热性的研究中发 现，s a 处理葡萄幼苗后能显著提高葡萄的抗热能力，诱导了和高温锻炼相似 的抗氧化系统的变化，即s a 处理后，h 2 0 2 骤然升高，h 2 0 2 启动了抗坏血酸一 谷胱甘肽循环系统，在这个系统中，a p x 能够清除1 - 1 2 0 2 ，g r 能利用n a d p h 把氧化型谷胱甘肽( g s s g ) 还原成还原型谷胱甘肽( g s h ) ，g s h 能选择性地 激发防御基因的表达，是防御基因的诱导者，抗氧化酶s o d 、p o d ，a p x 、g r 活性升高，c a t 活性下降。从中可以看出，高温锻炼提高植物抗热性的过程中 有s a 的参与s a 和高温锻炼有共同诱导葡萄抗热性机制【6 2 1 1 。因此认为，提高体 内抗氧化酶类活性及增强抗氧化代谢水平是缓解重金属毒害的途径之一。 1 3 4s a 与d n a s a 是一种新型植物生长调节物质，能够激活一系列植物抗病防卫反应， 作为植物生长调节物质一般都表现出低促高抑效应。低浓度s a 对烟草细胞 的生长具有促进作用，高浓度s a ( i m m 0 1 ) 则会使烟草细胞死亡 6 2 】，这可能 与高浓度s a 是氧化剂可诱导氧化胁迫，导致细胞中活性氧积累，从而引起 膜脂过氧化有关。然而，不同植物及同一植物的不同时期对s a 的敏感性不 同，而且即使是同一浓度采用不同处理方式也会产生不同的效果， 0 0 0 5 m m o l s a 可明显缓解铝对决明子根系的抑制作用，而0 0 2 m m o ls a 则抑 制其根系的生长l 矧，这可能与不同植物体内受体蛋白水平不同及各异的信号 6 四川师范大学硕士学位论文 转导途径有关。k a t h a r i n e 等1 6 z j 指出，s a 浓度小于l m m o l 时会促进烟草细胞 呼吸链上的电子传递，而当s a 在1 - 5 r e t o o l 的较高浓度时，则会抑制呼吸作 用，阻止电子从脱氢霉到u q 的传递。这种现象在大豆等其他植物中也有发 现 6 4 1 。 “ 此外，s a 还会影响很多胁迫反应和病原体有关的基因的表达【6 5 】。u v 辐 射使d n a 形成二聚体从而抑制d n a 复制和转录。植物受到u v 胁迫时内源 s a 和s a g 水平升高l 鲫。u v 处理的烟草积累s a ，对t m v 的抗性增强【6 刀。 用u v - c 处理烟草的叶片，s a 水平比对照增加了9 倍，而且同株其他非处理 叶片的s a 含量也增加了近4 倍，s a g 含量及催化s a 合成的酶一苯甲酸2 - 羟化酶活性也升高。同时，u v - c 处理的烟草叶片有p r - l a 和p r - l b 积累，增 强其对后续t m v 侵染的抗性，表明u v - c 和t m v 激活了一条共同的信号转 导途径，导致s a 和p r 蛋白积累及抗病性的增强嘟l 。s a 可以诱导聊k g r i t 3 5 、 s a g t 等基因的表达，赤霉素a 也会诱导它们的表达，但是赤霉素a 不能诱导 s a g t 的表达，表明s a 诱导基因表达除了与赤霉素a 具有相同的途径外可能 还有另外的途径，例如s a 诱导r n a 依赖聚合酶1 6 7 。可见，在植物体中s a 诱导基因的表达是通过多种途径的。g i l l i l a n d 等嗍研究发现，s a 与赤霉素都 能提高植物细胞r o s 的产生，从而影响许多基因的表达。s a 能通过抑制线 粒体呼吸链上的电子传递来提高r o s 的产生 6 9 7 “。s a 也可能通过其他途径 来刺激植物细胞产生r o s 。除此之外，s a 还能改变细胞a t p 水平和嘧啶核 营的氧化还原平衡，这些也是s a 影响基因表达的因素。而基因是d n a 分子 上具有遗传效应的特定核苷酸序列，是具有遗传效应的d n a 分子片段。综上 所述，s a 有可能通过对基因表达的影响从而表现出对d n a 损伤的修复作用。 水杨酸与d n a 的关系较复杂，虽然目前的研究已经取得了一定的进展，但 是其具体机理至今仍不清楚，还需进一步的试验证明。 1 4 本研究的主要研究内容和意义 随着人类活动的不断上升，重金属污染问题已经成为人们关注的焦点。寻 求一种适宜提高植物抗性，治理重金属污染的方法已经刻不容缓。前人的大 7 水杨酸对蚕豆重金属镉毒害的影响 量研究吲表明，水杨酸可以增强植物对高温、干旱、低温、盐渍以及病虫害 等不良环境条件的抵抗能力。而将水杨酸作为调节因子应用于污染植物毒理 学方面的研究尚不多见。加之，水杨酸本身就是一种无毒、廉价的植物激素 类物质，故将其作为一种微肥施用于被污染的土壤中，有一定的应用前景。 本研究选择四川简阳良种厂生产的蚕豆品种成胡1 4 。为实验材料，以水杨酸为 调节因子，常见重金属c d 2 + 为环境胁迫因子，从生长发育和遗传毒理学角度， 探讨s a 对c d 2 + 毒害下植物有丝分裂、染色体的影响和微核率的变化，希望 为重金属污染伤害植物的生态防御研究提供一定的科学依据。 ， 2 材料和方法 2 1 植物材料 蚕豆( 矿f a b a l ) ，作为一种广为种植的经济作物，由于它的染色体组型 为六对相当大的染色体，且根尖含有较多的分裂相细胞，d n a 含量多，非常 适合显微观察 7 3 , 7 4 1 ；环境诱变剂对它的遗传物质损伤较为敏感，可以较好的 反应环境污染彤1 ；以及成本低等三大特点，更是细胞学和遗传毒理学研究的 理想而常用的材料。蚕豆品种为成胡1 4 。，购自四川简阳良种厂 2 2 实验方法 2 2 1 浸种催芽 选择饱满、大小均匀、无损伤的蚕豆种子，自来水洗净后用0 5 0 的n a c i o 消毒3 0 m i n 。蒸馏水冲洗数次后( 3 5 ) 次，用蒸馏水浸种，在培养箱中无光培 养( 2 4 o 5 ) ，每天早晚各换一次水。待胚根刚好突破种皮时，将种子放在 底部铺有2 层滤纸的白瓷盘中催芽，种子上面盖两层润湿的纱布，催芽条件 与浸种样。而后选取根长为1 0 0 c m 左右的蚕豆进行染毒处理。 四川师范大学硕士学位论文 2 2 2 染毒处理 用蒸馏水分别配置0 ，0 0 1 ，0 0 2 ，0 。0 5 ，0 1 0 、0 5 0 n u n o l l 的c d c l 2 ( c d c l 2 2 5 h 2 0 2 分析纯) 溶液，以蒸馏水为对照，作为预实验。用蒸馏水配 置0 5 0 m m o f l 的c d c l 2 分别和0 ，0 1 0 、0 5 0 ，1 0 0 ，3 。0 0 ，5 0 0 m m o f l 的 s a 溶液的复合溶液( 预实验表明0 5 0 m m o l lc d c l 2 对蚕豆根尖毒害最大) ， 以蒸馏水培养组作为对照组，每组培养1 0 0 个蚕豆，在自瓷盘中进行培养， 染毒处理在2 4 h 光照与2 4 h 黑暗交替、室温下进行，分别于o h 、2 4 h 、4 8 h 、 7 2 h 、9 6 h 时取材。各实验重复3 次，结果用平均值士标准误差表示，用s p s s 1 3 0 对组间数据进行差异显著性分析。 2 2 3 蚕豆根弯曲度和色泽的观察 按时观察各时间段蚕豆根的弯曲度和颜色变化，并记录。 2 ：2 4 蚕豆根长的测量 按时随机取各时间段o h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 的蚕豆2 5 颗，对它们的根 进行长度测量，计算平均长。 2 2 5 蚕豆根有机物含量的测定 2 2 5 1 蚕豆根鲜重的称量 随机取蚕豆2 5 颗，切下根，小心用蒸馏水冲洗干净，再用滤纸将其吸干， 放在分析天平中称鲜重( f r e s hw e i g h t 。f w ) ，准确到o 1 0 m g 水杨酸对蚕豆重金属镉毒害的影响 2 2 5 2 蚕豆根干重的称量 把蚕豆根置于干净培养皿中，移入控温烘箱中，在6 0 c 下烘至恒重后称 其干重( d r y 。w e i g h t ，d w ) 。 2 2 5 3 蚕豆根灰分的称量 将烘干后的蚕豆根置于备用的石英坩锅中，在5 0 0 - - 6 0 0 的马沸炉中灼烧 6 h ，使其完全灰化，变成白色，自然冷却，当温度降至室温后再称重。 通过以上方法可以得到蚕豆根的鲜重、干重和灰分重。 有机物含量= d w - 灰分重 2 2 6 蚕豆根尖细胞有丝分裂的观察 2 2 6 1 固定染色 切取蚕豆根尖，长度约为5 m m 左右。先蒸馏水冲洗根尖3 - 4 次，再用 改良c a r n o y 固定液( 配方：用3 份无水酒精，加入1 份冰醋酸，要求现配现 用) 在室温下固定2 0 - 2 4 ，j 、- 时，其目的是为了迅速杀死蚕豆根尖细胞，并使其 保持原有状态【7 ”。然后用蒸馏水冲洗3 - 4 次，转移至7 0 酒精中在o q 下 保存。 。 取出保存的根尖，用蒸馏水冲洗3 4 次，加入0 1 m o l lh c i ，6 0 水 解8 - 1 0 r a i n 其目的是使蚕豆根尖分生区细胞间的果胶质分解，细胞壁软化 或分解，细胞和染色体容易分散和压平。 将根尖用蒸馏水冲洗3 4 次，注意冲洗根尖时不要剧烈摇动小青瓶， 以免损伤根尖。然后将根尖至于载玻片上，用改良的石炭酸品红染色5 m i n 。 改良的石炭酸品红液配方：母液a ：称取3 9 碱性品红，溶解于1 0 0 m l 的7 0 酒精中( 此液可长期保存) ；母液b ：取母液a 1 0 m l ，加入9 0 m l 的5 石炭酸水溶液( 2 周内使用) ；石炭酸品红染色液：取母液b 4 5 n d ，加入6 m l 冰 1 0 四川师范大学硕士学位论文 醋酸和6 m 1 3 7 的甲醛；改良的石炭酸品红染色液：取石炭酸品红染色液 2 l o m l ，加入9 0 曲8 m 1 4 5 的醋酸和1 8 9 山梨醇。放置两周后，效果更佳。一 将根尖放在载玻片中央，切除根冠、伸长区和成熟区，加一滴改良的石 炭酸品红染液，盖上盖玻片。用镊子轻轻敲打盖玻片。让根尖细胞均匀分散 而又不破裂，并用吸水纸从旁侧吸去渗出的染液。 2 2 ，6 2 细胞有丝分裂的观察 每一组镜检2 5 个根尖，每个根尖至少镜检4 0 0 个细胞，观察细胞总数在 1 0 0 0 0 以上，观察部位为根尖分生区。 有丝分裂指数= 处于分裂期细胞数，总细胞数1 0 0 。 有丝分裂下降速率= 一( 有丝分裂指数。一有丝分裂指数，2 4 ) 有丝分 裂指数t x l 0 0 2 2 6 3 染色体畸变率( f r e q u e n c yo fc h r o m o s o m a la b e r r a t i o n ) 的检测 本研究记录的染色体畸变主要是染色体断片、染色体桥、染色体环和落后 染色体等，并分别对它们进行统计。 染色体畸变率= 染色体畸变细胞数有丝分裂细胞数x 1 0 0 。 染色体断片畸变率= 含染色体断片的细胞数有丝分裂细胞数x 1 0 0 。 落后染色体畸变率= 含落后染色体的细胞数有丝分裂细胞数x 1 0 0 。 染色体桥畸变率= 含染色体桥的细胞数有丝分裂细胞数x 1 0 0 。 有丝分裂极化畸变率= 含有丝分裂非正常极化的细胞数有丝分裂细胞 数x l o o * 。 染色体环畸变率= 含染色体环的细胞数有丝分裂细胞数x 1 0 0 。 本实验还记录了s a 对c d 2 + 胁迫下蚕豆根尖细胞各时期染色体断片数量、 落后染色体数量和染色体桥数量的影响。 水杨酸对蚕豆重金属镉毒害的影响 2 2 7 微核钿i c r o n u c l e u s ，简称m c n ) 的观察 2 2 7 1 微核率( m i c r o n u c l e u sf r e q u e n c y ，m n f ) 的检测 微核率= 含微核细胞数细胞总数1 0 0 0 o 。 2 2 7 2 微核大小的测量 用微尺对微核的直径进行测量，并统计微核平均直径的分布情况。统计微 核在细胞各个时期出现的情况和每细胞中微核的多少，并求出它们的百分数。 2 2 8 照相 在n i k o nf x - - 3 5 w a 光学显微镜下，选择具有代表性的样本进行拍照。 3 结果 3 1 c d 2 + 对蚕豆根尖细胞遗传毒理学效应的影响 3 1 1c d 2 + 对蚕豆幼苗根生长的影晌 从表l 可以看出，与对照组( 蒸馏水组) 相比，当c d 2 + 浓度o 0 2 m