（发酵工程专业论文）啤酒口感协调柔和性的研究——高浓酿造稀释率的影响.pdf

摘要 摘要 本文利用顶空固相微萃取气相色谱( h s s p m e g c ) 技术，建立了一种能够同时检测 啤酒中醇、酯及游离脂肪酸( f f a s ) 的分析方法。利用p l a c k e t t b u r m a n 试验设计法及响应 面分析法，优化得到顶空固相微萃取气相色谱检测啤酒中挥发性风味物质的最佳萃取 条件：萃取温度5 4 、萃取时间4 5m i n ，加盐量为0 4 1g m l 。选用固相微萃取头 p d m s d v b 对啤酒中的醇、酯及脂肪酸进行定性定量研究，得到乙酸乙酯、乙酸异戊 酯、异丁醇、异戊醇、d 苯乙醇、辛酸和癸酸的线性范围分别为0 9 9 8 1 9 9 6 8 、0 2 5 5 0 0 、 0 7 3 5 1 4 7 、0 3 8 7 - 7 7 4 、0 1 2 6 2 5 1 5 、0 4 - - 8 0 8 、0 4 6 - - - 9 2m g l ，相对标准偏差( r s d ) d x 于 4 ，检测限在0 0 1 , 4 ) 4 0 4 肛g l 之间，各物质峰面积与浓度之间线性相关系数均大于 0 9 9 8 。同时将其与顶空气相色谱法( h s g c ) 及液液萃取( l l e ) 法进行了比较，证明了该 方法的可靠性和可行性。 尝试将模糊综合评价法应用于啤酒口感协调性品评中，通过与传统感观品评结果相 比较，发现两者的拟和度较好。对市售的4 8 种啤酒样品进行了口感协调性优劣排序和 比较，检测分析了口感协调性排名前2 0 的啤酒样品的风味物质含量，发现不同品牌啤 酒在有机酸、醇、酯和脂肪酸几大类风味物质组成上存在较大差异。在模糊综合评价基 础上，结合口感协调性品评试验，通过统计口感协调性最优啤酒样品的几大类风味物质 分布，初步确定了口感协调性啤酒风味物质组成的较优范围：丙酮酸3 5 7 7m g l ，苹果 酸3 7 - - - 6 4m g l ，乳酸5 3 8 2m g l ，乙酸2 l 5 5m g l ，柠檬酸1 1 3 1 5 7m g l ，琥珀酸4 4 9 5 m g l ；异丁醇5 1 1m g l ，异戊醇3 7 8 3m g l ，1 3 - 苯乙醇2 1 - 2 6m g l ，乙酸乙酯1 1 2 4 m g l ，乙酸异戊酯2 - 6m g l ：辛酸1 2m g l ，癸酸0 0 5 - 0 4m g l 。为后面以啤酒口感 协调为目标的酿造工艺的优化，即样品风味物质组成的优劣判别提供了参考依据。 依据口感协调风味物质的较佳组成配比，结合样品口感模糊综合评价结果和较佳稀 释率的放大验证试验得出：口感协调性较佳的样品稀释率相应较大，稀释率较小的样品 的口感协调性模糊综合评价结果等级也较低，常浓酿造啤酒口感协调性品评结果较差。 关键词：顶空固相微萃取；风味物质；模糊综合评价法；稀释率；协调性；感观品评 a b s t r a c t a b s t r a c t 砀em e t h o do fd e t e r m i n i n ga l c o h o l s 、e a s t e r sa n df r e ef a t t ya c i d sa tt h es a m et i m ew a s e s t a b l i s h e db yh e a d s p a c es o l i dm i c r o e x t r a c t i o n t h eh e a d - s p a c es o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n c o n d i t i o n sf o rf l a v o rc o m p o u n d sa n a l y s i si nb e e rw e r eo p t i m i z e db yp l a c k e t t b u r m a nd e s i g n a n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s e x t r a c tt e m p e r a t u r e ， t i m ea n ds a l td o s i n gw a s5 4 ，4 5m i na n do 41g m l ，r e s p e c t i v e l y t h ew o r k i n gc h i v e l i n e a rs c o p eo fe t h y la c e t a t e ，i s o - a r n y la c e t a t e ，i s o b u t y la l c o h o l ，i s o - a m y la l c o h o l ，1 3 p h e n e t h y la l c o h o l ，c a p r y l i ca c i da n dc a p r i ca c i dw a so 9 9 8 19 9 6 8m g l ，o 2 5 5 0 0m e r l e ， o 7 3 5 - 1 4 7m g l ，o 3 8 7 - 7 7 4m g l ，o 12 6 2 5 15m g l ，0 4 - 8 0 8m g la n do 4 6 9 2m g l ， r e s p e c t i v e l y t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w a sl e s st h a n4 w i t hd e t e c t i o nl i m i t s b e t w e e n0 01 , 4 ) 4 0 4r t g la n dc o r r e l a t i o nt o e m c i e n tm o r et h a n0 9 9 8 t h er e l i a b i l i t yo ft h i s m e t h o dw a sp r o v e d t h r o u g hc o m p a r i n g w i t h h e a d s p a c eg a sc h r o m a t o g r a m a n d l i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n t h ef u z z yc o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o nw a sa p p l i e dt ot h ee v a l u a t i o n o fh a r m o n y c h a r a c t e ro fb e e r w ef o u n dt h a tt h ef i r i n gd e g r e ef o rt h et w om e t h o d sw a sv e r yw e l lt h r o u g h t h er e s u l t so ff u z z yc o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o na n dt h er e s u l t so fs e n s o r ye v a l u a t i o n t h e h a r m o n yc h a r a c t e r so f4 8k i n d so fb e e rw e r ec o m p o s i t e d ，a n dt h ef l a v o u rs u b s t a n c e so ft h e b e e rr a n k i n gb e f o r e2 0 w ef o u n dt h a tt h eg r e a td i s c r e p a n c yi nt h ec o n t e n t so fo r g a n i ca c i d s 、 a l c o h o l s 、e a s t e r sa n df a t t ya c i d so fd i f f e r e n tb e e rs a m p l e sw a si n d e e dp r e s e n t e d w i t h m e a s u r e do ft h ef l a v o u rs u b s t a n c e sc o n t e n t so ft h eh a r m o n i o u sb e e r , t h er e l a t i v eo p t i m a l r a n g eo ff l a v o u rs u b s t a n c e so ft h eh a r m o n i o u sb e e rw a sc o n s i d e r e da s ：p y r u v i c3 5 7 7m g l ， m a l i e3 7 - 6 4m g l ，l a c t i c5 3 - 8 2m g l ，a c e t i c2 1 5 5m g l ，c i t r i c11 3 1 5 7m g la n ds u c c i n i c a c i d4 4 9 5m g l ；i s o b u t y la l c o h o l5 11m g l ，i s o - a m y la l c o h o l3 7 8 3m g l ，1 3 - p h e n e t h y l a l c o h o l21 2 6m g l ，e t h y la c e t a t e1 1 2 4m g l ，i s o - a m y la c e t a t e2 - 6m g l ，c a p r y l i ca c i d1 - 2 m g l ，c a p r i ca c i do 0 5 - 0 4m g l 1 1 1 eb e e rc o u l db er a n k e da n dc o m p a r e db yt h ef l a v o u r s u b s t a n c e sc o n t e n ti nb e e r a c c o r d i n gt ot h er e l a t i v eo p t i m a lr a n g eo f f l a v o u rs u b s t a n c e so ft h eh a r m o n i o u sb e e ra n d t h er e s u l t so ft h ef u z z yc o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o n ，w ec o u l do b t a i n e dt h a tt h eb e e rw i t h h i g h e rd i l u t i o nr a t eh a st h eb e t t e rs e n s o r ye v a l u a t i o nc h a r a c t e r i s t i c ，a n dt h eb e e rp r o d u c e db y h i 幽g r a v i t yb r e w i n go w n e dt h eb e t t e rh a r m o n i o u sc h a r a c t e r i s t i ct h a nt h eb e e rp r o d u c e db y g e n e r a lb r e w i n g k e yw o r d s ：h e a d s p a c es o l i dm i e r o e x t r a c t i o n ( h s - s p m e ) ；f l a v o u rs u b s t a n c e ；f u z z y c o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o n ；d i l u t i o nr a t e ；h a r m o n i o u sc h a r a c t e r i s t i c ；s e n s o r ye v a l u a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期：如宇o ； 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：丸恚风导师签名： 日 期： 第一幸绪论 第一章绪论 1 1 啤酒中的风味物质与啤酒风味类型 1 1 1啤酒风味物质与口感协调性 风味物质对感官协调柔和性的影响及其作用机理，是食品和发酵行业风味研究中的 一个崭新领域。所谓协调，是对风味口感特性的整体综合评价，风味协调与风味物质的 含量及比例直接相关，适当合理的风味组成，会使消费者感觉到“舒服”。生产工艺及 风味物质与风味口感协调柔和性息息相关。啤酒作为饮料酒，其风味特征主要通过感官 品尝进行评价。随着啤酒生产规模化集团化发展，仅靠专业评酒人员进行感官品尝，难 以达到控制产品品质的目的。利用现代仪器分析技术对啤酒进行监控，保持啤酒风味一 致性，是啤酒行业发展的趋势。 在食品研究领域，有人采用颗粒茶加工工艺加工风味茶，对风味物质与茶叶的协调 性进行了试验研究【l 】。醇、酯、羰基化合物和有机酸等已经成为酿造者关注的对象甚至 成为常规测定指标，国内对啤酒中醇类、酯类等风味物质的单。一分析与检测已经研究的 比较透彻，但针对几大类物质群与啤酒风味口感整体协调性的影响方面关注相对较少。 1 1 2 啤酒风味类型 风味是对啤酒的色、香、味的综合感觉和评价，是啤酒中各种化学物质组分反应到 色、香、味三个方面的具体表现。啤酒是深受世界人民喜爱的饮料酒，但由于各种原因， 啤酒的风味特点有多种类型和差异。有关啤酒风味特点及分布在2 0 0 5 年就有了比较系统 的概括【5 j ，如图1 1 所示。 氅“喝 i ，叶国蕊 o x 讣 v，涮 图1 - 1 不同啤酒品牌的风味特点及分布【5 1 f i g 1 1t h es t y l ea n dd i s t r i b u t i o no f d i f f e r e n tb e e r 造成啤酒风味类型有所差别的主要原因是各种啤酒中的风味物质有所不同。柔和型 啤酒，口感物质协调，风味物质不突出，口味柔和如水，苦味小，酸感低，酿造香味淡， 啤酒中水分子和风味物质( 乙醇和高级醇等) 以氢键缔合较好【5 】，因此风味不突出。风味 类型有一定的流行区域，也有一定的时代特征，目前中国的消费者大都喜好淡爽型淡味 啤酒，并且要求颜色越来越浅、口味越来越淡、苦味越来越小，这和食品结构的改变有 定关系。 江南人学硕1 ：学位论文 1 2 高浓酿造与啤酒风味 1 2 1高浓酿造的历史与发展现状 2 0 世纪7 0 年代，美国和加拿大率先推出高浓酿造啤酒，采用的是高浓投料、高浓发 酵、过滤的稀释的工艺【6 】。现在，北美和北欧的一些国家，己将高浓酿造稀释法作为通 常的生产技术，该技术在美国啤酒工业的应用范围已达7 0 以上，在北美高浓酿造技术 已逐步替代了传统的酿造方式。目前，国外仍在进行高浓酿造技术的纵深研究，麦汁浓 度已可提高至18 2 4 ，稀释率已达3 0 0 【7 1 。 高浓酿造工艺发展到今天已十分完善，稀释工艺可以在酿造的任何阶段通过加脱氧 水的方式实现，包括糖化阶段稀释( 麦汁煮沸结束前、麦汁冷却后) 、发酵阶段稀释( 发酵 期间或临近结束、啤酒后熟期) 及过滤阶段稀释( 过滤前稀释、过滤后稀释) 。通常采用的 高浓稀释方式是用高浓麦汁糖化、高浓发酵、过滤后加脱氧水稀释的生产方式，该工艺 可有效降低糖化车间用水量，在不增加糖化、发酵和后贮设备的情况下可扩大啤酒产量。 在我国，华光啤酒厂于2 0 世纪7 0 年代就进行了有益的探讨，即用浓度为1 2 1 3o p 的麦汁 生产，发酵后用脱氧水稀释为1 0 8o p 的稀释啤酒的工艺，目前不少啤酒企业仍在延用， 只不过脱氧水制备设备、添加设备及相应的工艺有了新的提高，但这种高浓技术与国外 的高浓稀释所能达到的浓度仍相差甚远。 1 2 2 高浓酿造对啤酒风味特性的影响 与常浓酿造相比，啤酒高浓酿造的优势在于它可在不增加糖化发酵设备的基础上大 幅度提高啤酒产量，节约设备投资和操作费用。然而，该工艺也存在明显的缺陷，如原 料利用率降低、啤酒泡持性较差、风味不协调以及高浓麦汁对啤酒酵母性能的不利影响 笙【8 】 。q 。 o a n d e r s o n s l l k i r s o p l l 2 】报道，与传统的麦汁( 1 2 0 p ) 相比，高浓麦汁( 1 6 。p ) 发酵产生更 多的酯类，尤其是乙酸乙酯和乙酸异戊酯，因此控制高浓酿造工艺，尽量降低副产物的 量将是保证啤酒品质的重要一环。s t e w a r t 等【9 】认为高浓麦汁中的可发酵性糖的组成是造 成酯类物质含量增高的主要原因，提高高浓麦汁中麦芽糖的含量，将有利于控制酯类物 质的增加。高浓酿造啤酒的双乙酰、戊二酮、乙偶姻、高级醇等风味物质的含量均略高 于低浓酿造啤酒的含量，这也是高浓酿造工艺本身所带来的风味变化。有人通过对滤前 生酒、清酒、成品酒与其它酒进行反复地对比、品剥1 0 】，发现糖浆高浓酿造稀释酒较非 稀释酒口味更柔和、淡爽，口感更干净，无异杂味。 1 3 现代化检测和分析手段在啤酒风味分析中的应用 1 3 1 啤酒中风味物质的常规测定方法 在国内，啤酒作为饮料酒，其风味特征主要通过感官品尝进行评价，但仅靠专业评 酒人员进行感官品尝，难以达到控制产品品质的目的。利用现代仪器分析技术对啤酒进 行监控，保持啤酒风味一致性，是啤酒行业发展的趋势。利用气象色谱可对啤酒中挥发 性风味化合物进行分析，气相色谱测定技术可以测定啤酒中连二酮、醇类、酯类、含硫 化合物、羰基化合物等重要风味化合物。随着对啤酒风味物质研究越来越重视，目前已 2 第一章绪论 采用g c m s 、g c o 气味检测法与g c m s 结合技术、及电子自旋共振( e s r ) 技术对啤酒酿 造过程及原料中的风味化合物和异味组分进行分析【l l l 。 测定发酵产品中有机酸的方法包括薄层层析法( t l c ) 、酶法、分光光度法、气固或 气液色谱法( g s c 或g l c ) 以及高效液相色谱、法( h p l c ) 1 2 - 1 6 ，其中气相和液相色谱法是 目前最精确和直接的方法。无锡轻工大学食品学院的肖刚、杨严俊、邬仁娜【1 7 】等人采用 有机溶剂萃取啤酒中游离脂肪酸( c 6 ：0 c 1 2 ：0 ) ，并用毛细管色谱测定了市售啤酒中 c 6 ：0 c 1 2 ：0 含量。青岛啤酒集团公司科研中心的科研人员【1 8 l 采用气相色谱法准确的测定 了啤酒中辛酸到二十二碳酸共1 1 种游离脂肪酸。江南大学生物工程学院的杨毅【1 9 】采用 高效液相色谱法成功的将啤酒中的八种有机酸进行了分离以及含量的测定。 1 3 2 固相微萃取( s p m e ) 技术 a 固相微萃取的应用和发展 固相微萃取技术( s o l i d p h a s em i e r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 是1 9 8 9 年由加拿大w a t e r l o o 大 学的c l a r t h u r 和j p a w l i s z y n 等开发出来的一种新型无溶剂化的样品前处理技术【2 0 1 ， 它集采样、萃取、浓缩、进样于一体，便于携带，真正实现了样品的现场采集和富集， 能够与气相、气相质谱、液相、液相质谱仪联用，因此在环境污染物、化工、食品分 析等领域有着广泛的应用。最近，s p m e 技术被用于分析番茄汁中的挥发性物质【2 1 1 、啤 酒中的硫化物【2 2 】、鱼的新鲜气味1 2 3 1 、血液中的碳氢化合物2 4 1 、废水中的游离挥发性脂 肪酸【2 0 1 、咖啡的分类及其风味物质分析等。目前，国内在啤酒挥发性风味成分研究中 应用s p m e 的还不多。 b s p m e 实验装置 固相微萃取实验装置状似一只气相色谱微量注射器，由手柄和萃取纤维头两部分构 成【2 6 】，如图1 2 所示。s p m e 的操作方式有两种：直接s p m e 法【” ( d i r e c ts p m e ，简称 d i s p m e ) 和顶空固相微萃取法( h e a d s p a c es p m e ，简称h s s p m e ) 。 l 压杆 2 简体 3 压杆卡持螺钉 4z 形槽 5 筒体视窗 6 调节针长度的定位器 7 拉伸弹簧 8 秘密隔膜 9 注射针管 图1 2s p m e 装置结构图 图1 - 3s p m e 吸附流程 f i g 1 2d e v i c eo fs o l i dp h a s em i cf i g 1 3t h ea d s o r p t i o np r o c e s so fs p m e 使用s p m e 吸附的具体过程如图1 3 所示，先使纤维头缩进不锈钢管内，将不锈钢 针管插过盛装待测样品瓶的隔垫，待进入瓶中后推手柄杆使纤维头伸出针管，纤维头可 以浸入待测样品中或置于样品顶空，待测有机物吸附于纤维涂膜上，达到平衡后，缩回 纤维头，然后将针管退出样品瓶。紧接着就是脱附过程，与微量注射器进样方式相同， 将s p m e 针管插入g c 进样1 ：3 ，推动手柄杆使纤维头伸出，被吸附物经热解吸后进入气 盖一u ，hl竹；| ii-。 2 ，_叶l。ifpi，h， 1 5 n瀚陆嘲甲， 江南大学硕士学位论文 相色谱柱或将s p m e 针管插入s p m e h p l c 接口解吸池，开启流动相通过解吸池洗脱样 品进样。 c s p m e 工作原理 s p m e 法的基本原理是当s p m e 的萃取头浸于样品中或放置于样品的顶空，样品中 挥发性有机物( v o c s ) 通过扩散原理被吸附在p d m s 或其它固定吸附薄膜内，吸附达到 平衡后，将石英纤维转移到气相色谱仪的进样口，通过加热使吸附在p d m s 或其它固定 吸附薄膜内的v o c s 解吸，随着载气流入色谱柱进行分离及测定。被测组分在固定吸附 薄膜内的吸附量与它在原始样品中的浓度存在一定的线性关系，因此，从分析结果得到 的固定吸附薄膜内v o c s 量就可以计算出原始样品中v o c s 的浓度。 l o u c h t 2 8 】最早对s p m e 方法的基础理论进行了研究，并提出了d i r e c t s p m e 方法的 数学模型，z h a n g 则提出了h s s p m e 的模型1 2 引。虽然纤维上涂层的厚度和极性、取样 方法以及样品的种类等都将会影响到s p m e 吸附量的大小，不过上面的理论证明，s p m e 作为一种平衡取样方式，只要采样条件( 温度、时间、体积等) 保持恒定，s p m e 吸附基 质的饱和吸附量与样品基质中待分析物的初始浓度呈线性关系【3 0 , 3 1 】。 1 4 啤酒风味评估 啤酒的各项理化指标，是相互影响和关联的，在不同风味特性、不同质量层次的啤 酒之间，就某一个理化指标而言，并不存在一种明显的分级标准。特别是感官指标，它 是各种理化指标的综合反映，因此，能够准确定量啤酒中各种风味物质的含量是对其进 行风味评估的一个重要方面，而在考虑各种因素的影响下，从庞杂的数据中确定风味物 质含量与风味口感之间的关系才是最重要的，也是比较困难的。评定啤酒的感官指标， 需要有丰富实践经验的品尝师。但是，人工品评带有很大的主观因素，其评判结果存在 相当大的个体差异，即使是同一鉴别者也随其身体状态、情绪、环境的不同而产生不同 的结果【3 2 】。而且啤酒是一个非常复杂的体系，许多因素都可能会影响啤酒的风味和口感， 在这种情况下，我们就需要将现代化的检测和统计分析手段合理的结合起来，建立以各 种理化指标为基础的评估体系，对传统的评酒方法进行有益的补充，并且对生产中控制 和提高啤酒风味质量提供指导。 目前常用的模式识别方法有主成份分析( p c a ) 、偏最d x - - 乘法( p l s ) 、聚类分析( c a ) 和模糊综合评价【3 3 3 4 i 。近年广泛用于各个领域的模糊综合评价方法具有很强的非线性映 射能力，它通过网络内部权值的调整来拟合系统的输入输出关系，即只根据输入输出数 据来建立模型，网络的统计信息储存在连接权矩阵内，故可以反映十分复杂的非线性关 系，因而很适合于多因变量、多自变量统计中的建模，其应用范围已波及发酵工业的相 关领域，成为目前研究的热点之一p5 。模糊综合评价是借助模糊数学的一些概念，应用 模糊关系合成原理，将一些边界不清、不易定量的因素定量化、综合评价的一种方法， 常用于定性检测、感官多指标综合【j 副。国内外很多研究者已把它应用到多个领域的综合 评价中，例如水质评估3 6 ，3 7 1 、市场调研【3 8 舶】、空气质量监测【4 l l 、工作质量评定等研 究领域都有所涉及。a d e mg o l e c 4 3 等人报道了一种评判职工合格与否的模糊综合评价体 系，该模型可以将雇员与某一特定工作系统合理地搭配起来，进而可以使企业运营及决 4 第一章绪论 策更加合理；最近，k u n l iw e n 删研发了一种可以进行模糊综合评价分析的m a t l a b 工 具箱，研究表明它可以方便高效地对学生成绩进行模糊综合评价。目前将模糊综合评判 法应用于风味品评分析中的实例并不多，但已有人将模糊数学应用于豆浆感观品评、湘 泉基酒风味差异中间过渡的描述中等研究领域 4 5 , 4 6 】；s e u n gj ul e e 等人【4 7 】应用模糊推理 进行香肠感官评定，与统计分析结果能够很好地吻合。 1 5 立题背景与意义 目前，酒类饮料的质量主要靠人的感官来进行鉴别。但是，人工鉴别带有很大的主 观性，其评判结果存在相当大的个体差异，即使是同一鉴别者也随其身体状态、情绪、 环境的不同而产生不同的结果。而且酒中的化学成分庞杂，其质量是各种化学成分的综 合反映，而完全依靠分析化学的方法来鉴别酒类风味、质量也是比较困难的，因此简单 可靠的酒类饮料的评估体系的研究就显得非常需要。现代化的仪器分析手段和数据处理 软件为我们解决上述矛盾提供了方法论的基础，我们一方面可以通过气相、液相等仪器 分析获得大量数据，另一方面可以借助近年来不断发展的s a s 、m a t l a b 等建模软件 建立人工风味质量鉴别和现代化仪器分析相结合的评估体系，从而得到更加准确及时的 评估信息，有效的指导实际生产操作，提高酒类饮料的质量，而且是对传统评价酒类风 味体系的有益补充和创新。 近几年来，国内外一直在进行高浓酿造的研究，发酵麦汁已经由原来的1 4 1 6 。p 提高到现在的1 8 2 0 。p 甚至更高。但国内大多数企业都采用1 0 - 1 3 。p 酿造，成熟后稀 释成6 5 1 0 。p ，稀释度控制在3 0 一5 0 。在高浓酿造中稀释率会对啤酒的风味和稳 定性产生巨大影响。国内对啤酒中醇类、酯类等风味物质的单一分析与检测已经研究的 比较透彻；葡萄酒、黄酒中的部分有机酸研究较多，而有关啤酒中有机酸的研究工作还 不广泛，主要集中在乳酸、琥珀酸、焦谷氨酸、柠檬酸、草酸、酒石酸等非挥发性酸的 研究上；对于挥发性脂肪酸的研究并没有引起足够的重视。在食品研究领域，有人采用 颗粒茶加工工艺加工风味茶，对风味物质与茶叶的协调性进行了试验研究。将各大类风 味物质综合起来，分析风味物质与啤酒风味口感协调性间的研究目前还没有广泛深入的 开展。有必要对啤酒中的风味物质群进行系统的研究以及总结，找出各大类物质间的比 例关系以及它们与啤酒风味口感的联系，在此基础上对建立有效的啤酒口感评估体系做 出进一步的探索和尝试。 1 6 主要研究内容 ( 1 ) 啤酒中挥发性风味物质分析体系的初步建立。 ( 2 )啤酒口感协调性评估体系的初步建立。 ( 3 ) 高浓酿造对啤酒风味协调性的影响。 江南大学硕士学位论文 第二章啤酒中挥发性风味物质分析体系的建立 2 1 前言 影响啤酒风味的物质可分为：醇、酯、酸、羰基化合物、含硫化合物、挥发性胺和 酚基化合物等。啤酒的各项理化指标是相互影响和关联的，在不同风味特性、不同质量 层次的啤酒之间，就某一个理化指标而言，并不存在一种明显的分级标准，特别是感官 指标，它是各种理化指标的综合反映，因此，能够准确定量啤酒中各种风味物质的含量 是对其风味评估的一个重要方面。 固相微萃取技术是一种应现代仪器的要求而产生的样品前处理新技术，它几乎克服 了以往一些传统样品处理技术的所有缺点，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，便于携 带，真正实现样品的现场采集和富集。国内在啤酒挥发性风味成分研究中应用s p m e 的 还不多，s p m e 的快速、简便、不用溶剂等优点，非常符合食品和发酵工业中质量控制 的分析要求，因此希望通过s p m e 在啤酒挥发性风味成分研究中的应用，建立一个简捷、 快速的分析方法。 本章尝试利用顶空固相微萃取气相色谱( h s s p m e g c ) 技术，建立了一种能够同时 检测啤酒中醇、酯及游离脂肪酸( f f a s ) 的分析方法，同时将其与顶空气相色谱法( h s g c ) 及液液萃取( l l e ) 法进行了比较，证明了该方法的可靠性和可行性。 2 2 材料与仪器 2 2 1 主要原料和试剂 辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、十七碳酸甲酯、3 庚酮、苯甲酸甲酯、乙酸乙酯、 乙酸异戊酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇和b 苯乙醇均购自s i g m a - a l d r i c h 化学公司；二 氯甲烷、正己烷、无水硫酸钠、甲醇( 色谱纯) 、n a c 0 3 、n a c l 、b f 3 、硫酸、盐酸和氢氧 化钠均购自中国( 医药) 集团上海化学试剂公司。 2 2 2 仪器设备 固相微萃取手柄( s u p e l c o ，b e l l e f o n t e ，p a ) 、7 5 1 t m 固相微萃取头( c a r p d m s 、 d v b p d m s ) 、s p m e 专用样品瓶上海安谱科学仪器有限公司 s h i m a d z ug c 2 0 1 0 气相色谱仪， 日本岛津 真空旋转蒸发仪、马弗炉江苏医疗仪器厂 p h s 3 c 型精密p h 计 上海雷磁仪器厂 t g l 1 6 c 型高速离心机上海安亭科学仪器厂 m e t t l e rt o l e d o 电子天平梅特勒托利多上海仪器有限公司 7 9 3 型恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂 2 2 3 数据处理软件 m a t l a b7 o ：n c s s p a s s g e s s ；s a s8 0 2 3 测定方法 2 3 1 标准溶液的制备 a 内标储备溶液 6 第二章啤酒中挥发性风味物质分析体系的建立 a 称取3 0 0 0m g3 庚酮于1 0 0m l 容量瓶中，3 9 的无水乙醇稀释至刻度。 b 称取3 0 0 0m g 苯甲酸甲酯于1 0 0m l 容量瓶中，3 9 的无水乙醇溶液定容。 b 标准溶液储备液 准确配置浓度分别为2 0 0 0m g l 、5 0 0m g l 、8 0 0 0m g l 、2 5 0 0m g 、2 5 0 0m g l 、2 5 0 0 m g l 、8 0 0m g l 、8 0m g l 的乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇、异丁醇、丙醇、b 苯乙 醇、辛酸、癸酸溶液储备液2 5m l ，3 9 的无水乙醇稀释至刻度。 c 工作曲线标准溶液配制 a 依次吸取b 中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇、异丁醇、正丙醇储备液o 8m l 、1m l 、 o 5m l 、0 5m l 、0 5m l 于1 0m l 容量瓶，超纯水定容至1 0m l ，此为c l 液。 b 依次吸取b 中1 3 一苯乙醇、辛酸、癸酸储备液1m l 、1m l 、1m l 于1 0m l 的容量瓶 中，超纯水定容至1 0m l ，此为c 2 液。 c 取c l 液1m l 依次稀释o 倍、5 倍、1 0 倍、5 0 倍、1 0 0 倍、5 0 0 倍、1 0 0 0 倍几个数量 级，配置不同梯度的混标溶液，g c 进样分析。 d 取c 2 液lm l 依次稀释o 倍、5 倍、1 0 倍、5 0 倍、1 0 0 倍、5 0 0 倍、1 0 0 0 倍几个数 量级，配置不同梯度的混标溶液，g c 进样分析。 2 3 2 样品制备 取4 5m l 除气啤酒于样品瓶中，加入2 0 7gn a c l ，分另, j j j n 入o 3m l 内标储备液 2 3 1 a ( a ) 和0 2m l2 3 1 a ( b ) ，按优化的萃取条件进行实验。 2 3 3g c 分析条件 检测仪器：f i d ：色谱分析柱：c p w a x5 2c b ( 3 0mi d o 3 2m m 0 5 p m ) ；汽化温 度：2 5 0 。c ；进样器及检测器温度：2 6 0 ；载气( 流量) ：高纯n 2 ( 2 0m l m i n ) ；分流比： 2 ：1 ；助燃气：空气，流量4 0 0m l m i m 燃气：h 2 ，流量4 7m l m i n ；尾吹：3 0m l m i n 。 程序升温条件：4 0 ( 保持4m i n ) 1 2 0 ( 升温速率3 o o m i n ，保持0 1 0m i n ) 2 2 0 ( 升温速率1 0 m i n ，保持1 0m i n ) 。 2 3 4 定量计算 根据被测物和内标物的浓度及在色谱图上相应的峰面积比，由内标法按式( 2 1 ) 计算 分析物含量。 置：堪z c f ( 2 一1 ) 4 4 其中：置一啤酒中分析物i 的含量；z 一混标中分析物i 的含量； 彳。一啤酒样品中内标物的峰面积；彳：一混标中内标物的峰面积； 4 一啤酒样品分析物i 的峰面积；彳一混标中脂分析物i 的峰面积；c f 浓缩倍数 2 3 5 顶空气相色谱法测定啤酒中的醇酯哺8 j 2 3 6 多级溶剂萃取法测定啤酒中的游离脂肪酸 a 内标储备液 a 准确称取1 5 0 0m g 十七碳酸甲酯于2 5m l 容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，为a 1 液。 b 吸取1 0m la 1 液正己烷定容至1 0 0 m l ，为a 2 液。 b 标准溶液储备液 江南大学硕士学位论文 称取1 0 0 0 0m g 辛酸、2 0 0 0 m g 癸酸、1 0 0 0m g 月硅酸、1 5 0 0m g 棕榈酸、1 5 m g 十七碳酸甲酯于2 0m l 具塞试管，加入2 5 b f 3 甲醇溶液2m l ，6 0 水浴酯化3 0m i n ， 冷却后将其转移入3 0m l 的分液漏斗，依次加入5m l 正己烷、2m l 饱和n a c l 溶液， 振荡1m i n ，静置分层后收集有机相于2 5m l 的容量瓶，水相再用正己烷萃取2 次后收 集有机相并入2 5m l 的容量瓶中，正己烷稀释至刻度。 c 工作曲线标准溶液配制 取b 储备液依次稀释0 倍、5 倍、1 0 倍、5 0 倍、1 0 0 倍、5 0 0 倍、1 0 0 0 倍几个数量 级，配置不同梯度的混标溶液，g c 进样分析。 d 样品制备 取1 5 0m l 除气啤酒，加入2 0gn a c l ，2m l 浓盐酸，向酸化的啤酒中加入3 0m l 二氯甲烷甲醇( 3 ：1 ) 溶液，振荡1m i n ，静置分层。收集有机相，上层加入2 0m l 二氯甲 崩甲醇再连续萃取2 次，将有机相并入1 5 0m l 具塞三角瓶中。将有机相依次用5 0m l ， 2 0m l ，2 0m l 的5 0g l 的n a 2 c 0 3 连续萃取3 次，收集水相。水相用6m o l l 的h c i 调节p h 至3 5 后，再依次用3 0m l ，2 0m l ，2 0m l 二氯叩烷甲醇连续萃取3 次，收集 有机相。有机相经无水硫酸钠脱水后滤入1 0 0m l 梨形瓶中，用真空旋转蒸发器将其浓 缩至3 5m l ，转入2 0m l 酯化管中，再经过n 2 吹扫浓缩至o 5m l ，加入2 5 b f 3 甲 醇溶液2m l ，在6 0 恒温水浴中酯化3 0m i n 。取出哺化管并冷却至室温，然后将其转 移入3 0m l 的分液漏斗中，依次加入3m l 正己烷、，2m l 饱和n a c l 溶液、，振荡lm i n ， 待静置分层后收集有机相于1 0m l 的容量瓶中，水相再连续用3 m l 正己烷萃取两次后 收集有机相并入1 0m l 的容量瓶中，l m l 内标储备液a 2 ，正己烷稀释至刻度，待测定。 e g c 分析条件：进样量：1 “l ；柱温程序：50 c ( 2m i n ) 1 0 0 ( o 1 0m i n ) ，升温速率 5 o o m i n 2 2 0 ( 1 0m i n ) ，升温速率1 0 m i n ；其它同2 3 3 节。 f 样品测定：取1 5 此待测样品进样，内标法进行定量分析。 2 4 结果与讨论 2 4 1h s s p m e 法检测啤酒中的挥发性风殊物质 a 萃取头的选择 分别考察c a r - p d m s 和p d m s d v b 两种萃取头对啤酒样品萃取分离效果，如图 2 1 所示。 ( a ) p d m s d v b 萃取谱图( b ) c a r p d m s 萃取谱图 图2 1 不同萃取头的分离效果比较 f i 醇一1c o m p a i ro fs e p a r a t i o ne f f e c tb e t w e e nd i f f e r e n tf i b e r s 8 第二章啤酒中挥发性风味物质分析体系的建立 萃取头涂层种类和厚度对灵敏度的影响最为关键，一般来讲，不同的分析物要用不 同类型的吸附质涂层进行萃取，选择的基本原则是“相似相溶原理”。c a r p d m s 萃取头 适用于分离非极性半挥发物质，而p d m s d v b 则适于分离极性挥发性物质。由图2 1 可以看出，p d m s d v b 对啤酒中挥发性风味物质的分离效果明显好于c a r p d m s ，故 在以后的实验中选p d m s d v b 纤维头进行研究。 b 色谱分离条件的选择 为达到较好的分离效果，实验设计了4 种程序升温条件，如表2 1 所示。对同一种啤 酒样品分别按表中设计的条件进行检测，得到色谱图见图2 2 。 表2 - 1 色谱分离条件 t a b l e2 - 1c o n d i t i o n so fc h r o m a t o g r a p h i cf r a c t i o n a t i o n 程序 流速( m l m i n ) 柱温 13 5 0 f 2m i n ) 2 2 0 ( 2 0m i n ) 1 0 22 4 0 ( 4m i n ) 1 2 0 ( 0 1m i n ) 3 2 2 0 ( 1 5m i n ) 8 3 2 4 0 ( 5m i n ) 1 2 0 ( 0 1m i n ) 5 2 2 0 ( 1 5m i n ) 1 0 42 5 0 ( 5m i n ) 1 2 0 ( 0 1r a i n ) 3 2 2 0 ( 1 0r a i n ) 8 图2 - 2 不同分离条件下的色谱图 f i g 2 - 2c h r o m a t o g r a mu n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s 由图2 2 可以看出，图( a ) 采用一级升温程序，受乙醇峰影响，o 1 0r a i n 内低沸点物质 没有完全分离；图( b ) 、( c ) 、( d ) 采用二级程序升温，各物质峰较图( a ) 有较好的分离效果， 但图( c ) 3 0m i n 之后的保留时间过长；图( d ) 中基线不稳，各物质峰脱尾现象严重；图( b ) 的分离效果最好，故最后采用该程序进行分析检测。 c p l a c k e a b u r m a n 设计法筛选显著因素 本试验选用实验次数n = 1 2 的实验设计，对影响固相微萃取萃取条件的8 个因素进 行考察，分别是：x l - 萃取温度( ) 、x 2 萃取时间( m i n ) 、x 3 一基体中的无机盐( g ) 、x 4 样 品体积( m l ) 、x s 一搅拌( r m i n ) 、x 6 p h 值、x 7 一样品瓶体积( m l ) 、x 8 解吸时间( m i n ) 。响应 值为峰面积( 。实验设计