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青岛科技人学研究生学位论文 富集方法 在毛细管电泳电化学检测中的应用研究 摘要 毛细管电泳是近年来发展最快的高效分离技术之一。本论文旨在将样品在线富 集方法应用于毛细管电泳检测中，以提高其检测灵敏度。 本文前言中，首先简单介绍了毛细管电泳的基本原理及其进展情况，然后分 析了导致毛细管电泳检测灵敏度差的主要原因并讨论了相应解决方法。详细介绍了 场放大样品堆积、等速电泳和瞬间等速电泳、乙腈降电导法等在线样品富集方法的 分离原理、影响富集因素及应用进展。最后介绍了多维电泳分离技术，其分辨率 和峰容量均明显高于一维电泳。 在实验部分，集成毛细管区带电泳和环糊精修饰的胶束毛细管电泳，发展了 一种可同时提高电泳分辨率和检测灵敏度的样品富集及分离方法。采用阳离子选 择性耗尽进样瞬问等速电泳双重富集的毛细管区带电泳法作为第一维，从中流出 的组分在环糊精修饰的胶束毛细管电泳构建的第二维得到进一步分离。相对传统 电动进样方法，该方法的检测灵敏度提升了1 40 0 0 - 3 50 0 0 倍；检测范围在0 0 3 g l - o 1 烬l 之间；理论塔板数在1 0 30 0 0 1 8 40 0 0 之间。该方法已成功应用于 医院废水中痕量心血管药物的分析，结果令人满意。 联合在柱电化学检测方法和由一根中间带微孔的毛细管构建的二维毛细管 电泳，提出一种测定大鼠血样中b 受体阻滞剂的新方法。血样先在第一维经毛细 管区带电泳纯化，然后目标区带在流体力学作用下转移至第二维，最后纯化的样 品经胶束毛细管电泳分离，并由电化学检测器在柱检测。在最优检测条件下，峰 高、峰面积和迁移时间1 0 次平行测定的相对标准偏差分别为2 1 4 3 、1 5 3 9 、 o 7 1 8 。本方法已成功应用于大鼠血样中p 受体阻滞剂的检测，这是使用基于 富集方法在毛细管屯泳电化学检测中的应用研究 一根带有微孔的毛细管的2 d c e 和在柱电化学检测对血样进行管内纯化和分离 以及药物动力学的研究的首次报道。 采用2 氨基3 羟基吡啶辣根过氧化物酶h 2 0 2 毛细管电泳电化学新体系，联 合一根中间带微孔的毛细管构建了用于甲胎蛋白分析的毛细管电泳电化学酶联 免疫分析平台。实验采用非竞争性免疫模式，在最佳实验条件下，测定甲胎蛋白 的线性范围为o 5 9 0n g m l ，检测限( l o d ) 为0 3 2n g m l 。该方法与e l i s a 法 检测a f p 的结果致。 关键词：毛细管电泳在线富集 电化学检测 甲胎蛋白p 受体阻滞剂 青岛科技人学研究生学位论文 a p p l i c a t i o nst u d y o np r e c o n c e n t r a t i o n i nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t h e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n a bs t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i so n eo ft h ef a s t e s td e v e l o p i n gs e p a r a t i o n t e c h n o l o g i e si nr e c e n ty e a r s ，b u ti th a si t sd i s a d v a n t a g e sd u et oi t ss m a l li n n e rd i a m e t e r , s u c ha sp o o rd e t e c t i o ns e n s i t i v i t y c ei n c o r p o r a t i n go n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o nm e t h o d s h a sb e e nd e v e l o p e df o ri m p r o v i n gt h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y t h em a i nc o n t e n to ft h i s d i s s e r t a t i o na r ea sf o l l o w s ： 1 t h eb a s i ct h e o r ya n dr e c e n tp r o g r e s so fc ew a si n t r o d u c e da tf i r s t ，t h e nt h e r e a s o n sf o rp o o rd e t e c t i o ns e n s i t i v i t ya n dt h e i rc o r r e s p o n d i n gs o l u t i o nm e t h o d sw e r e d i s c u s s e d o n em e t h o dw a si n t r o d u c i n go n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o n ；t h eo t h e ro n ew a s u s i n gd e t e c t o r sw i t hh i g hs e n s i t i v i t ys u c ha se l e t r o c h e m i c a ld e t e c t o r t h es e p a r a t i o n m e c h a n i s m ，a f f e c t i n gf a c t o r sa n da p p l i c a t i o np r o g r e s s o fo n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o n m e t h o d s i n c l u d i n gf i e l d a m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ，i s o t a c h o p h o r e s i s e t c w e r e i n v e s t i g a t e di nd e t a i l s f i n a l l y , m u l t i - d i m e n s i o n a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r s i sw a sb r i e f l y i n t r o d u c e d ，w h i c hh a sm u c hh i g h e rr e s o l v i n gp o w e ra n dp e a kc a p a c i t yt h a nt h e o n e d i m e n s i o n a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa l o n e 2 an o v e lp r e c o n c e n t r a t i o n s e p a r a t i o na p p r o a c h ，w h i c ho n l i n ec o m b i n e d c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) w i t hc y c l o d e x t r i n ( c d ) m o d i f i e dm i c e l l a r 富集方法在毛细管电泳电化学检测中的应川研究 e l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) ，w a sd e v e l o p e df o rs i m u l t a n e o u s e n h a n c i n gr e s o l v i n gp o w e ra n dd e t e c t i o ns e n s i t i v i t y c z e w i t hc a t i o n - s e l e c t i v e e x h a u s t i v ei n j e c t i o n ( c s e i ) a n dt r a n s i e n ti s o t a c h o p h o r e s i s ( t i t p ) p r e c o n c e n t r a t i o nw a s u s e da st h ef i r s td i m e n s i o n f r o mw h i c ht h ee f f l u e n tf r a c t i o n sw e r ef u r t h e ra n a l y z e db y c dm o d i f i e dm e k ca c t i n ga st h es e c o n dd i m e n s i o n a st h ek e yt os u c c e s s f u l i n t e g r a t i o n o fc z ew i t hm e k c ，an e wi n t e r f a c ew a sd e s i g n e da n d e l e c t r o a c c u m u l a t i o ns t r a t e g yw a se m p l o y e dt oa v o i da n a l y t eb a n dd i f f u s i o na tt h e i n t e r f a c e u pt o 140 0 0 - 350 0 0f o l di m p r o v e m e n ti ns e n s i t i v i t yw a so b t a i n e d c o m p a r i n gt oc o n v e n t i o n a le l e c t r o k i n e t i ci n j e c t i o nm e t h o d t h el i m i t so fd e t e c t i o n w e r ei nt h er a n g eo f0 0 3 - 0 1 t g lw h i l et h en u m b e r so ft h e o r e t i c a lp l a t e sw e r ei nt h e r a n g eo f10 30 0 0 18 40 0 0 t h i sm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e d t ot h ea n a l y s i s o ft r a c ec a t i o n i cc a r d i o v a s c u l a rd r u g si nw a s t e w a t e r 3 an o v e lm e t h o dt od e t e c t1 3 - a n t a g o n i s t si nr a tb l o o dw a sd e v e l o p e db y c o m b i n i n gh e a r t - c u t t i n gt w o - d i m e n s i o n a l ( 2 d ) c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i na s i n g l ec a p i l l a r yw i t ho n c o l u m ne l e c t r o c h e m i c a l ( e c ) d e t e c t i o n t h eb l o o ds a m p l ew a s p u r i f i e di nf i r s td i m e n s i o nb ，yc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) t h e no n l ya d e s i r a b l ef r a c t i o no ft h ef i r s td i m e n s i o ns e p a r a t i o nw a st r a n s f e r r e di n t ot h es e c o n d d i m e n s i o no ft h ec a p i l l a r yb yp r e s s u r e f i n a l l y ，t h ep u r i f i e ds a m p l ew a ss e p a r a t e db y m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) a f t e ro p t i m i z i n g t h e a n a l y t i c a lc o n d i t i o n s ，t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n so fp e a kh e i g h t ，p e a ka r e aa n d m i g r a t i o nt i m ew e r e2 1 - - - 4 3 ，1 5 - 3 9 a n do 7 1 8 ( n = l o ) ，r e s p e c t i v e l y t h i s m e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e r m i n e1 3 - a n t a g o n i s t si np o s t d o s i n gr a t b l o o ds a m p l e t h ep h a r m a c o k i n e t i cs t u d yd e m o n s t r a t e dt h a tt h ep r o p o s e dh e a r t - c u t t i n g 2 d - c ew i t ho n c o l u m ne cd e t e c t i o nw a sc o n v e n i e n t ，s e n s i t i v ea n dw o u l db e c o m ea n a t t r a c t i v e l ya l t e r n a t i v em e t h o df o ro n l i n es a m p l ec l e a n u pa n ds e p a r a t i o ni nc o m p l e x s a m p l e s 4 an e we l e c t r o c h e m i c a l e n z y m e - l i n k e di m m u n o a s s a y s y s t e m o f 2 - a m i n o p y r i d i n e - 3 一h y d r o x y l h 2 0 2 一h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s eh a sb e e nd e v e l o p e d a h p 青岛科技大学研究生学位论文 w a so x i d i z e d 、i mh 2 0 2c a t a l y z e db yh r p , a n dt h er e s u l t i n ge l e c t r o a c t i v ep r o d u c t p r o d u c e das e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a ls i g n a la tp o t e n t i a lo f - 0 3 2v ( v s s c e ) i n b r i t t o n r o b i n s o nb u f f e rs o l u t i o n t h ep r o c e s so ft h ee n z y m e c a t a l y z e dr e a c t i o na n d t h ee l e c t r o - r e d u c t i o no ft h ep r o d u c th a v eb e e ni n v e s t i g a t e db yc a p i l l a r ye l e t r o p h o r s i s i nd e t a i l s t h el i n e a rr a n g ef o rd e t e c t i o no fa f e t o p r o t e i ni nh u m a ns e r u mr a n g i n gf r o m 0 5t o9 0n g m l 谢mad e t e c t i o nl i m i to fo 3 2n g m l ，w h i c hw a sm u c hl o w e rt h a nt h a t o ft r a d i t i o n a l s p e c t r o p h o t o m e t r i ce n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) m e t h o d a h p h 2 0 2 - h r pe n z y m e - l i n k e di m m u n o a s s a ys h o w e dap r o m i s i n ga l t e r n a t i v e a p p r o a c hi nt h ed e t e c t i o no f a f pi nc l i n i c a ld i a g n o s i s k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o f e s i s ；o n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o n ； e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ；a - f e t o p r o t e i n ；i - a n t a g o n i s t i i i 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名： 型蝴丝 签字同期：q 印年f 月心r 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用使用 学位论文或与陔论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大 学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密o ，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 本人签名 导师签字 ：张明哲 焦 签字同期：w 夕年月肜日 签字同期：夕年月j 同 身 青岛科技人学研究生学位论文 第一章绪论 l 毛细管电泳的基本原理及其进展 1 1 毛细管电泳的兴起与发展 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是近年来发展最快的高效分离技 术之一。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 等1 1 l 用高电压在7 5l a m 内径的毛细管内进行物质的分 离，创立了现代毛细管电泳。1 9 8 4 年t e a a b e 等i 2 j 发展了毛细管胶束电动包潜 ( m e k c ) 。1 9 8 7 年h j e r t e n l 3 1 建立了毛细管等电聚焦( c l e f ) ，c o h e n 和k a r g e r t 4 提出了毛细管凝胶电泳( c g e ) 。1 9 8 8 1 9 8 9 年出现了第一批c e 商矗 i 仪器，1 9 8 9 年第一届国际毛细管电泳会议召丌，标志着门新的分析技术和分支学科的产 生。 短短的几年内，由于c e 配合了以生物工程为代表的生命科学各领域对生物 大分子( 蛋白质、肽、d n a 等) 分离分析的要求，得到了迅速发展，正逐步成为 生命科学及其它学科实验室中一种常用的分析手段。 1 2 毛细管电泳仪器及基本原理 c e 是以高压电场中的电动作用为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中 各组成之间淌度的差异，而实现分离的一类液相分离技术。 毛细管电泳的仪器装置如图1 1 所示，整个装置包括高压电源、毛细管、检 测器和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液池。常用的毛细管是用熔融 石英材料做成的，外壁涂一层聚酞亚胺保护层，具有化学和电学惰性、紫外可见 光透光性、柔韧性好、材料便宜等特点。常用的毛细管长度在1 0 1 0 0c i l l ，内径 在1 0 - - - 1 0 0l a m t 5 1 。 富集方法在毛细管电泳i u 化学检测中的麻州研究 少 篇簟 图i i 毛细管、e 泳仅装置示意图1 1 j f i g u r e1 _ is c h e m a t i cd i a g r a mo f c ei n s t r u m e n t a t i o n c e 主耍分离模j 包括毛细钳区带 b 滹( c z e ) 、毛绷管凝胶 u 泳( c g e ) 、毛 细管等电聚焦( c l e f ) 、毛细管等速电泳( c i t p ) 、胶求f b 动毛细管巴* ( m e k c ) 、 毛细管电色嘴( c e c ) 、亲耵j 毛细箭电泳和二悱水牛h 毛细舒电泳等，州于表1 - l 。 在这衅电泳分离模式中，c z e 和m e k c 是最常川的两种分离模式。存f b 解质 溶液叶| ，带电粒了在电场作用r ，以不同的速度向其所带电荷； | | 反方向迁移的现 象称为电泳。c e 所用的右英毛细管在p h 3 时，其内表l 自】带负电，和溶液接触 形成一积电层。在高电压作用f 。双电层中扩散层的水合阳离了引起溶液在毛细 管内整体阳负极流动，形成电滂流。带电椅予在毛细管内电解质溶液中的迁移速 度等十电泳和电渗流( e o f )者速度的矢量和。带惟电荷粒r 域兜流出：中性 粒子的电泳速度为“零”故其迁移速度等丁j ：e o f 速度；带负电荷粒予运动方 向与e o f 相反，凶e o f 速度一般大0 一电泳速度，故它将在中性粒子之后流出； 各种粒子田迁移速度不同而实现分析，这就是毛细管区带电泳( c a p i l l a r 3 , rz o n e d e e o p h o r e s i s ，c z e ) 的分离原理。c z e 的迁移时日jt 可用下式表示： 扛尚 m ， ( 如+ 心) r 7 式( 1 - 1 ) 中，为电泳淌度雎。为电渗淌度，v 为外加电压，为毛细管总长度， 青岛科技大学研究生学位论文 单根毛细管 1 空管( 臼由溶液) 毛细管区带电泳 毛细管等速电泳 毛细管等点聚焦 胶求电动毛细管色谱 微乳液毛细管电动色谱 高分子离子交换毛细管 电动电色谱 开管毛细管电色谱 亲和毛细管电泳 非胶毛细管电泳 2 填充管 毛细管凝胶电泳 聚丙烯酰胺毛细管凝胶 电泳 琼脂糖毛细管凝胶电泳 填充毛细管电色谱 阵列毛细管电泳 c z e c l t p c l e f m e c c m e e k c p i c e c o t c e c a c e n g c e 毛细管和电极槽滞有相同的缓冲液 使h j 西种不同的c z e 缓冲液 管内装p h 梯度介质，相当丁p h 梯皮c z e 枉c z e 缓冲液中加入一种或多种胶水 台c z e 缓冲液加入水包汕微乳液 在c z e 缓冲液中加入可微观分相的高分子离 子 使删同定相涂层毛细管，分止、反相与离子交 换等 在c z e 缓冲液或管内加入和作“j 试剂 在c z e 缓冲液中加入由高分f 构成筛选网络 c g e 管内填充凝胶介质，- uc z e 缓冲液 p a c g e 管内填充聚内烯酰胺凝胶 a g a r - c g e p c c e c c a e 管内填充琼脂糖凝胶 毛细管内填充色谱填料，分止、反相与离子交 换等 利用一根以上的毛细管进行c e 操作 芯片毛细管电泳 c c e 利h j 刻制在载玻片等上的毛细通道进行电泳 分离度r 为 脚朋7 鸭， 硼1 o 5 m 3 ， 式中，2 分别为两种溶质的电泳淌度， 3 印为两种溶质的平均电泳淌度。 富集方法在毛细管电泳电化学检测中的戍朋研究 从式( 1 2 ) 可看出，c e 分离效率高，主要有三个因素决定：一是c e 毛细管 的表面积体积比大，散热性能好，可以施加高电压；二是c e 用电渗流作为推动 流体前进的驱动力，整个流体呈扁平型的塞式流，使溶质区带在毛细管内不易扩 散，而h p l c 用压力驱动使柱中流体呈抛物线型，导致溶质区带扩散，使柱效下 降。三是根据微通道层流效应，样品在微通道内轴向扩散小。 1 2 1 胶束毛细管电泳( m e k c 或m e c c ) m e k c 又称为胶束电动毛细管色谱或胶束毛细管电动色谱。1 9 8 4 年，同本京 都大学t e r a b e e 6 l 等人将超过临界胶束束浓度的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠 ( s d s ) 弓l 入c e 缓冲液，形成由阴离予胶束构成的“准固定相”，成功地分离了中 性酚类化合物，提出了胶束毛细管电泳( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y ，m e k c ) 的概念。这是c e 发展历史上一次划时代的变革，这种 模式把电泳技术与色谱技术相结合，其突出特点是将只能分离离子型化合物的电 泳变成不仅可分离离子型化合物，而且也能分离中性化合物的电泳，从而大大展 宽了电泳的应用范围。 1 2 1 1m e k c 分离原理 m e k c 体系含有水相和胶束相，分析物的分离主要是依赖其在两相问的分 配。表面活性剂是一端为亲水性、一端为疏水性的物质。当它们在水中的浓度达 到其临界胶束浓度时，疏水性的一端聚在一起朝向里，避丌亲水性的缓冲溶液， 亲水端朝向缓冲溶液，形成胶束。表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、两性 离子型和中性分子型等不同种类。原则上凡是能在水或极性有机溶剂中形成胶束 的物质，都可以用于m e k c ，但实际工作中，由于受毛细管电泳分离效率及其检 测等方面的限制，可供选择的表面活性剂种类并不多。选用表面活性剂时应考虑 以下要点：易溶于水中；经济易得：紫外吸收弱或无；能形成稳定的胶 束：不与样品发生有碍分离的作用；中性样品需选择离子型表面活性剂，而 离子型样品可以选择所有种类的表面活性剂。 m e k c 的重要特征之一是毛细管中的运行缓冲组成的变化，可以改变分析物的迁 移行为和选择性。由于胶束的化学结构影响着分析物和胶束的相互作用从而影响 整个分析过程，所以，准固定相在分析物的分离过程中起着关键的作用。水相中 4 青岛科技大学研究生学位论文 有机改性剂的种类和含量对物质的分离具有明显的影响。此外，运行缓冲的p h 值可以通过改变分析物的离解程度和电荷从而影响分析物和胶束的相互作用，而 且可以改变e o f 的大小，进而影响胶束的迁移速率甚至迁移方向( 当p h p l 时，表面 活性剂呈阴离子型；当p h p 2 ，7 = p 一p 2 ) ，在毛细 管中进入一段长为，的样品，当毛细管两端施加电压后，样品和缓冲区带的场强 关系为： e l = p _ _ z e 2 = r e 2 ( 1 - 1 3 ) p 2 即样品区带的场强是缓冲区带的y 倍。由于离子迁移速度与场强成正比，在 样品区带中离子迁移速度快，而在流动相区带内迁移慢，当样品离子通过样品 流动相界面时，形成一个窄的区带。理想情况下堆积区带的长度为l y 。f a s s 幂i j 用了样品溶液与电泳缓冲液之问的电导率差，当快速迁移的离子从低电导率的样 品区进入高电导率的缓冲液区时，迁移速度剧减，从而在两者的界面处实现堆积。 因此，完成堆积实验最简单的方法就是将样品溶解在水或低电导的缓冲溶液中 富集方法在毛细管电泳电化学检测中的应用研究 ( 如分析用的缓冲溶液浓度的1 1 0 0 - 一1 1 0 0 0 ) 。如果样品的电导与缓冲溶液的相 同，可以在进样前先引入一小段水塞来产生堆积效果。另一种堆积的方法是将毛 细管的一半充满样品，缓冲溶液由电渗流逆向驱动，样品就堆积在毛细管端的小 区带中。在水和缓冲溶液界面上的电渗流压力差会限制这种方法的有效使用，这 个压力差会产生一个抛物面层流使区带扩张。当缓冲溶液的浓度约是样品浓度十 倍并且进样长度是扩散引起的峰宽的十倍时，才能获得最佳的堆积效果。 c h i e n 年i i b u r g i t 2 8 l 与a l b i n 2 9 1 都对f a s s 技术作过详细的讨论，b u r g i 和c h i e n 系统 研究了样品堆积现象，建立了一个优化样品区和管内缓冲液的浓度的简单模型， 并讨论了f a s s 中提高堆积效率的限制。f a s s 的限制就在于样品溶液的离子强度 必须远远低于背景缓冲液的离子强度，因此对于含有大量无机盐的生物样品难以 直接应用。场放大进样( f a i ) 时还要考虑到样品区带产生的热量。在堆积的条 件下，大部分的电脏降都j j l j 在了堆积的区带上，会使温度升高。实际上，即使住 毛细管恒温的条件下，样品区带的温度达到9 0 的情况已有报道【3 0 】。这一点在分 析热敏感样品时需要特别注意。实际上，当进样长度增加时，样品和缓冲区带内 的电渗压力差异也增加，引起的层流展宽会使柱效下降，降低浓缩倍数。此外， 进样长度增加还会引起分离度下降。因此，进样体积不能太大，灵敏度增加有限。 但是，因其操作简便，在多种样品分析中得到了广泛的应用。目前，f a s s 己 应用到d n a 片断的分析、尿液中药物的分析和违禁药物的分析等。富集倍数高达 1 0 0 0 倍的分析已有报道。非水毛细管电泳及非水手性分离体系中也实现了f a s s 技术。s h i h a b i 等人【3 lj 利用有机溶剂的场放大富集作用对血浆中的碱性药物进行在 线浓缩，获得5 0 - - 7 0 倍的富集倍数。 2 2 等速电泳( i t p ) 和瞬间等速电泳( t l t p ) i t p 步骤存在不连续缓冲溶液中，这种方法尤其适合于高盐样品中被分析物 的富集。在i t p 中，样品区带央在先导电解质( 含高淌度离子) 和终止电解质( 含 低淌度离子) 之间。样品的区带若在高压下连续迁移，经过一段时间达到完全分 离，得到一系列央在先导电解质和终止电解质之问的区带迭加。每一条区带只含 一种样品离子( 不考虑样品中存在具有相同有效迁移率的多种离子) 。第一条样 品区带含有具有最大有效迁移率的样品离子，而最后一条样品区带含有效迁移率 1 2 青岛科技人学研究生学位论文 最小的离子。至此，各样品组分不会进一步分离，系统进入一个恒稳态，可以认 为达到了一个等速分离系统。由于通道中电流密度是相同的，在恒稳态时所有区 带必须具有相同的移动速度，这个速度是由先导离子决定的。对区带厶a ，b ，c 和 兀 圪= 玖= = r c = 圩( 1 1 4 ) ，打厶既= 删毋= ，竹口= m c e c = 朋r e 7 ( 1 1 5 ) 式( 1 1 4 ) 称为“等速条件”，是等速电泳分离的特性。 由于各种离子按有效辽移率递减排列，电场强度向后方递增。棚邻两个特 有着电位梯度的增加，导致了等速电泳系统一个非常重要的特性，即区带界m f 自 身校正 效应。当一区带达到恒稳态时，界面不再变宽。这和区带电泳相反，后 者由于吸附和扩散，峰形会变宽。这个效应很容易理解，若一个离子落入后i f i j 具 有高电场强度的区带中，它将获得较高的移动速度，直至它赶上自身的区带，要 是它扩散进入f j i 一条区带，那里的电场强度较低，它的电泳速度将下降，重新退 回到自身的区带中。 等速电泳通常存在两种模式，单管等速电泳和双管等速电泳系统。单管等速 电泳通常指瞬时等速电泳，双管等速电泳用两根毛细管，样品在第一根毛细管1 1 1 进行等速电泳堆积，再进入第二根毛细管进行区带电泳分离【3 2 3 ”。利用这种方法， 大于整个毛细管总体积的样品可以堆积到纳升的体积，分离尿液中的手性化合物 取得了m m o l l 量级的检出限。等速电泳技术已广泛应用于带电荷小分子或蛋白 质的预富集。对于含有大量无机赫的生物、环境样品尤其适用。由于被分析物离 子的电泳速度受电荷、溶液p h 值和浓度、对离子( c o u n t e r - i o n ) 等因素的影响， 因此使用时要仔细考虑这些因素的作用。另外，为获得最佳的堆积效果，要慎重 选择先导离子和终止离子。 2 2 1 瞬间等速电泳( t r a n s i e n ti s o t a c h p h o r e s i s ) t i t p 不仅是一种基本的电泳方法，也是一种有效的在线富集方法；它不仅可 用于低盐或无盐样品的富集，还可用于高盐样品的富集【3 4 1 ，在生物化学和生物医 药等诸多领域得到了广泛应用【3 5 1 。当特定待测物的迁移率介于先导离子和终止离 富集方法在毛细管电泳屯化学检测中的应用研究 子的迁移率之间时，样品就会自动发生富集。t i t p 富集的机制为移动界面系统 ( m o v i n gb o u n d a r ys y s t e m ，m b s ) 的机理。瞬时等速电泳可以在同一毛细管中使 等速电泳堆积和毛细管区带电泳分离相结合，即在适当条件下，样品分离前先用 瞬时等速电泳法堆积，该方法对大分子和小分子都适用【3 6 ，3 7 1 。如果样品溶液是 高离子强度体系，在等速电泳中，该溶液基体离子本身就可以用作先导离子，这 是瞬间等速电泳的另外一种模型，称为自诱导堆积模型【3 8 1 。在这种情况下，缓冲 液离子的淌度应高于被分析物离子的淌度。s h i m 等【3 9 】将t i t p 与p h 联接法( p h j u n c t i o n ) 相结合，使富集效果在原有基础上又提高了8 6 。 2 3 乙腈降电导法 乙腈降电导法首先由s h i h a b i 等【4 0 j 建立。该方法在样品中加入乙腈，这样可以 使样品富集，特别是在有盐存在的情况下更是如此。虽然样品中存在盐，但是加 入的乙腈可以降低溶液的电导率，抵消高浓度盐对i t p 和f a s i 富集作用的不良影 响，从而使富集作用能够顺利进行。s h i h a b i 等【4 1 】仅用3 个步骤( 缓冲液稀释、盐和 乙腈加入) 就在c e 中完成了样品中人胰岛素的浓缩。缓冲液稀释可以使样品产生 一定的富集，高盐和乙腈处理则可以使样品产生近2 0 倍的富集。s h i h a b i 在实验中 通过h p l c 和免疫活性分析检验发现，加入6 6 的乙腈不仅不会使人胰岛素变性或 沉淀，还能使进样量达到毛细管体积的1 0 - - 2 0 的样品得到很好地压缩。s h i h a b i 等指出，阴离子化合物最好在高离子强度的无机缓冲液中富集，如硼酸盐和磷酸 盐，而阳离子化合物则最好是在氨和两性离子缓冲液中富集。该方法首先被用于 高盐多肽富集分离，后又用于加盐的胰岛素、弱阳离子化合物和黄嘌呤富集；最 近，又用于血管紧张素转换酶和血管紧张素i i 受体阴滞剂富集。此方法还用于短 链有机酸富集【4 2 1 ，提高荧光检测的灵敏度 4 引。 2 4 样品预富集技术中的定量问题【删 毛细管电泳进样量小、进样重现性相对较差，尤其对于痕量组分的分析，不 易准确定量。当采用预浓缩富集技术时，如电堆集富集中，由于样品溶液中离子 1 4 青岛科技大学研究生学位论文 强度的不同，导致不同的样品溶液中各离子富集率的不同，在场放大进样中，还 存在着严重的样品歧视，给样品中各组分的定量带来很大的困难。与色谱及其它 分析方法一样，目前用于毛细管电泳定量的方法有：外标法、内标法、双内标法、 内标标准曲线法、标准加入法、内部归一化法等。对于痕量组分的测定，在样品 富集过程中，一般采用内标标准曲线法、双内标法、标准加入法等进行定量。 3 间接紫外检测和电化学检测 3 1 间接紫外检测 紫外光度检测是c e 中最常用的检测方法。然而很多分析物( 如无机阴离子、 脂肪酸( 碱) 、糖等) 都没有足够的紫外吸收，因此采用i 日j 接检测是一种相对简单 而价廉的普适性的检测方法【4 5 】。它不要求样品具有能被检测的特征，如光的吸收、 发射、淬灭及电化学活性等。在c e 间接检测法中，信号不是来自样品本身，而是 来自背景电解质( b a c k g r o u n de l e c t r o l y t e ，b g e ) 中的探针离子( p r o b ei o n s ) ，探针 离子被分析物取代产生负的信号峰，其原理如f i g 1 3 所示。当样品区带流经检测 窗口之前时，b g e 能够产生一个稳定的检测信号( f i g 1 3 a ) ；当样品区带迁移至 窗i s i 时，因置换了部分探针组分，导致背景信号下降( f i g 1 3 b ) ；当区带完全通 过检测窗时，检测器的响应又回到原来的背景信号位置( f i g 1 3 c ) 。大多数的c e 检测方法可用间接检测的模式，只需调整缓冲溶液的组成而无需对仪器装置作任 何改动。因为紫外检测是c e 最为普及的检测技术，且具有紫外吸收的背景电解质 试剂较多，所以c e 间接紫外检测方法具有实用价值。 a 军罩警司 葱0 0 妥0 - 巫0 杰0 0 0 基00 逐0 0 誊二?：霪r b f 了巴= 习a e a n t a r 篷翟夏墨蕊跃皇q ! q 墨金生滥鑫量墨! 翌星 貔_ c 曩b 司1i 匹銎互墨蕊氐露 图1 3 间接紫外检测的原理示意图 f i g 1 - 3p r i n c i p l eo fi n d i r e c td e t e c t i o n ( a n a l y t ei o n s ，op r o b ei o n s ) 1 5 富集方法在毛细管电泳电化学检测中的应用研究 3 1 1 间接紫外检测的探针 探针的选择需要考虑其淌度、光谱性质和物理化学性质f 4 6 j 。探针的淌度和浓 度影响分析物的峰形和分离效率；其最大吸收波长要同仪器提供的检测波长相匹 配，而探针在检测波长处的吸光度会影响到方法的灵敏度。 为了获得最好的峰形、分离效率和检出限，探针的淌度和浓度的选择应遵从 下列规律：( 1 ) 探针的电泳淌度应当同分析物的淌度相匹配；( 2 ) 迁移区带中分 析物的浓度与背景电解质中探针的浓度差别应尽可能的大，也就是背景电解质的 浓度尽可能大而样品的进样量要尽可能的小。 问接检测法中的浓度检出限c l o d 可表示为： c 锄2g 月口= c p n b l i r a = n m r e l ( 1 - 1 6 ) 式中g 为产生信号相应的探针组分浓度；r 为转换率( 被lm o l l 分析物置换的 探针组分的物质的量) ；d r 为背景信号与噪音之比( s n ) ；n a l 为基线噪音标准偏 差的3 倍( 为表述统计规律和置信度) ；a 为探针组分的吸光度( 即背景信号) ；e 为探针组分的摩尔吸光系数；，为检测池的光程。可见，降低c ，增加所，可以 降低检出限。但这些参数不是孤立的，而是相互联系的，降低g 时，4 亦同时降 低。因此，提高检测灵敏度的最佳方法是通过选择高e 值的背景电解质来增加d ， 此时，c p 也可以维持在一个较低的浓度，进而减小基线噪声。转换率r 主要受背 景溶液中非探针组分的影响，它与样品组分对探针组分的竞争会导致尺的减小， 所以应尽量选择不含有非探针组分的背景缓冲液。 探针的光谱性质应考虑以下几方面：( a ) 问接紫外检测的基线噪声同相同波长 下直接紫外检测的基线噪声相比，如果间接紫外检测的基线噪音明显大，应该是 背景吸收过高或探针同毛细管壁相互作用( 称为化学噪声) 造成。( b ) 只要避免了 电解质中不需要的共存离子，转换率就可以通过探针和分析物的结合来测定。( c ) 尽管从公式( 1 1 6 ) 可知，应当选择尽可能大的检测光程，但有效光程一般不会 改变太多。除非选用大内径的毛细管，但内径大的毛细管会使热效应增大。可以 选用扩展光程池，但大的光程会使背景吸收较大，背景电解质应当仔细选择以适 应这种大吸收情况。 1 6 青岛科技大学研究生学付论文 3 1 2 间接紫外检测缓冲体系 并不是所有的缓冲液都可用于间接检测，电解质中应当避免共离子的加入，