（环境科学专业论文）五氯酚对蛋白核小球藻的毒性效应研究.pdf

第一 章绪论 第一章绪论 五氯酚 ( p c p ) 是氯代烃类杀虫剂和杀真菌剂， 最初被用于 木材防腐和防虫 蛀。 由于其作用机理是将生物代谢过程中的氧化磷酸化解偶联， 使得它具有广谱 生物杀伤性， 在木材防腐之外， 亦被广泛用作落叶剂、 除草剂和生物杀伤剂。 在 获得广泛应用的同时， 五氯酚所造成的环境问 题也受到人们的高度重视。 美国环 境保护局自 七十年代已 将其纳入优先污染物名单。 对五氯酚毒性和降解性及其所 污染环境的生物修复的研究， 一直是国际环境学、 医学等多学科研究的热点之一。 作为生态系统的初级生产者，藻类在水生和土壤生态系统中起着重要作用， 其种类多样性和初级生产量直接影响着生态系统的结构和功能。 近年来， 随着对 有毒物质所引起的生态系统整体效应关注程度的日 益增加， 藻类作为生态毒理学 的研究对象， 受到国内外学者的广泛重视。 开展有毒物质对藻类的生态毒理学研 究，了解毒物对单种藻类和藻类群落的毒性效应， 并进一步认识其对生态系统结 构和功能的整体影响， 为生态风险评价提供科学依据， 具有重大的理论和实际意 义。 1 . 1五氯酚毒性作用研究进展 五氯酚对哺乳动物的毒性作用 急性毒性 川 p c p通过食物途径呈中等毒性，不同类型工业制剂对鼠的 l d 5 。 为 2 7 - 2 1 1 m g / k g( 大鼠 ) 、 7 41 3 0 m g / k g( 小鼠 ) ， 对 兔的l d 5 。 为7 0 - 1 0 0 m g / k g l 2 1( 暴 露时间均未给出) 。 p c p 通过呼吸 途径也呈中 等 毒性， 据报道 对大鼠 ( r a t ) 的l c s 。 为0 .22 . 1 m 创 l ( 暴露时间 未给出尹 i ; 通过该 途 径的l d 5 。 值对大鼠 、 小鼠 分别 为2 2 5 . 3 5 5 m g / k g ( 暴露时间同 样未给出) 12 ) 。 另一 个实 验得出 的 对大鼠 的l d 5 。 值为 1 1 . 7 m g / k g ( 暴露时间为2 8 - 4 4分钟， 假定呼吸速率为8 0 m v m i n ) 1 1 1 . 经皮肤途径，p c p呈中等毒性。据报道，p c p对大鼠和兔经皮肤的l d 5 。 值 按配 方不 同， 分 别 为9 63 3 0 m g / k g 和4 0 - 1 0 0 0 m g /k g . 第一章绪论 皮下注射可能是最危险的暴露途径，有报道 p c p中毒的病例中与之有关的 超过5 0 例，其中3 0 例死亡p l p c p 对受 试动物的 粘 膜、 皮 肤和眼 睛都 有刺激作用 14 1 。 人手浸入0 .4 % 的p c p 溶液中1 0 分钟， 会造成疼痛和发炎 14 1 高度急性p c p 暴露会引起人体温升高，大量出汗，脱水，食欲不振，呕吐， 体重减轻，以 及神经学效应如: 震颤、 动作不协调、 腿疼、 肌肉 痉挛和昏 迷p .2 1 但其中一些症状可能是由p c p 中的杂质 造成的，而不是p c p 本身的作用12 ) 慢性毒性 许多对 p c p的研究所用的都是纯度较低的工业制剂，所观察到的慢性效应 在很大 程度上取决于 其中二恶英等物质的 含量川 。 在一 个9 0 天的 大鼠 饲养实 验中， 3 0 m g / k g / d a y 的 剂量会 造成红血球和血色素 水平的降低，以及肝脏功能衰退， 甚至更低的剂量也会造成血液化学和酶含量异 常， 并伴随 肝 脏和肾 脏的 增 重 1 1 . 5 1 o p c p 对大鼠 的 抗体反 应也有一定的 抑制作用 16 1 。 近来研究发现， p c p 之所以 影响大鼠 肝脏功能， 部分原因在于它抑制了 酚一 磺基转移酶 ( p - s l 几 t ) 和酚一 葡萄糖醛酸转移酶 ( p - u g t )的活性1 . s 1 以 猪为实验对象的 研究发现， 提纯的p c p 引 起猪血清中的白 细胞、 y 一球蛋 白 和免疫球蛋白( i g g ) 含量升高， 说明p c p 对于 造血 和淋巴 系统具有毒性19 1 对人来说，最常见的对 p c p的暴露途径是在工作场所的呼吸。腹痛、胃部 不适、发烧、 呼吸加速，以 及眼睛、 皮肤和咽喉的刺痛， 可能源于此类暴露( 1 1 职业暴露于p c p ，导 致氯痊 疮的 发病率明 显 提高 ( 1 6 1 。 很高水平的 暴露会导 致肺 部循环系统障碍和心力衰蝎， 生 还者还可能 遭受永久性视觉和中枢神经损伤2 1 对生殖的影响 在交 配 前 和 哺 乳 期以3 0 m g p c p / k g /d a y 的 剂 量 喂 养6 2 天的 大鼠 体重 下降， 但繁 殖能 力 并 未 下 降 11 。 以5 0 m g / k g /d a y 的 剂量 喂 给工 业或 提 纯的p c p ， 在3 5 天实验期内 雄鼠的精子并未出 现畸形川 。 以 雌绵羊为实验对象， 从交配前5 周至 哺乳期结束， 按 1 m g / k g / d a y 的剂量 喂以 p c p ，发现其血清中的甲 状腺素 ( t 4 ) 浓度降低，甲 状腺滤泡尺寸显著增 大川 ; 以 相同的剂量对雄绵羊进行实验， 也发现了甲 状腺素浓度降低的现象， 并 伴随有阴囊变大， 输精管萎缩， 附辜精子减少等症状(1 2 1 。 进一步研究发现，甲 状 -一一一m - y 一鱼一一 - 腺素浓度的降低， 部分原因 在于p c p 抑制了 碘化甲 状腺原氨酸的 硫酸化( 1 3 1 。以 上证据说明p c p 对甲状腺具有毒害作用，长期接触可能影响生殖功能。 对有过职业暴露经历的女工的病历进行研究发现，女工血液中 p c p浓度与 内 分泌 和免 疫参 数的 变 化间 存在 着显 著的 相关性 ” 4 , 1 5 1 。 有学者认为， p c p对卜 丘脑和前下丘脑有强烈作用， 可导致卵巢和肾上腺轻度机能不全， 从而对怀孕造 成一定影响p 4 , 1 5 1 致畸效应 在 交配 前 和 哺乳 期以3 0 m g p c p / k g / d a y 的 剂 量 喂 养6 2 天的 大鼠 后代 表 现出 存活率和发育速率的降 低， 3 m g l k g / d a y则不产生 任何影响d i 。 母体剂量为 5 m g / k g / d a y( 工业 p c p ) 时 对胚胎或胎儿有毒害效应， 在妊娠的 6 - 1 5 . 8 - 1 1 或 1 2 - 1 5 天 喂以5 0 m g / k g / d a y 的 剂 量， 导 致回 吸 增 加、 肿胀、 输尿 管扩张 和 骨 骼异 常( 1 1 致突变效应 对大鼠的研究发现，p c p 被细胞色素p 4 5 0 酶代谢为亲电的活性产物后，会 很快与邻近的蛋白或非蛋白 疏基共价结合，实验中没有观察到 p c p及其代谢产 物与d n a 或血红蛋白 结合的 现 象 1 1 6 1 。 另 有 研究发 现， p c p 对小鼠 有轻 微的 致突 变效应【 s 1 一项对职业暴露工人染色体变异的研究表明， 姊妹染色单体互换几率没有增 加，但另一项研究确实发现了 增加的现象。对人的淋巴细胞进行的 p c p暴露培 养发现了 微弱的 致突变效应15 1 以上证据表明，对哺乳动物而言，p c p 是非致突变或弱致突变物。 致癌效应 有研究表明， 两种配方( d o w c i d e a n d p e n t a ) 的p c p 在剂量为1 7 - 1 8 m g l k g / d a y 时， 导致大鼠 和 小鼠 脾、 肝和肾 上 腺 癌的 发 病率增 加 15 1 。 这些现象在使用d o w c i d e 对小鼠 进行的第二次研究中 未获得重现(5 1 。 以 大鼠 为对象开展了 一项为期两年的 实 验， 食 物中p c p 含 量 为1 ,0 0 0 m g l k g , 暴 露一 年， 然 后 停 止 暴露， 发 现 雄鼠 恶 性间皮瘤和鼻癌发 病率增加， 雌鼠 则无类似现象1 1 7 1 。 有研究认为， p c p对小鼠 的肝癌起促进作用， 而不是启动作用， 这种促进作用与肝的氧化压力增大及肝细 胞的补偿性增殖有关( 1 8 , 1 9 1 。 近来研究发现， p c p的存在导致大鼠肝脏对氧的消 第一章绪论 耗 增 加， 降 低了 线 粒体 呼 吸 控制 率( 调 节比 率) 2 0 1; 并 发 现了d n a 氧 化损 伤的 标志物之一8 -经基一脱氧鸟昔 ( 8 - o h d g )生成的现象 1 9 1 有报道认为，职业性暴露于工业p c p与霍奇金病 ( 淋巴肉芽肿病) 、急性白 血病和软组织肉瘤之间可能存在着联系， 但是干扰因素如与其它物质的共暴露使 得难以对这些数据进行解释15 1 尚无令人信服的证据说明p c p对人产生致癌效应。 在人和哺乳动物体内的归趋 p c p 经消化道的吸收很快。 一般没有蓄积现象， 但确实发生蓄积时， 主要部 位是肝、肾、 血浆蛋白、 大 脑、 脾和脂肪1 1 3 1 . p c p 会很快从血液和组织中清除， 并以 原态或 共扼形态通过 尿 排泄出 去11 1 . p c p 在大鼠 体内的 半衰期为 1 5 小时， 在猴体内为7 8 小时， 在人体内 为3 0 - 5 0 小时i l l . 1 . 1 .z p c p 对水生生物的毒性作用 p c p对斜生 栅藻 ( s c e n e d e s m u s o b l i q u u s ) 的 毒性 较强， 其 i c s 0 ( 8天) 为 0 .0 8 6 m g / l 1 1 o p c p 对 浮 萍 的 叶 绿 体 活 性 和 过 氧 化 物 酶 的 活 性 也 有一 定 影 响 12 8 1 p c p对淡水无脊椎动物毒性较强。 对水蚤 ( d a p h n ia m a g n a ) 2 4小时l c s o 为0 .3 9 m g / l 2 ; 对 喇 咕8 天l c s 。 为5 3 m g / l ( p h = 7 .5 ) ， 并 且当p h 降 至6 .5 时， p c p 对其毒性增 加5 .9 倍12 2 1 。 对 轮虫的 研究发 现， p c p 的 存在使轮虫对食 物的需 求量更多2 3 1 。亚致死剂量的p c p暴露导致轮虫 游动速度增加，从而增加了与捕 食者遭遇的几率， 即p c p 降 低了 轮虫对环境的适应性2 4 1 对许多种类的鱼来说， p c p具有很强的毒性，报导的% 小时l c s 。 值分别 为: 大磷大 麻哈 鱼6” 叭， 虹 蹲鱼5 2 p 叭 ， 绦鱼2 0 5 v g / l , 绘鱼6 8 p g / l , 淡 蓝 色 大 太 阳 鱼3 2 p g / l 2 s 1 e 有研究发现，暴露于p c p导致结鱼染色体结构的损伤，观察到的现象有染 色单体断裂，偏离中心，呈环状，以 及非整倍构造。这表明p c p对水生生物有 一定的 致突变作用2 6 1 几种鱼类、无脊椎动物和藻类体内 的p c p浓度远高于环境浓度2 1 ，表明存 在生物积累现象。 1 . 1 .3 p c p 对其它生物的毒性作用 第一章绪论 p c p 对鸟类毒性很 低。 据报导 对日 本鹤鹑的5 天喂食l cs。 大于s l39m gi k g 1， 7 1 ， 对 绿 头 鸭 和 雄 的 急 性口 服l o ， 。 分 别 为3 s o m g/ k g 和s o 4 ill g/ k g l2 7 。 1 . 1 .4 p c p 毒性效应研究的发展趋势 综上所述， 对p c p 毒性的研究主要以动物 ( 尤其是哺乳动物)为研究对象， 着重于慢性和远期效应的 研究; 并且己 经由 简单的致死剂量或浓度等整体性指标 转向研究p c p的生理生化作用机理方面，己有多种分子生物学指标 ( 如p 一 u g t 等酶学 指标和lg g等免 疫学指 标等等) 被成功 应用于 研究p c p 的作 用机理，并 取得了一定成果。 第一章绪论 1 .2蛋白 核小球藻在生态毒理学中的应用 蛋白 核小 球藻c c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 是一 种普生性单细胞绿藻， 生 态分布 广泛， 生长速度快， 易于人工培养。 其结构简单、 对环境变化敏感的特点， 使得 其在环境毒理学等领域获得广泛应用。 表1 - 1 列出了一些采用小球藻属不同藻种进行毒理实验的农药种类。 表1 - 1一些采用小球藻属不同藻种进行毒理实验的农药 农药种类测试藻种来源 gniji，飞飞甘4戈j6咋了月了1 2131333333口3333 单甲眯 甲基对硫磷 杀草快 五氮酚 禾草丹 c h l o r s u f u r o n 克菌丹 二 硫化四甲 基秋兰姆 蛋白 核小 球藻c h l o re l l a p y r e n o i d o s a 蛋白 核小 球藻c h l o re l la p y re n o i d o s a 蛋白 核小 球藻c h lo re l la p y r e n o i d o s a 普 通小 球藻c h lo re l l a v u lg a r is 小球藻c h l o re l l a o v o l i s 蛋白 核小 球藻c h l o re ll a p y re n o i d o s a 小 球藻c h lo re l la s a c c h a ro p h i la 普 通小 球藻c .v u lg a r is c c a p 2 1 1 / 1 1 6 普通小 球藻c v u lg a r is n i g s 2 2 7 小 球藻c h l o re l l a s a c c h a ro p h i l a 蛋白 核小 球藻c h lo re lla p y re n o id o s a 蛋白 核小 球藻c h lo re l la p y re n o id o s a 普通小 球藻c h lo r e l la v u lg a r is 近年来， 随着对藻类在生态毒理学方面应用的日益重视， 对藻类致毒机理的 研究也逐步深入， 藻类毒理实验也逐渐由简单的以获取生长量半抑制浓度等指标 为目 的转向从分子水平了 解有毒物质对藻类的毒性作用机理。 目 前己经开展的机 理性研究包括毒物对藻类生物膜、 光合作用、 呼吸作用、 固氮作用以及生化组分 的影响等几方面3 8 1 一 6 第一章绪论 1 . 3 本论文研究的主要内容 本论文以蛋白核小球藻为受试生物，以 6天为一个实验周期，研究五氯酚 ( p c p )对其生 长量 、生长速率 、叶绿素含量、硝酸还原酶 ( n r)和 c a l ( m 罗- a t p a s e 的 毒 性 效 应; 对 生 物量、 叶 绿 素 含量 和 硝酸 还原 酶 活 性 进行 连 续观测， 分析五氯酚毒性效应与时间的关系; 并通过酶学指标测试和透射电镜观 察，研究五氯酚的毒性作用机理，为生态风险评价提供科学依据。 第二章五氛酚对蛋白核小球蕊生长的影响 第二章 五氯酚对蛋白核小球藻生长的影响 在藻类毒性实验中， 细胞数、 干重以及生长速率是最常用的指标。 这些都属 于整体性指标， 是细胞生理生化功能受到的各种影响的综合表现， 虽然无法根据 其变化来判断毒物的作用部位和机理， 但它们的地位是其它指标无法取代的。 作 为水生生态系统的初级生产者， 藻类种群的大小、 生长速率的快慢会直接影响到 高营养级生物的物质和能量供应。 2 . 1实验材料与方法 2 . 1 . 1 实验材料 五氯苯酚，化学纯，购自 上海市计划生育科学研究所。 蛋白 核小球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 藻种购自 中国 科学院武汉水生生物研 究 所， 采 用b o ld b a s a l 培 养 基13 9 1 ， p h 6 .6 ， 配 方 如 下: 大量元素:k 2 h p 0 4 0 .4 3 m m, k h 2 p 0 4 1 .2 9 n i m, n a n 0 3 2 . 9 4 m m, n a c l 0 .4 3 m m, m 9 s 0 4 0 .3 0 m m, c a c 12 0 . 1 7 n i m 微量元素: h 3 b o 3 1 8 4 . 7 p m , e d t a 1 7 1 . 0 9 v m , c o 创0 3 ) 2 1 6 . 8 g m, c u s 0 4 6 2 .9 g m, f e s 0 4 1 7 . 9 p m, m0 0 3 4 .9 p m, mn c 1 2 7 .3 p m, z n s 0 4 3 0 . 7 p m, k o h 5 5 3 w m 培养条件: 温度2 5 土1 c， 光照强度4 0 0 0 l u x ，光暗e t 1 2 / 1 2 仪器:y x q g 0 2 型电热式灭菌锅，山东新华医疗仪器厂 l r h 2 5 0 a型培养箱，广东省医疗仪器厂 x s p - 1 8 s 光学显微镜 2 . 1 . 2实验方法 以细胞数为生长量指标，采用显微计数法，每2 4 h r 测定一次培养液的细胞 密度。 2 . 1 . 3计算公式 生长量抑制率i=( k一n)/n 。 第二章 五 氮酌对蛋白 核小球藻生长的影响 式中n 。 和n 分别为对照组和染毒组的细胞数。 生 长 速 率 “ ”k l n ( n / n o ) 式中 t 为实验持续时间， n o 和n 分别为实验零时刻和t 时刻的细胞数。 生长速率抑制率 i =( k 一k)/k c 式中k c 和k 分别为对照组和染毒组的生长速率。 2 . 2结果与讨论 2 . 2 . 1 生长曲线的测定 蛋白核小球藻的生长曲线如图2 - 1 所示。本实验选择第4 天的藻作为藻种 进行毒性实验。 nl急u哎u一u 0心嘴.几1几 省卜。1 试祠分su。pll。 0 1 2 3 4 5 6 t , d 图 2 - 1 蛋白 核小球藻生长曲 线 2 . 2 . 2五氯酚对蛋白 核小球藻生长量的影响 五级酚对蛋白核小球藻生长的影响实验结果见表2 - 1 和图2 - 2 e 由图2 - 2 可以看出，p c p 对蛋白核小球藻的生长具有明显的抑制作用，且随 浓 度的升高， 抑制作 用加强。当 培养液中p c p 含量达到7 m g / l 时， 小 球藻的生 长曲 线已 成为与x轴接近平行的直线。随p c p 浓度的升高，小球藻的生长滞缓 期 逐渐延长， p c p浓 度为5 . 6 . 7 m g 几的 三组藻生长 滞缓期与 对数生长 期的区 别己经基本消失。 以对照组的蛋白核小球藻相对细胞密度为 1 ，可求得各染毒组相对细胞密度 随时间的变化情况，见表2 - 2 和图2 - 3 0 第二章五氧酚对蛋白 核小球藻生长的影响 表2 - 1 p c p 对蛋白核小球藻生长量的影响 细胞密度 ( i p c p 含量 ( m g / l 6 . 0 0 0 . 3 1 0 . 4 4 1 _ 0 0 7 . 0 0 0 . 3 1 0 . 4 4 0 . 6 3 0 . 6 9 0 . 6 9 0 . 6 9 0 . 6 9 气、气口们 1八乙飞口 1 . 0 0 0 . 3 1 0 75 2 . 6 4 3 . 5 2 6 . 2 7 8 . 8 6 1 4 . 0 4 2 . 0 0 0 . 3 1 0 . 5 6 2 . 1 9 3 . 2 8 5 . 2 3 8 . 3 7 1 1 . 8 8 3 . 0 0 0 . 3 1 0 . 5 0 1 . 9 4 2 . 7 0 4 . 4 7 6 . 4 5 9 . 5 6 5 . 0 0 0 . 3 1 0 . 5 0 1 . 3 1 1 . 6 3 2 . 3 8 2 . 8 5 3 . 71 ，1，咭 8f fr7( d ) 对照组 0 . 0 0 0 . 3 1 0 . 7 5 2 . 8 5 4 . 0 1 7 . 1 2 1 0 . 9 3 1 5 . 7 8 0 / m l ) 染毒组 4 . 0 0 0 . 3 1 0 . 5 0 1 . 5 6 2 . 4 4 3 . 4 6 4 . 7 7 6 _ 7 9 月峪、 2 1 2 表2 - 2 p c p 对蛋白核小球藻相对细胞密度的影响 对照组 相对细胞密度 6 . 0 0 1 . 0 0 0. 5 8 0 . 3 5 0 . 2 8 0 . 1 8 0 . 1 3 0 . 1 3 7 . 0 0 1 . 0 0 0 . 5 8 0 . 2 2 0 . 1 7 0 . 1 0 0 . 0 6 0 . 0 4 加八uzn月呀j兮ij，乙 民inuo000n“ 2 . 0 03 . 0 0 染毒组 4 . 0 0 1 . 0 0 0 . 6 7 0 . 5 5 0 . 6 1 0 .4 9 0 . 4 4 0 . 4 3 00676867635961 in八uu八”八曰0 0075778273”75 ，.0八u八曰onuo 1 . 0 0 1 . 0 0 1 . 0 0 0 . 9 3 0 . 8 8 0 . 8 8 0 . 8 1 0 . 8 9 0000000000000000 0一111 p c p 含量 ( m g / l nl，乙1一j兮 、产0 时间 ( d) n口nd且n乙nu864n乙 (旧/li。忿扮叫的uapll。 t , d 图2 - 2 p c p 对蛋白 核小球藻生长量的影响 二 耐1 一l m g / l 8. 2 m g / l - i 4 - 3 m g / l 4 m g / l - 0 -5 m g / 1 t6 m g / l -7 m g / l 1 0 ngr，口行n民曰dcjn乙，.八u . 100c户0卜un户nn甘on 补一的uapll。公目曰。 图2 - 3 p c p 对蛋白 核小球藻细胞相对密 度的 影响 - 0呢/ - - j ie -4 m g / 一1 m g / l - b -2 m g 八 - o 4 - 3 m g / l - - o -5 m g / 1 1ee 6 m g / l - - 7 m g / l 由图2 - 3 可以较为直观地看出p c p 对蛋白核小球藻相对细胞密度随时间的变 化。 对于1 m g / l 染 毒组 来说， 实验第1 天其细胞密 度与 对照组相同， 未受到p c p 的明显影响; 从第2 天起， 该组细胞密度与对照组相比 有降低趋势， 但降低量很 小;从第3 天到实验结束，其细胞相对密度基本稳定在0 . 8 - 0 . 9 之间， 略有波动。 p c p 浓度从2 m g / l 起， 实 验第l 天均 对蛋白 核小球藻细胞 密度产生明 显影 响，并且随p c p浓度升高，蛋白 核小球藻细胞相对密度呈降低趋势; 2 m g / l组 在第1 天细胞相对密度显著降低， 从第2 天起， 细胞相对密度基本趋于稳定， 在 0 .7 3 - 0 .8 2 之间 略 有波 动; p c p 浓度 为3 m g / l 和4 m g / l 的 染 毒 组 第1 天 表 现出 来 的 趋势与2 m g / l 组 相同， 细胞密度均有明 显下降， 从 第2 天起， 其 趋势与l m g / l 组产生差异: 该两组相对细胞密度并没有稳定， 而是继续降低， 但降低的速率明 显小于第 1 天的情况。 p c p 浓度为5 , 6 , 7 m g / l 的 各染毒组情况又 有所不同， 其相对细 胞密 度急 剧 f 降的时间一直延续了2 天， 到实验第3 天其相对细胞密度降低速率才开始有所 缓和，但与上述其它染毒组相比，其降低速率仍然较大。 综上所述，p c p对蛋白核小球藻细胞相对密度的影响呈现明显的浓度一 效应 关系，在实验浓度范围内， p c p随浓度的升高，对细胞密度的抑制逐渐增强; 不同浓度染毒组细胞相对密度随时间的变化情况也有差异。 低浓度p c p ( 1 - 2 m g / l )对细胞相对密度的影响可分两个阶段，即细胞相对 一一 一 一一 一 一 选望 二 型 巡些望 丝 生 丝 些 些 竺 一 密度下降区和稳定区， 在染毒初期， p c p 导致染毒组细胞相对密度逐渐减小， 随 时间延长， 染 毒组细胞相对密度趋于 稳定。 p c p 浓度较高时( 3 - 7 m g / l ) ， 上 述稳 定区消失， 细胞相对密度在实验时间内 始终在不断降低， 但有急剧下降区和缓慢 下降区的差别。 这种阶段性差异可能是以下原因造成的: 藻细胞对p c p的适应、 细胞数增加使得单个细胞p c p负荷降低、 p c p的部分降解。低浓度时，有可能 由于上述原因，蛋白核小球藻细胞随时间延长，逐渐从p c p的毒性效应中恢复， 细胞相对密度逐渐趋于稳定;而 p c p浓度高时，细胞功能恢复程度较差，细胞 相对密度持续降低，只是降低速率较实验初期有所减小而己。 2 .2 .3 p c p 对蛋白 核小球藻生长量半抑制浓度i c 5 0 随时间的变化 如上文所述，实验时段内的不同时刻，p c p 对蛋白核小球藻生长量的抑制程 度是不同的，因而不同时刻所求得的半抑制浓度i c s 。 值也是不同的。实验第2 , 4 , 6 天p c p 对蛋白核小球藻生长量的抑制率如表2 - 3 所示。 表2 - 3 时间对生长量抑制率的影响 5一1 p c p 浓度 ( m g / l )3 . 0 0 浓度对数 0 . 2 3 0 . 2 7 0 . 2 5 1 . 1 0 0 . 3 2 0 . 3 7 0. 3 9 4 . 0 0 1 . 3 9 0 . 4 5 0 . 5 1 0 . 5 7 0 , 5 4 0 . 6 7 0 . 7 7 6 . 0 0 1 . 7 9 0 . 6 5 0 . 8 2 0 . 8 7 7 . 0 0 1 . 9 5 0 . 7 8 0 . 9 0 0 . 9 6 抑制率 注:本论 文中若无特别说明， 对数均指自 然对数。 由表2 - 3 可知，各浓度的p c p 对细胞生长量的抑制率均随时间延长而增加， 仅2 m g / l 组第4 天和第6 天稍有不同，因而， p c p 对蛋白 核小球藻生长量的半 抑制浓度值应随时间延长而减小。 以抑制率对p c p 浓度对数作图， 可得实验第2 , 4 , 6 天的抑制曲线，分别如图2 - 4 , 2 - 5 , 2 - 6 所示。线性回归方程分别为 2 天y = 0 .4 2 8 7 x 一 0 . 1 1 3 4 ， r 2 二 0 .9 5 3 9 4 天y = 0 .5 3 0 5 x 一 0 . 1 6 2 8 ， r z = 0 .9 6 0 6 6 天y = 0 . 5 9 2 8 x 一 0 .2 0 7 8 ， r 2 二 0 .9 7 8 5 由 以 上 方 程可 计 算出 对 应的i c s 。 值分 别 为4 . 1 8 m g f l ( 2 天) 、 3 .4 9 m g / l ( 4 天) 、 3 . 3 0 m g / l ( 6 天) 。随时间延长i c s 。 值逐渐减小， 表明p c p 对蛋白 核小球藻生长 量的毒性效应随时间延长而逐渐增大。 第二章五氮酚对蛋白 核小球藻生长的影响 1 . 0 0 . 8 0 . 6 0 4 0 . 2 0. q y 二0 . 4 2 8 7 x一0 . 1 1 3 4 r z二0 . 9 5 3 9 .f旧口ot祠qtqul 0 . 5 2 . 0 l n p c p 图2 一 4p c p 对蛋白核小球藻生长量抑制率曲线 (2天) 1 . 0 0 . 8 0 . 6 0 . 4 0 . 2 0 . 0 。护口。祠叫月叫心口引 0 . 5 图2 一 5 1 . 01 . 52 . 0 l n p c p p cp对蛋白 核小球藻生长量抑制率曲线 (4天) nsbdn l众仓仪仪 0祠目0引祠叫q叫月口叫 0 0 0 . 5 2 o ln 代p 图2 书 pcp 对蛋白 核小球藻生长量抑制率曲 线 ( 6 天) l 3 /， 第二章五氛酚对蛋白核小球藻生长的影响 2 .2 .4 接种量对半抑制浓度i c s 。 值的影响 曾有研究指出， 半抑制浓度i c 5 。 值的大小除了与实验持续时间有关外， 还受 实验初始接种生物量的影响13 1 1 .本论文进行了 接种量不同的两组对比实验。实 验结果如表2 - 4 所示。 表2 - 4 p c p 对接种量不同的蛋白核小球藻生长量的抑制率对比 细胞密度 ( i 对照组 0 / m l ) 染毒组 p c p 含量 ( m g / l ) 第初始 结束 0 . 0 0 0 . 0 3 4 . 2 9 0 . 0 0 0 . 3 1 1 5 . 7 8 0 . 0 0 1 . 0 0 0 . 0 3 4 . 6 8 - 0 . 0 9 0 . 3 1 1 4 . 0 4 0 . 1 1 2 . 0 0 0 . 0 3 4 . 9 3 - 0 . 1 5 0 . 31 1 1 名8 0 . 2 5 4 . 0 0 0 刀3 2 . 7 0 0 . 3 7 0 31 6 . 7 9 0 . 5 7 3 . 0 0 0 . 0 3 3 . 6 2 0 . 1 6 0 . 3 1 9 . 5 6 0 39 5 . 0 0 0 . 0 3 0 . 9 4 0 . 7 8 0 . 31 3 . 7 1 0 . 7 7 6 . 0 0 0 . 0 3 0 . 7 5 0 . 8 2 0 . 31 2 . 1 2 0 _ 8 7 赫丽儡 组一第二组 注:实验持续时间为6 天。 由表 2 - 4可以看出，相同浓度的p c p对接种量不同的蛋白核小球藻的抑制 程度存在着差异，当p c p浓度较低时，这种差异更为明显。实验第 1 组接种量 接近第2 组的1 1 1 0 . p c p 浓度在1 - 4 m g f l 范围内， 其 对第1 组蛋白 核小 球藻生长 量 的 抑制 率 要小于 第2 组; 1 m g / l和2 m g / l 的p c p 对 第1 组蛋白 核小 球 藻的 生 长 表现出 一定的 刺激作用， 对第2 组则表现为抑 制。 p c p 浓度为5 m g / l 和6 m g / l 时，两组抑制率相差不大。 以相应抑制率对p c p 浓度对数进行线性回归，得图2 - 7 e 八uon内们d且，目n :，: ，.工00000 。衬口0洲护分刀喇二洲 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 l n p c p 图2 - 7 不同接种量蛋白 核小球藻的抑制率曲线 . 第1 组 第2 组 第二章 五氛酚对蛋白 核小球藻生长的影响 相应线性回归方程分别为 第一 组 v = 1 .0 5 2 5 x 一 1 .0 1 5 7 , r z 二 0 .9 4 2 0 第二 组 y = 0 .5 9 2 8 一 0 .2 0 7 8 , r 2 = 0 .9 7 8 5 按上 述方 程可求 得半 抑制浓 度i c s 。 值分 别为4 .2 2 m g / l ( 第i 组) 和3 .3 0 m g 1 l第 2组) 。 上述实验表明，半抑制浓度值随实验初始接种量不同而有所变化，在应用 i c s 。 值进行比较分析时， 应该考虑初始接种量这一因素。 至于i c s 。 值随初始接种 量的变化规律及相应作用机制，尚需要进一步的实验研究。 2 .2 . 5 p c p 对蛋白核小球藻生长速率的影响 p c p 对蛋白核小球藻2 天、 4 天和6 天生长速率的影响见表2 - 5 。 由表2 - 5 可 以看出，随p c p 浓度的升高，蛋白核小球藻的生长速率明显降低。 p c p 对蛋白核小球藻生长速率的影响 表 2 - 5 对照组染毒组 p c p 浓度 ( - g / - 0 .0 03 . 0 0 1 . 1 0 7 . 0 0 浓度对数 1 . 9 5 ll0 2 天生长速率 抑制率 4 天生长速率 抑制率 6 天生长速率 抑制率 0 . 7 8 0 0 . 6 6 0 0 . 9 2 0 . 1 7 0 . 6 7 0 . 1 5 0 . 5 7 0 . 1 3 4 . 0 0 1 . 3 9 0 . 8 1 0 . 2 7 0 . 6 0 0 . 2 3 0 . 5 1 0 . 21 5 . 0 0 1 . 6 1 0 . 7 2 0 . 3 5 0 . 5 1 0 . 3 5 0 . 4 1 03 7 0 . 3 5 0 . 6 8 0 . 2 0 0 . 7 4 0 . 1 3 0 . 8 0 6 刀0 1 . 7 9 0 . 5 9 0 . 4 7 0 . 3 5 0 . 5 6 0 . 3 2 0 . 5 1 注:采用表2 - 1 数据计算。 分别以各生长速率抑制率对p c p 浓度对数做图，得线性回归方程为: 2 天y = 0 .5 5 7 3 x 一 0 .4 8 3 4 , 扩二 0 .9 0 6 1 4 天y = 0 .6 9 6 1 x 一 。 .6 8 4 7 , 扩= 0 .9 1 4 7 6 天y = 0 .7 4 7 7 x 一 0 . 7 6 7 6 , 扩= 0 . 8 9 7 6 由上述方程计算得p c p 对蛋白核小球藻生长速率的半抑制浓度分别为5 . 8 4 ( 2 d ) , 5 .4 8 ( 4 d ) 和5 .4 4 m g / l ( 6 d ) 。 与p c p 对生长量的 半 抑制 浓度变化情况相 似， p c p 对蛋白核小球藻生长速率的半抑制浓度值也随时间延长而减小。 第 二 童 五 氯 酚 对 蛋 白 核 小 球 藻 生 兰 鱼 兰 堕 0. 8 y二0 . 5 5 7 3 x一0 . 4 8 3 4 0 . 6 :.: 0 . 0 尸招uo叫户一q叫二叫 2 0 l n p c p 图2 - 8 生长速率抑制率曲线 ( 2 天) 0 . 8 m 卜 巴0 . 6 d，卜u : 0卜uo uo叫祠洲q叫q口叫 8 2 . 0 l n p c p 图2 - 9 生长速率抑制率曲线 ( 4 天) 0 . 8 八幻 - 0 山户司卜 d通n0 月，- 000 召。训护洲q洲二u训 1 . 01 . 24 1 . 6 82 . 0 l n p c p ) 图2 - 1 0 生长速率抑制率曲线 ( 6天) 1 6 第二章 五氮酚对蛋白核小球藻生长的影响 ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) ( 5 ) 2 .3结论 p c p对蛋白核小球藻生长具有明显的抑制作用，且随 p c p浓度的升高， 对蛋白核小球藻生长的抑制作用相应增强，呈现明显的浓度一 效应关系。 p c p 导 致蛋白 核小 球藻生长 滞缓期延长， 浓 度较高 时( 5 m g / l 以 上) 甚 至 导致对数生长期消失。 p c p对蛋白核小球藻细胞相对密度的影响可分为不同的阶段，当p c p浓 度较低 ( 1 - 2 m g / l )时，细胞相对密度在实验初期有所降低，实验后期则 相 对稳定; 当p c p 浓度较高 ( 3 - 7 m 叭 ) 时， 上 述 稳定区消失， 细胞相 对 密度在实验时间内始终在不断降低，但有急剧下降区和缓慢下降区的差 别。这种阶段性差异可能是以下原因造成的:藻细胞对 p c p的适应、 细 胞数增加使得单个细胞p c p 负荷降低、p c p 的部分降解。 p c p对蛋白 核小球藻生长量的抑制率随时间延长而增加，i c s 。 值相应减 小， 实 验第2 , 4 , 6 天i c s 。 值 分别为4 . 1 8 , 3 .4 9 , 3 .3 0 m g / l o 实验初始接种量不同， p c p 对蛋白核小球藻生长量的半抑制浓度值也有所 差 异: 接种 量为3 x 1 0 5 个 / m l 和3 . 1 x 1 0 6 个 / m l 时， 对应的i c s 。 值( 6 天) 分别为4 .2 2 m g / l 和3 .3 0 m g / l 。 在应 用i c s 。 值进行比 较分析时， 应该 考虑 初始接种量这一因素。 p c p导致蛋白核小球藻的生长速率明显降低，半抑制浓度 i c s 。 值分别为 5 . 8 4 ( 2 d ) , 5 .4 8 ( 4 d ) , 5 .4 4 m g / l ( 6 天) 。 第 三 章 五 氮 酚 对 蛋 白 核 小 球 藻 叶 绿 遨 翌 型 丝 堕 第三章 五氯酚对蛋白核小球藻叶绿素含量的影响 光合作用是植物物质和能量代谢的基础。 毒物对于藻类光合作用的影响是多 方面的， 如破坏叶绿体的 膜结构 (4 1 1 、 改变类 囊体膜的 流动 性四、 抑制光 合作用 的电子传递过程4 2 1 以及改变叶绿素含量13 1 1 等等。叶绿素含量测定方法简便易行 的特点使得其成为藻类毒性实验的一项常用指标。 3 . 1实验材料和方法 3 . 1 . 1 实验材料 试剂:9 5 %乙醇，分析纯， 仪器:7 2 2 型分光光度计，上海第三分析仪器厂 8 0 - 2 台式低速离心机，江苏省金坛市医疗仪器厂 b c d - 1 8 2 型冰箱，中意电冰箱厂 3 . 1 .2 实验方法 采用分光光度法测定含量叶绿素:每 2 4 h r 将对照组和染毒组培养液各取 5 m l , 5 0 0 0 r p m离 心1 0 m in 以 提取藻 细 胞: 用5 m l 9 5 % 乙 醇 将藻 细 胞 溶出， 转移 至带塞离心管中， 静置于4 冰箱内， 避光: 2 4 h r 后取出 离心管， 5 0 0 0 r p m 离心 1 0 m i n ，取上清液分别测定波长6 6 3 , 6 4 5 n m 处的吸光度。 3 . 1 . 3计算公式 采 用 校正 后的a r n o n 公 式 计 算乙 醇 提 取 液中 的 叶 绿 素 含量 43 1 叶绿素a 含量c a二1 2 . 7 2 a 6 6 3一2 . 5 8 5 a 6 4 5 叶绿素b 含量c b二2 2 . 8 8 a 6 4 ，一4 . 6 7 1 a 6 6 3 总叶绿素含量c t=c a十c b 以上式中a 6 6 3 , a 6 4 5 分别为提取液在波长6 6 3 和6 4 5 n m处的吸光度。 由于本实验中每日 所取培养液体积与提取液体积相同， 故上述公式计算结果 就是培养液中叶绿素的相应含量。 第 三 章 五 氧 阶 对 蛋 白 核 小 球 藻 叶 a 奎 $ 到 丝q 3 .2 结果与讨论 3 .2 . 1 p c p 对蛋白 核小球藻培养液中叶绿素含量的影响 根据实验测定乙醇提取液的吸光度a 6 6 3 , a 6 4 5 值，按校正的a r n o n 公式计算 得到叶绿素 a , b以及总叶绿素含量列于表3 - 1 . 3 - 2和3 - 3 。为方便直观地了解 培养液中叶绿素含量变化情况，故依据表3 - 3 作图，得图3 - l 0 表 3 一 1 对照组 培养液中叶绿素a 含量 叶 绿素a 含量 ( m g 1 l 染毒组 0 . 0 0p c p 含量 ( m g / l ) 2 . 0 0 3 . 0 0 时间 ( d) 0 . 0 8 0 . 3 3 0 . 9 0 1 . 7 0 3 . 5 2 4 . 8 4 6 _ 5 865 9 1 . 0 0 0.0 8 0 . 2 7 0 . 7 0 1 . 3 5 3 . 1 1 4 . 0 8 6 . 2 1 0 刀8 0 . 2 0 0 . 5 0 1 . 0 8 2 . 4 1 3 . 8 4 5 . 1 4 0 . 0 8 0 . 1 8 0 . 3 8 0 . 7 4 1. 7 9 2 . 6 4 4 . 0 9 4 . 0 0 0 . 0 8 0 . 1 4 0 . 2 9 0 . 5 5 1 . 0 9 1 . 7 6 2 . 8 4 5 . 0 0 0 . 0 8 0 . 1 4 0 . 2 0 0 . 3 4 0 . 5 2 0 . 8 4 1 . 1 3 6 . 0 0 0 . 0 8 0 . 1 0 0 . 1 3 0 . 2 2 0 . 4 0 0 . 4 5 0 . 5 9 ，且，1 表3 - 2 培养液中叶绿素b 含量 对照组 叶绿素b 含量 ( m g / l ) 染毒组 p c p 含量 ( m g f l ) 时间 ( d) 0 . 0 0 0 . 0 3 0 . 1 0 0 . 1 9 0 .41 1 . 0 1 1 . 3 4 2 . 0 6 1 . 0 0 0 . 0 3 0 . 1 0 0 . 1 4 0 31 1 . 1 0 1 . 1 3 1 . 91 2 . 0 0 0 . 0 3 0 . 0 6 0 . 0 8 0