（环境科学专业论文）三株嗜盐异养硝化细菌的分离鉴定及其脱氮特性.pdf

1 2 废水传统生物脱氮技术5 1 2 1 传统生物脱氮原理5 1 2 2 传统生物脱氮技术存在的问题6 1 3 异养硝化的研究进展“6 1 3 1 异养硝化作用的定义6 1 3 2 异养硝化作用的发现6 1 3 3 异养硝化作用的关键酶- o _ 7 1 3 4 异养硝化作用的基因8 1 3 5 异养硝化作用的反应途径9 1 3 6 已经发现的异养硝化菌及特性1 0 1 3 7 异养硝化在污水脱氮中的应用1 l 1 4 异养硝化与好氧反硝化的偶联机理1 2 1 5 本论文研究的目的与意义1 3 1 6 论文主要研究内容和解决的主要问题1 4 第二章实验材料及方法17 2 1 实验材料17 2 1 1 实验仪器17 2 1 2 培养基17 2 1 3 生理生化实验所用试剂及培养基一17 2 1 4 检测1 6 sr d n a 所用试剂1 9 2 2 试验方法2 0 2 2 1 筛选方案的确定2 0 2 2 2 嗜盐异养硝化菌的富集2 0 2 2 3 嗜盐异养硝化菌的菌种分离纯化2 0 2 2 4 嗜盐异养硝化菌的初筛2 1 2 2 5 优势异养硝化菌的复筛，2l t 第三章嗜盐异养硝化菌的筛选与生理生化特性2 7 3 1 嗜盐异养硝化细菌的分离筛选。2 7 3 1 1 菌样采集2 8 3 1 2 富集培养2 8 3 1 3 菌株的分离和初筛2 8 3 1 4 优势菌株的复筛2 9 3 2 菌株的形态学特征和生理生化特性。3 0 3 2 1 菌落的形态3 0 3 2 2 菌体的形态3 0 3 2 3 菌株的生理生化特性3 2 3 2 4 菌株的生长曲线绘制3 2 3 2 5 环境因素对菌株生长的影响实验3 4 3 3 菌株的1 6 sr d n a 测序及同源性分析3 7 3 3 11 6 sr d n a 测序3 7 3 3 21 6 sr d n a 同源性分析4 l 3 4 中度嗜盐菌的研究进展。4 4 3 5 本章小节。4 4 第四章菌株的异养硝化特性研究4 7 4 1 菌株的异养硝化性能。4 7 4 2 脱氮的可能途径5 2 4 3 盐度对异养硝化作用的影响5 3 4 4 碳源对菌株硝化性能的影响。5 7 4 5 c n 对菌株硝化性能的影响6 l 4 6 温度对菌株硝化性能的影响6 4 4 7 p h 对菌株硝化性能的影响6 6 4 4 本章小节。6 8 第五章菌株的好氧反硝化特性研究7 1 5 1 亚硝酸盐培养基中的好氧反硝化作用7 l 5 2 硝酸盐培养基中的好氧反硝化作用。7 2 5 3 本章小节7 4 主要结论及研究展望7 5 h 学位论文独创性声明8 5 学位论文知识产权权属声明8 5 第一章综述 第一章综述 1 1 高盐废水生物脱氮处理研究现状 1 1 1 高盐含氮废水的来源 随着水资源的短缺，废水( 含高盐废水) 的处理及回收利用越来越受到人们的 重视。高含盐量废水是指总含盐量( 以n a c l 含量计) 至少为1 的废水，主要包括 含盐工业废水、含盐生活污水和其他含盐废水。其主要来源有以下几方面n 叫： ( 一) 海水直接利用过程中排放的废水 为缓解淡水资源日益紧缺的局面，近年来许多沿海城市开始推行海水直接利用。 主要包括：用作工业冷却水，广泛应用于电力、钢铁、纺织、机械化工等行业； 用作工业生产用水，主要用于建材、印染、化工、海产品加工等行业；城市生 活用水，主要用于冲洗厕所、道路、消防及游泳娱乐等方面，其中以海水冲超应用 最广。 ( 二) 工业废水 一些工业行业在生产过程中会排放出大量的高含盐有机废水，如印染、腌制、 造纸、化工、农药等行业以及石油、天然气的开采。这些行业属于重污染行业，废 水排放量大，且废水中含有高浓度的盐、油、有机酸、重金属和放射性元素。 ( 三) 其他含盐废水 如大型舰船上产生的污水；沿海地区海水渗入城市下水道会增加城市污水的盐 度；工厂生产过程中为减少废水排放量，导致废水中有机物及无机盐浓度增加。 在这些废水中，不仅含有大量的盐分( c l 、c c 2 + 、n 矿等离子) ，而且很多高盐 废水同时含有大量的氮素污染物，是废水处理领域中的技术难题，常规的生物法很 难有效地处理该类废水。 1 1 2 高盐度对生物处理系统脱氮效果的影响 近年来，氮素给环境造成的污染问题日益突出，其危害也日益被人们说认识和 重视。在处理中、低浓度废水的过程中，生物脱氮技术较其他脱氮技术( 如物理法、 化学法等) 具有工艺简单、成本低廉、较易推广等特点，因此，越来越受到人们的 青睐。 但是，高盐度会对硝化菌和反硝化菌产生抑制，但许多研究结果表明，如果污 泥在高盐环境中有足够的驯化时间，使硝化菌和反硝化菌大量增殖，系统就能有较 好的脱氮效果。但关于盐对硝化反硝化的影响还存在一些不一致甚至自相矛盾的结 论。 青岛大学硕士学位论文 ( 1 )高盐度对硝化反应的影响 盐会抑制硝化菌的生长，硝化反应对盐浓度和盐冲击都敏感。m f r o s e 等h 1 处理 含盐废水时发现5 0 9 l 的n a c l 系统中氨的去除率为4 8 ，而没有n a c i 的系统氨的 去除率高达9 4 。c t h c h e n 等畸1 发现盐度在4 1 2 9 l 的n a c l 有利于硝化，但超过这 个浓度会下降。 ( 2 ) 盐度对反硝化反应的影响 许多研究证实高盐环境中可以进行反硝化反应，如e v a n d e rh o c k 等1 发现n a c i 或n a 2 c 0 3 为3 0 9 l 时能够进行反硝化反应。大部分的研究结果表明反硝化效率随 着进水盐度增加而降低，但是s y o s h i e 等口1 通过试验得出盐度为1 0 的反硝化活性 高于盐度为2 的反硝化活性，2 盐度下嗜盐菌反硝化菌和非嗜盐反硝化菌可能共 存，并且互相竞争底物，然而1 0 盐度下可能会导致嗜盐菌反硝化茵占统治地位， 从而提高了反硝化效率。 分析其产生对立结论的原因可能是：( 1 ) 系统的构造和实验条件( 如：温度、p h 、 废水中含有抑制微生物的化合物等) 的差异；( 2 ) 系统微生物种类，如使用单一或混合 的微生物，驯化或没有驯化的微生物；3 ) 盐加入系统的方式，如突然加入或逐渐加 入。 另外，还有研究表明，在硝化反应过程中，硝化细菌对盐度比亚硝化细菌更敏 感，在达到一定盐度后消化过程中会出现亚硝酸盐的大量积累。由于反硝化菌能够 直接将n 0 2 - n 还原，生物脱氮可经过n i - h + - n n 0 2 _ n o - - n 2 这样的途径完成( 即短程 硝化反硝化生物脱氮) 。短程硝化反硝化生物脱氮工艺可以减少硝化阶段的需氧量， 并且可以节省反硝化阶段的有机碳源陋1 ，因此，可以通过控制温度、p h 值、溶解氧、 游离氨以及污泥龄等条件来抑制硝化菌的活性或减少硝化菌的数量，以实现短程硝 化睁1 引。 为保证整个生物处理系统的有效运作有关的国标、部标中对排放水的含盐量作 了相应的规定。如对于进入生物处理构筑物的废水中n a c l 一般应 4 0 0 0 m g l ( g b j l 4 1 9 8 7 ) ；而排入城市下水道的污水中溶解性固体( 大多为盐类) 也 应弋 2 0 0 0 m g l ( g j l 8 - 1 9 8 6 ) 。 1 1 3 高盐废水生物处理的可行性 适应于淡水环境的微生物在受到高盐度废水冲击时，其正常代谢功能会受到抑 制。但在高盐环境中，微生物会通过自身的渗透压调节机制平衡细胞内的渗透压或 保护细胞内的原生质，这些调节机制包括细胞聚集低分子量物质，如氨基酸、糖、 甘氨酸三甲基内盐来形成新的保护层，调节自身新陈代谢，改变遗传基因n 引，因而 通过选择培养可以驯化出耐高盐度的菌种，系统可获得较好的处理效果。 2 第一章综述 近年来，国内外很多学者采用生物处理法对高盐废水进行了研究。对于盐度较 低的废水，一般采用驯化耐盐污泥的方法；而处理盐度较高的废水时，由于驯化污 泥中的微生物对盐度的耐受范围有限( 3 0 5 0 9 l ) n 4 。1 6 3 ，且驯化时间长，所以对于更 高盐度的废水( 含盐度5 0 9 l 以上，甚至高达2 0 0 9 t l ) ，向处理系统中接种嗜盐微生 物则是快速有效的方法。 1 9 9 5 年阿联酋u a e 大学的h a m o d a 等n 刀使用活性污泥完全混合反应器分别对 不含盐废水、含盐量1 0 3 0 9 l 的废水在不同泥龄( 3 - 2 0 d ) 和不同有机负荷 ( c o d c v o 5 - 2 0 k gvs s d ) 条件下进行平行对照实验，结果发现盐度对未经驯化的活 性污泥系统产生明显的抑制影响，但经过一段时间驯化后，系统的活性污泥浓度增 加，并显著改变了活性污泥中微生物种群的组成，且对t o c 的去除率均达到9 6 以 上。 国内学者也在这方面进行了相应的研究。安林等n 町讨论了盐对二段接触氧化法 处理废水的影响；杨健n 盯用s b r 法处理含盐含油发酵工业废水；梁展辉乜们等对高盐 度有机废水进行吹脱和冷却预处理后，再利用s b b r ( 序批式生物膜反应器) 处理，都 取得了良好效果。 另外，在自然界高盐环境如盐湖、死海、盐场和海洋中，也广泛生存着耐极高 盐度的嗜盐菌。一些研究表明将嗜盐菌接种到污水处理构筑物中，能有效的去除高 盐废水中的有机物。如e s t r e l l a a s p e 乜”等人用海洋底泥接种可有效处理渔场废水。 耐盐微生物和嗜盐微生物的广泛存在为高盐废水的生物处理提供了保证。 1 1 4 嗜盐菌的研究现状 1 1 4 1 嗜盐微生物的分类 根据微生物对盐的依赖程度可分为三类：第一类是指那些能耐受一定盐浓度， 但在无盐环境中生长最佳的一类微生物，称为耐盐菌( h a l o t o l e r a n tm i c r o o r g a n i s m s ) ； 第二类是指那些在盐浓度从零至饱和的环境中均能生长，但其最佳生长需要一定盐 浓度的特殊微生物，称为广域嗜盐菌( h a l o v e r s a t i l em i c r o b e s ) 第三类是指那些生长 需要一定盐浓度，且在一定盐浓度的环境中生长最佳的微生物，称为嗜盐菌 ( h a l o p h i l e s ) 捌。 依据嗜盐浓度的不同，嗜盐菌又可分为轻度嗜盐菌( s l i g h th a l o p h i l e s ) 生长最 适n a c i 浓度为1 1 7 2 9 3 ；中度嗜盐微生物( m o d e r a t e l yh a l o p h i l e s ) ：生长最适n a c i 浓度为2 9 3 1 4 6 3 ；极端嗜盐微生物( e x t e r m eh a l o p h i l e s ) ：生长最适n a c i 浓度为 1 4 6 3 3 0 4 。 嗜盐菌为革兰氏阴性菌，多为好气化能异养，一些盐杆菌的某些种可进行厌氧 呼吸。细胞含类胡萝卜素，菌体呈红色、紫色或浅褐色，大多数不运动，只有少数 青岛大学硕+ 学位论文 种靠鞭毛缓慢运动，采用二分分裂法进行繁殖，无休眠状态，不产生孢子。嗜盐菌 种类繁多，它们的分类主要依据三个方面：表型特征、化学分类数据和分子生物学 数据。根据表型特征的不同，有嗜盐球菌和嗜盐杆菌。根据1 6 sr r n a r d n a 序列分 析并结合其它生物学形状分为盐杆菌属( h a l o b a c t e r i u m ) ，盐深红菌属( h a l o r u b r u m ) ， 富盐菌属( h a l o f e r a x ) ，盐盒菌属( h a l o c o c c u s ) ，嗜盐碱杆菌属( n a t r o n o b a c t e r i u m ) ， 嗜盐碱球菌属( n m r o n o c o c e u s ) 等菌属，川。表1 1 列出了部分耐盐菌和嗜盐菌及其 特性。 表1 1 部分耐盐菌和嗜盐菌的特性幢钉 菌名嗜盐浓度 特性 明亮发光杆菌3 适合生长，0 5 5 可以生长革兰氏阴性，兼性厌氧 kp a r a h a e m o l y t i c u s 需盐脱硫弧菌生长需要n a c l ，在含苹果酸硫革兰氏阴厌氧菌 口s a l e x i g e n s酸盐培养基上生长 盐脱氮付球菌 嗜盐 专营有机化能 p h a l o d e n i t r i f i c a d s 硝化球菌似m o b i l i 舅w at s o n e t海水+ 亚硝酸盐环境革兰氏阴性无机化能型， 肠t e r r b u r y 专性好氧 欧洲硝酸单胞菌旭e u 拼o p a e a 海水或者淡水富加n h 3 和无机盐革兰氏阴性无机化能型， w i n o g r a d - s k y l 8 9 2 的培养基专性好氧 海洋亚硝化球菌革兰氏阴性无机化能型， o c c a d u s专性好氧 1 1 4 2 微生物的耐盐机理 嗜盐菌之所以能够在高盐环境中生长，是因为嗜盐菌具有特殊的生理结构和细 胞中所含的特殊物质使之能耐盐生长。 在高盐条件下或盐胁迫下，嗜盐微生物体内会主动积累或产生一些小分子物质 来抗衡外界高渗环境，这种抗渗透物质能在体内高度累积，但又不会影响或不会严 重影响到生物大分子的正常生理功能，所以又叫相容性物质。如嗜盐厌氧菌、嗜盐 硫还原菌和嗜盐古细菌通过在细胞内积累高浓度的1 0 来调节细胞渗透压；嗜盐真细 菌、嗜盐甲烷细菌和嗜盐真核生物的适应机制是在细胞内积累大量的小分子物质， 如甘油、单糖、氨基酸及其衍生物，这些物质使细胞内获得较高的渗透压，从而在 高盐环境中获取水分，并且这些物质在细胞内能够迅速合成和降解，从而增强了嗜 盐菌适应外界高盐环境的能力啪。 嗜盐菌的细胞内所含的k + 浓度是细胞外的1 0 0 倍左右，而细胞外的n a + 浓度是 细胞内的4 倍，因此，嗜盐菌具有浓缩k + 和排斥n a + 的能力，而嗜盐菌的紫膜( p u r p l e 4 第一章综述 m e m b r a n e ) 提供了这种生理功能。嗜盐菌细胞膜上具有一些特殊的、成六面格子的 紫色斑块，称为紫膜。紫膜主要以细菌视紫质为代表的一类视黄醛蛋白组成，是一 个功能稳定的光能转换器。细菌视紫质在光照下能不断的从细胞膜内侧吸收质子并 将其排出，使细胞膜内外形成质子梯度，为细胞浓缩k + 和排出n a + 、吸收营养物质 提供能量，满足嗜盐菌正常的生理需求啪1 。 1 2 废水传统生物脱氮技术 近年来，氮素给环境造成的污染问题日益突出，其危害也同益被人们说认识和 重视。在处理中、低浓度废水的过程中，生物脱氮技术较其他脱氮技术( 如物理法、 化学法等) 具有工艺简单、成本低廉、较易推广等特点，因此，越来越受到人们的 青睐。 1 2 1 传统生物脱氮原理 在自然生态系统中，从化合态氮到气态氮进而从根本上去除氮污染物质的转化 过程主要通过硝化和反硝化作用：首先在好氧条件下，通过硝化菌的作用，将废水 中的氨氮( n h 4 + - n ) 氧化为亚硝酸盐氮( n 0 2 - n ) 或硝酸盐氮( n 0 3 - n ) ；然后在 缺氧条件下，利用反硝化菌将亚硝酸盐氮或硝酸盐氮还原为氮气( n 2 ) 而从废水中 逸出。 ( 一) 硝化作用 传统理论认为生物硝化口k 嘲是由两组自养型硝化细菌氨氧化细菌( a o b ) 和亚 硝酸盐氧化细菌( n o b ) ，将氨态氮转化为硝态氮的生化反应过程。氨氧化细菌所完 成的氨氧化作用是整个自养硝化过程的第一个步骤，且氨氧化细菌的比增长速度小 于亚硝酸盐氧化细菌的比增长速度，所以，此步骤是整个自养硝化作用过程中的速 率限制步骤。 氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌大都是化能自养菌，它们利用c 0 2 、c 0 3 2 。、 h c 0 3 - 等作为碳源，通过与n h 3 、n h 4 + - n 或n 0 2 - n 的氧化还原反应获得能量。这 两类菌对环境十分敏感，都需要严格的好氧环境。在硝化反应过程中，混合液有机 物浓度较高时会使增值速度较高的异养型细菌迅速增殖，从而使自养型的硝化菌得 不到优势不能成为优势种属。这两类细菌对酸性环境很敏感，一般都在微碱性的环 境中生长良好，亚硝化细菌生长的p h 范围是7 - 9 ，硝化细菌p h 为5 8 ，当p h h a l o m o n a ss p ( j b 3 0 5 2 4 8 1 ) h a l o n m n a ss p ( 冉b 3 0 5 2 6 3 1 ) h a l o n 口o n a sw n u s t ai s o l a t e0 0 4 ( a y 6 6 9 1 6 5 1 ) t i a l o m o n a ss i ，( t 杖9 3 2 4 9 1 ) h a l o # a i cb a c t e r i u m ( 矾10 2 1 ( e u l 2 4 3 b - 1 1 ) h a l o m o n a ss p ( a f z l 2 2 1 6 2 ， h a l o m o n a s 幻配幻c 妇r _ 搬矗，s t r a 忉s f f h 2 ( a f z l 2 2 1 8 2 ) _ 一 0 0 0 0 j u n c u l t u r e db a c t e r i u mc l o n ef s l 4 2 4 7 b - 0 2 ( d q 5 1 3 0 3 1 ) 图3 1 3 基f f ： 6 sr d n a 序列同源性构建的菌株g s 3 和亲缘性相近的其他细菌的系统发育树 4 3 青岛大学硕士学位论文 3 4 中度嗜盐菌的研究进展 中度嗜盐茵是一类嗜极细菌，由于在胞内积累相似相容性溶质如海藻糖、甜菜 碱、四氢嘧啶等小分子物质进行渗透压调节的能力，因而能耐受含0 - 3 2 n a c i 的高 盐环境n 帆l o l l并且一般在n a c l 浓度为2 15 时生长最佳n 嘲。h a l o m o n a s 是目前 包含中最多的一个中度嗜盐菌属，也是最重要的一个属，属内细菌广泛分布于海洋、 盐湖、盐渍食物等环境，它们调节渗透的小分子物质可被用作刺激保护剂( 对抗高 盐、干燥、热变性等) 和核酸、酶膜及细胞的稳定剂，具有广泛的工业应用价值n 慨i 0 4 。 本实验分离出的菌株g s 2 和g s 3 就属于h a l o m o n a s 属。 由于中度嗜盐菌耐盐范围广，具有丰富的生理生化特性，其分类特征、系统发 育地位、渗透压调剂机制以及遗传学基础理论研究正日益受到国内外学者的关注 n 睁1 0 7 1 。但对将中度嗜盐菌应用于环境保护方面的研究还较少。 目前，许多工业行业在生产过程在会产生大量的高浓度含盐有机废水，这些废 水中很多同时又含有大量的氮素污染物。传统生物法在处理低盐度废水时具有很大 的优势，但当盐浓度过高时，会造成微生物代谢的中度抑制和毒害，使其失去降解 能力。而中度嗜盐菌产生的酶可以在高盐、高p h 值的情况下发挥作用，因而可使 一些特殊环境下的生物降解得以实现，为生物法处理高盐废水提供了理论上的可能。 本实验室分离出来的三株嗜盐异样硝化细菌g s l 、g s 2 和g s 3 分别可以耐受0 7 、 0 1 5 的高盐环境和p h 值为6 1 1 的碱性环境，并且具有较高的异养脱氮性能，在 高盐含氮废水中具有广泛的应用价值。 目前，对于嗜盐微生物的研究仍然极具吸引力，利用各种方法，特别是新的分 子技术区阐明嗜盐菌在环境中的微生物多样性及明确他们的分类是今后亟待进行的 工作。 3 5 本章小结 ( 1 ) 从实验室处理高盐废水的m b r 反应器中取驯化成熟的活性污泥，通过对 嗜盐异养硝化菌的富集培养，分离筛选出三株既有高效降解废水中氨氮、t n 的能力 又能在高盐环境中生长良好的菌株，分别命名为株菌g s l 、g s 2 和g s 3 。 ( 2 ) 通过对菌株进行异养硝化性能测试，表明筛选出的3 株菌均可利用有机碳 进行有氧呼吸，在2 盐度条件下对氨氮的去除率超过8 0 ，对总氮的去除率超过 7 0 ，具有较好的异养脱氮能力。 ( 3 ) 菌株g s l 的菌落为米黄色，菌株g s 2 的菌落为乳白色，菌株g s 2 的菌落为黄 绿色，各菌落均为圆形，表面光滑，边缘整齐，有隆起不透明、且粘性有光泽。 ( 4 ) 通过革兰氏染色实验结果为：三株菌均为为革兰氏阴性菌、无芽孢； 三株 菌的生理生化特性也具有一定的相似性：均能水解油脂、硝酸盐还原、乙酸氧化； 第三章嗜盐异养硝化菌的筛选与生理生化特性 接触酶、氧化酶结果均为阳性。但三株菌对淀粉水解、蔗糖产酸、乳糖利用的结果 不一致。 ( 4 ) 通过不同温度对三株菌生长的影响试验可得：菌株g s l 和g s 2 可在2 0 3 5 的环境中生长良好，菌株g s 3 在2 0 - 4 0 的环境中生长良好，三株菌最适宜生长 的温度范围是2 5 3 0 ，属于中温菌。 ( 5 ) 通过不同p h 对菌株的生长的影响试验可得：不同p h 对菌株的影响非常明显， 在酸性条件下三种菌的生长均受到明显的抑制，三者均适于在碱性环境( p h 为6 - 1 1 ) 中生长，但是每种细菌的最适p h 各不相同。菌株g s l 和g s 2 的最适p h 为8 ，菌株 g s 3 的最适p h 为9 。 ( 6 ) 经过形态观察、生理生化实验以及1 6 sr d n a 序列分析及同源性比对，菌 株g s l 与p s e u d o m o n a ss p 的相似性为9 9 ，可以初步判定为假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a ss p ) ；菌株g s 2 和g s 3 与h a l o m o n a ss p 的相似性为9 9 ，可以初步判 定为盐单胞菌属( h a l o m o n a ss p ) 。假单胞菌已经多次被报道具有异养硝化功能，而 关于盐单胞菌的异养硝化功能目前很少报道，该菌种具有较高的研究价值。 4 5 第四章菌株的异养硝化特性 第四章菌株的异养硝化特性研究 污水生物脱氮是目前水处理领域中关注和研究的热点，随着人们对生物技术的 掌握，在污水处理领域中，生物脱氮技术从单纯的工艺改革向着以生物学特性研究 并促进工艺改革的方向发展，以达到高效低耗的处理水平。 生物学认为，硝化过程不仅可由自养菌完成，一些异养菌也可参与硝化作用。 与自养硝细菌化相比，异养菌不仅生长速率快，细胞产量高，而且在生态环境要求 方面，适应能力较强，无论是p h 值还是温度，其范围均较自养硝化菌大。目前研 究已证实，很多异养菌同时具有好氧反硝化作用，异养硝化微生物的发现解决了传 统生物脱氮处理启动时间长，硝化环节条件要求苛刻，硝化和反硝化不能同步进行 等缺点，提高了异养硝化作用在污水脱氮中的应用价值。 关于异养硝化作用，目前仍有很多机理未得到解释，对一些现象的解释也不尽 圆满，因此日益受到研究者的关注n 惦1 0 9 1 。本实验从成熟耐盐活性污泥中分离出的三 株嗜盐异养硝化细菌，研究了菌株的氨氮去除性能，探讨了三株异养硝化菌的脱氮 机理，并测定了三株菌适宜生长的盐度范围，以及盐度对氨氮去除的影响，旨在为 高盐废水的异养硝化处理提供技术支持，同时为高盐环境下开发新型异养生物脱氮 技术提供理论依据。 4 1 菌株的异养硝化性能 将通过筛选得到的三株嗜盐异养硝化细菌活化后分别接种于灭过菌的异养硝化 培养基( 盐度2 ) 中，于3 0 。c 、1 2 0 r m i n 的条件下好氧培养，每隔- d , 时取样，样 品经离心分离后测定c o d 、n h 4 + - n 、t n 、n 0 3 - n 和n 0 2 - n 含量的变化及菌株的 生长量，所有结果均用空白溶液做对比。 图4 1 菌株g s l 的生长曲线与c o d 浓度的变化曲线 图4 1 体现出了菌株g s l 的生长吸光度值和c o d 含量的变化趋势。在最初的几 4 7 青岛大学硕士学位论文 个小时里，c o d 含量随着o d 6 0 0 值的增长迅速减少，这表明异养硝化细菌g s l 能利 用培养基中的碳源获得能量进行自身生长，这是一个同化合成的过程。1 6h 时，细 菌生长量达到最大值，此时o d 6 0 0 值为1 7 8 2 。随着细菌的快速增殖，培养液中的营 养物质被大量消耗，致使细菌增殖速度减慢，o d 6 0 0 值基本保持稳定，同时c o d 含 量也不再明显变化。经过3 6h 后，c o d 含量有最初的8 2 3 5 7 m g l 降低到2 0 8 1 4 m g l ， 去除率为7 4 7 3 。以上结论表明菌株g s l 可以充分利用有机碳源合成生命体，具有 异养生物的性质。 图4 2n k , + - n 、t n 、n 虢一- n 和n t h 一- n 浓度变化曲线 从图4 2 中n h 4 + - n 、t n 、n 0 2 - - n 和n 0 3 。- n 含量的变化趋势可以表明菌株g s l 具有异养硝化的性能。经过3 6h 的好氧培养后，n h 4 + - n 浓度由最初的1 0 8 7m g l 降低到1 8 9m g l ，去除率为8 2 6 1 。t n 由1 2 6 9m g l 降至3 3 7m g l ，一去除率为 7 3 4 4 。 如图所示，实验前1 2 h 内，n h 4 + - n 含量从1 0 6 7m g l 1 降低到7 5 4 3m g l 一，c o d 从8 2 3 5 7m g l 以降低到4 2 9 1 8m g l ，氨氮的降解趋势和c o d 的降解趋势基本一致， 说明此段时间内菌株g s l 利用培养基中的碳源、氮源及其他营养物质进行快速繁殖。 1 6h 后氨氮浓度趋于稳定，这与c o d 浓度和o d 6 0 0 值的变化趋势一致。w e h r f r i t z 等n 1 0 1 提出异养硝化代谢理论，认为异养菌在利用氨单加氧化酶氧化成亚硝酸盐的过 程中，并没有把电子通过细胞色素复合物传递给辅酶q ，因此辅酶q 是通过外加还 原性有机碳源的氧化来得到电子，从而恢复进行催化反应后的a m o 。因此，异养硝 化菌对氨氮的去除和对外加有机碳源的去除是相偶联的，这对于其应用于实际的污 水处理工程有重要的意义，异养硝化菌对有机碳源的需求性可以克服传统硝化池不 耐有机负荷冲击的缺陷，并且为提高同步脱氮系统的氨氮去除率提供了可能性。氨 氮和c o d 的同时降解也是异养型硝化区别于自养硝化的重要特征。 从第6h 到1 6h 期间，系统内n h 4 + - n 降低了5 4 5 3m g l ，t n 降低了4 6m g l ， 菌体生长吸光度增j j n n 最大值1 7 8 2 。表明处于对数生长期时的菌体生命活动最为旺 第四章菌株的异养硝化特性 盛，生长繁殖和氨氮去除的速率也最快。 从1 6h 以后，由于营养物质的耗尽和有毒代谢产物的积累，菌体活性降低并逐 渐出现死亡，菌株g s 2 的生长吸光度值有所下降，即此时系统内的菌体逐渐进入衰 亡期。大量的死亡细菌释放内源有机物，使c o d 和氨氮浓度趋于稳定，而t n 仍有 较明显的降低。由于t n 在测定时包含了菌体同化作用所利用的氮源，所以t n 去 除率可基本上认为是菌体异化作用从系统中所去除的氮的总量，由此可以证明，菌 株g s l 是一株在好氧条件下能同时完成硝化和反硝化脱除氮的异养菌。一 从图4 2 中可以看出，整个实验期间没有检测到n 0 3 - n 的生成，n 0 2 - n 的最大 积累量为1 9 6 m g l 。实验前期n 0 2 - n 含量的变化不明显。6h 后，n 0 2 - - n 含量逐 渐增加，在1 2h 时，达到高峰为1 9 6 m g l ，此后又继续降低。n 0 2 - - n 含量的这种 变化可能是因为：6 h 后，细菌进入对数生长期，硝化作用发生，使氨氮含量继续下 降，从而引起n 0 2 - n 含量的增加。过程中n 0 2 - n 的浓度一直处于很低的水平，这 与l e s l e y 妇的结论相同。l e s l e y 等认为通过测定异养硝化细菌积累亚硝酸盐的量来 确定该菌体的硝化强度，得出的数据往往很小，主要是由于一些异养硝化细菌能同 时进行反硝化作用，硝化作用与反硝化作用处于一种平衡的状态，使得亚硝酸盐不 能在溶液中有大量的积累，本研究的结果与之相符。由此也可知该菌反硝化作用主 要发生在菌株生长的对数期。 图4 3 菌株g s 2 的生长曲线与c o d 浓度的变化曲线 图4 4n i i + - n 、t n 、n 0 3 - - n 和n m 一- n 浓度变化曲线 4 9 但t n 含量仍有明显降低，由此同样证明，菌株g s 2 也能在好氧条件下同时完成硝 化和反硝化脱除氮。 从图4 4 中可以看出，实验前期，n 0 2 - n 和n 0 3 - n 含量的变化均不明显。8h 后， 系统内n 0 2 - n 含量逐渐增加，在1 2h 时，达到高峰为1 8 9 m g l ，此后又继续降低。 菌株g s 2 中n 0 2 - n 的变化趋势与菌株g s l 中n 0 2 - n 的变化趋势相一致，证明试验 8 h 后，细菌进入对数生长期，硝化作用发生，使氨氮含量继续下降，从而引起n 0 2 - n 含量的增加，过程中n 0 2 - - n 的浓度一直处于很低的水平，是由于菌株g s 2 能同时进 行好氧反硝化作用，将代谢过程中产生的n 0 2 - n 还原成气体从系统中逸出。 由此可以看出，菌株g s 2 与菌株g s l 具有相同的异养硝化特性。经过2 4h 的好 氧培养后，菌株g s 2 使n m + - n 浓度由最初的1 0 6 7m g l 降低到2 0 3m g l ，去除率 为8 0 9 7 ：t n 由1 2 9 8m g l 降至3 3 6 7m g l ，去除率为7 4 1 1 ；c o d 含量有最 初的8 3 3 6 m g l 降低到2 0 9 6 m g l ，去除率为7 4 8 6 。 图4 5 菌株g s 3 的生长曲线与c o d 浓度的变化曲线 图4 6m + - n 、t n 、s t h - n 和n t h 一- n 浓度变化曲线 从图中可以看出，实验前几个小时内，菌株g s 3 利用培养基中的碳源、氮源及 其他营养物质进行繁殖，使氨氮、t n 和c o d 含量同时降低。大约8 h 后，细菌均 进入对数生长期，此时菌体生命活动最为旺盛，使氨氮、t n 和c o d 含量继续同时 迅速降低。2 4h 时，细菌生长量达到最大，其o d 6 0 0 值为1 6 5 1 。这表明菌株g s 3 可 以充分利用有机碳源合成生命体，具有异养生物的性质。此后，随着细菌的快速增 殖，使培养液中的营养物质被大量消耗和有毒代谢产物积累，细菌增殖速度减慢， 菌体逐渐进入衰亡期，o d 6 0 0 值基本保持稳定，同时c o d 和氨氮含量也不再明显变 化，但t n 含量仍有明显降低，由此同样证明，菌株g s 3 也能在好氧条件下同时完 成硝化和反硝化脱除氮。 从图4 6 中可以看出，菌株g s 3 的系统内并无n 0 2 - n 的积累，3 6h 内，n 0 2 - n 和n 0 3 - n 的含量几乎都检测不到。分析其原因可能是因为菌株g s 3 与菌株g s l 和g s 2 所走的氨氮氧化路线都不同，菌株g s 3 在亚硝酸盐还原酶( n i r ) 没有被诱导激活的 时候，可能并不选择将n h 4 + - n 依次转化为n h 2 0 h 、n 0 2 - - n 、n o 、n 2 0 和n 2 的路 径，而是在h a o 的作用下将n h 2 0 h 直接转化为n 2 0 和n 2 排出水体所以系统中没 有n 0 2 - n 的积累。 由此可以看出，菌株g s 3 的系统内，n i 比+ - n 浓度由最初的1 0 7 1m g l 降低到 1 5 6m g l ，去除率为8 5 4 3 。t n 由1 2 6 8m g l 降至3 2 5m g l ，去除率为7 4 0 7 ； c o d 含量有最初的8 1 9 6 m g l 降低到2 3 4 1 m g l ，去除率为7 1 4 4 。 综上所述，三柱菌在有机碳源脱氮过程中主要进行了异性化脱氮，同时避免了 硝酸盐、亚硝酸盐等带来的危害，真正实现了水体的完全脱氮。菌体在脱氮过程中 t n 的去除率较高，证明过程中同化的氨氮所占比例不高，这意味着在次过程中菌体 生物量的增长并不高，这与r o b e r t s o n n l 2 1 等的报道相符。菌体对底物的高去除率和生 物量的低增长率在废水处理中有很大的优点，一方面既高效去除了污染物，另一方 面也减少了二次污染，降低了成本。 青岛人学硕+ 学位论文 另外，较高的t n 去除率、较低的n 0 2 - n 和n 0 3 - n 积累可以推断出三株异养 硝化菌可能同时具有较强的好氧反硝化能力，使系统内发生了异养硝化好氧反硝化 同步脱氮现象，这一点将在下一章的实验中进一步证明。 4 2 脱氮的可能途径 r i c h a r d s o n 等盯0 7 q 在对可以脱氮的异养硝化菌进行深入研究后，对其脱氮途径做 出了推测，认为有2 条可能的途径：n h 4 + n 在a m o 酶作用下转化为n h 2 0 h ， n h 2 0 h 在羟胺氧化酶作用下转化为n 2 0 和n 2 ；细菌将n h 4 + - n 氧化生成n h 2 0 h 后，n h 2 0 h 转化为n 0 2 。，n 0 2 。转化为n 0 3 的硝化过程，n 0 3 - 经反硝化转化为n o ， n o 转化为n 2 0 ，最后转化为n 。 n o r n h 3 n 。n i t r i f i c a t i o n 。d e n i t d f i c a t i o n m p e n z y m ec a t a l y s i s 图4 7r ic h a r d s o n 提出的一样硝化脱氮假想途径 在菌株g s l 和g s 2 代谢氨氮的过程中，n 0 2 - n 和n 0 3 - n 的含量非常少，说明菌 株g s l 和g s 2 可能是通过r i c h a r d s o n 的假想途径完成的；而过程中n 0 2 - - n 含量的 先增加后减少，出现了一个小高峰，说明有- d , 部分氨氮可能是通过r i c h a r d s o n 的 推测途径完成的。过程中没有检测到n 0 3 - n 的含量，可能是因为只有- - d , 部分的 n 0 2 - n 转化为n 0 3 - n ，n 0 3 - - n 的产生又诱导产生硝酸盐还原酶迅速进行硝酸盐呼 吸，将其又转化为了n 0 2 。- n ；或者是因为n 0 2 - n 亚硝酸盐还原酶的作用下直接进 行了反硝化转为了气体，从系统中逸出。所以，菌株g s l 和g s 2 代谢氨氮的过程是 由两条可能途径共同完成的。同时，这两条途径相互补充，硝酸盐和亚硝酸盐不仅 可以通过第2 条途径反硝化生产氮气，而且可以先逆生成羟胺，然后通过第一条途 径生成氮气。目前，这2 种途径间的相互关系尚未得到很好的解释，有关研究也在 继续深入过程中。 而菌株g s 3 在代谢氨氮的过程中，未检测到n 0 2 - - n 和n 0 3 - n 含量积累，说明 菌株g s 3 可能全部是通过r i c h a r d s o n 的推测途径完成的。m o i r n l 3 1 的硝酰基自由结 合理论认为，n h 2 0 h 可以与h a o 上活性位点的双核中心f e ”f e ”反应生成n o h 和f e 2 + f e 2 + ，然后f e 2 + f e 2 + 给出电子供细胞色素c 5 5 0 还原，同时两分子n o h 直接 5 2 第四章菌株的异养硝化特性 结合生成n 2 0 和h 2 0 。造成菌株g s 3 这种氨氮代谢模式的原因可能是菌体在长时间 对外界特殊环境( 如高盐环境) 进行调整和适应的过程中，逐渐形成的优先选择氮 素转化过程中最便捷的代谢方式。这样可以在最短的时间内最大限度的利用环境中 的资源进行生长繁殖，以免被环境中的其他微生物淘汰。 综上所述，异养硝化菌在代谢氨氮的过程中，大部分氨氮可以避免将n 0 2 一- n 氧化为n 0 3 一- n 再将n 0 3 - - n 还原为n 0 2 - - n 的环节，从而使异养硝化效率比自养硝 化效率更高。 4 3 盐度对异养硝化作用的影响 一般来讲，传统微生物在处理低盐度废水时具有很大的优势，但当废水中的盐 浓度过高时，会造成生物代谢的抑制和毒害，使微生物失去降解能力，而接种或投 加耐盐微生物处理高盐废水是一种有效的处理方法。此方法可以处理含盐量高于3 的高盐废水，这是传统生物法( 污泥直接驯化法) 无法实现的n 1 4 1 。 本实验筛选细菌所用的活性污泥是在海水比例为7 0 的条件下运行的，所以本 实验采用了n a c l 浓度为2 的培养基。为了考察不同盐度对菌株g s l 、g s 2 和g s 3 异 养硝化能力的影响，实验设了0 、2 、5 、7 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 共8 个不 同盐度，实验结果如图4 8 4 1 3 所示。 图4 8 菌株g s l 在不同盐度下的生长曲线 5 3 增加，菌体生长速率逐渐减缓，停滞期逐渐增长。当盐度为o 5 时，经过大约8 h 的停滞期后，菌株进入对数生长期，在1 6 2 4 h 左右，菌体生长吸光度值达到最高峰， 对氨氮的降解率也均可达到8 0 以上；当盐度为7 时，停滞期增加，4 8 h 左右，茵 体生长吸光度值达到最高峰，其o d 6 0 0 值可高达1 8 0 6 ，高于2 盐度下的最大o d 6 0 0 值，经过5 6 h 的培养，对氨氮的降解率可达8 6 0 1 。 在盐度为0 时，菌株g s l 生长良好，但其生长吸光度最大值小于盐度为2 下的 最高o d 6 0 0 值，说明其最佳生长条件需要一定的盐度，在菌体生长繁殖的时候需要 一定浓度的k + 、n a + 、s 0 4 2 - 等无机离子，完全无盐的环境对于菌体的新陈代谢和酶 的合成并不利，应属于广域嗜盐菌。 图4 1 0 菌株g s 2 在不同盐度下的生长曲线 第四章菌株的异养硝化特性 图4 1 1 不同盐度下对菌株g s 2 硝化性能的影响 由上图可以看出，菌株g s 2 在n a c i 浓度为0 - 2 0 时均能生长，具有很强耐盐和 适应盐浓度变化的能力，2 1 0 是比较适宜的培养浓度。因此，g s 2 属于中度嗜盐菌 口 。在盐度为0 时，菌株g s 2 生长良好，但其生长吸光度最大值小于盐度为2 下的 最高o d 6 0 0 值：随着盐度的增加，菌体生长速率逐渐减缓，停滞期逐渐增长。当盐 度为0 - 7 时，经过大约8 h 的停滞期后，菌株进入对数生长期，在2 4 h 左右，菌体 生长吸光度值达到最高峰，对氨氮的降解率也均可达到8 0 左右；当盐度为1 0 时， 停滞期增加，4 0 h 左右，菌体生长吸光度值达到最高峰，其o d 6 0 0 值可高达1 5 6 ，但 对氨氮的降解率却没有相应的提高，5 6 h 后对氨氮的降解率只有5 8 1 。分析其原因 可能是：当盐度升高到一定范围时，菌体需要更多的营养物质来调整自身的耐盐机 制，胞外多聚物的分泌以及氨基酸、嘧啶等小分子相容性