（食品科学专业论文）菊粉内切酶产生菌的选育鉴定及其发酵条件优化.pdf

摘要 摘要 低聚果糖具有显著的营养和保健功能。研究菊粉内切酶水解菊粉生产低聚果 糖，选育菊粉内切酶高产菌株，是功能性低聚糖研究中的热点课题。 本文的工作内容和研究成果主要有以下方面： 产菊粉内切酶菌株的分离筛选及鉴定：从西北农林科技大学生物园土壤 中采样，以菊粉为底物，松三糖为选择性鉴别碳源，平板分离纯化出6 株 产菊粉内切酶菌株。以酶活i s 值作为复筛标准，筛选出2 株产菊粉内切酶 酶活相对较高的菌株，标记为n c m 和n s y 5 ，它们的摇瓶初始酶活i s 值分别 为1 7 8 2 ，1 2 4 0 。通过菌落形态、菌丝及孢子形态以及生理生化特性分析，初步 鉴定命名为：柱隔孢霉r a m u l a r i an c m 和克鲁维酵母k l u v e r o m y c e sn s y 5 。 发酵条件优化研究：在单因素实验基础上，采用p l a c k e t t b u r m a n 实验设 计对影响k l u v e r o m y c e sn s y 5 发酵产菊粉内切酶的碳源、氮源、无机盐、发酵时 间等8 个选择因素进行评估，结果显示培养基的菊芋汁浓度、摇瓶装液量和发酵 时间对菌株发酵产酶具有显著影响。根据实验结果和经验方法对显著影响因素的 优化取值范围进行预估，用b o x b e h n k e n 中心组合实验和响应面寻优分析找出 显著影响因素的极优值，验证实验结果显示，采用优化的菊芋汁浓度3 5 、装 液量5 0 m l 2 5 0 m l 、发酵时间5 6 h ，k l u v e r o m y c e sn s y 5 摇瓶发酵液中的菊粉内切 酶i s 值达到1 8 2 9 ，比初始发酵条件下的菊粉内切酶i s 值1 2 4 0 提高4 7 5 0 ， 优化预测值和实验验证值的相对误差为0 2 6 。 菌株诱变育种研究：以菌株k l u v e r o m y c e sn s y 5 为出发菌，经u v ( 2 0 w 、 距3 0 c m 辐照1 1 0 s ) 、微波辐射1 5 m i n 协同多轮诱变处理，选育出一株突变株 k l u v e r o m y c e s n s y 5 4 w ，其发酵菊粉内切酶酶活( i s ) 较出发菌株提高了3 2 9 5 。 关键词：克鲁维酵母k l u v e r o m y c e sn s y 5 ；低聚果糖：内切菊粉酶；选育；响应 面优化 a b s t r a c t a bs t r a c t f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e sh a v es i g n i f i c a n tn u t r i t i o na n dh e a l t hf u n c t i o n s t h e r e s e a r c ho fi n u l i nh y d r o l y s i sf o rf r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e sp r o d u c t i o n ，a n dt h eb r e e d i n g o fe n d o i n u l i n a s e - p r o d u c i n g s t r a i n s ，a r e h o tt o p i c si n t h e s t u d yo ff u n c t i o n a l o l i g o s a c c h a r i d e s m a i nc o n t e n t sa n dr e s e a r c hr e s u l t si nt h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fe n d o i n u l i n a s e p r o d u c i n gs t r a i n s ：w i t h j e r u s a l e ma r t i c h o k es o i l s a m p l e df r o mn o r t h w e s tu n i v e r s i t y b i o l o g i c a lp a r k ，s i x e n d o i n u l i n a s e - p r o d u c i n gs t r a i n sa r ei s o l a t e db yt h ep r i m a ls c r e e n i n go na g a rp l a t e s ，i n w h i c hi n u l i nw a ss o l ec a r b o ns o u r c ea n dm e l e z i t o s ew a su s e da st h ei d e n t i f i c a t i o n c a r b o ns o u r c e a f t e rr e s c r e e n i n gb a s e do ni sv a l u e s ，t w oe n d o i n u l i n a s e - p r o d u c i n g s t r a i n sw i t hh i g h e ri sv a l u e sw e r eo b t a i n e d ，a n dw h i c ha l el a b l e dn c ma n dn s y 5 t h ei n i t i a le n d o i n u l i n a s ea c t i v i t i e s ( u sv a l u e ) p r o d u c e db yn c ma n dn s y 5r e a c h e d 1 7 8 2a n d1 2 4 1 r e s p e c t i v e l y t h r o u g ha n a l y z i n g a n d c o m p a r i n g o f c o l o n y m o r p h o l o g y , m y c e l i u ma n ds p o r e sm o r p h o l o g y , b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，t h es t r a i n s n c ma n dn s y 5w e r ei d e n t i f i e da sr a m u l a r i an c ma n dk l u v e r o m y c e sn s y 5 p r e l i m i n a r i l y ( 多f e r m e n t a lc o n d i t i o n so p t i m z a t i o no fe n d o i n u l i n a s e p r o d u c i n gs t r a i n s ：0 nt h e b a s i so fs i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t s ，e i g h tf a c t o r sa f f e c t i n gt h ee n d o i n u l i n a s e - p r o d u c i n g a c t i v i t yo fy e a s tk l u v e r o m y c e sn s y 5w e r ee v a l u a t e db yp l a c k e a - b u r m a nd e s i g n ，t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h em e d i u mc o n c e n t r a t i o no fj e r u s a l e ma r t i c h o k e j u i c e ，l o a d e dl i q u i d a n df e r m e n t a t i o nt i m eh a dn o t a b l ei n f l u e n c et ot h e e n d o i n u l i n a s e - p r o d u c i n ga c t i v i t y ac e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nb o x b e h n k e nw a s e m p l o y e dt oo p t i m i z et h es i g n i f i c a n tf a c t o r ss c r e e n e da n dt h er e s u l t sw e r es h o w ni n r e s p o n s es u r f a c ep l o t s t h ev a l i d a t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a t ，w i t h3 5 j e r u s a l e m a r t i c h o k ej u i c e ，l o a d e dl i q u i d5 0 m l 2 5 0 m la n d5 6h o u r sf e r m e n t a t i o nt i m e ，t h ei s v a l u eo fe n d o i n u l i n a s ea c t i v i t yp r o d u c e db yy e a s tk l u v e r o m y c e sn s y 5r e a c h e d18 2 9 ， w h i c hh a si n c r e a s e d4 7 5 0 t h a nt h a tp r o d u c e di nt h ei n i t i a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s i i i a b s t r a c t 功er e l a t i v ee r r o ro ft h ei sv a l u ep r e d i c t e da n dt h ee x p e r i m e n t a lv e r i f i c a t i o nv a l u e w a s0 2 6 m u t a t i o ne n d o i n u l i n a s e p r o d u c i n gs t r a i n s ：c h o o s i n gk l u v e r o m y c e sn s y 5a s s t a r t i n gs t r a i n ，am u t a n tn a m e dn s y 5 4 ww a sb r e e d e dt h r o u g hi n d u c i n gm u t a t e t r e a t m e n tb yu l t r a v i o l e tl i g h t ( 11 0s e c o n d sw i t h2 0 wu vl i g h ti n3 0 c md i s t a n c e ) a n d m i c r o w a v el i g h t ( 15m i n u t e s ) w i t hr e p e a t e ds y n e r g i s t i cm u t a t i o nt r e a t m e n t ，t h ei s v a l u ep r o d u c e db yk l u v e r o m y c e sn s y 5 4 wi n c r e a s e d3 2 9 5 t h a nt h a to ft h eo d g i n a l s t r a i n k e yw o r d s ：k l u v e r o m y c e sn s y 5 ；f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e ；e n d o i n u l i n a s e ；b r e e d i n g ；r e s p o n s e s u r f a c eo p t i m i z a t i o n i v 目录 目录 第一章绪论1 1 1 概j 苤1 1 2 国内外低聚果糖的研究现状与应用前景4 1 2 1 国外低聚果糖的研究现状4 1 2 2 国内低聚果糖的研究现状6 1 2 3 低聚果糖的应用前景7 1 3 菊粉低聚果糖研发的意义与前景9 1 3 1 从甜昧剂与人体健康营养关系分析。1 0 1 3 2 从蔗糖行业现状分析。1 0 1 4 制取低聚果糖的原料刁宥粉1 0 1 4 1 菊粉概述。ll 1 4 2 菊粉物化性质1 l 1 4 3 菊粉生理特性12 1 5 菊粉内切酶概述1 2 1 5 1 菊粉水解酶系的组成12 1 5 2 菊粉水解酶的酶学特性一1 3 1 5 3 菊粉内切酶的作用机理1 3 1 5 4 产菊粉内切水解酶的微生物1 4 1 5 5 菊粉内切酶活力测定方法1 4 1 6 课题来源及研究意义15 1 6 1 课题来源15 1 6 2 本课题研究的内容15 1 6 3 本课题研究的意义15 第二章菊粉内切酶产生菌的筛选与鉴定1 6 2 1 材料与方法1 6 v 目录 2 1 1 材料1 6 2 1 2 实验方法18 2 2 结果与讨论2 0 2 2 1 筛选菌株形态学分析与鉴定1 2 0 2 2 2 筛选菌株内切酶酶活。2 3 2 3 结论2 3 第三章产菊粉内切酶酵母k l u v e r o m y e e sn s y 5 发酵条件优化研究。2 4 3 1 材料与方法2 4 3 1 1 材料2 4 3 1 2 实验方法2 5 3 2 结果与讨论2 5 3 2 1 不同碳源对发酵菊粉内切酶活力的影响。2 5 3 2 2 不同氮源对发酵菊粉内切酶活力的作用2 5 3 2 3p l a c k e t t - b u r m a n 设计实验筛选显著影响因子2 6 3 2 4 显著因素取值的b o x - b e h n k e n 设计优化实验2 8 3 2 5 优化发酵条件的响应面拟合与实验验证3 0 3 3 结论3 2 第四章产菊粉内切酶酵母k l u v e r o m y c e sn s y 5 的诱变选育3 4 4 1 材料与方法。3 4 4 1 1 材料3 4 4 1 2 实验方法3 5 4 2 结果与讨论。3 6 4 2 1 菌体的生长曲线3 6 4 2 2 紫外诱变结果3 7 4 2 3 紫外线与微波复合诱变结果3 9 4 3 结论4 0 第五章结论与展望4 l 5 1 结论4 1 5 2 展望4 2 v i 目录 参考文献4 3 致 射4 7 攻读学位期间的研究成果4 8 v 儿 第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 低聚糖又称寡糖，包括普通性和功能性两类，是由2 l o 个同种或不同种 单糖分子构成的聚合物，分子量约为2 0 0 - - 3 0 0 0 。普通低聚糖有麦芽糖、蔗糖、 乳糖、海藻糖、麦芽三糖等，这些糖可以被人体消化吸收，对肠道有益菌并无 生长促进作用；功能性低聚糖其单糖分子间是以糖苷键聚合而成，如低聚果糖、 低聚异麦芽糖、低聚木糖、大豆低聚糖、低聚龙胆糖等，首先由于其糖分子相 互结合位置特殊，在人或动物体内找不到相应的代谢酶系，因此不能被人体胃 酸、胃酶降解；其次功能性低聚糖不作为能量供体，不在小肠内吸收，直接到 达大肠部；并发挥以增殖体内双歧杆菌为主的众多保健功能。因此，功能性低 聚糖因具有独特的生理功能而成为一类新兴的功能性食品基料，并被单独制成 或添加于食品中【。 低聚果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e ，简称f o s ) 是一类非常重要的功能性低聚 糖。低聚果糖又称蔗果低聚糖或寡果糖，分子式为g f f n ，n = l 3 或f m ，m - - 2 - - - 7 ( g 为葡萄糖基，f 为果糖基) ，是指果糖基以1 3 2 1 糖苷键与蔗糖中的d 一果糖基 结合而成的蔗果三糖( g f 2 ) 、蔗果四糖( g f 3 ) 、蔗果五糖( g f 4 ) 和蔗果六糖( g f s ) 混合物【2 l ，或者是由果糖单体通过1 3 一糖苷键连接成的不被内源酶水解的果糖聚 合物。低聚果糖广泛存在于自然界中，如细菌、酵母、洋葱、香葱、小麦、黑 麦、燕麦、牛蒡、菊芋、香蕉、梨、蜂蜜、啤酒等都含有f o s ，其中菊粉中的低 聚果糖含量最高，大约占9 2 左右p j 。 低聚果糖是完全符合益生元标准的典型双歧因子，是优良的水溶性膳食纤 维，也是人体保健功能领域试验最为深入详尽的寡糖之一。低聚果糖能抗龋齿： 口腔中的有害微生物( 主要是变异链球菌s m u t a n s ) 通过分泌葡萄糖转移酶，将口 腔食物中葡萄糖转化为葡聚糖，附着于牙齿表面而形成牙垢，进而导致龋齿， 低聚果糖难以被口腔唾液分泌的消化酶分解，不会被变异链球菌发育所利用， 在一定程度上抑制葡萄糖转移酶，从而起到预防龋齿的作用。低聚果糖能降血 脂、降胆固醇：功能性低聚果糖具有难消化、低甜度及低热量等特性，进入人 体中不易被转化为脂肪和胆固醇，通过降低肝脏中脂肪酸的合成而实现降低血 以蔗糖为原料，呋喃果糖苷酶催化合成低聚果糖 在菊芋资源贫乏的地区，主要是采用蔗糖酶法生产低聚果糖。目前全球低 聚果糖的生产大户之一法日合资的b m i ( b e g l l i n m e i j ii n d u s t r e e ) 公司即是采用蔗 糖酶法生产低聚果糖。国内企业如量子高科生物工程公司也采用此法生产低聚 果糖。蔗糖酶法即以蔗糖为基料，在5 0 6 0 浓度、p h ：直5 5 、温度6 0 左右 2 第一章绪论 条件下，蔗糖经微生物产生的p 一果糖基转移酶或者p 一果糖苷酶催化作用转化生 成低聚果糖，其结构是g f n 型低聚果糖( g 是葡萄糖分子，f 是果糖分子，n 是果糖 分子数目) ，且反应式如下： g f ( 蔗糖) + g f _ g f f ( 蔗果三糖) + g ( 葡萄糖) ； g f f + g f - - - ，g fff ( 蔗果四糖) + g ； g fff + g f - g fff ( 蔗果五糖) + g ； 无论f m 型或g f 。型低聚果糖，其生理机能是相同的，只是短链聚合度低的低 聚果糖比长链高聚合度的低聚果糖更容易发酵，和被双歧杆菌利用。产品中常 含有少量的蔗糖、葡萄糖和果糖的混合物，如需制得高浓度低聚果糖，必须将 其中的蔗糖、葡萄糖和果糖的混合物分离除去【6 7 】。 利用菊粉或菊芋提取物原料生产低聚果糖的微生物菊粉内切酶法，比以蔗 糖为原料生产低聚果糖的吠喃果糖苷酶法，主要有以下几方面优势：首先菊粉 资源丰富且价格低廉，适合工业化生产【8 j ；其次工业上利用微生物菊粉内切酶 水解菊粉生产f o s 纯度高，主产物低聚果糖含量达9 3 - - - 9 7 ；第三，每个 菊糖分子只含一个葡萄糖分子，后期处理较易进行( 纯酶控制水解产物中葡萄糖 含量可q 5 ) 。 自然界中许多微生物能够产生菊粉内切酶，如真菌、细菌、放线菌和 酵母菌等，但多数微生物所产菊粉酶为混合酶，因此筛选出产菊粉内切酶 的微生物或找到抑制混合酶中外切酶活性的方法，将是利用菊粉生产低聚 果糖的关键。据报道，在8 0 年代中后期，日本的三井东亚化学株式会社、比利 时的o r a f t ia c t i v ef o o di n g r e n d i e n t 公司、c o s u c r a 公司、荷兰的s e n s u s 公司等花大 力气开展微生物菊粉内切酶法生产f o s 的研究并取得一系列成果，尤其是o r a f t i a c t i v ef o o di n g r e n d i e n t 公司，在欧洲人认识n f o s 的生理作用并逐渐接受该产品 的情况下，斥巨资开发菊芋加工产品，目前已形成年产6 0 0 0 0 t 的生产规模；我国 菊粉内切酶的研究始于9 0 年代初，目前已有一些关于菌株筛选、诱变育种、 酶的分离提纯及酶学性质研究、实验室小规模发酵方面的报道，但由于产酶 菌株菊粉内切酶产量低，产酶成本高，使得绝大多数成果仍只能停留在实验 室研究阶段，一直都不能实现工业化生产。因此，筛选出高产菊粉内切酶菌 株并应用于工业化生产，对我国低聚果糖产业的发展具有重要意义【8 , 9 , 1 0 】。 第一章绪论 1 2 国内外低聚果糖的研究现状与应用前景 1 2 1 国外低聚果糖的研究现状 1 2 1 1 日本 国际上，功能性低聚糖以日本开发较早，品种也最多，其产品质量也是各 国企业作为参照的标准。1 9 6 1 年日本开始研究利用a 淀粉酶液化和葡萄糖淀粉酶 糖化的双曲法生产结晶葡萄糖；1 9 6 5 年日本的高崎义辛从土壤中成功分离出能 利用木聚糖或鼓皮等为碳源的白色链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b u s ) ，其产异构酶产量 高、性质好，使得异构酶生产成本大大降低；1 9 6 6 年日本首先利用这种异构酶 生产果葡糖浆；1 9 7 7 年日本通过应用已经产业化的离子交换树脂或无机吸附剂 将葡萄糖和果糖分离而得到了高果糖；1 9 8 2 年日本日高秀昌等利用含有果糖转 移酶的微生物实现了低聚果糖的生产，并于1 9 8 3 年进入日本市场；日本厚生省 自1 9 9 1 年开始设立特定保健用食品，包括调整肠道功能、防龋齿、降压、降血 脂、预防骨质疏松等功能；1 9 9 5 年批准的5 8 种“特定保健用食品 中有9 种是低 聚果糖产品；2 0 0 3 年日本特定专用保健食品f o s h u ( 低聚糖) 市场达到5 4 亿美元， 比2 0 0 1 年增长3 7 6 ：其中用于改善肠道功能的3 4 5 6 亿美元，占6 4 ，用于控制 体重1 1 2 ，调节血糖4 9 ，防龋齿1 4 2 ，骨健康2 1 ，调节血压1 6 ，调节 胆固醇2 。其终端产品中各种饮料占5 3 ，小食品1 3 1 ，肉鱼蛋白食品4 5 ， 汤类4 8 ，谷物食物5 8 ，糖片5 等【】。 近几十年来，日本低聚果糖市场一直处于开发成长期，低聚果糖已被视为 一种食品，每人每天都要摄入一定数量的低聚果糖。数据表明，低聚果糖在日 本2 0 0 0 年的产量已达到1 3 万t ，广泛应用于乳制品、乳酸菌饮料、饼干、冷饮、 面包、固体饮料糖果、果冻等各种食品中，以及应用于各种饲料配方中，具体 产品约有5 0 0 多种，而且需求量在逐年增加【1 2 1 。 1 2 1 2 欧美国家 2 0 世纪中后期，认知数据调查结果为日本7 0 ，法国1 6 ，德国9 ，英国 3 ，表明欧洲国家大部分消费者对功能性低聚果糖的认知度远远落后于日本， 虽然功能性低聚糖技术早己开始进入欧洲国家，但实现功能性低聚果糖的生产 应用比日本稍晚。 4 第一章绪论 随着低聚果糖特殊的生理特性和加工特性，欧洲等发达国家越来越重视低 聚果糖作为人类和动物食物的功能研究，吸引很多科教单位加入研究，如比利 时l o u v a i n 大学，荷兰w a g e n i n g e n 农业大学，荷兰t n o 、瑞典l u n d 大学，英国d u n n 临床研究中心等。欧洲等发达国家对菊粉内切酶大力研究，很快实现了菊粉低 聚果糖的工业化生产，如荷兰乳清产品b o r c u 公司和欧洲m i w o n 公司用乳制品工 业副产品乳清，经酶反应制取低聚半乳糖，产品不仅应用于乳品、饲料、糖果， 还用于婴儿食品；比利时r t 子公司o r a f i t 和法国l e r o u x 公司用水浸菊芋提取菊 粉，经菊粉内切酶水解生产低聚果糖；法日合资b m i ( b e g h i n - m e i j i l n d u s t r e s ) 公司， 则用比利时公司产蔗糖原料酶法生产低聚果糖。 在美国，从1 9 4 0 年开始，采用酸酶结合糖化工艺生产高甜度糖浆；1 9 5 0 年 b a c o na n de d e l m a n 及b l a n c h a r da n da l b o n 研究酵母转化酶( i n v e r t a s e ) ，分别独立 地发现了该转化酶具有水解作用和转移作用，并成功水解蔗糖得到蔗果三糖低 聚糖；1 9 5 2 年w h a l l e y 等人制得蔗果三糖；1 9 5 7 年m a r s h a l l 发现假单抱菌 ( p s e u d o m o n a sh y d r o p h i l a ) 能催化葡萄糖发生异构化反应转变成果糖，但转化率 低，不适于工业生产应用。随着微生物果糖转移酶法生产低聚果糖在美国实现 工业化生产和应用，2 0 0 2 年f o s 被f d a 批准作为公认级安全食品配料进入美国市 场，从此低聚果糖被喻为是继抗生素时代后最有潜力的一代添加剂促生物 质。 据报道，在2 0 0 0 年德国法兰克福的欧洲健康食品配料展览会上，功能性低 聚果糖的参展企业达到数十家，例如：荷兰b o r c u l o 、s e n s u s 、c a r g i l l 蛋白食品欧 洲分部：比利时e b s 、o l l f t i ；德国i g v 、k a d e n b i o c h e m 、v k m u h l e n 、法国l l e r o u x 、 s u c a f l o r e ：日本k i m i t s u ，中国量子高科，n i c h i m e n 等大型企业。 随着人们对健康意识的日益提高，功能性食品的需求量也在扩大，目前全 球功能性食品的市场每年的销售额达几百亿美元，其中全球最大的功能性食品 市场美国，年销售额已达1 0 0 亿美元，英国和德国达3 0 亿美元，意大利和法国也 有2 0 亿美元，巴西达到1 0 亿美元，所以低聚果糖产业的前景十分广阔【1 1 1 引。 1 2 1 3 国外低聚果糖研究存在的问题 国外低聚果糖虽然生产工艺成熟，所得低聚果糖产品技术含量相对较高， 但运用的分离纯化浓缩技术需有待进一步研究，且对菊粉内切酶重组菌种研究 仅涉足于实验室研究阶段，真正实现将其应用于工业化生产的企业很少，故为 了进一步提高低聚果糖产品纯度，还需更加深入的研究。 第一章绪论 1 2 2 国内低聚果糖的研究现状 1 2 2 1 现状 我国低聚果糖的研究与开发始于9 0 年代初，参与研究的学校主要有华 南理工大学、无锡轻工大学、东北林业大学。无锡轻工业大学承担了国家“九 五 重点攻关项目“酶法生产低聚果糖 ，研究得到的试产产品按干物质计， 低聚果糖质量分数可达51 - - - 5 5 ，这是目前国内唯一完成正常人体保健功能试 验，证明低聚果糖产品为功能性食品，能够双向调节人体肠道微生态。云南天 元国际有限公司将无锡轻工业大学的这项成果转化为生产力，投资1 5 0 0 万元建 成了年产3 0 0 0 t 的生产装置，顺利推出低聚果糖产品，并于1 9 9 8 年1 月获得由卫生 部批准的保健食品批准证书。国家科委课题“寡果糖开发”由中国食品发酵研 究所承担并经两年多的研究开发，1 9 9 7 年通过技术鉴定，现己形成年产寡果糖 6 0 t 生产线，技术采用自行筛选的黑曲霉，在1 5 0 0 l 发酵罐以蔗糖和少量无机盐为 原料一步转化为寡果糖，所得试验寡果糖质量分数平均达到4 5 9 8 。1 9 9 4 年广 西大学研制的蔗果低聚糖生产工艺技术，是利用微生物发酵法将蔗糖转化低聚 果糖，产品主要为蔗果低聚糖，其主要技术经济指标：蔗糖转化率为8 8 - 9 0 ， 糖浆中蔗果低聚糖含量为5 8 i m j 。天津市工业微生物研究所承担的菊粉酶研究项 目已通过天津市科委鉴定及验收，该成果中菌株菊粉内切酶发酵活力可达 8 5 p m l ，生产的低聚果糖含量为4 8 - - 5 4 。 我国食品业为第三大产业，占国民经济总产值的1 5 ，用于食品甜味剂有5 8 个3 0 0 0 多品种，低糖、低盐、低脂、低热量食品己广受欢迎，低聚果糖作为保 健品可用于婴幼儿及难消化的食品添加剂中以避免龋齿和成人心血管疾病的发 生，其发展前景是十分看好的。国内低聚果糖的生产已有一定的规模，产品质 量也已与国外大公司相差不多，但是国内发酵法生产技术水平的开发进展缓慢， 至今仍高价进口国外酶制剂，提取技术也制约着低聚果糖产业的发展，整体产 业抵御不过国际市场的风险，大多企业面对着严峻考验，需改善生产规模，提 高发酵生产技术水平，稳定产品质量【1 4 , 1 5 】。 1 2 2 2 国内低聚果糖研究和生产存在的问题 纯度9 0 以上的固体低聚果糖全部靠进口。 国内市场低聚果糖产品技术含量低，大都为粘稠状液体，产品一般是发酵液 经简单后处理直接投放市场。 6 第一章绪论 低聚果糖类产品有效成分含量低，一般为3 7 4 7 1 低聚果糖产品，由于后处理过程中无法去除原料蔗糖和其他副产物，降低了 保健功能； 贮存和运输成本高 因此，在提高生产技术同时，尽快解决低聚果糖的分离提纯浓缩问题，加 强对微生物菊粉内切酶的研究，筛选高产低聚果糖菊粉内切酶活力菌株，提高 市场竞争力1 1 5 j 。 1 2 3 低聚果糖的应用前景 从2 0 世纪8 0 年代后期开始，功能性低聚果糖在日本、欧美等发达国家逐 渐被人们所认识后，低聚果糖便作为健康食品的配料及优良的生理性能在世界 性保健食品中独树一帜。在日本和欧美市场上，用低聚果糖开发的食品多达 4 0 0 - - 5 0 0 种，包括乳制品、饮料、糕点、糖果、调味料及疗效食品等。 1 2 3 1 食品甜味剂 随着食品工业的迅速发展及人们生活水平的不断提高，低糖、低脂、低盐、 低热值的食品及食品甜味剂越来越受到人们的欢迎。低聚果糖被广泛地用于乳 制品、饮料、酒、糖果、糕点、调味品等食品中。 在冰淇淋中的应用 据有关报道，无蔗糖低脂肪低热量保健冰淇淋的设计配方是用低聚果糖和 山梨醇配比取代全部蔗糖。丘华等人选用胶体碳酸钙、功能性低聚果糖，生产 出口感较好，具有一定营养和保健作用的功能性冰淇淋i l 6 。 在乳制品中的应用 婴幼儿和中老年人消化道功能都不是很好，且容易缺钙，低聚果糖既有增 殖双歧杆菌功效，又有降血脂、降血糖、促进矿物元素吸收等功效，适合添加 在婴儿配方奶粉和中老年人奶粉中。在非发酵乳制品( 原乳、奶粉等) 中添加低 聚果糖可解决中老年人及儿童在补充营养时容易产生的上火和便秘问题；目前 市场上已有的添加了低聚果糖奶粉，如蒙牛、伊利、圣元、秦俑、金洋等产品， 婴儿奶粉中低聚果糖添加量3 5 为宣。 近年来，在发酵酸奶中添加低聚果糖等低聚糖的双歧因子保健酸奶很流行， 产品中低聚果糖为活菌提供营养源，增强活菌作用，延长酸奶保质期。 7 第一章绪论 在国内外市场上，风味乳饮料一直是以兼具乳香味和水果味两种风味形式 出现，现今加人少量低聚果糖，可增加乳饮料的营养和保健功能。在乳酸菌饮 料中添加低聚果糖，可提高乳酸菌饮料的营养和功能成分。而活性菌饮料虽然 含有一定量的有益菌，但经过人体消化道后便所剩无几，其营养保健功能极为 有限。 据市场报道，程涛等人生产出了以低聚果糖作为酸奶甜味剂的风味低热值 功能性酸奶。杭州娃哈哈集团将低聚果糖添加到新产品中，使得产品口味纯正， 口感良好，而且具有增加双歧杆菌、促进儿童饮食及生长发育、改善肠道菌群 的功效。 在糖果中的应用 以异麦芽低聚糖和低果聚糖为原料的新型甜源“双歧糖 ，其甜度相当于 蔗糖的2 - - 3 倍，热量低，不易被胃和小肠吸收，不会导致肥胖和龋齿，非常适 合忌食蔗糖者、肥胖者和婴幼儿。 1 2 3 2 保健品 作为益生素即双歧杆菌促生素 某些保健食品往往由于缺乏双歧杆菌促生素而达不到预期的效果，然而低 聚果糖作为益生素可克服这些缺陷，使得产品更加完美。例如在谷物产品中添 加低聚果糖，不仅可以得到高品质产品，而且可以延长产品的货架期。 作为活化因子，促进c a 、m g 、z e 、f e 等矿物质吸收 低聚果糖是钙、镁、铁等矿物质和微量元素的活化因子，实验证实低聚果 糖促进钙的吸收率达7 0 8 ，将低聚果糖应用于补钙、铁、锌等食品、保健品中， 可以达到改善营养不良、促进机体生长发育和预防骨质疏松症等功效。低聚果 糖在机体内代谢的机理大致为，其先被细菌发酵生成l 一乳酸，进而钙、镁、铁 等矿物质被溶解，从而促进人体对食物中钙、铁、锌等矿物质及蛋白质的消化 吸收。 作为营养素，促进维生素的合成 低聚果糖添加在滋补食品中，在体内促进维生素b 类及叶酸的合成，达到支 持大脑、神经系统、消化及能量生成的作用，提高人体新陈代谢水平和免疫力。 作为低糖、低热值的甜味剂 低聚果糖的热值为1 5 k c a l g ( 蔗糖热值为4 6 k c a l g ) ，不会引起肥胖，是理想 的、低热值功能性甜味剂。在低糖食品中添加低聚果糖，可以降低产品热值， 8 第一章绪论 不易引起血糖升高。 作为功能性食品添加剂，降低血脂保护肝脏 目前高血压、动脉硬化等一系列心血管疾病困扰着人类，为了预防和降低 此类疾病的发病率，应用低聚果糖达到降低血清胆固醇、甘油三脂、游离脂肪 酸，改善脂质代谢的效果，服用低聚果糖后，人体内双歧杆菌增殖迅速，同时 抑制大肠杆菌、沙门氏菌和梭状芽胞杆菌等腐败菌生长，减少毒性代谢物的生 成，达到减轻肝脏负担，保护肝脏作用。 1 2 3 3 在日化中的应用 美容延寿已成当今时尚，而低聚果糖具有增强产品美容、护肤等作用。服 用添加低聚果糖的美容护肤产品后，可以防止雀斑、黑斑、青春痘、面疮、老 人斑，使皮肤亮丽，减缓老化【l 引。 1 2 3 4 在饲料中的应用 过去的四、五十年中，抗生素的应用为畜牧业的发展起了极大的推动作用， 但其副作用也日益明显，作为益生素的低聚果糖是一种新型的绿色饲料添加剂， 近年被美国f d a 批准，作为功能性饲料添加剂应用于饲料工业中，为人类寻找 抗生素的替代品带来了希望。国内学者正在研究利用低聚果糖生产双歧因子饲 料，促进各种濒危野生珍稀动物( 如大熊猫) 由野外微生态平衡转为人工繁衍生 态平衡。研究发现，添加1 1 5 低聚果糖于仔猪日粮中，饲料效率提高1 0 ， 单位饲料消耗下降0 7 ，每千克饲料成本减少1 0 ，仔猪日增重提高6 4 ，明 显地促进仔猪的生长和饲料利用率；而鸡饲料中添加o 2 5 - - 0 5 0 低聚果糖， 能明显促进鸡的生长【l7 。 1 3 菊粉低聚果糖研发的意义与前景 2 0 世纪7 0 年代，美国玉米低聚果葡糖产业的起步和成功是迫于玉米产量的 过剩而为玉米农场主寻找出路。目前我国很多企业以蔗糖为原料，酶法转移生 产低聚果糖，原料成本较高，不适宜进行大规模工业化生产的。发展菊粉生产 低聚果糖菊粉资源丰富且价格低廉，利用微生物菊粉内切酶水解菊粉生产 f o s 纯度高，主产物低聚果糖含量达9 3 - - 9 7 ，副产物葡萄糖、果糖和蔗糖 含量之和仅为3 7 ；后期处理较易进行( 纯酶控制水解产物中葡萄糖含量可 i o 时，粗酶液的外切活性被抑制，表现为内切活性。以菊粉生产低聚果糖为 目的而言，应使用菊粉内切酶，其作用机理为菊粉内切酶从菊粉分子内部随机 切断某个1 3 2 ，1 糖苷键，最终得到高纯度低聚果糖及少量果糖，此类酶还可水解 第一章绪论 与菊粉的末端结构完全一致的松三糖等【翊，其可能的水解模式是： g f 4 一g f + f 3 、f 4 _ f 3 + f 、f 5 一f 2 + f 3 ，通过水解作用产生聚合度较小的果聚 糖，o p g f ( s ) 、g f 2 、g f 3 、g f 4 、f 2 、f 3 、f 4 、f 5 等低聚果糖。 1 5 4 产菊粉内切水解酶的微生物 微生物来源的菊粉内切酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。据不完全 统计，产菊粉内切酶的丝状真菌有1 7 个属4 0 余种，酵母菌有1 0 个属2 0 余种，细菌 有1 2 个属1 0 余种。目前国外研究较多的产菊粉内切酶菌株有酵母、黑曲霉及青 霉、枯草芽抱杆菌。产菊粉内切酶的主要微生物如表1 2 。 表1 2 产菊粉内切酶的各大微生物 t a b l 2v a r i o u sm i c r o b i a lo fi n u l i n a s ee n z y m e s 1 5 5 菊粉内切酶活力测定方法 摇床发酵粗酶液经4 0 0 0 r m i n 离, l 二, 1 5 m i n ，取上清液l m l ，加入4 m 1 2 的菊粉 液( 用0 2 m o l l ，p h 5 0 醋酸缓冲液配制) ，5 0 下反应3 0 m i n ，沸水浴煮沸5 m i n ， 取0 5 m l 反应液，加入1 5 m l 水和2 0 m l3 ，5 一二硝基水杨酸试剂，沸水浴加热5 m i n ， 立即冷却，加入蒸馏水6 0 m l ，摇匀，在5 4 0 n m 下测定吸光度o d 值，以蒸馏水做 空白对照，灭活的粗酶液残糖作参比，测量3 次取平均值，对照标准曲线计算反 应生成的还原糖浓度。定义以每分钟转化生成l p m o l j 丕原糖所需的酶量为一个酶 活力单位( u ) ，以i 值表示。 同样以4 m 1 2 的蔗糖代替菊粉溶液，检测步骤同上。定义以每分钟水解 1 4 第一章绪论 l “m o l 蔗糖所需的酶量为一个酶活力单位，以s 表示随2 9 3 0 1 。 计算v sl ：t ；值，分析检测菌株产内切菊粉酶活性。 1 6 课题来源及研究意义 1 6 1 课题来源 本课题来源于导师的自选课题。 1 6 2 本课题研究的内容 产菊粉内切酶菌株的分离筛选及鉴定：选择菊芋土壤为筛选土样，以菊 粉为底物，松三糖为选择性鉴别碳源平板培养基，对产菊粉内切酶菌株进 行分离纯化。以酶活i s 值作复筛标准，筛选产菊粉内切酶酶活力相对较高 菌株，通过菌落形态特征、茵丝及孢子形态等生理特征及生化实验对菌株进行 鉴定。 发酵条件优化研究：在单因素实验基础上，采用p l a c k e t t b u r m a n 实验设 计对影响发酵产菊粉内切酶的碳源、氮源、无机盐、发酵时间等8 个选择因素 进行筛选，得到对菌株发酵产酶显著影响因子。根据实验结果和经验方法