（食品科学专业论文）智舌微生物快速检测系统的设计与构建.pdf

浙江工商人学硕上学位论文 i l lll ll l l ll l ll lll ll li 【y 17 3 5 15 1 智舌微生物快速检测系统的设计与构建 摘要 根据世界卫生组织的估计，全球每年发生食源性疾病数十亿。发达国 家发生食源性疾病的概率也相当高，平均每年有1 3 的人群感染食源性疾 病。工业化程度的发达并不能保证食源性疾病爆发危险性的降低，反而由 于工业化程度越发达，食品的供应链越难控制，一旦发生食品安全问题， 其影响面和波及面会更大。快速、简便、经济、可靠的食品微生物检测技 i 术，是监测、监管、预防、质控和及时诊断等多方面有效实施的保障，是 多级检验检疫部门的迫切需求。因此，探求更好的快速检测技术是有关研 究人员的长期关注焦点和研究热点。 智舌是本课题组研制开发的，以组合脉冲弛豫谱为激发扫描信号，辅 以特定传感器阵列，检测待测物质的整体响应信号，结合多元统计分析方 法构建的一类新型电子舌，具有检测速度快、样品前处理简单、信息量丰 富、易智能化、使用寿命长、成本低廉等优点，在微生物快速检测方面具 有很大的潜力。本文以智舌为研究手段，以微生物酵母菌做为检测对象， 初步探索智舌在微生物快速检测方面的应用，构建了一套智舌微生物快速 检测的方法。本研究的主要内容如下： ( 1 ) 智舌快速检测微生物实验平台构建 设计构建了智舌微生物快速检测的专业检测池，并对检测酵母培养基 的电极以及频率段进行了选取。以铂电极、金电极、钯电极、钨电极、钛 浙江工商人学硕士学位论文 电极和银电极作为工作电极，每个工作电极在1h z ，1 0h z 和1 0 0h z 三个 频率段下进行扫描，对不同培养时间段的培养基分别进行监测，获得的反 应被测样品综合信息的大量数据处理采用主成分分析法。结果通过主成分 得分效果图显示，并以d i 值的大小来进行电极和频率段的选取。对酵母 培养基区分效果最佳的电极为钯电极，其三个频率均对酵母培养基有一定 的区分效果，其中1h z 对酵母培养基的区分效果最佳。最后又通过主成 分分析法的区分效果对酵母培养基进行了选取，有无机氮提供氮源的培养 基有利于智舌对酵母的检测。 ( 2 ) 智舌微生物快速定量检测方法建立 智舌微生物快速检测方法的建立，以酵母菌为例，通过智舌检测微生 物总功率曲线模型的拟合，检测阈的选取，建立模型到达检测阈的时间 ( i d t ) 与原始接种量之间的标准曲线，对微生物培养基原始接种量进行 预测，并在十几个小时左右能得到结果。结果显示，智舌检测微生物总功 率的生长曲线基本和o d 值检测的生长曲线一致，曲线分别经过和l o g i s t i c 模型、m m f 模型、g o m p e r t z 模型拟合，选取了最合适的l o g i s t i c 模型对 面包酵母进行拟合，经过拟合之后的生长曲线，有个别点有所偏差，但是 总体能体现微生物生长的特性。确定模型之后，再通过选取检测阈m = 2 0 ， 做模型到达检测阈的时间( i d t ) 与原始接种量之间的标准曲线相关系数 为0 9 7 8 83 8 3 3 。最后通过已知原始接种量的样品对建立的标准曲线进行验 证，模型对3 个浓度的预测平均相对误差为8 3 7 ，并且检出时间在十个 小时左右。 ( 3 ) 智舌微生物检测系统的应用研究 i i 浙江工商人学硕士学位论文 通过前面所建立的方法，分别对酿酒酵母、深红酵母以及大肠杆菌 0 1 5 7 ：h 7 进行了检测，结果显示，以前面选取的对面包酵母的检测经验， 选取钯电极1h z 对另外2 种酵母进行了检测，效果理想。对酿酒酵母和 深红酵母的总功率生长曲线用了m m f 模型进行拟合，并确定检测阈为 m = 2 0 所建立的模型到达检测阈时间( i d t ) 与原始接种量对数( l o g ( u ) ) 之间的标准曲线相关系数分别为o 9 9 和o 9 7 。对已知浓度的预测相对平均 误差分别为：6 5 6 矛t i9 4 6 。而对大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的检测由于培养基 的改变，所以对电极进行了重新选取，根据d i 值的大小，选择金电极1 0i - i z 对大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的区分效果最好，并用金电极1 0h z 检测大肠杆菌的 总功率曲线进行了模型的选取，然后又进行了检测阈的选取，经过比较得 到检测阈m = 3 0 ，智舌对大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 检测的效果最佳。其模型到 达检测阈时间( i d t ) 与原始接种量对数( l o g ( u ) ) 之间的标准曲线相关 系数可以达到o 9 7 。对已知浓度的预测相对平均误差为1 0 3 。总体的检 出时间也都在十个小时左右。 智舌系统通过传感器阵列选择与优化，结合总功率计算的方法，对检 测微生物生长曲线进行模型拟合，以及检测阈的选取和对原始接种量的预 测，探索了智舌系统在微生物快速检测方面的应用方法学，为智舌在此方 面的应用提供实验基础与理论依据。 关键词：智舌系统；模型拟合；酵母菌；主成分分析；总功率计算 i i i 浙江工商人学硕士学位论文 s y s t e mo fs 认r t o n g u er a p i dd e t e c t e d m i c r o b i a ld e s i g n e da n dc o n s t r u c t i o n a bs t r a c t a c c o r d i n gt ow h oe s t i m a t e s ，b i l l i o n so fc a s e so ff o o d b o r n ed i s e a s e s o c c u ri nt h ew o r l de a c hy e a r e v e ni nt h ed e v e l o p e dc o u n t r i e s ，t h eo c c u r r e n c e o ff o o d b o m ed i s e a s e si sq u i t eh i g h ，w i t ha na v e r a g ea n n u a li n f e c t i o nr a t eo f1 i n3p e o p l e h i g h e rd e g r e eo fi n d u s t r i a l i z a t i o nd o e s n tm e a nt h er e d u c t i o no f t h er i s ko ft h eo u t b r e a k so ff o o d b o m ed i s e a s e s t h ef a c ti st h a tt h eh i g h e rt h e l e v e l so fi n d u s t r i a l i z a t i o n ，t h em o r ed i f f i c u l tt h ec o n t r o lo ft h ec h a i no ff o o d s u p p l y , a n dt h em o r es e r i o u st h er e s u l ti nt h ec a s eo f o c c u r r e n c eo ff o o ds a f e t y a c c i d e n t ar a p i d ，s i m p l e ，e c o n o m i c a l ，d e p e n d a b l em e t h o df o r d e t e c t i n g f o o d - b o r n ep a t h o g e n si su r g e n t l yn e e d e db yd i f f e r e n tl e v e l so fi n s p e c t i o na n d q u a r a n t i n ed e p a r t m e n t sb e c a u s ei t st h ep r e r e q u i s i t ef o re f f e c t i v ee x e c u t i o nf o r m o n i t o r i n g ，s u p e r v i s i o n ，p r e v e n t i o n ，q u a l i t yc o n t r o la n dt i m e l yd i a g n o s i s a b e t t e rt e c h n o l o g yf o rr a p i dd e t e c t i o nh a sb e e nal o n g t e r mr e s e a r c ha n ds t u d y f o c u sf o rt h er e l e v a n tr e s e a r c h e r s i nt h i s p a p e r , y e a s tw a su s e da s t h ed e t e c t i o nt a r g e tt o s t u d y t h e a p p l i c a t i o no ft h es m a r t o n g u ei nt h er a p i dd e t e c t i o no fm i c r o b e s as e to f s m a r t o n g u em i c r o o r g a n i s mr a p i dd e t e c t i o nm e t h o dw a sb u i l t t h ei n n o v a t i v e a s p e c t i nt h e s m a r t o n g u ei s t h e a p p l i c a t i o no f an e we l e c t r o c h e m i c a l i v 浙江工商大学硕士学位论文 m e t h o d t h em u l t i f r e q u e n c ya m p l i t u d ep u l s ev o l t a m m e t r yw h i c hi sv e r y u s e f u lf o rd i s c r i m i n a t i n gs a m p l e si nt h ev o l t a m m e t r i ce l e c t r o n i ct o n g u eb y a p p l y i n gt h r e ef r e q u e n c ys e g m e n t s ，1h z ，10h za n d10 0h z m u l t i v a r i a t ed a t a a n a l y s i s s u c ha s p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ( p c a ) w a so f t e nu s e dt o a n a l y z i n gt h ed a t af r o mt h es m a r t o n g u e w i t ht h ea d v a n t a g e so fr a p i dd e t e c t i o n a n ds i m p l es a m p l ep r e p a r a t i o n ，s m a r t o n g u es e e m st ob es u i t a b l ef o rd e t e c t i n g t h em i c r o o r g a n i s m t h em a i nr e s e a r c hw o r ki sa sf o l l o w s ： ( 1 ) b u i l d o ft h e e x p e r i m e n t a lp l a t f o r m f o r r a p i d d e t e c t i o no f m i c r o o r g a n i s m sw i t hs m a r t o n g u e d e s i g n e da n db u i l t e dt h ep a r t i c u l a ra n a l y z e dp o o lw i t ht h eb e s to p t i m i z e d s e n s o r s a r r a y a n df r e q u e n c ys e g m e n tf o rs m a r t o n g u e ，e s p e c i a l l yi nr a p i d d e t e c t i o no fm i c r o - o r g a n i s m s s e v e r a le l e c t r o d e ，i e p l a t i n u m ，g o l d ，p a l l a d i u m ， t u n g s t e n ，t i t a n i u ma n ds i l v e re l e c t r o d e su n d e rt h r e ef r e q u e n c ys e g m e n t so f1 h z ，10h za n d10 0h zw e r eu s e df o rt h ea n a l y s i so fy e a s t i tu s e dp r i n c i p a l c o m p o n e n ta n a l y s i sa sad a t ap r o c e s sm e t h o da n dd iv a l u ea saj u d g e m e n tf o r s e n s o r so p t i m i z a t i o n t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s t h ed i f f e r e n c eo ft h e s a m ey e a s tc u l t u r em e d i u mo fe a c hg r o w t hs t a t u sc o u l db es h o w e db y p a l l a d i u me l e c t r o d ew i t hi t st h r e ef r e q u e n c ys e g m e n t s a n dt h e1h zd i s p l a y e d t h eb e s tr e s u l t a l s o ，t h ec u l t u r em e d i u mo fy e a s tw a so p t i m i z e d t h ec u l t u r e m e d i u mw i t ht h ei n o r g a n i cn i t r o g e ne x h i b i t e dt h eb e s tr e s u l t ，d u et oi t ss t r o n g c o n d u c t i v i t y ( 2 ) e s t a b l i s h m e n to ft h er a p i dd e t e c t i o nm e t h o d o l o g yo fm i c r o o r g a n i s m s v 浙江工商人学硕上学位论文 w i t hs m a r t o n g u e y e a s tw a st a k e na sac l a s s i c a le x a m p l et oe s t a b l i s ht h er a p i dd e t e c t i o n m e t h o d o l o g yo fm i c r o o r g a n i s mw i t hs m a r t o n g u e t h em o d e l ，w h i c hw a s u s e d t op r e d i c tg r o w t ht h r e s h o l da c c o r d i n gt op r i m a r ys e e d i n gc o n c e n t r a t i o n ，w a s c a r d e do u tb yt h ef i t t i n go fc u r v em o d e lo fm i c r o o r g a n i s mt o t a lp o w e rw i t h s m a r t o n g u ed e t e c t i o n ，c h o i c eo ft h r e s h o l da n dc o m p l e t i o no fs t a n d a r dc u r v e i n d i c a t e dr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt i m er e a c h i n gd e t e c t i o nt h r e s h o l da n di n i t i a l s e e d i n gc o n c e n t r a t i o n t h ee n t i r ep r o c e s sw o u l dt a k em o r et h a nt e nh o u r s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tg r o w t hc u r v eo ft o t a lp o w e ro fm i c r o o r g a n i s m ，w h i c hw a s d e t e c t e db ys m a r t o n g u e ，i sc o n s i s t e n tw i t ht h a to fo dv a l u e s t h eo p t i m a l f i t t i n gm e t h o df o ry e a s tw a sd e t e r m i n e db yc o m p a r i n gl o g i s t i cm o d e l ，m m f m o d e la n dg o m p e r t zm o d e l t h eg r o w t hc u r v ea f t e rf i t t i n gc o u l de m b o d yt h e c h a r a c t e r i s t i c so fm i c r o o r g a n i s mg r o w t h ，a l t h o u g hs o m ed e v i a t i o ne x i s t e d a f t e re s t a b l i s h m e n to ft h er a p i dd e t e c t i o nm e t h o d o l o g yo fm i c r o o r g a n i s m s w i t hs m a r t o n g ，t h ed e t e c t i o nt h r e s h o l dw a ss e tm = 2 0 ，t h e ng r o u d i n go nt h i s t h es t a n d a r dc u r v ew a sc o m p l e t e db e t w e e t ni d ta n dp r i m a r y s e e d i n g c o n c e n t r a t i o n ，w h i c hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti so 9 7 8 83 8 3 3 t h er e l i a b i l i t yo f s t a n d a r tc u v ew a sd e m o n s t r a t e db yq u a n t i t a t i v es e e d i n gs a m p l e t h ea v e r a g e r e l a t i v ee r r o ro ff o r e c a s ti s8 3 7 a n da p p r o x i m a t e l y10h o u r sw o u l db ec o s t ( 3 ) a p p l i c a t i o n so f t h er a p i dd e t e c t i o nm e t h o d o l o g y t h r o u g ht h ep r e v i o u sm e t h o d ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，r h o d o t o r u l a r u b r a ，a n de c o l iw e r ed e t e c t e dr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e v i 浙江t 商大学硕士学位论文 p a l l a d i u me l e c t r o d e1h zw a st h eb e s tt od e t e c tt h et w ok i n d so fy e a s ta c c o r d i n g t o p r e v i o u se x p e r i e n c e t h et h et o t a lp o w e ro ft h eg r o w t h c u r v eo f s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n dr h o d o t o r u l ar u b r aw a sf i r e dw i t ht h em m f m o d e l ， w h i c hd e t e r m i n et h ed e t e c t i o nt h r e s h o l dm = 2 0 t h e nt h es t a n d a r d c u r v eo ft h et i m eo fa r r i v a ld e t e c t i o nt h r e s h o l d ( i d t ) a n dt h eo r i g i n a li n o c u l u m l o g a r i t h m w i t hw e r eo b t a i n e d f o rs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n dr h o d o t o r u l a r u b r a ，w h i c hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t w e r eo 9 9a n do 9 7 ，r e s p e c t i v e l y t h e f o r e c a s to fr e l a t i v ea v e r a g ee r r o ro fk n o w nc o n c e n t r a t i o n so ft w ot y p ey e a s t w e r e6 5 6 a n d9 4 6 b e c a u s eo ft h em e d i u mc h a n g e so fe c o l i ，t h e e l e c t r o d ew a sr e - s e l e c t e d t h eg o l de l e c t r o d elo h zw a sc h o s e nf o re c o l i a c c o r d i n gt ot h ed iv a l u e s t h em o d e lo ft o t a lp o w e rc u r v eo fe c o l iw a s c h o s e na n dt h e nt h ed e t e c t i o nt h r e s h o l dw a sd e t e r m i n e d w h e nm = 3 0 ， m o d e lw a st h eb e s tf o re c o l i t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to fs t a n d a r dc u r v eo f t h em o d e lo fi d ta n d ( l o g ( u ) ) r e a c h e dt oo 9 7 a n dt h ef o r e c a s tr e l a t i v e a v e r a g ee r r o rw a s10 3 a n dt h ew h o l ed e t e c t i o nt i m ew a sa l s oa l m o s tt e n h o u r s s m a r t o n g u es h o w e dap r o m i s i n ga p p l i c a t i o ni nq u a l i t a t i v ea n a l y s i s o f m i c r o o r g a n i s m s ，w h e nt h ea p p r o p r i a t es e n s o ra r r a yw h i c hw a sc o m p o s e do f d i f f e r e n tn o n m o d i f i e dm e t a le l e c t r o d e sa n dt h e c o r r e s p o n d i n g 仔e q u e n c y s e g m e n t so fm u l t i 仔e q u e n c yl a r g ea m p l i t u d ep u l s ev o l t a m m e t r yw e r es e l e c t e d k e y w o r d s ：s m a r t o n g u e ；m o d e lf i t ；y e a s t ；p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ； t o t a l lp o w e r sc a l c u l a t i o n v i i 浙江_ t 商大学硕十学位论文 目录 第一章引言一l 1 1 微生物检测在食品安全中的重要性1 1 2 国内外微生物快速检测的主要方法和研究进展。l 1 2 1 免疫学方法1 1 2 2 分子生物学方法2 1 2 3 生物电化学方法3 1 3 智舌原理及其应用简介6 1 3 1 智舌的概念及特点6 1 3 2 智舌的结构和原理。6 1 3 3 国内外电子舌研究现状6 1 3 4 电子舌模式识别方法9 1 4 智舌快速检测微生物的原理1 0 1 4 1 细菌纯培养的群体生长规律1 0 1 4 2 智舌检测培养基的原理1 2 1 5 课题研究的内容及其意义1 3 1 5 1 选题背景及意义l3 1 5 2 研究目标和内容1 4 1 5 3 技术路线15 第二章智舌快速检测微生物实验平台构建。1 6 2 1 实验仪器及材料16 2 1 1 主要试剂l6 2 1 2 实验仪器17 2 2 实验方法17 2 2 1 菌悬液的制备1 7 2 2 2 电极处理方法17 2 2 3 检测方法18 2 3 数据处理方法1 9 2 3 1 主成分分析方法l9 v i i i 浙江工商人学硕士学位论文 2 3 2 区分辨识效果判别依据2 0 2 4 结果与分析2 1 2 4 1 智舌检测池的设计与构建2 1 2 4 2 电极的选取2 3 2 4 3 特异性培养基的确定2 7 2 4 4 钯电极p c a 区分效果图与其生长曲线对比2 8 2 5 结论2 9 第三章智舌快速定量检测微生物方法建立3 0 3 1 实验仪器及材料3 0 3 1 1 主要试剂和菌种3 0 3 1 2 实验仪器3 0 3 2 实验方法。3 1 3 2 1 菌悬液制备3l 3 2 2 电极处理方法31 3 2 3 检测方法3 1 3 3 结果与分析3 2 3 3 1 浊度法测定不同接种浓度面包酵母的生长曲线3 2 3 3 2 智舌监测面包酵母不同菌种浓度的培养基总功率的生长趋势3 2 3 3 3 总功率生长曲线拟合的模型选取。3 3 3 3 4 模型拟合曲线检测阈的确定以及标准曲线的建立4 0 3 3 5 模型对已知样晶的预测4 2 3 4 结论4 3 第四章方法的实际应用研究：4 5 4 1 实验仪器及材料4 5 4 1 1 主要试剂和菌种4 5 4 1 2 实验仪器4 5 4 2 实验方法。4 6 4 2 1 菌悬液制备4 6 4 2 2 电极处理方法4 6 4 2 3 检测方法4 6 l x 浙江工商大学硕十学位论文 4 3 数据处理方法一4 7 4 4 结果与分析4 7 4 4 1 酿酒酵母智舌快速检测方法的建立4 7 4 4 2 深红酵母智舌快速检测方法的建立5 l 4 4 3 大肠杆菌智舌快速检测方法的建立5 4 4 5 结论5 8 第五章总结和展望5 9 5 1 总结5 9 5 2 展望5 9 参考文献6 1 硕+ 期间发表的论文一6 8 致谢。6 9 独创性声明7 0 x 浙江t 商大学硕十毕业论文 第一章引言 1 1 微生物检测在食品安全中的重要性 目前，“食品安全”已经成为一个全球性关注的问题，世界上许多发达国家在加强食品 安全管理的同时，通过提高标准，增加检验检疫项目，不断修订新的技术法规等手段。而食 品微生物检测又是食品安全中最重要的环节，据w h o 统计，发达国家每年约有三分之一 的人感染食源性疾病，在一些发展中国家情况就更加严重，食源性疾病往往是致人非正常 死亡的主要原因。随着人们生活水平的提高，卫生条件也不断的改善和一些抗生素的滥用， 人类对疾病的抵抗能力也在下降。食源性疾病一直呈上升的趋势，食源性疾病不仅会严重 损害人体的健康，而且很容易引起食品贸易纠纷( 杨建秀，2 0 0 4 ) 食源性疾病主要是由微 生物和化学药物所引起的，其中微生物引起的食源性疾病占具一半以上的比例。食品中的 微生物污染成为食品安全的首要问题。微生物污染存在在食品生产、加工、储存、运输、 销售、到食用的整个过程的每个环节中，对人体产生严重的危害。因此，对食品中致病菌 的检测变的非常的重要。而常规的检验技术大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是 否受到此微生物的污染，包括增菌、分离培养、形态观察、生化鉴定等步骤，这些方法准 确性、灵敏性均很高，但涉及的实验较多，操作烦琐，需要时间长( 需要一定的培养时间， 少则2 到3 天，多则数周才能确定) ，准备和收尾工作繁重，而且一般是一个检验程序只 是一种菌的确认程序，不适于批量、大范围检测( 唐漪灵，等，2 0 0 0 ；吴清平，等，2 0 0 5 ) 。 为此，食品微生物快速检测得到了很快的发展。各种基于不同原理的新型快速检测 技术相继出现。有基于免疫学方法、仪器分析学方法、分子生物学方法、微量生化法还有 电化学法。这些快速检测的方法不但可以对菌种进行鉴别，计数。而且跟传统的方法相比 大大缩短了时间，节省了人力，甚至物力的投入。即做到了快速、简便、准确。 1 2 国内外微生物快速检测的主要方法和研究进展 1 2 1 免疫学方法 免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免 疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于 l 浙江工商大学硕士毕业论文 免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反 应可在很短时间内完成，所以免疫学方法是微生物快速检测方法中应运最广泛的一种。免 疫学方法主要有酶联免疫吸附分析法、免疫荧光技术、免疫印迹技术、乳胶凝集试验和免 疫磁珠分离法等等。其中酶联免疫吸附分析法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n a s s a y ，简称 e l i s a ) 又是免疫学方法中应用最为广泛的一种，也是技术上相对比较成熟的一种技术， 它是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合起来的一种综合性技术。最早 是在1 9 7 1 年由荷兰学者v a nw e e m a n 和s c h u r r s ，瑞典学者e n g v a l l 和p e r l m a n n 分别提出 的( 陈福生，等，2 0 0 4 ) 。 e l i s a 具有特异性和高度的敏感性。和其他的化学、生物学方法相比，其具有检测时 间短，操作简单、方便。由于反应的特异性强，所以预处理和提取纯化的过程就可以简化， 可以同时检测上百个样品，而其酶的高效催化性，使其可以在几个小时内就可以等到结果。 还有就是灵敏度高。e l i s a 可以对样品做定性和定量的检测，对微生物的检测限可达1 0 z c f u m l 一- 1 0 3o f u m l ( r a j s h w a r ln ，e ta 1 ，1 9 9 8 ；赵志晶，等，2 0 0 3 ) 。还有就是干扰性小， 安全性高，污染少。 e l i s a 虽然有较大的优越性，当然也存在这一些不足之处：比如由于其免疫反应的特 异性，对反应试剂的选择性高，所以很难同时对多种成分进行分析。对结构类似的化合物 有一定程度的交叉反应；分析分子量很小的化合物和很不稳定的化合物有一定的困难。为 了弥补这些不足，许多学者正致力于改进和完善e l i s a 检测技术的研究，为了避免交叉 反应，现已开始由单克隆抗体来代替多克隆抗体；纯化抗体和抗原；选择吸附性更高 的载体和寻找最佳e l i s a 工作条件及定量方式等几个方面( 方平，等，2 0 0 4 ) 。 免疫荧光技术( i m m u n o f l u o r e s c e n c et e c h n i q u e ，i f a ) 是用荧光素标记的抗体检测抗原 或抗体的免疫学标记技术，又称荧光抗体技术。该技术的应用主要有直接法和间接法两种。 直接法就是直接在样品中滴加已知特异性荧光标记的抗血清，洗涤之后进行观察。而间接 法是在检样上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。 免疫荧光直接法可清楚地观察抗原并用于定位标记观察( 陈忠杰，等，2 0 0 7 ) 。 1 2 2 分子生物学方法 分子生物学方法目前主要的检测手段主要有：基因探针检测法聚合酶链式反应技术、 蛋白质芯片技术、基因芯片技术。 基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳定的 2 浙江- t 商大学硕上毕业论文 d n ar n a 或d n ad n a 链的原理，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细 菌。基因探针是新发展起来的一项特异、敏感、快速的检测技术技术。其的优点是减少了 基因片段长度多态性所需要分析的条带数。如法国生物一梅里埃公司的g e np r o b e 基 因探针检测系统，对于分离到的单个菌落，3 0m i n 完成微生物的确证试验( 时炜2 0 0 3 ) ， 当然基因探针也存在着缺点：不能鉴定目标菌以外的其他菌。而且需要专门的技术和方法 过程复杂，同时还可能出现一定比例的假阳性。此技术在沙门菌的检验中应用的比较成熟。 聚合酶链式反应技术即p c r 技术采用体外酶促反应合成特异性d n a 片段，再通过扩 增产物来识别细菌。由于p c r 灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细 菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过p c r 进行筛选，节约了大量时间，但 p c r 技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物d n a 对t a q 酶具有 抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性d n a 进入p c r 后可以引起无限放大产生假阳性结果；扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。 美国快力康公司推出了全球第一台p c r 全自动检测仪b a x 系统，克服手工操作p c r 的缺 点，能用于检测细菌，敏感性和特异性都非常好。 1 2 3 生物电化学方法 生物电化学方法是指通过电极测定生物量产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的 方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发 生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参数的变化，来实现对微生物的快速测定。常 见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法以及电子舌检测等( 卢智远，等2 0 0 5 ) 。 阻抗技术是电化学研究方法之一，和微生物检测的结合已经形成了一个独立的研究 领域。早在1 8 9 8 年的7 月爱丁堡举行的一次英国医学会议上，s t e w a r t 首次提出了“阻抗微 生物学”的概念( s t e w a r tgn ，e ta t , l8 9 9 ) 。其基本的方法是微生物在培养过程中，新陈代 谢使培养基中的电惰性大分子物质( 如碳水化合物、类脂、蛋白质) 转化为电活性的小分 子物质。而其电导率的变化曲线和微生物的生长曲线很相似。所以二者可以建立一个模型 来检测微生物。 2 0 世纪8 0 年代前后许多应用b a c t o m e t e r 微生物自动检测器的研究，这些报道也拓展了 阻抗技术在许多领域的应用，如临床微生物学尿