（环境工程专业论文）苯酚降解菌的分离筛选及其降解特性研究.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药、医药合成等行业生产的原料或 中间体。随着经济的发展，未经处理的含酚废水对人类的生存环境已经造成 了严重的威胁。利用微生物降解的方法处理含酚废水是种经济有效且无二 次污染的方法。在生物处理过程中，由于含酚废水的难降解特性，因此引入 的菌种要有较强的降解酚能力，能较好地适应冲击负荷的变化。 基于以上的问题，本文研究的是含苯酚废水的生物处理，即以培养高效 菌株为主要研究内容，从四川省江油市某甲醇厂的污水处理站的污水、污泥 中筛选到一株高效的苯酚降解细菌p d 2 ，能够在以苯酚为唯一碳源和能源的 培养基上生长。该菌株菌落呈橙红色，表面皱折；光学显微镜观，察表明， 菌体呈杆状，有鞭毛和芽孢；革兰氏染色阳性 接触酶阳性。该菌株最适生 长温度为3 0 ，最适p h 为7 5 。根据其菌体形态特征、培养特征、生理生 化特征等，检索伯杰氏细菌鉴定手册( 第八版) ，将其初步鉴定为芽孢杆 菌( b a c i l l u s s p 。) 。 本研究采用逐渐提高苯酚浓度的方法驯化p d 2 菌株，使其对苯酚的 降解能力从5 0 0 m g l 提高到2 0 0 0 m g l 。培养基主要成分如碳源、无机 盐等营养成分是影响p d 2 菌株生长和降解苯酚的重要影响因子。同时在 一定范围内提高接种量可以加快反应速率，缩短延迟期，最佳接种量为 1 0 。 从对p d 2 菌株对苯酚降解速率探讨可知，p d 2 菌株的生长和对苯酚 的降解是基本同步的，而且由于各菌之间存在协同降解作用，混合菌株 对苯酚的降解在各方面都优于纯菌株。 本研究确定苯酚降解菌p d 2 的最佳生长条件和对苯酚最高耐受性，为后 面p d 2 菌株应用于实际废水处理打下基础。 关键词：苯酚废水；生物降解；芽孢杆菌 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i 页 a b s 。r r a c t p h e n o li sa l li m p o r t a n tr a wm a t e r i a lo rm i d s ts u b s t a n c eo fp r o d u c t i o ni n p a p e rm a k i n g ，c o k i n g ，o i lr e f i n i n g ，p l a s t i c ，p e s t i c i d ea n dm e d i c i n es y n t h e s i s i n d u s t r i e s w i t ht h ed e v e l o p m e n to f e c o n o m y ，p h e n o lw a s t e w a t e rw i t h o u tb e i n g t r e a t e dh a sb e e ni m p o s e das e r i o u st h r e a t e no i l o u re n v i r o n m e n t i ti sa ne c o n o m i c a n de f f e c t i v ew a yt ot r e a tp h e n o lw a s t e w a t e rw i t l lt h em e t h o do f m i c r o o r g a n i s m b i o d e g r a d a t i o n m o r e o v e r ，t h ew a y d o e sn o th a v es e c o n d p o l l u t i o n s i n c ep h e n o l w a s t e w a t e rh a sat r a i ti nd i f f i c u l td e g r a d a t i o n ，b a c t e r i u mi si m r o d u c e di n t ot h e p r o c e s so fo r g a n i s mt r e a t m e n tt od e g r a d ep h e n o la n da d a p tt ot h ec h a n g e so f i m p i n g e m e n t l o a d ， b a s e do nt h ea b o v ep r o b l e m ，b i o d e g r a d a t i o no fp h e n o lw a s t ew a t e ri s s t u d i e da n dm a i ns t u d yo b j e c ti st oc u l t i v a t ew e l l p e r f o r m e ds t r a i n s ，p d 2 ，w h i c h c a ng r o wo nt h ec u l t i v a t i n gg r o u pb a s e do np h e n o la st h es o l es o u l e eo fc a r b o n a n de n e r g y ，a n dt h e s es t r a i n sw e r ef i l t e r e df r o mw a s t e w a t e ra n ds o i l s a m p l e s w h i c hw e r ep o l l u t e db yp h e n o lw a s t e w a t e ra lt h ew a s t e w a t e rt r e a t m e n ts t a t i o no f am e t h a n o lf a c t o r yi nj i a n g y o u ，s i c h u a n p r o v i n c e t h e c o l o ro f t h es t r a i n sc l o n e i so r a n g e ，w h i c hs u r f a c ei sw i t hw r i n k l e o b s e r v e du n d e ral i g h tm i c r o s c o p e ，t h e s h a p eo f t h es i n g l ec e l l s i s p o l e ，a n d t h ec e l l s h a v e f l a g e l l u m a n d e n d o s p o r e t h e c e l l so f t h es t r a i na r eg r a m p o s i t i v e t h eh y d r o g e np e r o x i d er e a c t i o no f t h es t r a i n i sg r a m p o s i t i v e t h eb e s te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sf o rt h eg r o w t ha n d p h e n o l d e g r a d a t i o no f b a c t e r i u m p d 2a r e3 0 c a n d p h 7 5r e s p e c t i v e l y t h em e t h o di st og r a d u a l l yr a i s et h ec o n d e n s a t i o nd e g r e eo fp h e n o lf o r b a c t e r i u mp d 2s t e pb ys t e ph e r e t h er e s u l ts h o w st h a tt h ep h e n o ld e g r a d i n g a b i l i t i e sa l eg r e a t l yp r o m o t e df r o m5 0 0 m g lt o2 0 0 0 m g l m a i ne l e m e n t so f t h e c u l t i v a t i n gg r o u ps u c ha sc a r b o ns o u r c e s ，n u t r i t i o u se l e m e n t sh a v ea ni m p o r t a n t e f f e c to nt h eg r o w t ha n dp h e n o ld e g r a d a t i o no fb a c t e r i u mp d 2 m e a n w h i l e ， i n c r e a s i n gi n o c u l a t i o na m o u n ti nc e r t a i nr a n g e c a l ls p e e du pt h er e a c t i o nr a t ea n d s h o r t e nd e l a y i n gp h r a s e t h eb e s ti n o c u l a t i o na m o u n ti s1 0 t h r o u g hs t u d y i n g i t sd e g r a d i n gr a t e ，i tb ef o u n dt h a tt h eg r o w t ha n d p h e n o l 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i i 页 d e g r a d a t i o no fb a c t e r i u mp d 2 a r en e a r l ys y n c h r o n i c i na d d i t i o n ，d u et ot h e c o - d e g r a d a t i o ne f f e c ta m o n g b a c t e r i a ，t h em i x t u r eb a c t e r i a ls t r a i n sh a v ea nm o r e a d v a n t a g e dp e r f o r m a n c e o n d e g r a d i n gp h e n o lt h a nw h a tp u r eb a c t e r i a ls t r a i n sd o i nt h i se x p e r i m e n t t h eb e s te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o nf o rp d 2a n dt h eg r e a t e s tt o r m e n tt o p h e n o ld e g r a d a t i o no f b a c t e r i u mp d 2a r ec o n f i r m e d ，w h i c ht h ed e g r a d a t i o no f w a s t e w a t e rw i l lb a s e do n k e yw o r d s ：p h e n o lw a s t e w a t e r ；b i o d e g r a d a t i o n ；b a c i l l u ss p 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 1 1 苯酚的性质及其废水来源 苯酚( u “) 是最简单的酚，外观为白色或无色结晶，有特殊气 味和一定的腐蚀性，显酸性。该化合物是1 8 3 4 年龙格( l u n g c f ) 在煤 焦油中发现的，故也叫石炭酸。在空气中易变成粉红色，密度1 0 7 1 9 c m ， 熔点4 2 4 3 、沸点1 8 2 ，在室温下微溶于水、乙醚、氯仿、甘油和二 硫化碳，几乎不溶于石油醚【l 】。 苯酚是一种重要的有机化工原料，是丙烯的重要衍生物之一，主要 用于生产酚醛树脂、己内酰胺、双酚a 、已二酸、苯胺、烷基酚以及水 杨酸等，此外还可以用作溶剂、试剂和消毒剂等，在合成纤维、合成橡 胶、石料、医药、农药、香料、染料以及涂料等方面具有广泛的应用 2 1 。 随着世界经济的飞速发展，为满足工农业的需求，全世界苯酚的生产和 消费分别由1 9 9 5 年的5 5 7 ，3 万t 和5 1 3 1 万t 增长到2 0 0 2 年的7 9 3 - 3 万 t 和6 8 3 8 万t ，我国苯酚的生产和消费分别由1 9 9 8 年的2 3 0 6 万t 和2 7 0 0 万t 增加到2 0 0 2 年的2 7 o o 万t 和4 8 7 2 万t 【3 l 。图1 1 是我国近年来苯 酚的产量、进口量及消费总量情况。 1 9 9 8 年1 9 9 9 年2 0 0 0 年2 0 0 1 年2 0 0 2 年 圈l f 国近年来苯酚的产量、进口量及消费总量情况 蛎拈孙加坫m 0 0 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 表1 - 1 酚在各种工业废水中的含量 t 业污染源 酚浓度m g l 气化焦炭 气化无烟煤 气化石炭 气化油页岩 气化褐煤 气化泥煤 气体t 厂 苯酚生产 树脂生产 木质纤维板 塑料( 焦油上水层) 酚醛树脂( 焦油上水层) 炼焦脱酚前 炼焦脱酚后 石油化工 航空站( 加油站) 玻璃纤维生产 塑料 木材干馏 木材加工 炼焦化t 采矿 环氧树脂 二羟苯基丙烷 木质纤维板 痕量7 ；， 5 0 1 0 0 m g l ) 直接灌溉农田，会使农 作物枯死和减产。特别是在播种期和幼苗发育期，幼苗因抵抗力弱，酚 水会使其霉烂。如用酚浓度 l m g l 的水灌溉黄瓜地，收获的黄瓜有异 味。因此，工业含酚废水的处理，已成为工业废水处理方面急待解决的 问题之一。苯酚是最简单的酚，本研究选择苯酚废水作为研究对象。 1 2 酚类物质降解方法的研究现状及存在的问题 目前，降解水中酚类物质的方法有很多，归纳起来为吸附法、萃取法、 化学氧化法、湿式氧化法、催化氧化法、光化学氧化法、光化学催化氧化法、 活性污泥法、固定化细胞法等。 吸附法是一种简单易行的处理废水的方法，成功地用于废水处理早 有报道【6 4 】。目前较广泛采用的固体吸附剂有活性炭、磺化煤、大孔树 脂等。磺化煤虽然再生容易，但吸附容量较小，处理后废水中含酚量远 达不到排放标准，需进行二级处理。活性炭的吸附容量大，对高、低浓 度废水都有较好的去除效果，但随着活性炭用量的迅速增加，活性炭的 再生显得愈来愈重要。目前，过热蒸汽再生法仍占主要地位，但是，此 法除了达到和维持8 0 0 高温的再生条件要消耗大量的能量外，每次循 环由摩擦造成的活性炭损失也高达5 1 0 ，且被吸附的酚易聚合形 成双烃基联二苯和苯氧基酚覆盖在活性炭表面而使再生困难，结果导致 用活性炭处理含酚废水的方法在经济上的可行性受到了质疑。大孔树脂 较其他两种吸附剂有明显的优势，它有大量的孔穴和较大的比表面积， 而且具有良好的疏水性。它对废水中酚类物质吸附可逆性好，可用 n a c l 州a o h 再生，不仅树腊可反复使用，而且可以回收酚类物质。大空 树脂处理含酚量较低的废水已取得较好的效果，但对含酚量较高的废 水，由于吸附量有限，仅靠树脂法还不行，可先采用化学沉淀法将废水 中的含酚量降低，再用树脂法处理，效果较好。 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 溶剂萃取法是工业上常用的废水脱酚方法之一【9 1 1 。但采用通常的 溶剂萃取工艺处理含酚废水，废水中酚含量很难达到排放标准。络合萃 取法处理高浓度含酚废水已在苯酚、制药等工厂得到应用，易于工业实 施，经过2 3 个萃取理论级可以达到国家规定的排放标准。但此技术 为液液相萃取，出水需经油水分离器之后才能排放，存在着溶剂损失 等问题。 化学氧化法是一种发展早且比较成熟的一种有效降解方法l l 。”j ，它主要 是通过外加氧化剂与溶解在水体中的酚类物质发生化学反应，从而达到降解 有机物的目的，常用的降酚物质的氧化剂有臭氧( 0 3 ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、 f e n t o n 试剂等。其中f e n t o n 试剂从发现至今已有一百多年的历史，它因能有 效快速地降解酚类等难降解的有机污染物仍而沿用至今，但是此法的局限性 在于运行时需要消耗大量的h 2 0 2 而使降解成本大幅度提高。 湿式氧化法是在化学氧化法基础上发展起来的一种优良的污水处理技术 t 1 5 - 1 9 1 ，它是在高温、高压下，利用外加氧化剂将有机污染物氧化降解从而达 到去除污染物的目的，该法的突出优点是能彻底氧化高浓度、难降解污染物， 缺点是因要求高温、高压而大大增加了投资成本和运行成本。 催化氧化法是在有催化剂的条件下降解有机污染物的过程1 2 0 j ，该法也主 要是通过过渡金属或其氧化物做催化剂产生羟基自由基，从而高效降解酚类 等有机物，该法对催化剂的技术含量要求比较高，技术相对复杂，如果使用 贵金属，成本会很高。 光化学氧化法、光化学催化氧化法 2 1 2 4 1 都是在光的作用下，产生具有高 氧化电极电位的羟基自由基有效降解酚类物质的方法，近二十年来，这两种 方法因其不再产生二次污染且能高效地降解有机污染物等优点开始成为国 内外学术界与环境界共同探讨与研究的课题，被称作为“高级氧化技术”。现 探讨研究最多的光化学氧化法、光化学催化氧化法包括0 3 ，u v 法、h 2 0 2 ，u v 法、0 3 1h 2 0 棚v 法、t i 0 2 u v 法、u v f e n t o n 试剂法等。其中u v f e n t o n 法是均相光化学催化氧化法的主要方法，它是在f e n t o n 反应的基础上发展而 来。它的核心也也是通过光助产生大量的羟基自由基降解有机污染物。它的 出现大大提高了光的催化效率和增强了氧化降解能力，在深度处理废水方面 比其它方法有更多优势，但它同时存在着光量予效率低和自动产生h 2 0 2 的 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 机制不完善的缺点。同所有光化学氧化法、光化学催化氧化法一样，该法目 前存在的主要问题仍然是处理成本高，难以工业化。 苯酚是一种生物毒性物质，即使在低浓度下对人体及微生物也有毒 害作用，由于很多好氧菌及微生物可利用苯酚作为生长碳源，因此活性 污泥法是常用的除酚方法。但该法同时也存在运行管理要求高、对毒物 承受能力低、不适应冲击负荷、曝气池容积负荷低、污泥产生量大等不 足之处，对组成复杂、浓度较高的含酚废水处理效果不理想。为提高常 规活性污泥法的处理效果，改良工艺的应用是近年来生物处理技术发展 的一个重要方向之一。如添加粉末活性炭的活性污泥法( p a c t 工艺) ： 在普通序列间歇式活性污泥法( s b r 工艺) 中投加粉末活性碳即 p a c - s b r 工艺；利用形成生物铁絮凝体的生物铁法以及近年来开发的 膜分离活性污泥法。 普通活性污泥法中微生物易流失、细胞对毒物的承受能力低。近十 几年来，国内外丌展了将固定化细胞技术用于废水处理的探索研究。 2 0 0 0 年，朱柱 2 5 4 等用红砖碎粒为载体固定脱酚菌，脱酚菌经固定后， 反应速率增大，降解酚的能力大大增强；刘和、王晓云【2 6 】等采用经苯酚驯 化后的活性污泥制成固定化微生物小球处理苯酚浓度为2 1 4 8 o m g l 、c o d 为1 0 8 2 8 8m g ，l 的高浓度含酚废水，经2 4 h 处理后，对苯酚的去除率为 5 0 1 ，k a i c h l e e l o n 等用p s e d o m o n a s p u t i d a 美国型技术4 9 4 5 l 构造的固 相细胞膜反应器处理酚，可使浓度高达2 0 0 0 3 5 0 0 m g l 的酚完全降解。 固定化细胞技术在处理时间及苯酚浓度两方面均优于活性污泥法，但该技 术还处于研究阶段，要投入实际应用，还面临许多问题。 综上所述，运用物理和化学处理含酚废水不仅可能存在着二次污染， 而且因为溶剂损失或者高耗能等问题而不经济，因此如今更倾向于利用经济 有效且无二次污染的微生物降解的方法来处理含酚废水，但是由于含酚废水 的难降解特性，所以引入的菌种要有较强的降解酚能力。并且要能较好地适 应冲击负荷的变化。于是，近几年很多科研工作者致力于高效酚降解菌株的 研究。 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 1 3 高效苯酚降解菌株的研究现状 高浓度含酚废水( 高于5 0 0 r n g l ) 过去一直采用物理回收处理，但由于 存在溶剂损失、吸附剂再生困难等原因而不经济，并且还会产生二次污染， 因此，当今的研究已建议放弃这种回收而倾向于推行更为完整的处理系统。 而传统的生物法大多是对自然界生长的微生物群体经驯化、繁殖后利用，但 对酚类等毒性物质，仅靠从自然界获得的菌株，往往降解活性有限，不能较 好地适应冲击负荷的变化等，因此投加经过筛选的具有特殊分解能力菌株的 投菌法受到了人们的青睐 2 6 - 4 7 1 。 吴培诚 z7 】等从被含酚废水污染的土壤中分离筛选到一株苯酚琼氏 不动杆菌( a c i n e t o b a c t e r j u n i i ) ，能以苯酚为唯一碳源生长，1 6 h 内可完 全降解6 0 0m g l ；徐玉泉，张维【2 8 】等从工业废水中分离到一株高效降 解苯酚菌株醋酸钙不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s ) ，其最高苯酚 降解率为3 9 4 n m o l ( m g m i n ) ：杨光、向阳【2 9 等从化工废水污染的土壤 中筛选分离到一株假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) ，在2 4 h 内可完全降解 浓度为6 0 0m g l ；陈明，张维【3 0 等从炼油厂污水中分离的醋酸钙不动 杆菌( a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s ) 在2 4 h 内完全降解苯酚的浓度为3 0 0 m g l ；高平平，陈迎春【3 i j 等用未经处理的含酚焦化工业废水为基础培 养基，采用平板涂布法分离到a l c a l i g e n e s f a e c a l 拈、a r t h r o b a c t e r m c o t i a n a e 、k l e b s i e l l as p 莉o c h r o b a c t r u ms p 等四株菌，均能在苯酚浓度 为5 0 0 8 0 0m g l 的唯一碳源的培养基上生长：周治、杨柳燕【32 】用生物 流化床驯化活性污泥，富集、筛选一株瓶形酵母菌( p i t y r o s p o r u ms p ) ， 可以降解1 0 0 0 m g l 的高浓度苯酚；周群英【3 2 1 等人从焦化废水中筛选出 了1 2 株高温降酚菌株，在温度为6 0 6 8 下，含酚量为1 0 0 0 m g l 的情 况下进行实验研究，它们的降酚率从1 2 1 0 0 不等。 通过筛选菌株，引入高效降解活性菌株能提高含酚废水的降解率， 但如何使这些优良菌株长期在生物处理系统中占优势，并保持其高降解 性是研究者们要解决的主要问题，而且提高降解速率是生物处理含酚废 水的一个关键问题，因此有必要进行高效降解菌株的筛选培养，研究这 些高效菌株的降解特性，确定其最佳的生长条件。但是，已报道的各种 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 降解苯酚菌的降解时间较长，耐苯酚浓度较低( 最高1 0 0 0m g l ) ，因此 有必要继续分离筛选出降解时间短耐酚浓度高的高效降酚菌，为有效、 经济处理含酚废水打下基础。 1 4 苯酚降解菌的种类和代谢途径 1 4 1 苯酚降解菌的种类 微生物对有毒有害化合物的降解有着重要的作用，特别是微生物生态降 解系统具有温和、有效和不产生二次污染等特性，越来越引起科学家的重视。 关于微生物降解苯酚的研究已有许多报道，己分离鉴定的微生物包括：假单 胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) 、醋酸钙不动杆菌似c i n e t o b a c t e rs p 1 、根瘤菌 ( r h i z o b i a ) 、真养产碱菌( a l c a l i g e n se u t r o p h u s ) 、反硝化菌( d e n i t r i f y i n g b a c t r e i a ) 、藻类( a t g ao c h r o m a o n a sd a n i c a ) 、酵母菌( y e a s t f ，i c h o s p o r o n c u t a n e u m ) 等降酚菌，说明苯酚能够被原核和真核微生物利用。能够降解 苯酚的根瘤菌和反硝化菌属的发现具有重要的意义，说明植物根际微生物种 群和功能的多样性，可以为自然界中具有生物降解、固氮和抑制病原菌等多 功能微生物存在可能性的预测及相应工程菌构建的可行性提供线索。 1 4 。2 微生物代谢苯酚的途径 苯酚降解基因通常成簇排列，位于大质粒上，些位于染色体上。在好 氧菌中，苯酚羟化酶基因是降解苯酚的关键基因，编码苯酚降解途径的第一 个酶，负责将苯酚转化成邻苯二酚。邻位和间位酶负责将邻苯二酚开环裂解 为三羧酸( t c a ) 产物，如图1 一l 所示，邻位途径中，将邻苯二酚开环裂解 产生乙酸、内酯和琥珀酸等无色中间物；而间位途径中，将邻苯二酚开环裂 解产生黄色的2 羟基粘糠酸半醛。 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 坚竺 - 。 蹦。h u l t e c o o h r ，7 尸= o 够 i c o o h ”“ h 、l l 琥珀峨、o 畦c 。- - - a h 0 o o h h o 。力 c o 2 + 目、雨舅蠹 图1 i 微生物降解苯酚的代酣途径 说明：i 苯酚；2 邻苯二酚；3 2 羟基粘糠酸半醛；4 2 - 羟基粘酸；5 4 氧代 二乙酸( a - 酮基二乙酸) ：6 ，2 - 氧代戊乙酸7 乙二酸：8 内酯：9 ，b - 酮基= 乙 酸；h o ：苯酚羟化酶；c 2 3 0 ：邻苯二酚2 ，3 加氧酶：c 1 2 0 ：邻苯二酚1 ，2 加氧酶；h m s d ：2 - 羟基粘糠酸羟化酶；4 - o t ：4 氧化丁烯酸变位酶；t e ：顺 粘糠酸内酯酶 舀 佣冬 黜 嚣 失一l 龟 1 忐。仑 7 ， o 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 0 页 1 5 研究目的、主要内容与技术路线 1 5 1 研究目的和主要内容 本研究从降解有毒化合物，治理环境、保护生态系统，减少酚类等有毒 物质对动植物和人类危害的角度出发，从污水处理厂的水样和污泥中分离筛 选高效降解苯酚的菌株，并对其生理特性和降解苯酚能力方面进行研究。筛 选出的高效降酚菌株为进一步丌发应用于生产提供依据。 ( 1 ) 从含苯酚的废水中分离筛选对苯酚有降解活性的菌株，并筛选 出降解苯酚效率较好的菌株； ( 2 ) 采用不断提高苯酚浓度的驯化方法逐渐增强菌株的降解能力， 直到达到本课题拟定的降解目标： ( 3 ) 研究具有高效降解能力的菌株降解特性，找出最佳的降解条件， 即从环境因子( 温度、p h 值、溶解氧等) 、营养条件( 氮源、碳源等) 、 苯酚浓度变化方面来研究其降解特性，并考察混合菌株对降解苯酚的影 响： ( 4 ) 鉴定对具有高效降解能力的菌株进行分类鉴定。 1 5 2 技术路线 经查阅相关资料，结合本次研究的特点，确定技术路线如下 西南交通大学硕士研究生学位论文第11 页 幽l 一2 研究技术路线 西南交通丈学硕士研究生学位论文第1 2 页 第2 章苯酚降解菌的分离筛选和驯化 2 1 实验仪器、试剂和方法 2 1 1 实验主要仪器 本实验所用仪器见表2 一l 。 表2 1 本实验使用的主要仪器 2 1 2 实验主要药品、试剂与培养基 2 1 2 1 实验主要药品 实验主要药品见表2 - 2 。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 3 页 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 4 页 2 。1 2 2 实验用培养基组分 实验用培养基组分见表2 - 3 。 表2 - 3 实验用培养基种类及组分 培葬基组份浓度( g l ) 牛肉膏 5 蛋白胨 l o 富集培养基n a c l5 k h 2 p 0 4 o 5 k 2 h p 0 4 o 5 m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 c a c l ，o 1 筛选培养基 n a c l0 2 m n s 0 4 h 2 0微量 f e c l 2l o 微量 n h d n 0 3 l ，o 苯酚1 0 蛋白胨 1 0 牛肉膏5 固体培养基 n a c i5 琼脂2 0 苯酚1 0 蛋向胨5 酵母膏5 斜面培养基葡萄糖 1 0 琼脂 2 0 k 2 h p 0 4 1 0 蛋白胨 5 m r v e 实验培养基n a c l5 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 5 页 葡萄糖5 ( n h 4 ) 2 h p 0 4 1 0 k c lo 2 m g s 0 4 o 2 葡萄糖发酵培养基酵母膏o ，2 琼脂6 葡萄糖1 0 0 0 4 溴甲酚监1 5 m l 淀粉培养基肉汁蛋白胨培养基中加入0 2 可溶性淀粉 2 1 。3 苯酚浓度的测定4 毒【基安替t 匕林直接光度法 2 1 3 1 方法原理 本实验测试苯酚浓度用4 氨基安替比林直接光度法5 ”。酚类化合物于 p i l l 0 0 4 - 0 2 介质中，在铁氰化钾存在下，与4 - 氨基安替比林反应，生成橙红 色的口鲥哚酚安替比林染料，其水溶液在5 1 0 n m 波长处有最大吸收。 2 1 3 2 试剂配制 ( 1 ) 苯酚标准贮备液 称取1 0 0 9 无色苯酚( c 6 h 5 0 h ) 溶于水，移入1 0 0 0 m l 容量瓶中，稀 释至标线。置冰箱内保存，至少稳定一个月。 ( 2 ) 苯酚中间液 取适量苯酚贮备液，用水稀释至每毫升含o 0 1 0 m g 苯酚。 ( 3 ) 溴酸钾溴化钾标准参考溶液 称取2 7 8 4 9 溴酸钾溶于水，加入1 0 9 溴化钾，使溶解，移入1 0 0 0 m l 容量瓶中，稀释至标线。 ( 4 ) 碘酸钾标准参考溶液 称取预先经1 8 0 。c 烘干的碘酸钾o 4 4 5 8 9 溶于水，移入1 0 0 0 m l 容量 瓶中，稀释至标线。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 6 页 ( 5 ) 硫代硫酸钠标准滴定溶液 称取3 1 9 硫代硫酸钠溶于煮沸放冷的水中。加入0 2 9 碳酸钠，稀释 至1 0 0 0 m l 。 ( 6 ) 淀粉溶液 称取1 9 可溶性淀粉，用少量水调成糊状，加沸水至1 0 0 m l 。冷后， 置冰箱内保存。 ( 7 ) 缓冲溶液( p h 约为1 0 ) 称取2 0 9 氯化铵溶于】0 0 m l 氨水中，加塞，置冰箱中保存。 ( 8 ) 2 ( m v ) 4 ，氨基安替比林溶液 称取4 一氨基安替比林2 9 溶于水，稀释至1 0 0 m l ，置冰箱内保存。 ( 9 ) 8 ( m v ) 铁氰化钾溶液 称取8 9 铁氰化钾溶于水，稀释至1 0 0 m l ，置冰箱保存。 2 1 3 4 测试步骤 l 标准曲线的绘制 于一组8 支5 0 m l 比色管中，分别加入0 ，0 5 0 ，1 o o ，3 0 0 ，5 0 0 ， 7 o o ，1 0 0 0 ，1 2 5 0 m l 酚标准中间液，加水至5 0 m l 标线。加0 5 m l 缓 冲掖，混匀，此时p h 值为l o 0 + 0 2 。加4 氨基安替比林溶液1 0 m l ，混 匀。再加1 0 m l 铁氰化钾溶液，充分混匀后，放置1 0 m i n 立即用7 2 2 s 型分 光光度计于5 1 0 n m 波长，用光程为2 0 m m 比色皿，以水为参比，测量吸光 度。经空白校正后，绘制吸光度对苯酚含量( r a g ) 的标准曲线。标准曲线数 据见表2 - 4 。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 7 页 0 1 6 曾0 1 2 螋o 0 8 裔 祷0 0 4 0 oo 20 40 60 8 吸光度 图2 - 1苯酚标准曲线 2 水样的测定 分别取待测水样适量放入5 0 m l 的比色管中，稀释至标线，用与绘制 标准曲线相同的操作步骤测量吸光度，再减去空白实验吸光度。 3 空白试验 用水代替水样进行蒸馏后，按水样测定相同步骤进行测定，以其结 果作为水样测定的空白校正值。 4 计算 挥发酚( m g l ) = m v 式中，m - 由水样的校正吸光度。从校正曲线查得苯酚含量( “g ) ； 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 8 页 v - 分取馏出液体积( m 1 ) 。 2 1 4 微生物量的测定方法比浊法 2 1 4 1 测定原理 比浊法【5 2 】是在分光光度计或浊度计上进行测定培养液中微生物的 数量。在某一波长的光线，通过混浊的液体后，其光强度将被减弱。入 射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。 ， l o g 争：k c d 1 0 式中：i t ：透射光的强度；i o ；入色光的强度；k ：吸光系数；c ：样 品液的浊度；d ：液层厚度：i d i o ：透光度( t r a n s m i t t a n c e ) ；l o g 上 光 密度( o p t i c a ld e n s i t y ，简o d ) 。 。t 。1 。“ 如果样品液层厚度一定，则o d 值与样品浊度相关，根据此原理， 可通过测定样品中的o d 值来代表培养掖中的浊度，即微生物量。 2 1 4 2 最大吸收波长的确定 取培养1 2 h 的菌悬液，用7 2 2 s 型分光光度计对待测液进行扫描， 然后作光密度o d 值与吸收波长曲线，其最大吸收峰处的波长即为菌体 的最大吸收波长，如图2 2 所示。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 9 页 o 3 2 0 2 9 o o 0 2 6 0 2 3 0 2 3o 波长( 册) 图2 - 2 菌悬液光密度与波长关系图 从图2 - 2 可以看出，在4 0 0 n m 处有最大吸收，即l m a x 为4 0 0 n m 。 2 1 4 3 细菌o d 值的测定 取待测的菌悬液样品，以未接种的液体培养基作参比调零，在最大 吸收波长处测得的数值为菌体的o d 值。( 注：若菌液浓度大，可适当进 行稀释，使o d 值的读数在0 o 0 4 之间最好。) 2 1 4 4 细菌生长曲线的测定 细菌接种到一定体积的、合适的新鲜液体培养基中，在适宜的条件 下进行培养，定时测定培养液中的菌量。以菌数为纵坐标，以时间为横 坐标，绘制的曲线为生长曲线。一般生长曲线可分为停滞期( 适应期) 、 对数期、稳定期和衰亡期。生长曲线是微生物在一定环境条件下于液体 培养基时所表现出的群体生长规律1 5 2 1 。实验用o d 4 0 0 表示菌量，因此所 作生长曲线为o d 4 0 0 与时间t 的关系曲线，如图2 - 3 。 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 0 页 2 5 2 0 1 5 凸 o 1 0 0 5 0 0 o81 62 43 24 04 85 6 时间( h ) 幽2 - 3 生长曲线幽 从图2 3 可以看出，本实验所用细菌的对数生长期为1 2 2 4 h 。 2 2 采样 2 2 1 采样点的确定 本实验的目的是要获得高效的苯酚降解茵，结合石油化工废水中含 有相当数量的苯酚的特点，确定本实验采样点为以石油为原料生产甲醇 的江油市某甲醇厂的污水处理站。 2 2 _ 2 采集方法 根据己确定的采集点，采集样品时将样品的环境因素( 包括气温、 水温、p h 等) 、日期、时间、瓶号等一一记录。所采样品种类为污水和 污泥，采回后放置于冰箱中保藏备用。具体采集的样品如表2 5 。 表2 - 5 样品采样记录表 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 1 页 2 3 菌株的寓集 2 3 1 基本原理 富集培养是筛选高效降解菌株最强力的技术手段之一1 5 ”。主要是利 用不同细菌间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于 该条件的细菌旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够 更容易地从自然界中分离到所需的苯酚降解菌。富集条件可根据所需分 离的细菌的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、 p h 、光照、氧气、营养等。根据以上原理，并结合本实验的特点，本实 验采用含有苯酚的液体培养基作为富集培养基，从而抑制或淘汰那些不 适应该条件下生长的细菌，而所需要的细菌经富集培养后在数量上占优 势。富集培养基的主要成分见表2 3 。 2 3 2 富集培养 从污泥样品中耿出1 0g 污泥放入9 0 m l 无菌水并装有玻璃珠的三角 瓶中，振荡约2 0 s ，使样品与水充分混合，将细胞分散，形成均匀的菌 悬液。分别用已经灭过菌的1 m l 移液管吸取上清夜或原污水样l m l 到富 集液体培养基中，在3 0 、1 2 0 r m i n 的摇床上振荡培养，4 8 h 后取5m l 再次接入新鲜的液体富集培养基中，在相同的条件下振荡培养4 8 h 后， 测定苯酚浓度，结果如表2 - 6 。 从表2 - 6 可知，经过富集培养三个样品对苯酚的降解率都大于7 5 ， 表明三个样品中都含有降解苯酚的菌种。因此，我们将三个样的菌悬液 都做菌种分离实验。 表2 - 6 初次富集培养结果 样晶编号苯酚初始浓度( m g l ) 培养后苯酚浓度( m g l ) 苯酚降解率( ) 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 2 页 2 4 菌株的分离 菌种在正常条件下是与各种菌混杂生长在一起的，富集培养只是抑 制或淘汰了那些不适应培养条件的细菌，不能得到细菌的纯种，所以有 必要进行分离纯化。本实验采用涂布平板法( s p r e a dp l a t em e t h o d ) 和平板 划线法( s t r e a kp l a t em e t h o d ) 进行菌株分离，琼脂平板培养基的配制见表 2 - 3 。 取经过两次富集培养后的菌悬液1 m l 依次制成1 0 、1 0 一、1 0 。至 1 0 西稀释度的稀释液，然后分别取0 2 m l 接到琼脂平板上，涂布均匀后 倒放置于3 0 的恒温培养箱中培养。两天后发现每种稀释度的平板上均 长出了菌落，并且三个样品长出的菌落主要菌种相同。用接种针挑取其 中清晰可见的单菌落，利用平板划线分离法反复划线分离，得到纯菌株。 菌株分离实验所得结果如表2 7 。 表2 7 各纯菌平板培养外观特点描述 2 5 苯酚降解菌株的筛选 由菌株分离实验结果可以看出，纯种允离得到六株菌，采用筛选的 方法再次对纯菌株进行淘汰，以便获得高效的苯酚降解菌。 所选用的筛选培养基配制见表2 3 。 从长出明显单菌落的各纯菌株平板内用接种环分别刮取一环于 l o m l 无菌水中，用离心机充分混匀，制成菌悬液。分别取5 m l 接入5 0 m l 筛选培养基中，置入3 0 、1 5 0 r m i n 的摇床上振荡培养2 4 h ，取样测定 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 3 页 从表2 - 8 可以看出，6 个菌株中，2 号菌株的苯酚降解率最高，说 明p d 2 菌株对苯酚的降解起到关键作用，其余菌株可能对苯酚的降解起 到协同作用。因此，选用2 号菌株作为本次实验中纯菌株性质研究的对 象。 2 6 菌株的驯化 本实验的菌源是从以石油为原料生产甲醇的废水中获得，为了获得 较好的能以苯酚为唯一碳源并且对苯酚有较好降解效果的菌株，对其进 行以苯酚为唯一碳源的振荡驯化培养。振荡培养是将培养液装入三角 瓶，瓶口用棉塞塞好，以利于通气和防止杂菌污染，同时尽量减少瓶内 的装液量，把它放在旋转式摇床上，在适宜的环境温度下振荡，以达到 提高溶解氧的目的。 2 6 1 培养基的配制 设计和选用培养基应该遵循目的明确、营养协调、理化适宜、经济 节约4 个原贝, t l t 5 4 】。培养基的种类很多，按其营养成分分为天然培养基、 组合培养基和半组合培养基；按物理外观分为液体培养基、半固体培养 基和固体培养基。本实验中培养基为组合式液体培养基，其主要成分按 以下配制见表2 3 ，配制成苯酚质量浓度为1 0 0 0 ，1 2 0 0 ，1 4 0 0 ，1 6 0 0 ， 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 4 页 18 0 0 ，2 0 0 0 m g l 的唯一碳源培养基。在1 2 1 ，0 1 m p 的条件下进行高 压灭菌消毒3 0 s ，备用。 2 6 2 驯化的方式 采用不断加大苯酚浓度的方法对p d 2 菌株进行驯化。首先取一环斜 面上的p d 2 的菌体制成菌悬液，再移取5 m l 接种到5 0 m l 苯酚浓度为 1 0 0 0 m g l 的无机盐液体培养基中，置于3 0 。c 、1 5 0 r m i n 的摇床上振荡培 养，液体培养基变浑浊大约六小时后取样测苯酚浓度并计算苯酚降解率。 一代传种：取以上菌液5 m l 接种到5 0 m l 苯酚浓度为1 2 0 0 m g l 的无 机盐液体培养基中，在相同的条件下进行培养和测定苯酚浓度并计算苯 酚降解率。 二次及多次传种：取上一代传种实验的菌液5 m l ，接种到苯酚浓度 依次高出2 0 0 m g l 的无机盐液体培养基中，在相同的条件下进行培养和 测定苯酚浓度，并计算苯酚降解率。p d 2 菌株驯化结果如表2 - 9 。 从表2 - 9 的数据可知，p d 2 菌株经过六代驯化，其对苯酚的降解能 力从1 0 0 0 m g l 提高到2 0 0 0 m g l ，达到了本课题拟订的目标。同时还说 明在一定范围内提高苯酚的浓度可以提高p d 2 菌株降解苯酚的酶的活 性。 表2 - 9p d 2 菌株驯