（物理电子学专业论文）基于体硅加工技术的安培型微电极生物传感器研究.pdf

摘要 摘要 本文提出了一种新型的硅基衬底体硅加：i 安培型微电极生物传感器。作者设 计了传感器，并利用各向异性硅腐蚀技术制备了该传感器。硅片、金及s u8 分 别用作制作衬底、电极及微反应池。铂化并聚合毗咯第一次被用作表面修饰。 该传感器的设计目标是：低的单片成本、微型化及与i c 工艺的兼容。 $ u - 8 微反应池用来盛装反应溶液以降低反应液用量及单片成本。体硅微加 f 、饷化并聚合吡咯用来增强传感器的灵敏度，以达到微型化的目的。使用硅片 作为衬底使得与t c 工艺的兼容成为可能。 为寻找最佳的电极表面修饰方法及酶固定化方法，设计并实验了几种不同的 乜极表面修饰方法及酶固定化方法。 设计并制作了用于循环伏安法的扫描电压模块。该扫描电压模块能完全满足 实验需要。 该微电极传感器已成功应用于葡萄糖检测。与传统的安培型传感器及表面加 一技术制作的安培型微电极传感器相比，该传感器有敏感面积较小、检测下限较 低、榆测范倒较宽、灵敏度较高、重现性较好、易于制作阵列、易于与处理电路 集成等优点。 从原理卜分析了安培型微电极免疫传感器的可行性、优越性以及研究中需要 重点解决的问题。 关键字：生物传感器，安培型，微电极，微反应池，体硅微加工 a b s t r a c l a b s t r a c t an e w s i l i c o n b a s e db u l km i c r o m a c h i n e d a m p e r o m e t r i c m i c r o e l e c t r o d e b i o s e n s o ri sd e s i g n e da n df a b r i c a t e dw i t ha n i s o t r o p i cs i l i c o nw e te t c h i n g s i l i c o n w a f e r s ，a ua n ds u 一8 a r eu s e df o rm a k i n gs u b s t r a t e s ，m i c r o e l e c t r o d e sa n dm i c r o r e a c t i o np o o l s ，r e s p e c t i v e l y c o n s e c u t i v ep l a t i n i z a t i o na n dp o l y m e r i z a t i o no fp y r r o l e i s ，t oo u rk n o w l e d g e ，u s e df o rs u r f a c em o d i f i c a t i o nf o rt h ef i r s tt i m e t h es e n s o ra i m sf o rl o wu n i tc o s t ，s m a l ld i m e n s i o n sa n dc o m p a t i b i l i t yw i t hi c ( i n t e g r a t e dc i r c u i t ) t e c h n o l o g y s u 8m i c r or e a c t i o np o o l sa r em a d et oc o n t a i nd e t e c t i o ns o l u t i o n t or e d u c e r e a g e n tv o l u m e a n du n i tc o s t b o t hb u l km i c r o m a c h i n i n gt e c h n o l o g ya n dc o n s e c u t i v e p l a t i n i z a t i o na n dp o l y m e r i z a t i o n o fp y r r o l ea r eu s e dt oe n h a n c es e n s o rs e n s i t i v i t y , w h i c hh e l p st om i n i a t u r i z ei t s d i m e n s i o n s u s i n gs i l i c o nw a f e ra ss n b s t r a t em a k e s c o m p a t i b i l i t yw i t hi ct e c h n o l o g yp o s s i b l e s e v e r a ls u r f a c em o d i f i c a t i o nm e t h o d sa n de n z y m ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sw e r e d e s i g n e da n dt r i e dt o s e a r c hf o rt h eb e s ts u r f a c em o d i f i c a t i o nm e t h o da n dt h eb e s t e n z y m ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d a v o l t a g es c a n n i n gm o d u l ew a sd e s i g n e da n df a b r i c a t e dt oc a r r yo u tt h ec y c l i c v o l t a m m e t r i cd e t e c t i o n i tw e l lm e e t st h ee x p e r i m e n t a lr e q u i r e m e n t s s u c c e s s f u l e x p e r i m e n t a l r e s u l t sh a v eb e e na c h i e v e df o r g l u c o s e d e t e c t i o n c o m p a r e d w i t hc o n v e n t i o n a la m p e r o m e t r i cs e n s o r sa n d a m p e r o m e t r i cm i c r o e l e c t r o d e s e n s o r sm a d ew i t hs u r f a c e m i c r o m a c h i n i n gt e c h n o l o g y , t h e b u l km i c r o m a c h i n e d s e n s o rh a ss e v e r a la d v a n t a g e s ，s u c ha ss m a l l e rs e n s i t i v es u r f a c ea r e a ，l o w e rd e t e c t i o n l i m i t ，b r o a d e rl i n e a rr a n g e ，l a r g e rs e n s i t i v ec o e f f i c i e n t ，b e t t e rr e p l i c a b i l i t ya n ds t a b i l i t y , e a s i e rt ob em a d ei n t oa r r a y sa n dt ob ei n t e g r a t e dw i t h p r o c e s s i n gc i r c u i t r y , e t c f e a s i b i l i t y , a d v a n t a g e s ，a n dc r u c i a lp r o b l e m st ob er e s o l v e d ，o fa m p e r o m e t r i c m i c r o e l e c t r o d ei m m u n o s e n s o ra r et h e o r e t i c a l l yd i s c u s s e d k e yw o r d s ：b i o s e n s o r ，a m p e r o m e t r i c ，m i c r o e l e c t r o d e ，m i c r or e a c t i o np o o l ， b u l k m i c r o m a c h i n i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究：r 作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得主国型堂暄电量堂婴塞压或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 签字日期辟月夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解生国登堂隧鱼王堂盟窒逝有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权虫国抖堂医鱼至堂强窒逝可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数掘库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位沦文作者签名 引欲碲 ji 导师签名 页兽红 签字f | 期多伊仁月乡e 签字日期：m 。侔6 月f 同 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 第一章绪论 1 1 m e m s 第一章绪论 微电子机械系统( m i c r oe l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m s ) ，英文缩写m e m s ，欧 洲习惯称做m i c r os y s t e m s t e c h n o l o g y ( m s t ) ，日本习惯称做m i c r o m a c h i n i n g ， 被称为二十世纪最重要的技术之一。m e m s 技术特点可由3 个m 概括：即小尺 寸( m i n i a t u r i z a t i o n ) 、多样化( m u l t i p l i c i t y ) 、微电子( m i c r oe l e c t r o n i c s ) 。m e m s 技术白二十i e l 名e 八十年代崛起以来发展极其迅速，被认为是继微电子之后又个 对罔民经济和军事有重大影响的技术领域，将成为2 1 世纪新的国民经济增长点 和提高军事能力的重要技术途径。 m e m s 技术的主要技术途径有三种：一是以美国为代表的以集成电路加工 技术为基础的硅微加工( s i l i c o nm i c m m a c h i n i n 2 ) 技术；二是以德国为代表发展 起米的l i g a 技术( 包括x 射线深度光刻、微电铸、成型等加工工艺) ；三是以 f 1 本为代表发展起来的精密加工技术( p r e c i s i o nm a c h i n i n g ) 。 m e m s 技术的基本特点： f 1 1 、m e m s 器件体积小、重量轻、耗能低 f 2 ) 、批量生产：用砖微加工工艺在一片硅片上同时可制造出成百上千个微 型机电装置或完整的m e m s 批量生产可大大降低生产成本。 ( 3 ) 、集成化：可以把不同功能、不同敏感方向的多个传感器或执行器集成 丁一体、或形成微传感器阵列、微执行器阵列，甚至把多种功能的器件集成在一 起，形成复杂的微系统件集成在一起可制造成可靠性、稳定性很高的m e m s 。 ( 4 1 、多学科交叉：m e m s 涉及电子、机械、材料、制造、信息与自动控制、 微传感器、微执行器和微电子器物理、化学和生物等多学科、并集约当今科学发 展的许多尖端成果。 如图1 - 1 所示1 1 _ 1j ，传感m e m s 基本模型般由传感器( s e n s o r ) 、模拟信号 处理( a n a n l o gs i g n a lp r o c e s s ) 、数字信号处理( d i g i t a ls i g n a lp r o c e s s ) 、执行器 ( a c t u a t o r ) 、通讯接口( c o m m u n i c a t i o ni o ) 组成。其输入的是自然信号( 力、 声、热、电、生物、化学等) ，通过传感器转换为电信号，然后是信号处理( 模 箍于体硅) j h j ：技术的安培型微1 u 极生物传感器碍f 究 拟的和或数字的) ，通过执行器与外界作用。 卧 传 + 翳肾 执 卧 厂订， 1 _ 一 感 行 卧 医习一 嚣 器 i 其它卜 与其它系统的通讯接口 感压量 控制量 网1 - 1 传感m e m s 基本模型示意图( 引自文献【1 - 1 】) 早期的微电子机械系统几乎完全以硅材料为基础。首先，人们埘硅材料的机 械和电性质已经了解得很清楚：硅的强度、硬度与铁相当，密度近似铝，热传导 率接近铂和钨，机械电性能优良，惯性小，谐振频率，响应时间短等。第二，微 制造领域的集成电路制造技术目前已相当成熟，而当今绝大多数的集成电路芯片 都是用砖制成的，这使得从集成电路的制造到微电子机械系统的制造的转移相对 比较容易。在一块硅芯片表面卜制造微型机械元件使得有可能在标准的集成电路 生产线l 制造这些器件。第三，同样都以硅材料为基础的微电子机械系统的集成 电路芯片使得两者在制造工艺上能相互兼容，这样就可以利用集成电路制造技术 将备种微型机构与传感、测控等器件以及驱动电路、定位电路等集成在一块芯片 卜以组成- 个完整的微电子机械系统。最后，与集成电路上的晶体管一样，利用 光刻技术可一次制造数千甚至数百万个相同的微型装置，从而使得制备器件的成 本大幅度下降，大批量低成本的生产成为可能，并能将单个的装罱组成一个阵列 以产生离散装置所不可能产生的效果。在许多情况下，只有在通过制造成千上万 甚至几百万个机械结构并与电子元件集成之后，微电子机械系统的价值才可能变 得明显【l - 2 】。硅材料的这些特点决定了m e m s 向微小型化、多样性和微电子技术 方向不断发展的潜能】。 硅m e m s 加工技术最早出现于二十世纪六十年代，所采用的主要技术是单 晶硅( s i n g l ec r y s t a ls i l i c o n ，s c s ) 各向异性腐蚀技术( a n i s o t r o p i c s i l i c o ne t c h i n g ) ( 体砖微机械加工技术) ( b u l km i c r o m a c h i n i n g ) ，其代表产品是硅压力传感器。 2 第章绪论 八十年代荚国率先丌发出以多晶硅为结构层、二氰化硅为牺牲层的表丽牺牲层技 术( s u r f a c es a c r i f i c i a ll a y e r ) ( 表面微机械加工技术) ( s u r f a c em i c r o m a c h i n i n g ) ， 并开发山微硅静电马达，使得m e m s 技术得到质的飞跃发展。表面微机械加工 技术与半导体集成电路技术最为相近，其主要特点是在薄膜淀积的基础上，利用 光刻、刻蚀等集成电路常用1 艺制备微机械结构，最终利用选择腐蚀技术释放结 构单元，获得可微动结构。进入九f 年代，随着深槽刻蚀技术( d e e pr e a c t i v ei o n e t c h i n g d r i e ) 、键合技术( b o n d i n g ) 及其它关键技术的成功应用，体硅微机械 加工又得到了飞速发展，并发展出多种体硅二r ：艺与表面微机械_ 1 ：艺相互结合的新 工艺。特别是丌发出利用感应耦合等离子体( i n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m a ，i c p ) 和侧壁钝化( s i d ep l a n ep a s s i v a t i o n ，s p p ) 的先进硅刻蚀 ：艺( a d v a n c e ds i l i c o n e t c h i n g ，a s e ) 叮对硅材料进行很大深宽比( h i g h a s p e c t r a t i o ，h a r ) 的j 维微 加工，其加工厚度可达几百微米，侧壁垂直度可接近九十度。这使得m e m s 技 术小仅存传感器领域的应用得到迅速发展，而且在光纤通信、微型化学分析系统、 d n a 分析及微型机器人等领域的应用研究也得到空前发展1 1 。 生物m e m s ( b i o m e m s ) 技术是一类应用m e m s 加1 ：技术制造的化学生 物微型分析和检测芯片或仪器。它把生化检测过程中的进样、反应、分析、检测 等功能通过存l 直| 相基片上的微反应器( 微流体腔和微流体管道) 实现。借助m e m s 加1 ：技术制备的微阵列芯片是生物m e m s 研究的重要内容。药物缓释芯片以及 其它与生物医学诊断与治疗相哭的芯片式微型装置和仪器也是生物m e m s 的研 究内容。 生物m e m s 是种典型的m e m s 器件及系统，具有体积小、成本低、呵标 准化和批量化生产等特点。在功能上它具有获取信息量大、分析效率高、样品用 量少、操作简便、可实现生物和化学信息的实时自动化检测等特点。在生物医学、 化_ ：_ 广、制约、农业、环境监测、园家安全等许多研究和应用领域有重要的应用。 国际l ，l 物m e m s 的研究已成为热点，竞争i 分激烈”j 。图1 2 给出生物m e m s 应用的一个实例。 基十体硅加t 技术的安上齐型微1 b 极生物传感耕研究 m i c r o f i u i d i cs u b s y s t e m f o rr e m o t eb i o - c h e m i c a la s s a y 图1 - 2 远程生化分析的微流体系统 i 2 电化学生物传感器 生物传感器( b i o s e n s o r ) 是一种能够连续和“丁逆地感受化学量和生物量的装 胃，其最早可以追溯到1 9 6 2 年c l a r k l l 5 】提出酶传感器的原理。它既可以进行分 了识别，又”f 以被视为信息采集和处理链中的一个逻辑元件。生物传感器的结构 与其他类型的传感器类似，只是在其他传感器的基础上增加了一种生物组分，通 常是生物敏感膜。它主要是由分子识别元件( 接受器、r e c e p t o r ) 、转换元件( 换 能器、t r a n s d u c e r ) 和信号处理元件( 电子线路、e l e c t r o n i cc o n t r o lc i r c u i t ) 三部分 组成。图1 - 3 岬j 为生物传感器的结构及原理示意图。 图1 - 3 生物传感器结构及原理示意 目标分析物通常包括生物小分子( 如，糖、尿素、谷氨酸、磷酸盐等) 和生 物大分子( 如氨基酸( d n a r n a ) 、肽( 如蛋白质、抗体、酶) ) ：酶、菌、抗原 4 第一章绪论 ( 或抗体) 、激素受体、结合蛋白质或生物体本身( 细胞、细胞器、组织) 通常 被视为敏感元件，固定于载体膜上，构成传感器的敏感膜，即分子识别元件，对 目标分析物做出n f d j i ；转换元件把目标分析物与分子识别元件相互作用产牛的物 理或化学信弓转换成另一种形式的与目标分析物的量成比例的信号；信号处理元 件用_ ：r 对转换后的信号进行放大、滤波以及相关处理。常用的信号转换器有电化 学电极( e l e c t r o c h e m i c a le l e c t r o d e ) 、离子敏场效应晶体管( i o n ，s e l e c t i v ef i e l d e f f e c t i v e t r a n s i s t o r , i s f e t ) 、热敏电阻( t h e r m o r e s i s t o r ) 、石英晶体微天平( q u a r t z c r y s t a lm i c r o b a l a n c e ，q c m ) 、光纤( f i b e r ) 等。当待测物质经过具有分子识别的 接受器时，传感器所感受的物理或化学量由信号转换器将其转化成为与分析物浓 度有关的电信号或光信号输出，通过电子系统进行处理和显示。生物传感器的质 昔主要取决于接受器的选择性、换能器的灵敏度以及它们的响应时问、可逆性、 寿命和电子系统的可靠性。 依掘不同研究角度，生物传感器的分类方式有很多，如表1 - 1 所示。 表1 - 1 生物传感器的分类 分类方_ j i i =分类依据传感器名称 1 底物1 1 分了识别元件l 敏感物质具有生物亲和作用1 亲和型生物传感器 传感器输川信哆 2 底物与分了识别元件卜的敏感物质作用并产生产物2 催化型生物传感器 1 酶与底物作用1 酶传感器 2 微生物代谢2 微生物传感器 分了识别，b 件 3 盟【织代谢 3 组织传感器 的敏感物质 4 细胞代谢4 细胞器传感器 5 抗体抗原反应5 免疫传感器 6 核酸杂交6 d n a 传感 器 】，屯化学电极 1 屯化学生物传感器 2 ，离子敏场效应晶体管2 离子敏场效应生物传感器 3 热敏电阻3 热敏电阻生物佶感器 信吁转换器 4 压电晶体4 胝电晶体生物传感器 5 光电器件5 光电生物传感器 6 声学装置6 ，声学生物传感器 在微电了- 工艺发明以前，生物传感器主要利用玻碳电极，p h 玻璃泡电极， 金属丝电极或金属薄片电极等作为敏感膜固定的场所，这些电极的敏感面积为数 | 平方毫米、数平方厘米或更大。微电子工艺兴起后，虽然传统电极的研究仍然 很盛行，但以硅基做为衬底的生物传感器己逐步成为研究的热点。 罐十体硅加工技术的安培掣微【b 檄生物传感器4 0 f c 电化学生物传感器( e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ) 是生物传感器的一种。电化 学，仁物传感器可分为电容型、电位型和安培型( 电流型) 三种。其巾，电位型和 安培型应用较为广泛。 电位型传感器是根据离子选择性膜两边电解质浓度或组成的差异所产生的 电位差来检测物质，其输出信号是电位值，电位信号与被测物质浓度之间依从能 斯特关系( 见式( 】1 ) ) 。 e = e o 只t l n q n f 或 e = e o 一2 3 0 3 $ r 丁 l g q n f ( 1 1 ) 其中e 为任一浓度时的电动势，e 0 为标准电动势，r 为气体常数8 3 1 4j m o l - 1k 1 ， f 为法拉利常数9 6 4 8 5 c m o l ，o 为反应熵 安培型传感器是根据电极表面或其修饰层内发生氧化还原反应所产生的电 流来检测物质”】，其输出信号是与被测物浓度旱线性关系的电流信号。 电流检测具有不受试剂浑浊度的影响，输出与被测物的浓度呈线性，灵敏度 较高，使用简便，成本低，便于小型化、集成化等优点。就目前的研究和应用情 况而苦，安培型酶传感器是最为成熟，应用晟广泛的电化学生物传感器之。 1 2 1 安培型酶传感器 安培型酶电极可以追溯到1 9 6 2 年c l a r k 提出酶传感器的原理】，1 9 6 5 年 g u i l b a u l 制成了胆碱酯酶传感器f j 。 安培型酶传感器的基础电极为a u a g p t 1 。8 ，。9 1 ( 一些文献中也出现过 a 9 2 0 ) 。通常所见的为i 电极或双电极系统。三电极系统由工作电极( w o r k i n g e l e c t r o d e ) 、对电极( c o u n t e re l e c t r o d e ) 及参比电极( r e f e r e n c ee l e c t r o d e ) 组成。 双电极系统由一1 ：作电极( w o r k i n ge l e c t r o d e ) 及对电极( c o u n t e re l e c t r o d e ) 组成。 参比电极的电位呵以稳定在某基准电位而不漂移，这对稳定反应中的电位差值 是很重要的。因为测量的是电位的变化量，一般电位型传感器中都应该使用参比 电极。在安培型传感器中，由于测量的是反应中的电流变化值，而工作电极上的 电位保持恒定，因而参比电极可以不用。双电极安培型传感器的反应原理如图 1 4 。 第一覃绪论 图1 - 4 双电极安培型传感器示意图 用f 葡萄糖检测与临控的安培型酶传感器一直是研究的重点与热点1 1 - 1 0 。 1 ”】。随着新技术、新材料的发展，新的加工技术，如微针技术1 1 “】，新材料，如 碳纳米管5 1 “】电不断被应用于葡萄糖传感器的研究。 1 2 2 免疫传感器 免疫反应是抗原与抗体之间特异性的结合反应。免疫分析法( i m m u n o a s s a y ， i a ) 是2 0 世纪6 0 年代后期发展起来的，将免疫反应与现代测试技术相结合而建 立的超微量测定技术。免疫分析法主要是利用抗体与对应抗原，半抗原之间特异 性结合来检测特定物质的存在。1 9 6 7 年c e n t e n o 和j o h n s o n 首次报道制备 ： 兔抗 滴滴涕和马拉硫磷抗体，标志着免疫学技术丌始应用于农药分析。免疫分析法包 括荧光免疫测试法、酶免疫测试法、放射免疫测试法和流动注射免疫分析法等。 免疫传感器( i m m u n o s e n s o r ) 是生物传感器中一大分枝。8 0 年代以来，生 物学技术的迅速发展为免疫传感器的发展提供了有力的帮助。由于抗原和抗体的 特异性反应，免疫传感器较其它生物传感器有更高的专一性和选择性【1 - 1 7 _ 1 2 3 1 。 电化学免疫传感器( e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r ) 是免疫传感器中研究最 早、种类最多、也较为成熟的。个分枝，它交联各种电分析技术( e l e c t r o a n a l y s i s ) ， 如循环伏安法( c y c l i c a lv o l t a m m e t r y ) 、脉冲伏安法( p u l s ev o l t a m m e t r y ) 、脉冲差 堆r 体辟力1 技术的安培型微电微生物传感器 i i 究 分法( p u l s ed i f f e r e n t i a la n a l y s i s ) ，大大提高了灵敏度。在短短几十年翠升辟了种 类繁多的研究和应用领域，目前i f 朝着更加灵敏、特效、微型和适用的方向发展。 1 3 微电极生物传感器的关键技术 微电极生物传感器是电化学生物传感器l - l 应用较为广泛的一种，其应用的重 点在医学检测，如葡萄糖检测i l _ 】”1 。1 6j 。微电极生物传感器的关键技术包括：微 r 乜极设计与制备、微电极表面修饰、生物敏感膜制备( 酶抗体崮定化技术研究) 及信号检测技术。要想制备有较高灵敏度、较宽线性检测范围的微电极生物传感 器，必须同时从这四个方面着手。 1 3 1 微电极设计与制备 1 3 1 1 电极反应机理 以葡萄糖电极为例，电极反应机理的发展主要经历了如表1 - 2 所示的 “代。 表1 - 2 电极反应机理进化表 i u 橄反心机艘特征优点缺点 碱化还原的i u 了受体为非活 简单、易操作； 受 = f 解氧及p h 影响； 第代 性物质，如0 2 ( 见式( j 2 ) ， 寿命妊：数月 工作电位较高：0 7 v ； ( 1 3 ) ) t 乜了转移中介，电活性物质替对氧惰性；电子转移中介易溶解、 代0 2 ( 见式( 14 ) ) ；电活性物 较低的1 二作屯位：0 2v ；脱落，传感 只能次 爿j 代 质包括一茂铣衍生物、苯雕、 可与辅基发生发艘，性使用； 氯酪、甲基梳、眦红素等提高响廊速度寿命低：数天 减少电子迁移过程中 直接电予转移，无中介体的损耗： 易受p h 影响： 第一二代稳定性差； ( 导电聚合物薄膜)缩短了电子1 专递距离， 寿命短 提赢j 响应速度 赶接电了转移，无中介体 制各简单： 易受p h 影响； 笫叫代亲水和多孔渗水性稳定性差； ( 金属氧化物) 有良好的运输性能寿命短： 酶通道：双酶系统 提高了信号强度； 固相栽体卜的酶易失 第五代( 一种酶的产物同时作为另 酶与电极间直接电子 活： 转移，速度快； 外一种酶的底物，级联放大)双酶固定化难度大 分析时问短 铺一章绪论 g l u c o s e + 0 2 + h 2 0 旦业g z “聆把a c i d + h 2 0 2 h ，o ，! ! k 片，o + 0 ， 一一 z 葡萄糖+ 二茂铁一葡萄糖酸+ - 茂铁离子 1 3 1 2 电极制备技术 ( l 2 ) ( 1 3 ) ( 1 4 】 酶电极分析法首创r6 0 年代，1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n s 用半透性膜将可溶性 葡萄糖氯化酶( g o d ) 包裹在p h 电极玻璃泡外面，成功地测定了葡萄糖含量 ”。5 l 。1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k 用固定化酶覆盖在铂金电极表面，定量测定血清中 葡萄糖的含量，并首次提出“酶电极( e n z y m ee l e c t r o d e ) 这一术语【l - 2 “。我国的 酶电极研究起步于8 0 年代，主要应用于医学检洳及发酵工业生产【l - 7 11 。叭3 l 1 1 2 5 ， 1 2 引。在微电子工艺发明以前，传统的酶电极主要是玻碳电极，p h 玻璃泡电极1 1 - 2 3 1 ， 命属丝或盒属薄片【。，这些电极的敏感面积大小为数十平方毫米、数平方厘米或 亚犬。微电子j ：艺兴起后，虽然传统酶电极的研究仍然很盛行f f _ l 4 1 3 i f l - 2 一蠲f 嘲 。3 ，但是微电了二加- l 工艺制备的电极以其独特的优势而成为研究的热点i l f 9 ，1 1 0 l l l - 2 6 1 1 - 3 1 1 。 图j 一5 简路给出了也极制备技术的进化过程。从图1 5 可以看出，电 图1 - 5 电极锕各技术的进化过程 摧十体辟加t 技术的安培型微电檄牛物传感器蜘f 宄 极的制备技术大体上经历了从简单到复杂、再到简单的过程，但其外观尺 、j 上口朝微型化方向发展。 电极的制备技术朝两个方向发展：实用性方面继续朝应用方便性与低价格方 向发展，而小计较电极的大小：研究方面朝微型化、集成化、以及与i c 兼容化 方m 发展。玻碳电极、p h 玻璃泡电极、金属丝或金属薄片等传统电极多见于市 场。微型化、集成化及与l c 兼容化的电丰及基本上处于研究室阶段，且多为表面 微加工( s u r f a c em i c r o m a c h i n i n g ) 1 艺制备。体硅微加工( b u l km i c r o m a c h i n i n g ) 工艺制备的微电极少见报道。 1 3 1 3 表面微加工电极 用传统方法( 非微电子工艺) 制备的电极敏感面积较大，携带不方便， 并且卅i 易与后面的处理电路集成【1 “，1 。2 l1 1 - 3 2 】。随着微电子技术、m e m s 技术和s o c 的不断发展，近年来微电极( 微电子工艺制作) 以其独特的优 点引起人们越来越多的重视1 1 。8 ，1 。，各种微电极的研究与应用取得了许多 进展【1 。3 2 。3 ”，基f 硅基的微电极生物化学传感器的研究也进行得如火如荼【1 - 3 8 1 。4 5 1 。基于硅基并跟c m o s ( c o m p l e m e n t a r ym e t a lo x i d es e m i c o n d u c t o r ) i 艺完 全兼容的微电极生物传感器也有报道1 1 4 “。医学领域内对发展微型酶生物传感 器及免疫传感器的需求也不断增加u - t o j l l - 4 7 1 。 表面微加工电极的研究主要有：禁新霞等1 1 - i o 】以玻璃为基底，制成了用于多 参数测量的金微电极；朱建中等【1 3 4 1 以硅片为衬底，用电子束蒸发装置，在已形 成光刻胶图形底衬底上蒸 = t i 、p t 、t i 、a g 四层金属，制成了h 2 0 2 微电极阵列 ( m i c r oa r r a ye l e c t r o d e ，m a e ) 葡萄糖传感器；吴佳俐等【1 j 3 5 1 用c v d ( c h e m i c a l v a p o r e dd e p o s i t i o n ) 在硅片上生氏金刚石薄膜，然后分别蒸上p t ，a g 两层金属， 制成了微电极葡萄糖传感器；e c r o w l e y 等【1 - 3 6 】以碳粉末为原料经丝网印刷制备 了安培型免疫微电极。a n t h o n yj k i l l a r d 等【1 - 3 7 】以碳粉末为原料经丝网印刷 ( s c r e e np r i n t ) 制各了流体注入免疫分析( f l o wi n j e c t i o nl m m u n o a s s a y , f i i a ) 传 感器中的微电极。 l o 笫一章绪论 1 3 1 4 体硅微加工电极 以硅基为衬底，采用与微电子( 主要是c m o s ) 工艺_ 簸容的加一i ：工艺， 制备能与i c 集成的微电极( 或阵列) 将是电极制备的发展趋势。这种制 各技术具有以下优点：电极尺寸小，并能精确控制、一致性及重复性好、 能与处理电路集成、适合大批量生产等f 1 。“。 8 0 年代兴起的玻碳或金属印刷微电极【1 - 9j 1 - 3 4 l 【1 4 8 - 1 5 1 】的制备一般都 采用表面加工工艺( s u r f a c em a c h i n i n g ) ，很少采用硅腐蚀等体硅微加工1 艺( b u l km i c r o m a c h i n i n g ) 。诚然，表面加工工艺具有工艺简单、平整度好、 可重复性好、易于批量，e 产等优点。但是，它也有缺点：缺少保护结构、 易于被外界环境所干扰，冈而一般的表面加工微电极敏感面积都较大( 般都为数卜平方毫米或更大) 。 本课题采用与i c 兼容( i cc o m p a t i a b l e ) 的硅作为基底材料，利用体 硅微加工丁艺，制成了新型微电檄。其制备的独特之处在于两个方面：硅 腐蚀及s u 一8 微反应池。 硅腐蚀t 艺虽然比表面加工工岂复杂，但硅腐蚀形成的微池增大了实 际的敏感面积，并且微池对其底部的淀积金属薄层起到了环绕保护作用， 从而较少了外界环境干扰。凶而在同样电极面积、同样固化定酶量的条件 下，砖腐蚀微电极有较大的灵敏度；或者说在同样灵敏度的要求下，砖腐 蚀法制备的微电极j 叮以更微小。 1 ，3 2 微电极表面修 布 自电极传感器研究”展以来，电极活性化研究一直是探索的热点。在确定电 极面积后，怎样在有限的范围内有更好的活性，即更好的灵敏度一直是人们研究 的重点，各种各样的表面( 化学) 修饰方法也应运而生【1 - 3 7 】【l - 5 1 。5 。 比较成熟的电极表面修饰方法有表面铺膜( s u r f a c em e m b r a n ep a v i n g ) 、金属 f , ( m e t a l l i z a t i o n ，主要是铂化p l a t i n i z a t i o n ) 、多聚物聚合( p o l y m e r i z a t i o n ) 及氧化 ( o x i d i z a t i o n ) 等。 本文使用的表面修饰方法主要有四种：氧化、铂化、聚合毗略及铂化并聚合 1 1 基j 体辟加t 投术的安上吝型微电微生物传感器研究 i 比咯，其中销化并聚合毗咯是第一次应用于电极表面修饰。 13 3 酶抗体固定化技术研究 2 0 世纪6 0 年代以前使用的各种传感器中，酶并没有固定化，这时候酶的使 用是次性的、用过之后就抛弃、无法恢复活性。酶同定化发源：r2 0 世纪6 0 年 代，最初主要是将水溶性酶和不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物， 所以曾被称为“水不溶酶”和“固相酶”。但后来发现，也可以将酶包埋于凝胶 内或置于超滤装置中，高分子底物和在超滤膜一边，而反应产物l 叮以透过膜逸出， 在这种情况之下，酶本身仍是可溶的。因此，用水不溶酶和固桐酶的名称就不恰 当了。在1 9 7 1 年第一届国际工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称。 所溜固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续地进行反应，反应后 的酶，可以重复回收利用【l f 5 4 1 。酶固定化后与换能器结合后i 、f 以使酶法分析实现 t t 无试剂化”( n o n r e a g e n t a l ) b 5 5 1 ，操作简单。 经过几十年的发展，酶固定化技术得以蓬勃发展。比较成熟的酶的同定化方 法主要有叫种( 见图1 6 ) 1 1 - 5 6 】：包埋法( e n t r a p m e n t ) 、吸附 2 ( a d s o r p t i o n ) 、共 价法( c o v a l e n tb i n d i n g ) 、交联法( c r o s s l i n k i n g ) 。几乎所有酶传感器都使用固定 化酶，针对具体的不同物质，方法的选取f i 尽相同。有时候有几种不同的方法可 以选用，各种方法之间也很难分出优劣。如s i l v a n a a n d r e e s c u 等1 1 4 7 】提到了三种 吲定化酶的方法：p v a s b q 感光树脂的包埋法、胶体交联法、金属共价键鳌合 法。 图1 - 6 酶固定化方法图( 引自文献【1 5 6 1 ) 1 2 第一章绪论 本论文对9 种不同的酶抗体崮定化方法进行了理论分析及实验验证。根据 实验结果分析了酶，抗体固定化方法的优劣、联合使用时的顺序、以及酶圈定化 方法_ 表面修饰方法穿插使用时的顺序。 1 3 4 信号检测技术 作者没讨并制作了用f 循环伏安法( c v 法) 分析的扫描电压模块。利用该 扫描电压模块、与c h 1 恒电位仪，作者搭建了用于用于电流检测的信号榆测系 统。 1 4 本论文的主要研究内容 随着m e m s 技术和s o c ( s y s t e m o n a c h i p ) 的刁i 断发展，近年来微电极 传感器以其独特的优点引起人们越来越多的重视，各种微电极传感器的研 究与应则取得了许多进展，医学领域内对发展微型酶生物传感器及免疫传 感器的需求不断增加。用常规方法制备的微电极传感器敏感面积大、不易 与后面的处理电路集成，因而无法满足发展的需求。集成化的、高灵敏度 f 、易于与处理电路集成的微电极传感器将是研究的重点。 针对上述需求，本论文的主要研究f 1 标是研制出一种基f 体硅加工技术的安 培型微电极，l 化传感器。进行传感器结构设计、加工技术研究、电极表面修饰研 究、酶同定化技术研究、以及微传感器性能测试，以提高微传感器的灵敏度。 以葡萄糖作为检测对象，将敏感面积确定为1m m 1m m ，本文作者 将对不同的电极制备工艺、电极材料、电极表面修饰方法以及酶固定化方 法进行了比较。进一步的研究与比较，包括电极的进一步微型化、其他电 极表面修饰方法、其他酶固定化方法、待测物质的种类变化( 如各种蛋白 质、抗原抗体等) 、多参数的同时检测( 多功能传感器) 以及与处理电路 ( i c ) 的集成等，在进一步的实验中。 参考文献 【1 1 j 赵晓峰，温殿忠，m e m s 研究与发展前景，黑龙江大学自然科学学报，2 0 0 2 鼎十体硅加t 技术的安蚺型微电极生物传感器研究 1 9 ( i ) ：6 4 6 9 。 【1 ，2 】吴国锋，陈希明，m 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